Name: İndüklenebilir ve tersinir baskın-negatif (DN) Protein inhibisyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Öğrenin, baskın-negatif mutantların tersinir aşırı ekspresyonuyla proteinlerin koşullu ve geçici inaktivasyonunu sağlayan bu yöntemi. NIH3T3 hücreleri kullanılarak geliştirilen bu sistem, protein fonksiyonlarını koruyarak kısmi aktivite azalmasına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PCS2 + CB-Myc6 vektör Marshall Horwitz (University of Washington, Seattle, WA, ABD) bir hediye oldu. Hee OC1 hücreleri nazikçe Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, Kaliforniya, ABD) tarafından temin edilmiştir. Teknik destek UNMC fare genom mühendislik çekirdek (C.B. Gurumurthy, Don Harms, rol Brezilya'lı) ve Creighton Üniversitesi entegre Biyomedikal görüntüleme tesis (Richard Hallworth, John Billheimer) tarafından sağlandı. UNMC fare genom mühendislik NIH/NIGMS, bir Kurumsal Geliştirme Ödülü (fikir) tarafından desteklenen sayı P20 GM103471 verin. Entegre Biyomedikal görüntüleme tesisin Creighton Üniversitesi Tıp ve hibe GM103427 ve GM110768 NIH/NIGMS dan tarafından desteklenmiştir. Tesisin Ulusal Merkezi gelen hibe desteği için araştırma kaynakları (RR016469) ile inşa edilmiştir ve NIGMS (GM103427). Bu çalışmada oluşturulan fare satırları Creighton Üniversitesi'nin hayvan kaynak tesis olan altyapı bir hibe NIH/NCRR G20RR024001 tarafından geliştirildi, muhafaza. Bu eser geçmiş COBRE vermek (Shelley D. Smith ile) bir NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471, NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) ve işitme Sağlık Vakfı (S. Tarang için) bir ortaya çıkan araştırma hibe yoluyla destek aldı. Bu araştırma içeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.

Transgenik CBRb fare ve tüm hayvan bakımı ve çalışma ile ilgili deneyler nesil Creighton Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve kendi kurallarına göre yapılır.
1. transgenik CB-Myc6-Rb1 yapı
Not: CBRb bir pTet_Splice vektör klonlama bir çok adımlı işlem (Şekil 1A ve 1B) yapıldı.
<ol><li>
İlk sahne klonlama pCS2 + CB-Myc6 vektör gerçekleştirin.
	<ol>
<li>CBRb transgene yapı oluşturmak, 1583-bp-uzun Rb1 cDNA parçası (528 amino asitler amino asit bölgesine 369-896 karşılık gelen) aşağıdaki astar kullanarak RB1 protein yükseltmek için ayarlayın: EcoRI +RB 1243için F, GGGGAATTCA kullanın TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTCve CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCCXbaI + EcoRV +RB 2826R için kullanın.</li>
		<li>Klon parça (1546 bp) pCS2 + CB-Myc6 vektör olarak yukarıda açıklanan1,12 EcoR1 ve XbaI kısıtlama siteler arasında oluşturulan. Not: biraz endojen RB1 protein (~ 110 kDa) küçük bir protein yaklaşık 865 amino asitlerin (yaklaşık 108 kDa), Rb1 parça erimiş 1012-bp-uzun CB-Myc6 yapı (337 amino asitler) sonuçlandı (Şekil 1 Bir), N-terminus ve Rb1 C-terminus adlı bir CB-Myc6 etiketi ile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İkinci sahne pTet-Splice vektör subcloning gerçekleştirin.
	<ol>
<li>CB-RB-Myc6 füzyon parçası yükseltmek ve Tet-organizatörü geçirmesine, EcoRV (XbaI + EcoRV + RB 2826R) ve SalI siteleri içeren primerler kullanılarak CB-myc6-Rb1 oluşan kaset, yükseltmek: SalI +CBf, CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTCkullanın.</li>
		<li>SalI ve EcoRV kısıtlama site böyle arasında pTet-Splice vektör içine oluşturulan parçası (2567 bp) subclone SV40 intron ve PolyA dahil olmak üzere tüm TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgene sinyal, bir şekilde NotI (Şekil 1B) ile tek bir sindirim yoluyla ayrılmış olabilir. Not: NotI parçası transgenik fon oluşturmak için kullanılmıştır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 Transgene in vitro test.
<ol><li>
DOX-Yönetmelik: NIH3T3 hücre kültürünü Not: Aksi belirtilmediği sürece, tüm birimleri 6-şey plaka için ayarlanmış bulunuyor.<ol>
<li>Satıcı belirtimleri, önerilen hücre kültür % 10 ile % 10 CO237 ° C'de fetal Sığır serum içeren medyayı kullanarak takip NIH3T3 hücrelerin büyümesine.</li>
		<li>PTet-Splice hücrelerle cotransfect ve pCMV-Tet3G vektörlerinden (adım 1) için 24 h cotransfection için aşağıda belirtilen adımları izleyin.<ol>
<li>2-4 µL lipid tabanlı transfection reaktif/kuyu ve 1 mL, eksik (serum) olmadan Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) Oda sıcaklığında 5 min için karıştırın. 12 veya 24 iyi tabağı, 250 ya da 500 µL kültür ortamının sırasıyla kullanın ve transfection reaktif hacmi buna göre ayarlayın.</li>
			<li>2-3 µg, plazmid DNA/iyi transfection reaktif-DMEM ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.</li>
			<li>DNA ve her şey için DMEM içinde transfection reaktif içeren karışımı ekleyin. (Son Hacim 2 mL/iyi olması), kuluçka 3-4 h sonra komple medya 1 mL ekleyin. Aliquots Dox stok (1 mg/mL) tutmak ve 2 µL her wells (+ Dox) ekleyin. %5 CO237 ° C'de hücreler kuluçkaya. Not: Cotransfected hücreleri Dox ile tedavi değil kontrol örnekleri oluşur (-Dox), yanı sıra NIH3T3 hücreleri sadece transactivator pCMV-Tet3G vektör ile transfected ve 24 saat süreyle Dox ile tedavi. PCMV-Tet3G, konsantrasyonu için 0,1 – 1 µg/mL Dox transgene ifade ikna etmek için yeterli olmalıdır.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HEK293 hücre satırı kullanarak yapı reversibility sınayın.
	<ol>
<li>TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgene reversibility, kültür HEK293 hücreler kartal'ın en az gerekli Orta (satıcının özellikleri takip EMEM içinde) test etmek ve 24 h için pTet ek yeri ve pCMV-Tet3G vektörler ile açıklandığı gibi cotransfect (adım 2.1.2) yukarıda.</li>
		<li>Transgene inactivation için 24 saat sonra Dox içeren medyayı çıkarın, hücreleri 2 x-3 x fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkayın ve onları Dox ücretsiz medya ek bir 24 saat kuluçkaya. Not: DOX-kaldırma üzerine transgene inactivation ve normal protein ifade 24 saat süre içinde devam.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zamanlanmamış hücre çoğalması teşvik TetO-DN-CB-myc6-Rb1 yapı işlevselliğini değerlendirmek için aşağıda açıklandığı gibi bir Hee OC1 hücre satırı kullanarak fonksiyonel analizleri gerçekleştirmek.
	<ol>
<li>Kültür Hee OC1 hücrelerde % 10 DMEM altında keyfi koşullarda (33 ° C % 10 CO2). Hücre çoğalması çalışmaları için bir hücre sayaç ve plaka 10.000 Hee OC1 hücreleri 200 µL birimindeki bir 96-şey plaka üzerinde kullanarak hücreleri saymak. Hücreleri gecede kuluçkaya.</li>
		<li>Ertesi gün, geçici bir cotransfection pTet-Splice ve pCMV-Tet3G vektörlerin lipid tabanlı transfection reaktif kullanarak gerçekleştirmek (2.1.2 adımlara bakın). Ayrı bir kuyuda pmR-ZsGreen1 transfection at2-µg transfection oranını hesaplamak için lipid tabanlı transfection reaktifi (adım 2.1.2) kullanarak gerçekleştirin. Sigara transfected hücreleri denetimleri kullanın.</li>
		<li>Bir floresan mikroskop altında yeşil floresans var olup olmadığını belirlemek (uyarma 485 = nm, emisyon 530 = nm) transfected için hücreleri 24 saat sonra transfection. Yeşil floresans olup kaydetmek ve DAPI ile (Toplam hücreleri) etiketli hücreleri üzerinde GFP pozitif hücreler (transfected hücreleri) toplam sayısı transfection oranını hesaplamak. Not: ~ %70 transfection oranında tahmin.</li>
		<li>Transgene ifade ikna etmek için 1 µg/mL Dox transfected hücre alt grubunu için diğer alt denetimi olarak kullanırken eklediğiniz (-Dox). Tedavi edilmemiş Hee OC1 hücreleri ek denetimleri kullanın.</li>
		<li>Hücre çoğalması değerlendirmek için bir hücre proliferasyonu kiti üreticinin protokolüne göre kullanın.<ol>
<li>Kısacası, 48 h transfection sonra hücre kültür orta kaldırın ve boya-bağlama çözüm x 1 100 µL Mikroplaka her şey için ekleyin. 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya</li>
			<li>Bundan sonra her örnek bir Floresan Mikroplaka Okuyucu kullanarak floresans yoğunluğunu ölçmek (uyarma 485 = nm, emisyon 530 = nm).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Daha fazla immunocytochemistry kullanarak hücre çoğalması değerlendirmek için bir 12-şey plaka bir cam Hee OC1 hücrelerdeyse plaka ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya<ol>
<li>Ertesi gün, pTet-Splice ve pCMV-Tet3G ile cotransfect ve gerçekleştirmek Dox arıtma (+ Dox). Untransfected hücreleri denetimleri kullanın. İşlem Hee OC1 hücreleri Ki-67 etiketleme için.</li>
			<li>PBS, pH 7.4, oda sıcaklığında 10 dakika içinde %4 paraformaldehyde (PFA) ile hücreleri tamir. 3 hücreleri yıkama x ile buz gibi PBS ve %0.25 10 min için PBS içinde non-iyonik deterjan hücrelerde kuluçkaya.</li>
			<li>Hücreleri yıkama PBS 3 x 5 min ve oda sıcaklığında 1 h için oksijen odasında % 10 serum kullanarak bloğu için tekrar.</li>
			<li>Ki-67 birincil antikor (1: 200 seyreltme) Oda sıcaklığında 3 h için 500 µL hücrelerde kuluçkaya veya bir gece 4 ° C'de</li>
			<li>3 hücreleri yıkama x PBS ile 5 min için. Bundan sonra karanlık oda sıcaklığında 1 h için ikincil antikor hücrelerle kuluçkaya.</li>
			<li>İkincil antikor çözümü kaldırmak ve hücreleri 3 yıkama x PBS ile 5 min her karanlık için.</li>
			<li>Phalloidin etiketleme için 1: 200 phalloidin için 30 min Hee OC1 hücrelerde kuluçkaya. Hücre çekirdekleri etiketlemek için 5 µg/mL DAPI oda sıcaklığında 10 dakika için hücrelerle kuluçkaya. Not: Phalloidin boya eşlenik ikincil antikor eşlenik farklı olduğundan emin olun.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. nesil CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb), transgenik fareler ve Vivo DN-CBRb yaklaşımın test
<ol><li>TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgene etkili Dox Yönetmeliği onayı, üzerine NotI parçası arındırmak ve onları sözde hamile kadın daha sonra transfer fare zigotları içine microinject. Not: Bu yordamları Nebraska Üniversitesi Tıp Merkezi (UNMC) fare genom mühendislik çekirdek tesisinde gerçekleştirilmiştir.</li>
	<li>Sonra teslim, bir astar kullanma belgili tanımlık pups ayarla belirli CB-Rb1 füzyon bölgesine genotip: CBRb F, 5' CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG 3'kullanın ve 5'GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC 3'cbrb R için kullanın. Not: Özel jel üzerinde gözlenen PCR ürünü 401 boyutudur bp (60-bp CB region + 341-bp Rb1 bölge (Tablo 1). TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgene varlığı dayalı on bağımsız kurucusu satır belirlendi. Beş bu satırları, Döl transgene germline iletimini doğruladı transgene miras kaldı. Transgenik satırlardan birini sonuçta kurmak ve çizgi korumak ve deneysel TetO-DN-CB-myc6-Rb1 hayvanlar için daha fazla çalışmalar oluşturmak için kullanılmıştır.</li>
	<li>Deneysel DN-CBRb fareler oluşturmak için yetişkin TetO-DN-CB-myc6-Rb1 fareler ROSA-CAG-rtTA tetrasiklin uyarıcı hattı (hisse senedi #006965) (alternatif olarak, tTA uyarıcı hattına doğurmak) için doğurmak. Genotip bu aşağıdaki astar kümesi kullanarak çapraz yavruları: GGAGCGGGAGAAATGGATATG; rtTA-WT R için kullanın rtTA Mutant R için GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC kullanın; ve ortak rtTA için AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT kullanın. 340 PCR ürünü ölçüleridir bp (mutant), 340 bp ve 650 bp (heterozygote) ve 650 bp (vahşi türü).</li>
	<li>Bir doz-yanıt eğrisi Dox tedavi bir transgene ifade temin gerekli uzunluğu ve zamanı belirlemek için Dox tedavi aşağıdaki RB1 protein üretir. Not: Bu deneyde, Batı leke ve qRT-PCR doku özgü transgene harekete geçirmek ve RB1 ifade değerlendirmek için kullanıldı.</li>
	<li>Floresans in situ hibridizasyon (balık) transgene genomik ekleme onaylamak için gerçekleştirin. Not: Bu merkezde uygulanan genomik için hastane hasta çocuklar için (Toronto, Kanada) gerçekleştirilmiştir. ELISA veya Batı (protein özgü antikor kullanarak) kurutma transgene harekete geçirmek, doku-özgüllük ve endojen POI düzeyde değişiklikler değerlendirmek için kullanılabilir. DN-CB-myc6-Rb1 inşa etmek için biz bir anti-RB1 antikor kullanılır.</li>
</ol>

<ol><li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+MyoD+homodimer+formation+demonstrated+by+a+general+method+of+dominant+negative+mutation+employing+fusion+with+a+lysosomal+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease.</a> Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).</li>
<li>Tarang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+retinoblastoma+%28rb%291-inducible+dominant-negative+%28DN%29+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model.</a> Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).</li>
<li>Kominami, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+selective+role+of+cathepsins+B+and+D+in+the+lysosomal+degradation+of+endogenous+and+exogenous+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins.</a> FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).</li>
<li>Cortellino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+ciliogenesis%2C+embryonic+lethality+and+severe+impairment+of+the+sonic+hedgehog+pathway+caused+by+inactivation+of+the+mouse+complex+A+intraflagellar+transport+gene+Ift122%2FWdr10%2C+partially+overlapping+with+the+DNA+repair+gene+Med1%2FMbd4%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4.</a> Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).</li>
<li>Ferreira, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryonic+lethality+of+H+ferritin+gene+deletion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).</li>
<li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+deficient+for+rb+are+nonviable+and+show+defects+in+neurogenesis+and+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis.</a> Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).</li>
<li>Turlo, K. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20813881">When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss.</a> Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).</li>
<li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15190215">The first knockout mouse model of retinoblastoma.</a> Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletions+of+retinoblastoma+1+%28Rb1%29+and+its+repressing+target+S+phase+kinase-associated+protein+2+%28Skp2%29+are+synthetic+lethal+in+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).</li>
<li>Yamasaki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+E2F-1+reduces+tumorigenesis+and+extends+the+lifespan+of+Rb1%28%2B%2F-%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice.</a> Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).</li>
<li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+a+dominant+negative+retinoblastoma+protein+%28RB%29+inhibiting+satellite+myoblast+differentiation+implies+an+indirect+interaction+between+MyoD+and+RB%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).</li>
<li>Pitkanen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+human+retinoblastoma+gene+product+in+mouse+fibroblasts%3A+Effects+on+cell+proliferation+and+susceptibility+to+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation.</a> Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).</li>
<li>Chano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+abundance+of+RB1CC1+contributes+to+the+non-proliferating+enlarged+cell+phenotype+through+both+RB1+maintenance+and+TSC1+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).</li>
<li>Kole, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+therapeutics%3A+Beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).</li>
<li>Yamamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ons+and+offs+of+inducible+transgenic+technology%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The ons and offs of inducible transgenic technology: A review.</a> Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).</li>
<li>Houdebine, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+animal+models+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenic animal models in biomedical research.</a> Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).</li>
<li>Brehm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoblastoma+protein+recruits+histone+deacetylase+to+repress+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription.</a> Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2F-HDAC+complexes+negatively+regulate+the+tumor+suppressor+gene+ARHI+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer.</a> Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).</li>
<li>Magnaghi-Jaulin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoblastoma+protein+represses+transcription+by+recruiting+a+histone+deacetylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase.</a> Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Geleneksel transgenik stratejileri ile ilgili sınırlamaları aşmak için hangi endojen bir POI koşullu olarak bir DN mutant formu kronolojik zamanmekansal bir şekilde overexpressing tarafından inaktive bir fare modeli oluşturmak çalıştı. Endojen İÇN fonksiyonu ortadan kaldırmak için çeşitli seçenekler önerilen15,16,17olmuştur. Bir önceki genetik strateji1 Dox bağımlı transkripsiyon sistemi basit bir stratej...

Genellikle tam ortadan kaldırılması veya kesme gen, RNA dizileri veya protein (POI) ilgi neden kalıcı süreçleri, çoğu yaklaşımlar gen ve protein ablations amaçlayan güveniyor. Bu yöntem genel amacı endojen, vahşi tipi proteinin işlev kaldırılması için Rekombinant protein mühendisi etmektir. Biz revisited ve geçici ablasyon poi DN inhibisyonu yoluyla izin veren bir alternatif strateji1,2, revamped. Bu yöntem inşaat için her ikisi multimeric ve monomeric peptidler ama multimeric derlemesinde işlev proteinler için uygundur.
Yöntem bir multimeric POI (CB füzyon karmaşık) bir alt birim için lizozomal proteaz CB eritme oluşur. Sonuç CB füzyon karmaşık ile etkileşim ve proteolytically endojen protein sindirimi veya bozulmuş3olmak lysosome için tüm CB-POI karmaşık aktarma. Ayrıca, CB füzyon karmaşık bir birleşim tetrasiklin kontrollü transkripsiyon harekete geçirmek (TetO) sistem indüklenebilir doğası ile geri dönüşümlü moda2transgene indüklenebilir ve kontrollü bir ifade sağlar. Birçok durumda yararlı olsa da genleri veya proteinler içinde vivo tam silinmesine ölümcül4,5,6' neden olabilir. Bu sonuçta, kritik genomik elements7kalıcı kaybına yol açacaktır aynı şekilde, bazı genlerin veya Cre/Lox sistemini kullanarak proteinler doku özgü, koşullu silinmesine basit, olmayabilir. Bu nedenle, gen veya POI bağlı olarak, bu yaklaşımlardan hiçbiri sonraki çalışmaları için uzun bir faydalı model sağlanmasında etkili olacaktır özellikle genler veya protein fonksiyonel çalışmalarda geç Doğum sonrası ve yetişkin mice.
Bu tür yaklaşımlar ile ilgili sorunları aşmak ve sağlamak için ilke kanıt önerilen yöntemin etkinliği üzerine burada koşullu bir DN sürüm Retinoblastom 1 (RB1) protein üreten tarafından sunulan yöntemini sınamanızı sağlamak seçtik. Çeşitli seçenekler endojen RB1 fonksiyonu ortadan kaldırmak için önerilen8,9,10 olmuştur; Ancak, tüm bunların bazı yukarıda açıklanan aynı sınırlamaları karşı karşıya: RB1 silinmesiyle kalıcı germline embryonically öldürücü ve tümör baskılayıcı rolü, kalıcı ile tutarlı RB1 koşullu silme tümörler11çeşitli için yol açar. RB1 bir DN sürümü doğal olarak görünmüyor olsa da, şu anda mevcut stratejileri daha iyi bir alternatiftir endojen RB1 bir geçici kontrollü inactivation için izin ve sonunda geri yüklemek için alternatif bir mekanizmaya onun işlev. Böyle bir yapı için temel üzerinde yirmi yıl önce açıklanan1. Ancak, teknolojik sınırlamalar nedeniyle, denetim transgene harekete geçirmek, yanıt ve doku özgüllük bir mekanizma yoktu. Bu zarafeti doksisiklin (Dox) ile birleştirmek için ilk çalışmadır-bağımlı transkripsiyon sistemi lizozomal proteaz CB ve Rb1 proteinlerin bir mühendislik transgenik inşa ile. Elde edilen CBRb fare modeli için bir geçici olarak düzenlenmiş Dox aracılı RB1 sağlar düzenleme2. Gen işlevini incelemek için böyle bir Proteom tabanlı yaklaşım kullanmanın avantajı bu faaliyet hakkında çok az bilgi ile ilgi herhangi bir gen için kabul edilebilir olduğunu.
Önerilen DN transgene strateji geleneksel yaklaşımlar birçok avantaj sunar. İlk olarak, DN protein inhibisyon sadece kısmi bir ablasyon için böylece bir kalıntı endojen ifade koruyarak protein etkinliği olarak, yol açar. Böyle bir sonuç nereye embriyonik ölümcül, büyük ölçüde sınırlayan bir canlı fare işlevinde gen çalışmaya herhangi bir soruşturma için protein etkinlik tam bir kaldırılması çıktığını durumlarda son derece arzu edilir. İkinci olarak, sadece bir transgene faaliyet verimli ve tersinir denetimi için izin veren bir antibiyotik, huzurunda transgene harekete geçirmek TetO sistemi sağlar. Bu nedenle, antibiyotik yönetim çıkıyordu tarafından transgenik sistem devre dışı bırakılabilir ve normal RB1 ifade geri yerdir. Üçüncü olarak, transgene ifade özgüllük seçim düzenleyici bağlı olarak değişebilir. Her yerde ROSA-CAG organizatörü ilkesi kanıt için seçtik, bir doku özgü organizatörü altında transgene yerleştirerek istenmeyen transgene ifade kısıtlamak ve bu transgene tedavi uygulanması çalışmaları kolaylaştırmak muhtemeldir metodoloji.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Kartal Orta, DMEM</td><td>GIBCO-BRL</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Temel Orta Kartal, MEME&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M8042</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F2442&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Liofektamin ve nbsp;</td><td>DharmaFECT</td><td>T-2010-03</td><td></td></tr><tr><td>Sal I</td><td>Roche</td><td>11745622</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>Roche</td><td>13090730</td><td></td></tr><tr><td>CaspaTag&nbsp;</td><td>Kırlangıç</td><td>APT523</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>CyQuant NF hücre proliferasyon kiti ve nbsp;</td><td>İnvitrojen</td><td>C35007</td><td></td></tr><tr><td>Retinoblastom 1 antikoru</td><td>Abcam</td><td>Ab6075</td><td></td></tr><tr><td>c-Myc antikoru</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M5546</td><td></td></tr><tr><td>b-aktin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67&nbsp;</td><td>Thermofisher scientific</td><td>MA5-14520</td><td></td></tr><tr><td>Phallodin</td><td>Thermofisher scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroplaka okuyucu</td><td>FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epifloresan mikroskobu&nbsp;</td><td>NikonEclipse80i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) fare serisi, Jackson Laboratuvarı'ndan JAX#032011.&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İndüklenebilir ve tersinir baskın-negatif (dn) protein inhibisyon

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Baskın-negatif (DN) protein inhibisyonu protein işlevi işlemek için güçlü bir yöntemdir ve diğer genom tabanlı yaklaşımlar birkaç avantaj sunar. Örneğin, her ne kadar chimeric ve hedefleme stratejileri yaygın olarak kullanıldığını Cre-LoxP , bu stratejileri (Sızıntılı organizatörü etkinlik, mozaik Cre ifade, vb) iç sınırlamaları önemli ölçüde sınırlı onların uygulama. Ayrıca, birçok endojen genlerin tam silme postnatal hayatta gen işlevini incelemek imkansız hale embryonically, ölümcüldür. Bu sorunları ele almak üzere, biz erken bir genetik mühendisliği protokolü için yapılan önemli değişiklikler ve kısa bir (transgenik) sürüm Rb1 gen lizozomal bir proteaz ile kombine procathepsin B (Rb1 bir DN fare modeli oluşturmak için CB), (CBRb). Lizozomal bir proteaz varlığı nedeniyle, tüm CB-RB1 füzyon protein ve onun etkileşen karmaşık proteasome-aracılı bozulması için yönlendirilir. Ayrıca, tetrasiklin uyarıcı (rtTA) elementini transgenik yapısında varlığını indüklenebilir ve tersinir yönetmelik RB1 protein sağlar. CBRb fare modelindeki her yerde ROSA-CAG Organizatör varlığı nerede RB1 ifade edilir geçici ve tersinir Rb1 gen ablasyon taşımak ve araştırmacılar faaliyete hemen hemen herhangi bir hücreye anlamak için bir kaynak sağlamak için yararlı bir araç yapar.

Genellikle, bir DN mutasyon tasarlama yapısı hakkında bilgi önemli miktarda ve işlev poi gerektirir. Buna ek olarak, yapısal ve fonksiyonel bilgi POI için sınırlı olduğunda burada sunulan DN strateji özellikle yararlıdır. POI bir multimeric protein ise, lizozomal bir proteaz için bir alt birim bir füzyonu baskın monte multimer ve büyük olasılıkla, diğer ligandlar proteolizis endojen alt birimleri ve hücre altı saptırma bir birleşimi yoluyla engellediğini multimer lysosome için. Başarılı k...

Burada içinde protein var koşullu olarak ters bir baskın negatif mutant yorum overexpressing tarafından inaktive bir baskın negatif indüklenebilir sistemi geliştirmek için bir iletişim kuralı mevcut.

İndüklenebilir ve tersinir baskın-negatif (DN) Protein inhibisyon

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Bu yöntem, bir ilgi geninin koşullu ve geçici olarak inaktivasyonunu gerektiren çok çeşitli alanlardaki anahtar sorularının yanıtlanmasına yardımcı olarak, bunun baskın negatif bir sürümünü tersine çevirerek yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı protein aktivitesinde sadece kısmi ablasyon sağlar, böylece, bir kalıntı endojen ifade koruyarak. Burada multimerik bir montajda işlev gören RB proteininin inaktivasyonunu tanımlasak da, bu metodoloji monomerik proteinlere de uygulanabilir.Umesh Pyakurel, bizim laboratuvar teknikeri ve el yazması bir coauthor prosedürleri gösterecektir. Başlamak için,% 10 fetal sığır serumiçeren önerilen hücre kültürü ortamı kullanarak, 5% 5 CO2 ile 37 santigrat derece, satıcının özelliklerine göre NIH3T3 hücreleri büyümek. PTet-Splice ve pCMV-Tet3G vektörlerini kullanarak hücreleri cotransfect için, ilk iyi başına lipid bazlı transfeksiyon reagent iki ila dört mikrolitre karıştırın, ve bir mililitre eksik DMEM iyi başına 15 mililitrelik bir tüp, ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçka.Bu transfeksiyon reaktifinin DMEM karışımına her kuyuda 2-3 mikrogram plazma DNA'sı ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika karıştırın ve kuluçkaya yatırın. NIH3T3 hücreleri ile altı iyi plaka her kuyuya DNA ve DMEM transfeksiyon reaktifiçeren karışımın bir mililitre ekleyin.%5 CO2 ile 37 santigrat derecede 3-4 saatlik kuluçkadan sonra, bir mililitre tam orta madde ekleyin. Sonra, her iyi doksisiklin stok 2 mikrolitre ekleyin ve artı-doksisiklin olarak plaka işaretleyin. Hücreleri %5 CO2 ile 37 derecede kuluçkaya yatırın.TetO-DN-CB-myc6-Rb1 yapısının işlevselliğini değerlendirmek için planlanmamış hücre çoğalmasını teşvik etmek için, DMEM'de %10 FBS içeren hei-OC1 hücrelerinin kültürü, izin verilen koşullar altında. Hücre çoğalması çalışmaları için, bir hücre sayacı kullanarak HEI-OC1 hücreleri saymak. Plaka 10, 000 HEI-OC1 hücreleri her biri hacmi 200 mikrolitre 96-iyi plaka üzerinde iyi başına.Hücreleri gece boyunca %5 CO2 ile 33 derecede kuluçkaya yatırın. Transgen ekspresyonunu indüklemek için, transfected HEI-OC1 hücrelerinin bir alt kümesine doksisiklin mililitre başına bir mikrogram ekleyin. Eksi-doksisiklin olarak etiketlenmiş diğer alt kümeyi ve transfected olmayan HEI-OC1 hücrelerini kontrol olarak kullanın ve hücreleri %10 CO2 ile 33 santigrat derece olarak kuluçkaya yatırın.Hücre çoğalmasını değerlendirmek için, transfeksiyondan 48 saat sonra, hücre kültürü ortamını çıkarın ve bir hücre çoğalma kitinden 100 mikrolitre boya bağlayıcı çözeltiyi mikro plakanın her kuyuya ekleyin. Üreticinin protokolünü uygulayın ve 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yat. Her numunenin floresan yoğunluğunu ölçmek için floresan mikroplaka okuyucukullanın.İmmünositokimya kullanarak hücre çoğalmasını daha fazla değerlendirmek için, HeI-OC1 hücrelerini DMEM'deki 12 kuyuluk plakanın her kuyunun her kuyununa yerleştirilen bir kapak camı üzerine yerleştirin. Hücreleri bir gecede 33 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, pTet-Splice ve pCMV-Tet3G vektörleri ile iki kuyuda hücrelere cotransfect, ve sonra bir de doksisiklin tedavisi gerçekleştirmek ve NIH3T3 hücreleri ile yapılır.Bir untransfected iyi bir kontrol kullanın. Ki-67 etiketleme için hücreleri işlemek için, oda sıcaklığında 10 dakika pbs% 4 paraformaldehit ile düzeltin. Bundan sonra, beş er dakika buz gibi PBS ile üç kez yıkayın.PBS'ye %0.25 noniyonik deterjan ekleyin ve 10 dakika kuluçkaya yatırın. PBS'de üç kez beşer dakika yıkayın. Hücreleri engellemek için %10 serum kullanın.Oda sıcaklığında bir saat nemlendirilmiş bir odada. Ki-67 birincil antikor 500 mikrolitre ekleyin ve dört santigrat derece gecede kuluçka. Hücreleri pbs'de üçer kez beşer dakika yıkayın.İkincil antikor bir mililitre ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında bir saat boyunca hücreleri kuluçkaya yatırın. Sekonder antikor solüsyonu çıkardıktan sonra, karanlıkta PBS beş dakika boyunca hücreleri tekrar üç kez yıkayın. HEI-OC1 hücrelerini phalloidin ile etiketlemek için, 1:200 phalloidin ile oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.Hücre çekirdeklerini etiketlemek için, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca dapi mililitre başına beş mikrogram ile hücreleri kuluçkaya yatırın. Transjen farelerin tesliminden sonra, el yazmasında açıklandığı gibi CBRb1 füzyon bölgesine özgü bir astar seti kullanarak yavruları genotip. Rosa-CAG-rtTA ve tetresikin indükleyici hattına yetişkin TetO-DN-CB-myc6-Rb1 fareleri üretin ve makalede açıklandığı gibi yavrularını genotipleyin.NIH3T3 endojen RB1 proteinini ifade etmez, bu nedenle burada görülen sağlam RB1 ekspresyonu Dox varlığında transjen indüksiyonundan kaynaklanır, ancak yokluğunda, TetO-DN-CB-myc6-Rb1 karışımı RB1 yapısının etkin aktivasyonunu onaylar. Buna karşılık, HEK293 hücreleri endojen RB1 ifadesine sahiptir. Doksisiklin eklenmesi TetO-DN-CB-myc6-Rb1 aktivasyonu ve RB1 aşağı regülasyon yol açtı.Doksisiklin medyadan çıkarıldıktan 21 saat sonra RB1 ekspresyonuna devam edildi. Hei-OC1 hücreleri aynı vektörler ile cotransfected, hücre sayısında mütevazı ama önemli bir artış doksisiklin ile tedavi edilmeyen transfected hücrelere göre doksisiklin tedavisi takip gösterdi, ve transfekssiz hücreler. Floresan in situ hibridizasyon farelerde TetO-DN-CB-myc6-RB1 transgeninin genomik yerleştirisini doğruladı.Kontrol grubuna göre üç gün boyunca doksisiklin ile tedavi edilen transgenik farelerin kokleasında toplam RB1 protein ekspresyonunda ilk artış saptandı. Ancak yedi ve 10 gün boyunca doksorusin ile tedavi edilen gruplarda RB1 ekspresyonunda anlamlı bir azalma gözlendi. Analiz edilen dokune bakılmaksızın, doksosikline ile tedavi edilen transgenik farelerde RB1 proteininde önemli bir azalma gözlendi, ancak kontrol grubunda değil, TetO-DN-CB-myc6-RB1 yapısının verimliliğini doğruladı.Bu yordamı denerken, transgenin kodlama öğelerinin her birinin birbiriyle aynı çerçevede olduğunu doğrulamak önemlidir. Bu raporda tanımlanan Cathepsin B ve retinoblastomun kodlama bölgeleri tesadüfen çerçeveden bağlı olsaydı, istenilen füzyon proteinini vermezdi. Bu nedenle transgeni tek hücreli fare embriyolarına enjekte etmeden önce DNA dizisi doğrulaması yapılmalıdır.Bu prosedürü takiben, her yerde CAG organizatörü bir hücrenin özel bir şekilde gen fonksiyonu çalışma için belirli organizatörler ile değiştirilebilir.

inducible-and-reversible-dominant-negative-dn-protein-inhibition

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Indüklenebilir ve ilgilenilen genin reversibl cDNA aşırı veya shRNA aracılı knock-down ile insan hücre hatları oluşturmak için bir hızlı ve kolay yolu. Bu yöntem geçici transfeksiyon yöntemleri veya konvansiyonel knockdown / nakavtla stratejileri değiştirmek zordur güvenilir ve son derece tekrarlanabilir işlemek hücre hatları için araştırmacılar sağlar.

Tetrasiklin-indüklenebilir (Tet-on) shRNA veya cDNA Expression Durağan İnsan Hücre Üretimi

Burada açıklanan yöntem, bir anti-apoptotik bakteriyel efektör proteinin aktivitesini incelemek için tanımlanmış adımlarda apoptotik sinyal kaskadını indüklemek için kullanılır. Bu yöntem aynı zamanda pro-apoptotik veya toksik proteinlerin indüklenebilir ekspresyonu için veya diğer sinyal yollarıyla etkileşimi incelemek için de kullanılabilir.

Bir uyarılabilir İfade Sistemi uygulamak Hücre içi Sinyali ile Bakteriyel Virulans Faktörler Girişim Eğitim için

Burada, Escherichia coli'deki replikasyon çatallarını durdurmak ve çökertmek için bölgeye özgü, geri dönüşümlü in vivo protein bloğu kullanan bir sistemi tarif ediyoruz. Replikasyon bloğunun kurulması floresan mikroskobu ile değerlendirilir ve replikasyon ara ürünlerini görselleştirmek için nötr-nötr 2 boyutlu agaroz jel elektroforezi kullanılır.

Bir Siteye Özel çoğaltma Blokaj içinde uyaran<i&gt; E. E. coli</i&gt; Bir Floresan Baskılayıcı Operatör Sisteminin Kullanılması

Bu iletişim kuralı olarak bir düzeni kanser hücre satırları ve sonraki kullanımı, işlevsel bir Tet-ON sistemi kurmak için özellikle monosit/makrofajlar tümör microenvironment için işe alım içinde tümör hücre kaynaklı proteinlerin rolü eğitimi için hizmet vermektedir.

Monosit/makrofajlar tümör Microenvironment için işe alım çalışmaya kanser hücre hatlarında gen ifadesinin koşullu nakavt

Bu iletişim kuralı canlı hayvan veya gelişmiş lac önleyici ve/veya tet harekete geçirmek sistemleri kullanarak hücreleri içinde ilgi endojen bir gen transkripsiyonu koşullu olarak kontrol edilebilir bir modeli sistemi oluşturmak için gereken adımları açıklar.

Uzaktan kumandalı sistem in vivo uygulama için işleme endojen gen ekspresyonu

DNA epigenome temsil düzenleme güçlü bir tedavi yaklaşımı hedef. Bu iletişim kuralı üretim, arıtma ve toplama tüm-içinde-bir lentiviral vektörlerin İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC)'epigenome düzenleme uygulamaları için CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene yataklık açıklar-nöronlar türetilmiş.

Pluripotent kök hücre kaynaklı hastalık modelleri lentiviral vektör platformu için Epigenome düzenleme araçları verimli bir şekilde teslim insan içine indüklenen

Burada, shield-1 adlı küçük molekül altında düzenli olarak kümelenmiş kısa palindromik tekrar- (CRISPR-) ilişkili protein 9'un (Cas9) zamansal ve koşullu stabilizasyonuna dayanan bir genom düzenleme aracı tarif ediyoruz. Yöntem kültürlü hücreler ve hayvan modelleri için kullanılabilir.

Koşullu Cas9 Stabilizasyonunu Kullanarak Gen fonksiyonlarını değerlendirmek için Yeni Bir Araç Seti

ATP'ye bağımlı kromatin remodeler'in DNA ligand ile etkileşimi CD spektroskopisi kullanılarak açıklanmaktadır. Üretilen zirveler tarafından analiz edilen bir gen promotöründeki indüklenen konformasyon değişiklikleri transkripsiyonal regülasyon mekanizmasını anlamak için kullanılabilir.

DNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için CD Spektroskopisi

Burada, yüksek, uzun vadeli, kararlı, hedefe yönelik susturma verimliliğine ve düşük genom çapında, hedef dışı aktiviteye sahip tasarlanmış transkripsiyonel baskılayıcıların (ETR'ler) in vitro seçimi için bir protokol sunuyoruz. Bu iş akışı, aday ETR'lerin başlangıçtaki karmaşık repertuarını, terapötik olarak ilgili ortamlarda daha fazla değerlendirme için uygun olan kısa bir listeye indirgemeye olanak tanır.

In Vitro Hedeflenen Epigenetik Susturma için Tasarlanmış Transkripsiyonel Baskılayıcıların Seçimi

Bu çalışma, pMGX plazmid sistemini kullanarak Escherichia coli'de tek bir plasmidden çoklu genlerin T7 aracılı co-ekspresyonu için yöntemleri açıklamaktadır.

İndüklenebilir T7 RNA Polimeraz aracılı Çok Boylu İfade Sistemi, pMGX

Öğrenin, baskın-negatif mutantların tersinir aşırı ekspresyonuyla proteinlerin koşullu ve geçici inaktivasyonunu sağlayan bu yöntemi. NIH3T3 hücreleri kullanılarak geliştirilen bu sistem, protein fonksiyonlarını koruyarak kısmi aktivite azalmasına olanak tanır.

İndüklenebilir ve tersinir baskın-negatif (DN) Protein inhibisyon

Daha fazla video keşfet