Bir zebra balığı embriyo Model In Vivo görselleştirme ve Staphylococcus aureus Intravital analiz Biomaterial ilişkili enfeksiyon

Bu yöntem, biyomalzemelerin enfeksiyona yatkınlığı nasıl etkilediği, bu tür enfeksiyonların ilerlemesini nasıl etkilediği ve bu tür biyomalzemelerin etrafındaki bağışıklık hücre davranışlarını nasıl etkilediği ile ilgili anahtar soruların yanıtlatılabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, biyomateryalle ilişkili enfeksiyonların in vivo görselleştirme ve intravital analizine olanak sağlayan yeni bir hayvan modeli sağlamasıdır. Biyomalzeme mikrokürelerinin enjeksiyonu çok hassas bir işlem olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir.

Bir bakteri sadece süspansiyon oluşturmak için, ilk transfer dört ila beş floresan Staph aureus mCherry suşu, triptik soya tarım plakaları üzerinde kültürlü 10 kloramfenikol mililitre başına mikrogram ile desteklenen 10 kloramfenikol ile takviye lifanikol mililitre, orta logarritmik büyüme aşamasında büyüme için 37 derece santigrat santigrat. Kültür 0,4 ila 0,8 620 nanometre optik yoğunluk ölçümü ulaştığında, santrifüj ile bakteri toplamak ve yıkama başına steril PBS bir mililitre ile hücreleri iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, pvp 1.1 mililitre pelet resuspend, ve tekrar optik yoğunluğu ölçmeden önce bakteriyel süspansiyon girdap.

Daha sonra bakteri sadece süspansiyon oluşturmak için deneysel gereksinimlerine göre PVP ile bakteriyel süspansiyon konsantrasyonu ayarlayın. Bir bakteri mikrosfer süspansiyon oluşturmak için, ticari polistiren mikrosfersan santrifüj, PS-10, ve bakterilerin sadece süspansiyon mikrosfer pelet resuspend. Bakterilerin mikrosfer süspansiyonunun 1/2 hacmi pvp ile seyreltin ve süspansiyonda uygun bir bakteri konsantrasyonuna ulaşın ki bu da bakterilerin sadece süspansiyonunda bunun yaklaşık 2/3'üdür.

Girdap ile süspansiyon karıştırın. Sadece bakteri ve bakteri mikrosfer süspansiyon konsantrasyonu kontrol etmek için, 96-iyi plaka bireysel kuyulara her süspansiyon 100 mikrolitre ekleyin. Sonraki kuyularda 90 mikrolitre steril PBS'deki süspansiyonların 10 mikrolitresini, her seyreltme adımı için taze ipuçları kullanarak seri olarak seyreltin.

Sulandırılmamış ve seyreltilmiş bakteriyel süspansiyonların 10 mikrolitrelik aliquotlarını agar plakalarına uygulayın ve plakaları bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi sabah, sadece hazırlanan bakterilerve bakteri mikrosfer süspansiyonları içindeki bakteri sayısını hesaplamak için kolonileri sayın. Zebra balığı embriyolarını topladıktan sonra, saydam olmayan unviable embriyoları atın ve taze E3 ortamda 28 santigrat derecede 100 mililitrelik Petri kabı başına yaklaşık 60 embriyo kuluçkaya yatırın.

Anesteziden sonra floresan mikroskopi için GFP pozitif embriyoları ayırın. E3 orta 100 mililitrepetri çanak onları aktarın. Bir enjeksiyon kalıbı oluşturmak için, 100 mililitrelik Petri kabını %1 ila %1,5 sıvı agarose ile doldurun.

Agarose oluklar oluşturmak için plastik bir kalıp şablonu kullanın. Agarose katılaşmış olduğunda, kalıp çıkarın, ve E3 orta ile kapsayacak 0.02% tricaine ile takviye. Bir gün üç post-fertilizasyon, oküler bir ölçek çubuğu ile Bir ışık mikroskop altında yaklaşık 20 mikrometre dış çapı ile ipuçları elde etmek için bir çekti cam mikrokapiller iğne ucu kırmak için forceps kullanın.

İğne ucunun açılmasımikrokürelerin enjeksiyonu için pratiktir. AçılışÇapı farklı boyutlardaki mikroküreler için ayarlanmalıdır. Daha sonra iğneyi yaklaşık 20 mikrolitre bakteri mikrosferi veya yalnızca bakteri süspansiyonu ile yüklemek için bir Microloader pipet ucu kullanın ve iğneyi mikroenjektöre bağlı bir mikromanipülatöre monte edin.

Şimdi seçilen embriyoları oluklü agarose plakasına aktarın. Embriyoların uyuşdurulması için beş dakika bekledikten sonra, embriyoları enjeksiyonları için tek bir oryantasyonda oluklar içinde hizalayın. Mikroenjektörü uygun enjeksiyon ayarlarına ayarlayın ve iğneyi stereo mikroskop altında 45 ila 60 derecelik bir açıyla ilk embriyonun kas dokusuna yerleştirin.

İğneyi gerektiği gibi doku içindeki pozisyonu ayarlamak için yavaşça ileri geri hareket ettirin ve yüklenen süspansiyonu enjekte etmek için mikroenjektör ayak pedalını kullanın. Zebrabalığı embriyolarının dokusuna bir bakteri mikrosfer süspansiyon enjekte ederken, iğne hafifçe ama sabit bir el ile takılmalıdır. Başarılı bir ekleme den sonra, enjeksiyondan önce malzemeler için bir boşluk oluşturulmalıdır.

Tüm embriyolar enjekte edildiğinde, stereo floresan mikroskobu altında başarılı bir enjeksiyon için embriyopuan, ve günlük orta değişiklikler ile 48-iyi plakalar bireysel kuyularda trikotin olmadan E3 ortamda embriyolar korumak. Koloni oluşturan birim nicelleştirme ile enfeksiyon ilerlemesini izlemek için, rastgele enjeksiyondan kısa bir süre sonra bireysel iki mililitrelik mikrotüpler içine beş ila altı canlı enfekte embriyolar transfer ve hafifçe steril PBS ile embriyoları yıkayın. Yıkar attıktan sonra, her tüpe 100 mikrolitre steril PBS ekleyin ve ardından iki ila üç adet steril iki milimetre çapındazirkon boncuk ekleyin.

Sonra 30 saniye boyunca 3, 500 rpm bir homogenizer embriyoezmek ve kültür homojen olarak gösterildiği gibi. Stereo floresan mikroskobu aşamasına %0,02 trikotin içeren E3 ortamı içeren 100 milimetrelik Petri kabı yerleştirin ve Petri kabına 500 mikrolitre %2 metilselüloz ekleyin. Floresan mikroskopisi ile enfeksiyon ilerlemesini izlemek için, uygun parlak alan ve floresan filtrelerdonabilir, bir Petri kabında metilselüloz bir noktada yatay anestezi enfekte embriyolar hizalamak.

160x büyütme de odak içine hasarlı enjekte doku getirmek için parlak alan filtre kullanın. Z-stack derinliğini 10 mikrometreye ve adım boyutunu beş mikrometreolarak ayarlayın ve art arda üç görüntünün kaydedilmesine izin verin. Daha sonra 160x büyütme de aynı optimize ayarları altında bireysel embriyolar görüntü.

Görüntüleri analiz etmek için ImageJ'deki ObjectJ eklentisini kullanın. Staph aureus intramüsküler enjeksiyon embriyolarda doza bağlı bir enfeksiyon başlatır, embriyolarda gözlenen uygun enfeksiyon ilerlemesi ile gün bir ve iki post-enjeksiyon yüksek zorluk dozlarda uygulandı. Gösterildiği gibi, mikrokürelerin varlığı nda veya yokluğunda benzer sayıda bakteri enjekte etmek mümkündür.

Tipik olarak, Staph aureus mCherry 20'den fazla koloni oluşturan birimleri ile tüm embriyolar mikroskobik skorlama altında floresan için pozitif, mikrokürelerin varlığı önemli ölçüde düşük doz da sorunlu embriyolarda enfeksiyon ilerlemesini etkilemez gibi görünse de. Yüksek dosed meydan embriyolarda, mikroskobik skorlama mikrosferli veya mikroküresiz enfekte embriyo sıklığında herhangi bir farklılık göstermez, ancak kantitatif kültür, enjeksiyon dan sonra iki gün içinde Staph aureus grubundan alınanlara kıyasla Staph aureus artı mikrosfer grubundaki embriyolardan alınan daha yüksek koloni oluşturan birim sayılarını ortaya koymaktadır. Bir biyomalzemenin varlığı hem bağışıklık hücresi yanıtını hem de enfeksiyona ilk yatkınlığı etkiler.

Örneğin, enjeksiyon dan sonra beş saat, bir Staph aureus sadece enjeksiyon yanıt olarak makrofaj infiltrasyon önemli ölçüde bir Staph aureus artı mikrosfer enjeksiyonyanıt olarak daha yüksektir, bir gün post-enjeksiyon, mikroküreler ile embriyolar mikrosferler olmadan embriyolar daha Staph aureus enfeksiyonu önemli ölçüde daha yüksek düzeyde sergilerken. İğne ucunun açılmasını her zaman biyomalzemelerin büyüklüğüne göre ayarlamayı ve sadece bakterilerin süspansiyonu ve mikrosfer süspansiyonu ndaki bakteri konsantrasyonu oranını ayarlamak önemlidir. Bu zebrabalığı embriyo modeli in vivo görselleştirme ve enfeksiyon ilerlemesi ve biyomalzemelerin varlığı ve yokluğunda provoke bağışıklık hücresi yanıtları intravital analizi sağlar.

Bu teknik, güvenli tıbbi cihazlar için antimikrobiyal biyomalzemeler ve tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için yeni bir bütün-hayvan modeli sağlar.