Name: Lineage yetişkin fare Fibroblast Erythroid ataları için yeniden programlama doğrudan (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Öğrenin fare yetişkin fibroblastlarını doğrudan soy hattı yeniden programlama ile eritroid öncü hücrelere dönüştürme yöntemini. Bu teknik, transkripsiyonel düzenlemeyi incelemek ve in vitro kırmızı kan hücresi üretimi için yeni olanaklar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Evelyn Wang ve Gregory Hyde (Whitehead Enstitüsü, Cambridge, MA) klonlama ve Harvey Lodish (Whitehead Enstitüsü) için birçok retroviral kütüphane oluşturmak için kullanılan plazmid verdiğiniz için teşekkür ederiz. Biz berkay Siva ve Sofie Singbrant (Moleküler Tıp bölümü ve gen terapisi, Lund Üniversitesi), Göran Karlsson ve Shamit Soneji (moleküler Hematoloji Bölümü, Lund Üniversitesi) Açıklama IEP üretim rolleri için teşekkür ederim. Ayrıca kabul ve teşekkür Julian Pulecio (rejeneratif tıp merkezi, Barcelona Biyomedikal Araştırma Parkı), Violeta Rayonu-Estrada (The Rockefeller Üniversitesi, New York), Carl Walkley istiyorum (St. Vincent'ın Enstitüsü tıbbi araştırma ve Bölümü tıp, St Vincent'ın hastane, Melbourne Üniversitesi), Ángel Raya (Katalan kurumun araştırma ve ileri araştırmalar, Barcelona) ve Vijay G. Sankaran (Broad Enstitüsü Massachusetts Institute of Technology ve Harvard, Cambridge ) Bu çalışmaya önceki katkılarından dolayı. Bu eser (için JF); Ragnar Söderberg Vakfı tarafından desteklenmiştir İsveç Araştırma Konseyi (için JF); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (için JF); İsveçli Vakfın Stratejik Araştırma (için JF); Åke Wiberg'ın kuruluşuna (J.F.); Marie Curie tümleştirme grant (için JF).

1. kuruluş ve bakım birincil fare kuyruk Fibroblast kültürler İpucu
<ol><li>% 0.1 jelatin ile yüzeyini örten ve bulaşıkları yaklaşık 20 dk 37 ° C'de için kuluçka (10 cm çanak bir kuyruk için tavsiye) jelatin kaplı yemekleri hazırlamak Çanak jelatin çözümden Aspire edin ve en az 2 h için kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Fareler tarafından servikal çıkığı ötenazi. Kuyruk kuyruk tabanında kesme makasla kaldırın. Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DPBS) kuyrukta % 2 fetal Sığır serum ile (FBS) kullanıma hazır kadar koymak. Not: en iyi sonuç için kuyrukları yaklaşık 6-8 hafta-in yaş fareler alınmalıdır. Kuyrukları fareler 8 hafta-in yaş, ancak, büyük fareler yaş, fibroblast proliferasyonu kapasitesini ve azalma11yeniden programlama verimliliğini olarak alınabilir.</li>
	<li>Doku kültürü başlıklı steril koşullarda bu protokolün tüm sonraki adımları uygulayın. %0,02 tripsin-EDTA DPBS içinde seyreltilmiş tripsin çözeltisi hazırlamak ve 5 mL kaplamasız 10 cm çanak içine ekleyin.</li>
	<li>Kuyruk, % 70 etanol ilk, sonra DPBS yıkayın. Bir tabak içinde kuyruk düz ve forseps yerde tutmak için kullanın. Bir kesik ucuna tabanından boyuna ekseni boyunca kuyruk üzerinde olun.</li>
	<li>Kuyruk forseps bir çift ile kavramak ve dikey olarak tutun. Forseps ikinci bir çifti kullanarak, cilt üssünde kesik kuyruk yanında kavrama ve geri soyma. Belgili tanımlık kesme her iki tarafında, cildi aşağı kuyruk ucuna doğru çekerek soyulmuş kadar bunu.</li>
	<li>Soyulmuş kuyruk forseps ile tripsin solüsyon içeren çanak üzerinde tutun ve kuyruk yaklaşık 1 cm uzun parçalar halinde kesin. Tripsin çözümde kuyruk taşlarla parçaları daha küçük parçalar halinde parçalara ayırması makas kullanın. Kuyruk parçalar için 10 dk. 37 ° C'de tripsin çözümde kuluçkaya. Not: Küçük parçalar böylece her parça için hacim oranı yüksek bir yüzey alanı sağlamak için tercih edilmektedir.</li>
	<li>Fibroblast genişleme (FEX) Orta 2 birimleri kullanma tripsin gidermek (yüksek glikoz Dulbecco modifiye kartal Orta (DMEM) % 15 ile FBS, 2 mM L-glutamin, Sigara-esansiyel amino asitler (NEAA) ve 100 U/mL penisilin/streptomisin).</li>
	<li>50 mL tüp ve 4 ° C'de 5 min için 350 × g , santrifüj çanak tüm içeriğini toplamak Süpernatant Aspire edin ve kuyruk parçaları 10 mL taze FEX orta resuspend.</li>
	<li>Jelatin kaplı yemek için kuyruk parçaları orta aktarmak ve % 5 CO2 ve %4 O2taze FEX Orta 2 günde ekleme, 37 ° C'de kuluçkaya. Not: 5-7 gün sonra çanak alt kısmında kuyruk parçaları eklediyseniz ve onlardan uzak hareket fibroblastlar görülebilir.</li>
	<li>Fibroblastlar kümeleri fark sonra yavaşça kuyruk parçaları çıkarmak ve orta ve plaka bağlı fibroblastlar bırakarak tüm kemik parçaları Aspire çanağı sallamak. Yeni FEX orta ekleyin ve fibroblastlar birleşmesi kadar kültür.</li>
	<li>Fibroblastlar hematopoetik ataları tarafından hiçbir kirlenme emin olmak için 5 dakika için 1 x tripsin-EDTA kullanarak plaka hücrelerden ayırmak ve hücreleri toplamak. Hematopoetik işaretleri ifade hücreler için tüketmek (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G/C), 7-4 ve Ter-119) kullanarak bir manyetik ayırma sistemi10.</li>
</ol>2. retrovirüsü üretim
<ol><li>Tohum retroviral ambalaj hücreleri yaklaşık 2.5 × 104 hücreleri/cm2 (2.0 × 106 hücre 10 cm yemek için) bir çanak (tarafından elektrik-gaz plazma) doku kültürü tedavi ve geceleme yüksek glikoz DMEM % 10 ile kültür FBS, 10 mM sodyum Pyruvate ve 100 U/mL penisilin/streptomisin 37 ° C ve % 5 CO2.</li>
	<li>Ertesi sabah, orta yarım birimi gecede kültür için kullanılan (10 cm yemek için 5 mL) kullanan hiçbir katkı maddesi ile DMEM için değiştirin. Öğleden sonra kontrol edin hücreleri % 70-80 birleşmesi ve transfection başlar.</li>
	<li>Programlama her faktör için Gata1, Tal1, Lmo2ve c-Myc, ifade vektör (pMX) ve Yardımcısı vektör (gag ve pol genleri içeren) 2:1 karışımı hazırlayın. Fibroblastlar 10 cm fincan için 6 µg ifade vektör ve yardımcı vektör DMEM ortamda 100 µL son bir hacim içinde 3 µg kullanın.</li>
	<li>Programlama her faktör için steril bir polistren tüp içinde oda sıcaklığında (RT) DMEM 300 µL hazırlamak ve ticari transfection reaktif 27 µL dikkatle ekleyin. Not: Transfection reaktif RT için kullanmadan önce getirilmelidir ve bahçedeki elektrostatik özellikleri bu tüp Plastik duvara sopa yapabilir gibi doğrudan orta eklenmesi gerekir.</li>
	<li>Plazmid karışımı transfection reaktif içeren Tüp, kısaca girdap içine ekleyin ve transfection reaktif-DNA karışımı 15 dakika RT. kısaca girdap karışımı, kuluçkaya ve dropwise retroviral ambalaj hücrelere ekleyin böylece transfection reaktif-DNA karışımı kültür üzerinde eşit olarak yayılmış ve 37 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
	<li>24 h transfection sonra DMEM için % 20 ile orta değiştirmek FBS ve 100 U/mL penisilin/streptomisin. 48 h transfection sonra süpernatant toplamak ve 0,22 µm gözenek boyutu şırınga filtre ile filtre. Not: Viral supernatants-80 ° C-dondurulmuş ve iletim taze viral süpernatant kullanılırsa daha verimli olmasına rağmen gerekli kadar tutulur.</li>
</ol>3. GTLM iletim ve IEP hasat
<ol><li>Kuyruk ön kaplamalı jelatin %0,1 1 × 104 hücreleri/cm2 fibroblastlar ipucu tohum FEX ortamda yemekleri ve 24 saat için 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Ertesi gün, aşağıdaki gibi bir iletim karışımı hazırlayın.<ol>
<li>1 4 µg/mL ile retroviral enfeksiyon reaktif (% 40) desteklenen programlama her faktör için viral süpernatant hacmi FEX Orta (%60) 6 cilt için ekleyin.</li>
		<li>Fibroblastlar 10 cm fincan için 1 mL her viral süpernatant ekleyin (4 × virüs 4 mL =) 10 mL iletim karışımı toplam verilmesi 4 µg/mL retroviral enfeksiyon reaktif FEX orta, 6 ml ile desteklenmiştir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fibroblast kültür ortamından FEX Aspire edin ve iletim karışımı ile değiştirin. İletim (%5 CO2 ve %4 O2) hipoksik koşullarda 37 ° C'de 4 h için kuluçkaya.</li>
	<li>İletim karışımı Aspire edin ve eski yerine koymak o ile taze programlama Orta (Serum-Alerjik genişleme Orta (SFEM), U/mLPenicillin/streptomisin 100, 100 ng/mL fare kök hücre faktör (mSCF), 10 ng/mL fare interlökin-3 (IL3), 2 U/mL insan rekombinant Eritropoietin (hrEPO) ve 100 nM deksametazon).</li>
	<li>8 günlüğüneonda taze programlama Orta 2 günde ekleme hipoksik koşullarda 37 ° C için kuluçkaya. Beş-sekiz gün sonra başarılı yeniden programlama plaka ayırdıktan hücre kümeleri ortaya çıkarır.</li>
	<li>Analiz için programlanmış hücreleri toplamak için yavaşça yukarı ve aşağı onları yemek doğrudan hasat için pipet. Karşılaştırma için untransduced fibroblastlar hasat için 1 x tripsin-EDTA kullanarak plaka hücrelerden ayırmak ve toplamak.</li>
</ol>

<ol><li>Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+We+Really+Vastly+Outnumbered%3F+Revisiting+the+Ratio+of+Bacterial+to+Host+Cells+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans.</a> Cell. 164 (3), 337-340 (2016).</li>
<li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing%2C+tripotent+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).</li>
<li>Szabo, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21057492">Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors.</a> Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).</li>
<li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).</li>
<li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).</li>
<li>Yu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+fibroblasts+into+bipotential+hepatic+stem+cells+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).</li>
<li>Hendry, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+transcriptional+reprogramming+of+adult+cells+to+embryonic+nephron+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).</li>
<li>Vierbuchen, T., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+conversions%3A+unnatural+but+useful%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Direct lineage conversions: unnatural but useful.</a> Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).</li>
<li>Capellera-Garcia, S., Flygare, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+reprogramming%3A+a+useful+addition+to+the+blood+cell+research+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox.</a> Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).</li>
<li>Capellera-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+Minimal+Factors+Required+for+Erythropoiesis+through+Direct+Lineage+Conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion.</a> Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).</li>
<li>Mahmoudi, S., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+reprogramming%3A+a+two-way+street%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Aging and reprogramming: a two-way street.</a> Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).</li>
<li>Singbrant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+couples+erythropoiesis%2C+B-lymphopoiesis%2C+and+bone+homeostasis+within+the+bone+marrow+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment.</a> Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).</li>
<li>Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+visualization+and+conditional+mutations+in+the+erythroid+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage.</a> Blood. 104 (3), 659-666 (2004).</li>
<li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li>
<li>Psaila, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+profiling+of+human+megakaryocyte-erythroid+progenitors+identifies+distinct+megakaryocyte+and+erythroid+differentiation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways.</a> Genome Biology. 17 (1), 83(2016).</li>
<li>Pulecio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Conversion+of+Fibroblasts+to+Megakaryocyte+Progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors.</a> Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).</li>
<li>Kurita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+immortalized+human+erythroid+progenitor+cell+lines+able+to+produce+enucleated+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells.</a> PLoS One. 8 (3), 59890(2013).</li>
</ol>

Yazarlar raporlanacak hiçbir çıkar çatışması var.

Dört faktör kokteyl, overexpression, GATA1, TAL1, LMO2 ve c-MYC (GTLM), fare ve insan fibroblast iEPs10için doğrudan yeniden programlamak için yeterli. Programlanmış erythroid hücreleri bona fide erythroid ataları morfoloji, fenotip, gen ekspresyonu ve koloni kurma yeteneği açısından büyük ölçüde andıran. Bu bulgu gelişimsel faktörler hematopoiesis içinde tanımlamak için bir araç olara...

Kırmızı kan hücreleri (RBCs) tüm omurgalıların gereklidir ve tüm hücreleri insan organları%184'yapmak. Yetişkin yaşam için gelen embriyonik, sağlığımız çok RBC homeostazı tam regülasyonu bağlıdır. Olgun RBCs geliştirme yetişkinlik boyunca devam eden üretim arttığından bilinir. RBC geliştirme ve ilkel ve kesin arttığından arasında geçiş alacak ana düzenleyiciler tanımlamak için arttığından araştırma büyük bir sorun olduğunu. Doğrudan soy erythroid ataları yeniden şekillendirmek için daha erythroid geliştirme içinde vivoanlamak için bir fırsat sunuyor.
Doğrudan soy da transdifferentiation bilinen (DLR), yeniden programlama pluripotent ve multipotent progenitör aşamaları atlayarak bir hücre tipi doğrudan içine başka yeniden programlama işlemidir. DLR, sinirsel2, hematopoetik3,4,5, hepatik6 ve nefrotik7, progenitör hücre de dahil olmak üzere çok sayıda hücre tipleri üretmek için şu ana kadar kullanılmıştır. Gelişimsel biyologlar için DLR lineage bağlılık ve terminal farklılaşma işlemler8,9sorgulama yönleri için önemli bir araç haline gelmiştir. DLR tamamlayan ve kısmen in vivo çalışmalar anlayış mekanizmaları hücre kader geliştirme sırasında faktörlerin belirlenmesi için değiştirin. Bu raporda açıklanan erythroid ataları yeniden programlama için DLR protokol alanı arttığından gelişim çalışmaları için ücretsiz bir yöntem sağlar.
Daha önce dört faktör kokteyl, overexpression, GATA1, TAL1, LMO2 ve c-MYC (GTLM), fare ve insan fibroblast doğrudan bağlı erythroid ataları için yeniden programlamak için yeterli olduğunu göstermiştir (iEPs) 10. erythroid GTLM yeniden programlanan hücreler büyük ölçüde bona fide ilkel erythroid ataları morfoloji, fenotip ve gen ifade10açısından benzer. Böylece iEPs nükleer silahların yayılmasına karşı kapasitesi sınırlı ve çekirdekli eritrositler geçici kesin arttığından başlangıcından önce erken embriyo üretilen benzer olgun. (Örneğin, nokta faktörler veya diğer faktörlerin yanı sıra yeniden programlama içinde mutasyonlar) programlama koşullarında değişiklikler yaparak, biri nasıl bu erythroid geliştirme ve farklılaşma değişikliklere neden anlayabiliyorum. Biz örneğin Klf1 veya Myb eklenmesi için GTLM kokteyl globin ifade deseninin ağırlıklı olarak embriyonik (ilkel) değişiklikleri için esas olarak yetişkin göstermiştir (kesin). Bu bulgu DLR arttığından gelişimsel faktörleri tanımlamak için bir araç olarak kullanarak geçerlilik doğruluyor.
Burada, iEPs fare kuyruk ucu fibroblastlar (TTF) oluşturma işlemine anahat. Temsilcisi sonuçlarımızda fibroblastlar üzerinden erythroid soy izleme fareler üzerinde yeniden programlama yapılır (Epor- Cre R26- eYFP) Rosa26 odağı tüm gelen sarı floresan protein (eYFP) ifade bu hücreleri erythroid soy bağlılık kolay görselleştirme sağlayan eritropoetin reseptör ifade ettiler. Bu yöntemi kullanarak, YFP pozitif (EpoR +) hücrelerinin beş gün sonra iletim gibi erken mevcut. Bu iletişim kuralı, bu nedenle, erythroid ataları vitroüretimi için hızlı ve sağlam bir teknik sunar.

<table><tbody><tr><td>Sodyum piruvat içermeyen DMEM</td><td>GE Yaşam Bilimleri</td><td>SH30022.01</td><td>PhGP hücreleri için kültür ortamı</td></tr><tr><td>Sodyum piruvat ile DMEM</td><td>GE Yaşam Bilimleri</td><td>SH30243.01</td><td>Kuyruk ucu fibroblastlar için kültür ortamı</td></tr><tr><td>StemSpan Serum Serbest Genleşme Ortamı (SFEM)</td> <td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>9650</td><td>Ortamın yeniden programlanması&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu HyClone</td><td>GE Yaşam Bilimleri</td><td>SH30071.03HI</td><td>Büyüme faktörü</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin HyClone (100x)</td> <td>Ge Yaşam Bilimleri</td><td>SV30010</td><td>Antibiyotik</td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asitler (100x)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td>SNL ortamı bu</td></tr><tr><td>Tripsin HyClone (1x)</td> <td>GE Yaşam Bilimleri</td><td>SH30042.01</td><td>Hücre ayrışma ajanı</td> ile sağlanır</tr><tr><td>Murin Kök Hücre Faktörü (mSCF)</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>Yeniden programlama ortamına eklendi</td></tr><tr><td>Rekombinant Murine Il-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td>Yeniden programlama ortamına eklendi</td></tr><tr><td>insan rekombinant eritropoietin (hrEPO)</td><td>Peprotech</td><td>100-64</td><td>Yeniden programlama ortamına eklendi</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>50-02-2&nbsp; &nbsp;</td><td>Medyayı yeniden programlamaya eklendi</td></tr><tr><td>Domuz derisinden elde edilen jelatin</td><td>Sigma</td><td>9000-70-8&nbsp;</td><td>dH2O'da ayrıştırılır ve plakaları kaplamak için kullanılır. Kullanmadan önce steriliteyi sağlayın.</td></tr><tr><td>Blasticidin S hidroklorür</td><td>Sigma</td><td>3/9/3513</td><td>Seçim antibiyotiği. Hem pro- hem de ökaryotik hücreleri etkiler</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS)</td><td>Ge Yaşam Bilimleri</td><td>SH30850.03</td><td>Yıkama aşamaları için kullanılır</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Merck</td><td>TR-1003-G</td><td>Enfeksiyon / Transfeksiyon&nbsp; Reaktif</td></tr><tr><td>FuGENE HD Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>PhGP hücre hattı için Transfeksiyon Reaktifi</td></tr><tr><td>Millex-GP Şırınga Filtre Ünitesi 0.22 ve mikro; m</td><td>Merck</td><td>SLGP033RS</td><td>Virüs süpernatantını filtrelemek için kullanılır</td></tr><tr><td>BD Zümrüt Hipodermik Şırınga</td><td>Becton Dickinson</td><td>SKU: 307736</td><td>Virüs süpernatantını filtrelemek için kullanılır</td></tr><tr><td>100 mm Kültür Kabı</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>Falcon</td><td>10799541</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>Kuyumcu Forseps #5</td><td>Sklar</td><td>66-7642</td><td>İçin kullanılır Küçük kuyruk parçalarının taşınması</td></tr><tr><td>Sklarlite İris Makas</td><td>Sklar</td><td>23-1149</td><td>Kuyruğu küçük parçalara ayırmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Soy Hücresi Tükenme Kiti, fare</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>Fibroblast kültürlerinde hematopoetik hücrelerin tükenmesi için</td></tr><tr><td>CD117 Mikro Boncuklar, fare</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-224</td><td>Fibroblast kültürlerinde</td></tr> <tr><td>hematopoetik hücrelerin tükenmesi içinPheonixGP hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-3215</td><td>retroviral paketleme hücre hattı</td></tr><tr><td>EcoPAC vektörü (pCL-Eco)&nbsp;</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-29540</td><td>gag ve pol genleri içeren retroviral yardımcı vektör</td></tr><tr><td>pMX-Gata1</td><td>Laboratuvarda</td><td></td><td></td>klonlanmış</tr><tr><td>pMX-Tal1</td><td>Laboratuvarda</td><td></td><td></td>klonlanmış</tr><tr><td>pMX-Lmo2</td><td>Laboratuvarda</td><td></td><td></td>klonlanmış</tr><tr><td>pMX-cMyc</td><td>Laboratuvarda</td><td></td><td></td>klonlanmış</tr><tr><td>CellSens Standard 1.6 yazılımı&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Sitospin analiz yazılımı</td></tr></tbody></table>

lineage yetişkin fare fibroblast erythroid ataları için yeniden programlama doğrudan

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid hücre bağlılık ve farklılaşma etkinleştirmesi belirleme ve faktörler olgunlaşması hücre kaderi bir grup tarafından düzenledi lineage tarafından kısıtlanmış transkripsiyon ağ üzerinden devam etmek. Biz daha önce faktörler doğrudan lineage fibroblastlar indüklenen erythroid ataları/öncüleri (iEPs) yeniden programlama kullanarak kırmızı kan hücresi geliştirme talimat için gerekli en az sayıda tanımlamak için yola çıktı. Biz bu overexpression Gata1, Tal1, Lmo2ve c-Myc (GTLM) hızlı bir şekilde dönüştürmek fare ve insan fibroblast doğrudan bona fide erythroid hücre morfolojisi, açısından benzer iEPs için olabilir gösterdi fenotip, ve gen ekspresyonu. Biz iEPs arttığından ve hücre kader düzenleme eğitim için paha biçilmez bir araç sağlamak niyetindeyim. Burada fare kuyruk ucu fibroblastlar (DLR) yeniden programlama iEPs üzerinden transkripsiyon faktörü uygulamalı doğrudan lineage dönüştürme kademeli işlemi açıklanmaktadır. Bu örnekte, biz fibroblastlar gelen sarı floresan protein (YFP) erythroid hücre görselleştirme sağlayan eritropoetin reseptör gen (EpoR) düzenleyici kontrolü altında hızlı erythroid soy izleme fareler içinde yeniden programlama yapmak yeniden programlama üzerine kader indüksiyon. Bu iletişim kuralı fibroblastlar beş-sekiz gün içinde iEPs programlanabilir.
Gelişmeler hala süreci için yapılabilir iken, biz GTLM-aracılı yeniden programlama hızlı ve doğrudan bir süreç, bona fide özelliklerini içeren hücreleri erythroid yaratıcı ve öncü hücreleri verimli gösteriyor ki.

Burada iEPs gelen yetişkin fibroblastlar transkripsiyon faktörü odaklı DLR kullanarak üretim için tekrarlanabilir bir protokol mevcut. Akış Sitometresi, koloni oluşturan deneyleri ve gen kullanarak hücre yeniden programlama değerlendirmek ifade analizi. Görselleştirme erythroid hücre kaderi dönüşüm yardımcı olmak amacıyla, fibroblastlar üzerinden erythroid soy izleme fareler üzerinde yeniden programlama yapılır (Epor- Cre R26- eYFP) Sarı floresan protein (eYFP) ifade eri...

Üreten indüklenen için burada bizim iletişim kuralı mevcut erythroid ataları (iEPs) üzerinden fare yetişkin fibroblastlar transkripsiyon faktörü odaklı kullanarak doğrudan lineage (DLR) yeniden şekillendirmek için.

Lineage yetişkin fare Fibroblast Erythroid ataları için yeniden programlama doğrudan

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Fibroblastlardan eritroid ata hücrelerine doğru soy yeniden programlama. Eritroid hücre kaderini belirleyen transkripsiyonel düzenleme süreçlerini daha iyi incelemek için laboratuarımızda geliştirdiğimiz yeni bir yöntemdir. Geliştirme yi incelemek için doğrudan soy yeniden programlamakullanmanın en büyük avantajı çok basit bir teknik olmasıdır.Yani, örneğin, nakavt fareler içinde fonksiyon çalışmalarıkaybı ile karşılaştırıldığında, burada çok kolay faktör manipüle, belirli bir zaman noktasında aşırı ifade ve daha sonra kolayca kromatin değişiklikleri veya gen ekspresyon değişiklikleri gibi downstream etkileri incelemek için yeterli malzeme elde edebilirsiniz. Bu yöntem, fare kuyruk ucu fibroblastlarının eritroitoid atalarına yeniden programlanmasına odaklanırken, diğer fibroblast hücre tiplerine ve insanlar da dahil olmak üzere diğer organizmalara da uygulanabilir. Bu tekniğin etkileri transfüzyon tıbbına kadar uzanır ve bu da in vitro olarak kırmızı kan hücrelerinin üretimine giden yolu açmaktır.Prosedürü gösteren araştırma grubumdan Alban Johansson olacak. % 0.1 jelatin ile bulaşıkyüzeyini kaplayarak başlayın. Yaklaşık 20 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yat.Jelatin çözeltisini aspire edin ve yemeklerin kurumasını bekleyin. Kaldırmak için ötenazi li bir farenin kuyruğunun tabanını kesmek için makas kullanın. Kuyruk kullanıma hazır olana kadar %2 FBS ile DPBS'ye yerleştirin.Steril koşullar altında bir doku kültürü başlık, DPBS 0.02% tripsin EDTA seyreltilmiş trippsin çözeltisi hazırlamak ve kaplamasız 10 santimetrelik çanak içine 5 mililitre ekleyin. Bir doku kültürü başlık olarak, onu kapsayacak şekilde 15 mililitrelik bir tüp içinde yeterli% 70 etanol kuyruk yıkayın ve daha sonra DPBS. Kuyruğu bir tabağa düz yerleştirin ve yerinde tutmak için forceps kullanın.Tabandan uca uzunlamasına eksenboyunca kuyruk üzerinde bir kesi yapmak için bir neşter kullanın. Kuyruğu kavramak ve dikey olarak tutmak için bir çift forceps kullanın ve kuyruk tabanında kesi yanında deri kavrama ve geri soyma kullanabilirsiniz ikinci bir çift kullanın. Deri kuyruğun ucuna doğru aşağı doğru çekerek soyulmuş kadar kesiğin her iki tarafında bunu gerçekleştirin.Soyulmuş kuyruğu, tripsin çözeltisini içeren yemeğin üzerinde forsepslerle tutun. Küçük parçalar halinde kuyruk kesmek için diseksiyon makas kullanın. Daha küçük parçalar halinde tripsin çözeltisi bu parçaları parçalamak ve daha sonra 10 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka makas kullanın.Tripsin gidermek için, FEX orta iki cilt ekleyin, Takviyeleri ve antibiyotikler ile DMEM. 50 mililitrelik bir tüp içine çanak tüm içeriğini toplayın. Tüpü 350 kez G'de beş dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj edin.Supernatant aspire ve taze FEX orta 10 mililitre kuyruk parçaları içeren pelet resuspend. Bu süspansiyonu jelatin kaplı bir tabağa aktarın. %5 karbondioksit ve %4 oksijenle 37 derecede kuluçkaya yatarak her iki günde bir taze FEX ortamı ekleyin.Kuyruk parçalarının yemeğin altına bağlandığı ve fibroblastların onlardan uzaklaştığını gösteren beş ila yedi gün sonra kültürü gözlemleyin. Fibroblastkümeleri görünür olduktan sonra, yavaşça kuyruk parçaları yerinden çanak sallayın. Tüm kemik parçaları ile orta aspire, plaka bağlı fibroblastlar bırakarak.Taze FEX orta ve kültür fibroblastlar 10 mililitre ekleyin confluent kadar fibroblastlar. Fibroblast kültüründe hematopoetik ataların kontaminasyon olmamasını sağlamak için, el yazmasında açıklandığı gibi tripsin EDTA kullanarak hücreleri plakadan ayırın. Orta ekleyin ve hücreleri toplamak ve antikorlar ile manyetik boncukekleyin.Hematopoetik belirteçleri ifade eden hücreleri kaldırmak için manyetik ayırma sistemi kullanın. Bu adım ın dahil edilmesi kesinlikle hayati önem taşımaktadır, çünkü kültürde bulunabilecek herhangi bir HSPC'yi ve bu nedenle FACS analizinin olduğu gün herhangi bir yanlış pozitif sonuç olasılığını ortadan kaldırır. Tohum retroviral ambalaj hücreleri yaklaşık 25, 000 hücre kare santimetre kare bir doku kültürü tedavi çanak üzerinde.Yüksek glikozLu DMEM'deki hücreleri bir gecede 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle inkübe edin. Ertesi sabah, orta çıkarın ve hiçbir katkı maddesi ile DMEM kültür için kullanılan hacmin yarısını ekleyin. Öğleden sonra, transfeksiyon için gerekli% 70-80 birleşimi için hücreleri kontrol edin.Her yeniden programlama faktörü için gag, Pol ve zarf genleri içeren yardımcı vektörün altı mikrogramı ve üç mikrogramı ile altı mikrogramlık bir karışımını hazırlayarak transfeksiyona başlayın. Daha sonra, her yeniden programlama faktörü için steril polistiren tüpe 300 mikrolitre oda sıcaklığında DMEM ekleyin. Daha sonra dikkatlice tüp duvar ile temas önlemek için doğrudan orta içine oda sıcaklığında ticari transfeksiyon reaktif 27 mikrolitre ekleyin.Plazmid karışımını tüp içeren transfeksiyon reaktifine ekleyin. Girdap kısaca ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca karışımı kuluçkaya yatırın. Girdap transfeksiyon reaktif DNA karışımı tekrar.Retroviral ambalaj hücrelerine damla şeklinde ekleyin, böylece kültüre eşit olarak yayılır ve 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırılır. Transfeksiyondan 24 saat sonra, ortayı çıkarın ve mililitre penisilin streptomisin başına 100 ünite ile DMEM ekleyin. Transfeksiyondan 48 saat sonra, supernatant'ı toplayın ve 0,22 mikrometre lik gözenek boyutuşırşırıktan geçirin.FEX ortamda%0,1 jelatin önceden kaplanmış yemeklerde kuyruk ucu fibroblastlarını santimetre kare başına 10,000 hücreye tohumlayarak transdüksiyona başlayın. 24 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Bu adımı gerçekleştirirken, dört transgenin de yeniden programlama sürecine eşit katkıda bulunmasını sağlamak için dört retroviral süpernatantı eşit oranda eklemek önemlidir.Ertesi gün, ilk FEX orta altı hacimli retroviral enfeksiyon reaktif mililitre başına dört mikrogram ile desteklenen her yeniden programlama faktörü için viral supernatant bir hacim ekleyerek bir transdüksiyon karışımı hazırlamak. Bundan sonra, fibroblast kültüründen FEX ortamı aspire ve transdüksiyon karışımı ekleyin. Transdüksiyon reaksiyonu hipoksik koşullarda %5 karbondioksit ve %4 oksijenle 37 santigrat derecede dört saat kuluçkaya yatırın.Dört saat sonra, transdüksiyon karışımı aspire ve taze yeniden programlama ortamı ekleyin. Hipoksik koşullarda 8 gün boyunca 37 derecede kuluçkaya yat, her iki günde bir yeni programlama ortamı ekleyin. Plakadan ayrılan hücre kümeleri ile başarılı yeniden programlama gözlemleyin.Daha fazla analiz için çanak yeniden programlanmış hücreleri hasat için, yavaşça onları pipet yukarı ve aşağı ve daha sonra hücreleri toplamak. IED'lerin başarılı bir şekilde yeniden programlanmasından sonra, YFP pozitif hücreler transdüksiyondan beş gün sonra gözlemlenebilir. Yuvarlak olurlar, plakanın yüzeyinden yükselirler, kümeler oluşturmaya başlarlar ve eritroid öncül benzeri morfolojisi sergilerler.Bazı hücrelerin hemoglobinizasyonu pozitif benzidin boyama ile belirgindir. Küçük bir kısmı eritroid özgü yüzey belirteci TER-119 ifade eder. Sekizinci güne kadar büyük YFP pozitif kümeler görülebilir.Sekizinci gün iEP'ler beşinci gün iEP'lerden daha farklı eritroid fenotipgösterirler. Onlar önemli ölçüde daha küçük, daha fazla hemoglobin birikmiş, ve TER-119 artan ifade göstermektedir. Sekizinci gün toplanan iPCR'lerin qPCR'ı ile yapılan gen ekspresyonu analizi, fibroblast genlerinin ekspresyonunu neredeyse kapattıklarını ve birçok eritroid geni güncellediklerini göstermektedir.Yeniden programlanmış hücrelerde BFU-e koloni oluşturan tahliller yaptıktan sonra, sekizinci gün iEP'ler belirgin kırmızı ve gözle görülür kırmızı olmayan iki tür koloni oluştururlar. Kırmızı kolonilerden hücreler eritroblast morfolojisi sergilerken, kırmızı olmayan kolonilerden hücreler sergilenmedi. Yaklaşık 1,000 günde bir, beş iEP kırmızı koloniler oluşurken, sekiz giyotlu iEP'den sadece 10,000 koloniden biri oluşmuştur.Kuyruk ucu fibroblastlarının veya TTF'lerin yeniden programlama verimi geçiş sayısından etkilenir. Dokuz kez geçen TTF'ler, üç kez geçen hücrelere kıyasla iED kümeleri üretme yeteneğinde dramatik bir azalma gösterdi. Ayrıca, farklı kültür koşulları yeniden programlama verimliliğini etkileyebilir.Normoksia da kültüre aktarılan TTF'ler yeniden programlanır ve IEP kümeleri beş ila sekiz gün yerine 10 gün sonra gözlenir. Bu işlemden sonra hücre farklılaşma durumunu belirlemek için koloni oluşturma tahlilleri, qPCR ve FACS analizi gibi yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, gelişiminden bu yana, fare ve insan daki ilkel ve kesin eritroid hücreler arasındaki geçişi anlamada eritropoez alanında araştırmacıların önünü açmektedir.

direct-lineage-reprogramming-adult-mouse-fibroblast-to-erythroid

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video indüklenebilir lentivirüs kullanarak bağlı pluripotent kök hücreleri üretmek için prosedürü ifade Oct4, Sox2, c-Myc ve Klf4 gösterir.

Sox-2 Zorla İfade yoluyla MEFS iPS Hücreler oluşturma, Eki 4, c-Myc ve Klf4

Biz retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ve c-myc (OSKM) kodlayan vektörler ve canlı boyama ile doğru yeniden programlanması hiPSC belirlenmesi kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC) Tra-içine insan somatik hücre verimli yeniden programlama için bir protokol sunmak 1-81 antikor.

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre seçme ve ayırma Kolonileri Yetişkin Fibroblastlar gelen reprogrammed

Doğrudan soy-yeniden programlama için beyin-yerleşik hücreleri hedef beyin onarımı için yeni perspektifler sunuyor. Burada yetişkin insan serebral korteks beyin-yerleşik perisitlerden için zenginleştirilmiş kültürleri hazırlamak ve Sox2 ve Ascl1 faktörleri transkripsiyon retrovirüs aracılı ifade tarafından uyarılan nöronların bu dönüştürmek için nasıl bir protokol açıklar.

Kaynaklı Nöronlar içine Yetişkin İnsan Beyninin perisit türetilmiş Hücreler Lineage yeniden programlama

Fare embriyonik fibroblastı, transkripsiyon faktörleri Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc'nin zorla ekspresyonu ile düşük verimlilikte indüklenmiş pluripotent kök hücrelere yeniden programlanabilir. Yeniden programlama reaksiyonunun nadir ara ürünleri, hücre yüzeyi yapıcıları Thy-1.2, Ssea-1 ve Epcam'a karşı antikorlarla etiketleme yoluyla izole edilen FACS'dir.

Bir programlayabilme Fare Modeli iPS Hücre araürünler Hücre Yüzey Etiket Aracılı Arıtma

Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi otolog nakli türetilmesi için ilginç umutları sağlar. Ancak, pluripotent devlet ve zahmetli yeniden farklılaşma yoluyla ilerleme hala klinik çeviri engellemektedir. Burada erişkin insan fibroblast türetme ve uyarılmış nöral progenitör hücrelerin içine doğrudan dönüşüm ve nöral soy içine sonradan farklılaşmayı açıklar.

Yetişkin İnsan Fibroblastları türetilmesi ve Genişletilebilir Sinir Progenitör Hücreler içine Doğrudan Dönüşüm

Burada açıklanan protokol, minimal bir transkripsiyon faktörü setinin aşırı ekspresyonu yoluyla fare embriyonik fibroblastlarında bir hemojenik programın indüksiyonunu detaylandırır. Bu teknoloji, hematopoez, hematolojik hastalık ve hematopoietik kök hücre nakli ile ilgili gelecekteki çalışmalar için platformlar sağlamak üzere insan sistemine çevrilebilir.

Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

Süzülen makrofajlar dolaşımdaki öncüllerden yetişkin dokulara sürekli olarak işlenirken, yerleşik makrofajlar, gelişme sırasında dokularını tohumlamakta ve burada progenitörlerden başka girdiler almadan korunmaktadırlar. Yerleşik makrofajların öncüleri yakın zamanda tanımlandı. Burada, yerleşik makrofaj öncüllerinin genetik kader haritalaması için yöntemleri sunuyoruz.

Akım Sitometresi ile Fare Embriyosunda Eritromiyeloid Progenitörlerin Ve Döllerinin Belirlenmesi

Burada birincil embriyonik fibroblastlar içine fonksiyonel cardiomyocytes overexpression GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 ve miR-133, TGF-β sinyal inhibisyon yanında (GHMT2m) aracılığıyla yeniden programlamak için sağlam bir yöntem mevcut. Bizim iletişim kuralı dayak cardiomyocytes 7 gün sonrası iletim % 60 ile olduğu kadar erken oluşturur verimlilik.

Pro-fibrotik sinyal bastırma faktörü-aracılı fare embriyonik fibroblastlar indüklenen Cardiomyocytes yeniden programlama Potentiates

Bu protokol, insan dermal fibroblastlarında hemojenik bir programın hematopoetik kök ve döl hücreleri üretmek için gata2, GFI1B ve FOS transkripsiyon faktörlerinin zorunlu ekspresyonu ile indüksiyonuna neden olduğunu göstermektedir.

Transkripsiyon Faktörlerinin Zorunlu İfadesi Ile İnsan Fibroblastlarının Hemojenik Yeniden Programlanması

Burada, melanositler için optimize edilmiş bir doğrudan yeniden programlama sistemi ve sorunsuz doğrudan yeniden programlama sağlayan yüksek verimli, konsantre bir virüs paketleme sistemi açıklanmaktadır.

Fare Fibroblastlarının Melanositlere Doğrudan Yeniden Programlanması

Öğrenin fare yetişkin fibroblastlarını doğrudan soy hattı yeniden programlama ile eritroid öncü hücrelere dönüştürme yöntemini. Bu teknik, transkripsiyonel düzenlemeyi incelemek ve in vitro kırmızı kan hücresi üretimi için yeni olanaklar sunar.

Lineage yetişkin fare Fibroblast Erythroid ataları için yeniden programlama doğrudan

Daha fazla video keşfet