Name: Alpaka (Lama Paços) Protein antijenleri ve antijen spesifik tek etki alanı antikor üretimi ile bağışıklama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Öğrenin, alpaka immünizasyonu ve faj görüntüleme seçimi kullanarak tek etki alanı antikor üretim protokolünü. Bu yöntem, biyomedikal araştırmalar için antijen spesifik antikorlar oluşturmayı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından (P30GM103486) destek verdi.

<ol><li>Krah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-domain+antibodies+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Immunopharmacology+and+Immunotoxicology%22%5BJournal%5D)">Single-domain antibodies for biomedical applications.</a> Immunopharmacology and Immunotoxicology. 38 (1), 21-28 (2016).</li>
<li>Rothbauer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+and+tracing+antigens+in+live+cells+with+fluorescent+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies.</a> Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).</li>
<li>Maass, D. R., Sepulveda, J., Pernthaner, A., Shoemaker, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpaca+%28Lama+pacos%29+as+a+convenient+source+of+recombinant+camelid+heavy+chain+antibodies+%28VHHs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Alpaca (Lama pacos) as a convenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies (VHHs).</a> Journal of Immunological Methods. 324 (1-2), 13-25 (2007).</li>
<li>Pardon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+protocol+for+the+generation+of+Nanobodies+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology.</a> Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).</li>
<li>Hertveldt, K., Belien, T., Volckaert, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+M13+phage+display%3A+M13+phage+display+in+identification+and+characterization+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">General M13 phage display: M13 phage display in identification and characterization of protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 502, 321-339 (2009).</li>
<li>Kushwaha, R., Schafermeyer, K. R., Downie, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+phage+display+and+affinity+selection+using+recombinant+protein+baits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A protocol for phage display and affinity selection using recombinant protein baits.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), e50685(2014).</li>
<li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).</li>
<li>Muyldermans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Camelid+immunoglobulins+and+nanobody+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Immunology+and+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Camelid immunoglobulins and nanobody technology.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 128 (1-3), 178-183 (2009).</li>
<li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23495938">Nanobodies: natural single-domain antibodies.</a> Annu Rev Biochem. 82, 775-797 (2013).</li>
<li>Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+antigens+by+single-domain+antibody+fragments%3A+the+superfluous+luxury+of+paired+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody-derived+nanobiotechnology+tool+kits+for+diverse+biomedical+and+biotechnology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Nanobody-derived nanobiotechnology tool kits for diverse biomedical and biotechnology applications.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 3287-3303 (2016).</li>
<li>Van Saun, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+requirements+and+assessing+nutritional+status+in+camelids%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Clinics+of+North+America%3A+Food+Animal+Practice%22%5BJournal%5D)">Nutritional requirements and assessing nutritional status in camelids.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 25 (2), 265-279 (2009).</li>
<li>Jones, M., Boileau, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19460638">Camelid herd health.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 25 (2), 239-263 (2009).</li>
<li>Daley, L. P., Gagliardo, L. F., Duffy, M. S., Smith, M. C., Appleton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+monoclonal+antibodies+in+functional+and+comparative+investigations+of+heavy-chain+immunoglobulins+in+new+world+camelids%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Application of monoclonal antibodies in functional and comparative investigations of heavy-chain immunoglobulins in new world camelids.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (3), 380-386 (2005).</li>
<li>Romao, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Useful+Nanobodies+by+Phage+Display+of+Immune+Single+Domain+Libraries+Derived+from+Camelid+Heavy+Chain+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Identification of Useful Nanobodies by Phage Display of Immune Single Domain Libraries Derived from Camelid Heavy Chain Antibodies.</a> Current Pharmaceutical Design. 22 (43), 6500-6518 (2016).</li>
<li>Henry, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+TGF-beta-neutralizing+single-domain+antibodies+of+predetermined+epitope+specificity+using+next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%2C+Design+and+Selection%22%5BJournal%5D)">Isolation of TGF-beta-neutralizing single-domain antibodies of predetermined epitope specificity using next-generation DNA sequencing.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 29 (10), 439-443 (2016).</li>
<li>Burg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology.+Structural+basis+for+chemokine+recognition+and+activation+of+a+viral+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural biology. Structural basis for chemokine recognition and activation of a viral G protein-coupled receptor.</a> Science. 347 (6226), 1113-1117 (2015).</li>
<li>Wesolowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+domain+antibodies%3A+promising+experimental+and+therapeutic+tools+in+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity.</a> Medical Microbiology and Immunology. 198 (3), 157-174 (2009).</li>
<li>Harmsen, M. M., De Haard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties%2C+production%2C+and+applications+of+camelid+single-domain+antibody+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77 (1), 13-22 (2007).</li>
<li>McMahon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+surface+display+platform+for+rapid+discovery+of+conformationally+selective+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 289-296 (2018).</li>
</ol>

DRS. Whiteheart ve Hersh Kentucky Üniversitesi ve moleküler tıp alpaka bir ücret-için-hizmet olarak tek etki alanı antikor üreten bir çekirdek merkezi çalışır.

Belirtildiği gibi yüksek benzeşme ve özgüllük facile ifade ve istikrar, ile birlikte tek etki alanı antikorların onları uygulamalar için ideal reaktifler Biyomedikal araştırma, kritik biyokimyasal reaktifler, tanı araçları yapmak veya terapötik ajanlar18. Ticari uygulamalar için dikkate alınması gereken bazı sorunları ile ilgili fikri mülkiyet vardır. Ayrıca, tek etki alanı antikorlar belirli işaretçileri veya gazetecilere hücresel deneyleri veya tanılama olarak kullanılan Etiketler içerecek şekilde tasarlanmış. Bu kullanımlar için anahtar faiz antijenlere karşı belirli tek etki alanı antikor üretmek için yeteneğidir. Bir yöntem burada tek etki alanı antikorlar alpaka, kullanarak üretmek için çeşitli protein antijenlere karşı güçlü bir bağışıklık yanıtı üreten açıklanmıştır. Hayvan işleme ve yasal uyumluluk hakkında önemli noktalar açıklanır. Bu işlemi bu kısmında başarı için anahtar vardır.
Bağışıklama gerektirmez, ancak bunun yerine semisynthetic kütüphaneler seçimi ve yinelemeli benzeşim19,20 iyileştirmesi için farklı sistemleri ile kullanmak tek etki alanı antikor üretimi için diğer strateji vardır . Ancak, aşılı hayvanlardan elde edilen kitaplıkları kullanmanın avantajı güvenilir bir şekilde yüksek oranda zenginleştirilmiş, çeşitli ve yüksek-benzeşimi tek etki alanı antikorlar yalıtmak için yeteneğidir. Ayrıca, sadece önemli sıra varyasyonları görülmektedir, ancak belirli tek etki alanı antikorlar izole önemli bir çoğunluğu benzersiz eklemeler ve silmeler, özellikle CDR3 vardı.
Ayrıca, tek etki alanı, antikor sadece küçük iğne antijen ve sonra bu işlemi gerektirir basit bir süreci ile üretilen hayvanlar sürünün için döndürülebilir. Dikkat, hayvan lif üretimi için serbestçe kullanılabilir, ancak test antijenleri ve sigara FDA onaylı adjuvan kullanım için tek etki alanı antikor üretimi nedeniyle et (insan gıda zinciri) olarak kullanımdan tutulmalıdır. Yordamı tamamlandığında, hayvanlar için bir hafta, bir final veteriner sınavı verilen takip edilmelidir sonra ya onların ev çiftliğine geri döndü ve tek etki alanı antikor üretimi başka bir turdan önce altı ay dinlenmiş.

Alpakalar ve Devegiller ailesinin diğer üyeleri Biyomedikal araştırma1,2,3için antikorlar oluşturmak için popüler bir kaynağı haline gelmiştir. Devegiller ürettikleri hem normal antikor hem de ağır zinciri tek antikorları yüksek özgüllük ve yüksek afinite korurken daha küçük tek etki alanı antikor üretimini sağlayan benzersiz bir bağışıklık sistemi sahip. Böylece, Devegiller antikorlar çok yönlü reaktif çok çeşitli amaçlar için yararlı sağlar. Alpaka bağışıklık ve tek etki alanı antikorlar antijenleri protein çeşitli üretmek için bir yöntem burada açıklanmıştır. Bu antikorlar Devegiller sadece küçük iğne ile bağışıklama hedef protein (antijen) ve bir kan berabere4gerektirir nispeten basit bir süreci ile üretilmektedir. Daha sonra kütüphane inşaat, M13 fajının ekran5 ve karşı rekombinant antijen6 panning ayırmak ve istenen özelliklere sahip tek etki alanı antikor üretmek için kullanılır. İşleminin fajının ekran teknolojisi olanaklarından aldığından, beş veya daha fazla antijenleri aynı anda hayvan yararlı olabilir, böylece hayvan sayısını azaltmak kullanılan ve maliyetleri ilişkili.
Tipik memeli antikorlar veya immünoglobulinler disülfür bağları ile birbirine bağlanmış zincirler (2 ağır zincirleri ve 2 hafif zincirleri), iki tür oluşan büyük moleküllerdir. Bu antikorlar nispeten büyük, moleküler ağırlık ~ 140-190 sergilenmesi kDa daha bol IgG türler insanlar, fareler, keçi ve tavşan için. Onların çok alt birim yapısı, yüksek molekül ağırlıklı ve disülfür bağları nedeniyle immünglobulin yüksek maliyet yapım büyük miktarlarda üretmek için oldukça zor olabilir. 1990 's, deve, kaç Lama ve alpaka içerir Devegiller, yanı sıra tipik memeli türü immünglobulin, bir roman formu sadece ağır zincir7sahip yapısında daha basit immünglobulin yapmak keşfedilmiştir. Bu benzersiz Devegiller antikorlar özellikle yabancı maddelerin yüksek afinite ile bağlamak için aynı yeteneğine sahip ama sadece bir protein zinciri8üretilmiştir. Ayrıca, Devegiller antikorlar deneysel bir tek etki alanı antikor9olarak da adlandırılan bir daha da küçük birim VHH parçası için kesilmiş. Kendi küçük boyutu nedeniyle tek etki alanı antikorlar Biyomedikal araştırma uygulamaları geniş bir yelpazesi için yararlıdır ve akademik ve ticari kaynakları1,10çeşitli kullanılabilir. Bir özel durum tek etki alanı antikorlar daha sık genellikle Batı lekesi kullanılan denaturing koşullar altında kaybolur conformation bağımlı epitopları karşı yönlendirilmektedir beri Western Blot gibi görünüyor.
Onlar tek polipeptid zinciri yapılır beri belirli tek etki alanı antikorlar seçili ve kolayca bakterilerde rekombinant proteinler olarak büyük miktarlarda üretilen. Tek etki alanı antikorlar da belirli işaretleri, "muhabir grupları olarak" hastalıkları11tanılamak için kullanılabilir etiketler yoksa genetik olarak. Kullanım esnekliği ile birleştiğinde manipülasyon bu kolaylığı tek etki alanı antikorlar üniversiteler ve başka bir yerde araştırmacılar için önemli bir kaynak yapar.
Bir Ulusal Sağlık Enstitüleri parçası çekirdek desteklenen gibi mevcut yöntemler tek etki alanı antikorlar alpaka3,4üretmek için uyarlanmıştır. Alpaka işleme erişilebilirlik yanı sıra daha büyük Devegiller aile üyeleri göre her iki kolaylığı önemli avantajları var. Alpaka lif ve et için yaygın olarak yetiştirilir ve böylece bölgesel devlet damızlık dernekler veya kendi web siteleri aracılığıyla tespit eden yerel alpaka çiftçilerin elde edilebilir. Alpaka iki doğurmak are elde edilebilir, Suri ve Huacaya. Huacaya daha sık görülür ve bu iletişim kuralı için kullanılan, ancak genellikle her iki doğurmak için uygulanabilir ve ayrıca diğer Devegiller daha yaygın olarak uygulanabilir protokolüdür.

<table><tbody><tr><td>GERBU FAMA Adjuvan</td><td>Biotechnik, Heidelberg, Almanya&nbsp;</td><td>3003,6001</td><td></td></tr><tr><td>Serum toplama tüpü</td><td>Becton Dickinson</td><td>367983</td><td></td></tr><tr><td>Kan alma tüpü</td><td>Becton Dickinson</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer kan alma seti</td><td>Becton Dickinson</td><td>368652</td><td></td></tr><tr><td>Maxisorp İmmüno plakaları</td><td>Nunc</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>HRP konjuge keçi anti-lama IgG antikoru&nbsp;</td><td>Bethyl Labs</td><td>A160-100P</td><td></td></tr><tr><td>TMB reaktifi kromojenik peroksidaz substratı&nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-76-03</td><td></td></tr><tr><td>Plaka Okuyucu</td><td>Spectramax</td><td>M5</td><td>Herhangi bir UV/VIS özellikli okuyucu kabul edilebilir</td></tr><tr><td>Uni-SepMAXI+ likosit ayırma tüpü</td><td>Novamed</td><td>U-17</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder sütunu</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>Üst simge IV ters transkriptaz&nbsp; &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>AEBSF çözeltisi</td><td>Biosynth</td><td>A-5440</td><td></td></tr><tr><td>TG1 faj görüntüleme yetkin hücreler</td><td>Lucigen</td><td>60502</td><td></td></tr></tbody></table>

alpaka (lama paços) protein antijenleri ve antijen spesifik tek etki alanı antikor üretimi ile bağışıklama

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Bu makale, Alpaka bağışıklama ve antijen spesifik tek etki alanı antikor üretmeye moleküler biyoloji yöntemlerin kullanımı için bir yöntem açıklanan ve gösterdi. Tek etki alanı antikor üretmek için kullanılan ağır salt zinciri antikor roman türü ürettikleri bu yana Devegiller, alpakalar ve llamas, gibi Biyomedikal araştırmalar için değerli bir kaynak haline gelmiştir. Bağışıklık sistemi son derece esnek olduğundan, tek etki alanı antikorlar için birçok farklı protein antijenleri ve hatta farklı biçimler antijen, özgüllük çok yüksek bir derece ile yapılabilir. Bu özellikler, diğerlerinin yanı sıra, tek etki alanı antikorlar Biyomedikal araştırmalar için paha biçilmez bir araç olun. Alpaka üzerinden tek etki alanı antikor üretimi için bir yöntem bildirilmektedir. Bağışıklama, kan toplama ve B-hücre izolasyon için bir protokol açıklanmıştır. B-hücreleri kaydırma üzerinden belirli tek etki alanı antikorlar seçiminde kullanılan aşılı bir kütüphane yapımı için kullanılır. Kaydırma yolu ile elde edilen sözde belirli tek etki alanı antikorlar açılan tarafından teyit ELISA veya jel-shift deneyleri. Ortaya çıkan tek etki alanı antikorlar, daha sonra doğrudan veya bir mühendislik reaktif bir parçası olarak kullanılabilir. Tek etki alanı antikor ve tek etki alanı vekiller antikor tabanlı kullanır yapısal, biyokimyasal, hücresel, içinde vivo ve tedavi uygulamaları içerir. Rekombinant proteinler prokaryotik ifade sistemlerinde, saf ve doğrudan kullanılan veya belirli işaretçileri veya hücresel çalışmaları ya da gazetecilere olarak kullanılan Etiketler içerecek şekilde tasarlanmış tek etki alanı antikorlar büyük miktarlarda üretilmektedir Tanılama.

Burada sunulan Protokolü a sıra-in protein antijenlere karşı antikor tek etki alanı oluşturmak için kullanılmıştır. Beş antijenleri alpaka kullanılmıştır. Bağışıklık izleme antijenleri çoğunluğu üç hafta (Şekil 1) başlangıçta güçlü tepki gösterdiğini belirtti. Üretim Kenar taşmaları ve sonra yaklaşık altı hafta verir en iyi dengeyi hayvanlar için bu kütüphane inşaat enjekte birden çok antijenleri var. Kaydırma iki tur her antijen için gerçekleştirilen ve izole kolonileri ekranlı (Şekil 2). Sıralama olumlu kolonileri çeşitli tek etki alanı antikor dizileri farklı antijenler tespit. Örnekler için üç benzersiz klonlar maltoz bağlayıcı Protein (MBP) (Şekil 3A) başvuru antijen izole edildi. Sık sık görülmektedir, tek etki alanı antikorlar önemli sıra çeşitlilik ve son derece değişken CDR3 uzunluğu (Şekil 3) içerir. Bu özellikler özellikle başvuru tek etki alanı antikor/CX3CL1 karmaşık17 ' (Şekil 3B) görüldüğü gibi tek etki alanı antikor/antijen etkileşim içinde önemlidir.
Tam uzunlukta tek etki alanı antikor dizileri çoğunluğu ifade ve 1-10 mg/L Kültür (Şekil 4A) saf. Nedeniyle CDR3 uzunluğunda, farklı tek etki alanı antikorlar dinleyelim moleküler ağırlıklı göstermek. Doğrudan bağlama ve uygulama belirli performans önemlidir. Örneğin, seçim karşı antijen B iki tur sonra tek etki alanı antikorlar vardı bir panel (Şekil 2) tespit edilmiştir. Birden çok özdeş dizileri tespit edilmiştir ve tek etki alanı antikor üretilen ve saf. Sonra doğrudan çekme aşağı antijen benzeşme reçine ile test ve güçlü doz bağımlı bağlama (Şekil 4B) gösterdi. Önemlisi, tek etki alanı antikor reçine denetlemek için hiçbir bağlama gösterdi. Bu veriler doğrudan bağlama etkileşim ve benzeşme yakalama içinde aşağı açılır ve ELISA tabanlı oluşum için de uygun olduğu bir göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig1.jpg"> Resim 1 : Farklı antijenler önemli belirli bağışıklık yanıtı aynı hayvan gösterilen iki ayrı antijenleri temsilcisi bağışıklık izleme. Birçok antijenleri bağışıklama, maksimal yanıt altı hafta sonra gösterilen çoğunluğu ile başlıyor sonra üç hafta gibi erken sağlam tepki göstermek. Altı hafta da afinite olgunlaşma için sağlar ve üretim taşma payı ve B-hücre izolasyon önerilen zamanı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig2.jpg"> Resim 2 : Olumlu klonların PCR tabanlı onay. Astar yayılan pMES4 vektör MCS ve olumlu nanobody klon bir amplicon ~ 500 üretir bp (ile işaretlenmiş *). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig3.jpg"> Şekil 3 : Antijen spesifik dizileri vurgulamak alpaka tek etki alanı antikor çeşitlilik. (A)hizalaması seçin tek etki alanı antikor dizileri için MBP izole bir başvuru tek etki alanı antikor 4XT1, çerçeve ve tamamlayıcılık belirleme bölgeleri (Kabat) aşağıda vurgulanmış. (B) yapısını alpaka tek etki alanı antikor 4XT1 bağlı CX3CL1 için (PDB 4XT1), değişken CDR kritik rolünü vurgulayan spesifik antijen bağlamasında döngüler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig4.jpg"> Şekil 4 : Arıtma ve tek etki alanı antikorlar doğrulanmasını. (A)SDS-çeşitli tek etki alanı antikorlar karşılaştırma sayfası saf IMAC tek etki alanı antikorların. Farklı molekül ağırlıkları CDR3 döngünün farklı uzunluk nedeniyle öncelikle vardır. İfade farklı düzeylerde de saf protein düşük verimleri gösterilen tek etki alanı antikorlar bir azınlık ile gözlenir. (B) doğrulanması bir antijen ilgi açılan kullanarak doğrudan bağlama. Güçlü doz bağımlı tek etki alanı antikor bağlama antijen birleştiğinde reçine ile ama denetim reçine ile değil görülmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Alpaka üzerinden tek etki alanı antikor üretimi için bir yöntem, aşılama, kan toplanması, B-hücre izolasyon ve seçimi de dahil olmak üzere tanımlanır.

Alpaka (Lama Paços) Protein antijenleri ve antijen spesifik tek etki alanı antikor üretimi ile bağışıklama

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

Burada tanımladığımız yöntemler, araştırmacıların alpakalarda tek etki alanı antikorları üretmesine yardımcı olmak için NIH COBRE sponsorluğundaki University of Kentucky Protein Core Facility tarafından benimsenmiştir. Tek etki alanı antikorları biyomedikal araştırmalarda anahtar soruları cevaplamak için kullanılan önemli bir araçtır. Gösterdiğimiz tekniklerin en büyük avantajı, tek bir alpakada beş farklı proteine kadar tek etki alanı antikor üretimine olanak sağlamasıdır.Bu tekniğin etkileri insan sağlığı ve hastalık tedavisine kadar uzanır, çünkü bu tek etki alanı antikorları tedavi amaçlı, aşı olarak ve tanı olarak kullanılabilir. En köklü biyomedikal müfettişleriçin en önemli engel alpaka gibi büyük hayvanlar, ele olduğunu. Bir alpaka işleme Görsel gösteri, antijen enjeksiyonu, ve kan toplama, bu camelids tek etki alanı antikorların başarılı üretimi için önemlidir.Prosedürü gösteren Doktor Jeff Smiley, Üniversite Veteriner, Bayan Kathy Boaz, Veteriner Teknisyen ve Bayan Erin Jones, Lab Hayvan Teknisyeni olacaktır. Kanın kullanımı, Araştırma Görevlisi Doktor Martin Chao tarafından gösterilecek. Bu prodüksiyonun gerçek hikayeleri Blue Eyes, Big Boy, ya da sevgiyle Gorilla olarak bilinen ve Freddie, bizim Kentucky alpaka vardır.Başlamak için, bir halter ve kurşun ile hayvan dizginlemek. Sonra alpakanın saçını, boynundan omuza kadar hilal ay deseni içinde elektrikli makaslarla kırpın. Dikkatle baş ve boyun tarafından alpaka tutun ve yavaş yavaş boyun tabanı boyunca bir 22 gauge iğne ile subkutan antijenler enjekte, yay lenf düğümleri yakın.Her biri yaklaşık beş santimetre arayla yaklaşık 200 mikrolitrelik beş enjeksiyon gerçekleştirin. Bundan sonra, anafilaksi belirtileri için yaklaşık 20 dakika hayvan izlemek. Enjeksiyon bölgesini haftalık olarak lokalize inflamasyon için inceleyin.Kan almak için, alpaka nın saçını kırpın ve toplama alanını alkol bezleriyle dezenfekte edin. Alpaka hafifçe dizginlemek, boyun dik ve düz tutulur sağlanması. Vertebranın enine prosesinin ventral projeksiyonlarını bir dönüm noktası olarak kullanarak, ventral proseste sadece medial basınç uygulayarak damarı tıka.Daha sonra, 45 derecelik bir açıyla iğne takın, biraz projeksiyon medial, boyun merkezine doğru. Kan akana kadar iğneyi manipüle edin. İlk olarak, toplanan kanın 15 mililitresini beş mililitre PBS ile seyreltin.Sonra, bir lenfosit ayırma tüpü içine pipet kan periferik kan lenfositler izole etmek, veya PBLs, yoğunluk gradyan santrifüj yoluyla. Üst plazma tabakasını yavaşça çıkarın ve ayrı bir tüpe kaydedin. Daha sonra, pbl tabakasını hafifçe çıkarın ve steril 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.PBLs için önceden soğutulmuş PBS 45 mililitre ekleyin ve 800 kez G 20 dakika için tüp spin ve dört derece santigrat. Lenfositler içeren pelet bırakarak, bir pipet ile supernatant çıkarın. PBL'leri RNA izolasyonu için hazırlamak için peleti beş mililitre önceden soğutulmuş PBS ile iki kez daha yıkayın.Bu protokol kullanılarak, bir dizi protein antijenine karşı tek etki alanı antikorları üretildi. Bağışıklık takibi, antijenlerin çoğunluğunun üç haftadan itibaren güçlü bir yanıt gösterdiğini ve kan almak için en uygun sürenin altı hafta olduğunu göstermiştir. Pozitif kolonilerin dizilimi, farklı antijenler için farklı tek etki alanı antikor dizileri tespit etti.Örneğin, üç benzersiz koloniler referans antijen maltoz bağlayıcı protein izole edildi. Genellikle, tek etki alanı antikorları önemli dizi çeşitliliği ve antijen bağlayıcı döngülerin son derece değişken uzunlukta içeriyordu. Bu özellikler özellikle tek etki alanı antikor antijen etkileşimlerinde önemlidir.Bu prosedür hayvan başına en fazla beş antijen için tek etki alanı antikorüretimi sağlar. Her hayvan için tek bir kan toplama ve kütüphane inşaatı kullanılmaktadır. Faj ekran tabanlı seçim antijen özgü, tek zincirli antikorlar tanımlamak için kullanılır.Antijen enjeksiyonları ve kan örnekleme yaparken, onları daha sakin tutan bir grupta alpaka tutmak önemlidir. Bu, durduranlar ve müşteri adayları kullanılarak ve yordamlar sırasında yakın bir şekilde bağlanabilir.

immunization-alpacas-lama-pacos-with-protein-antigens-production

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bazı fare suşlar miyelin temel protein olan deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE) indüksiyon karşı edebiliyoruz. Burada anlatılan yanıtsızlık tersine çevirir ve birkaç tipik EAE dirençli fare lekeler paralitik hastalığın neden basit bir bağışıklama protokoldür.

Kabul edilmiş Transfer ve antijenik Challenge Deneysel Otoimmün Encephalomyelitis (EAE) Dayanıklı Fare Suşlarında yanıtsızlık Aşmak

Profilaktik ve terapötik aşılama çoğu zaman düğümleri ve bağışıklık hücrelerinin dolayısıyla kötü katılımını lenf nedeniyle aşının hafta drenaj güçlü bağışıklık tepkilerini uyarmak için başarısız olur. Lenf düğümlerine aşı doğrudan enjeksiyon ile, sözde lenf sistemi içi enjeksiyon, aşı etkinliği güçlü geliştirilebilir ve aşı doz azaltılabilir.

Fare intralenfatik immünoterapi ve Aşılama

Hidoma teknolojisine dayalı monoklonal antikorların üretilmesi için optimize edilmiş bir protokol sunulmuştur. Fareler bir immünokonjugat ile aşılandı. Dalak hücreleri, PEG ve ölümsüz miyelom hücreleri ile bir elektrik darbesi ile kaynaştırıldı. Antikor üreten hibridoma hücreleri HAT ve antijene özgü ELISA taraması ile seçildi.

Hibridoma teknolojisi ile murin monoklonal antikorlar üretilmesi

Bu makale hazırlanması ve doğal ürünler kullanmak üzere çeşitli uzun karşı Monoklonal antikor değerlendirilmesi için detaylı bir protokol sağlar. Bu yordam bağışıklama, hücre füzyon, dolaylı rekabet ELISA olumlu klon eleme ve monoklonal Hibridoma hazırlık için içerir. Antikor karakterizasyonu MALDI-TOF-MS ve ELISA analizleri kullanarak spesifikasyonları da temin edilmektedir.

Doğal ürünler karşı monoklonal antikorların üretimi

Açıklanan antijenik liposomal nano tanecikleri ve kullanımları uyarıcı B-hücre harekete geçirmek vitro ve in vivohazırlıktır. Tutarlı ve güçlü antikor yanıt-e doğru yeni bir fıstık alerjisi model gelişmesine yol açtı. Antijenik lipozomlar oluşturmak için protokol farklı antijenleri ve bağışıklama modeller için genişletilebilir.

Antijenik lipozomlar hastalığa özgü antikorların üretimi için

İnterferon-gamma ELISpot tahlil için eskiden şiling şimdi domuz PBMCs gelişimi bulaşıcı hastalıklar çalışmak için son derece alakalı bu modelde T hücreli yanıt karakterizasyonu sağlar. DNA aşıları intradermal teslimatla ilişkili T hücre yanıtları ölçmek için tahlil başvurdum.

En iyi duruma getirilmiş Interferon-gamma ELISpot tahlil ölçü birimi T hücre yanıtları sonrasi hipererjik eskiden şiling şimdi domuz modelinde

Opsono-bağlılık testi, antikorların aşı geliştirmedeki opsonik fonksiyonlarını değerlendirmek için opsono-fagositik öldürme testine alternatif bir yöntemdir.

Bacillus anthracis ve Diğer Kapsüllenmiş Patojenlere Karşı Aşı Geliştirmede Fonksiyonel Antikorları Değerlendirmek için Opsono-Adherence Tahlili

Bu makale, intranazal aşıların ve emziren tavşanlardan(Oryctolagus cuniculus)süt toplanmasının, dil bağışıklığını çeviriye uygun bir anne bağışıklama modelinde değerlendirmenin bir yolu olarak tanımlanmaktadır ve göstermektedir.

Yeni Zelanda Beyaz Tavşanlarında Anne Bağışıklama Çalışmalarında İntranazal Bağışıklama ve Süt Toplama (Oryctolagus cuniculus)

pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO hücrelerinde eksprese edilen rekombinant antikor proteini ve geleneksel hibridoma teknolojisi kullanılarak üretilen monoklonal antikorlar, domuz aminopeptidaz N (APN) proteinini tanıyabilir ve bağlanabilir.

Domuz Bağırsak Mukozal Epitelinde Aminopeptidaz N'yi Hedef Alan Monoklonal Antikorların Üretimi

Burada, C57BL/6 farelerde deneysel otoimmün ensefalomiyeliti aktif olarak indüklemek için alternatif bir protokol sunuyoruz, ısıyla öldürülen Mycobacterium avium alt türü paratüberkülozu içeren tamamlanmamış Freund adjuvanında asılı duran immünojenik epitop miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG)35-55'i kullanıyoruz.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Sırasında Otoantijenlerin İmmünojenitesinin Arttırılmasında Mycobacterium Paratuberculosis'in Adjuvan Aktivitesi

Öğrenin, alpaka immünizasyonu ve faj görüntüleme seçimi kullanarak tek etki alanı antikor üretim protokolünü. Bu yöntem, biyomedikal araştırmalar için antijen spesifik antikorlar oluşturmayı sağlar.

Alpaka (Lama Paços) Protein antijenleri ve antijen spesifik tek etki alanı antikor üretimi ile bağışıklama

Daha fazla video keşfet