Name: Canlı Drosophila melanogaster yumurta Chambers Içinde endojen mrnas görselleştirme ve izleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Öğrenin canlı Drosophila melanogaster yumurta odacıklarında endojen mRNA taşınımını moleküler işaretçiler ve konfokal mikroskopi ile gerçek zamanlı görselleştirme. Bu yöntem RNA biyolojisi ve tedavi hedefleri keşfi için değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz, sentez, etiketleme ve moleküler işaretçileri ve arıtma için Salvatore AE Marras (kamu sağlığı Araştırma Enstitüsü Merkezi, Rutgers Üniversitesi) teşekkür ve Daniel St Johnston (Gurdon Enstitüsü, Cambridge Üniversitesi) Oskar-MS2 için/ MCP-GFP transgenik sinek stok. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı karıyer Ödülü 1149738 ve DPB profesyonel personel Kongresi-CUNY Ödülü tarafından destekleniyordu.

<ol><li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).</li>
<li>Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+for+live-cell+RNA+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes for live-cell RNA detection.</a> Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).</li>
<li>Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+techniques+for+visualizing+RNA+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Current techniques for visualizing RNA in cells.</a> F1000Research. 5, (2016).</li>
<li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+observation+of+transcription+initiation+and+elongation+on+an+endogenous+yeast+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li>
<li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li>
<li>Garcia, J. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS2+coat+proteins+bound+to+yeast+mRNAs+block+5%27+to+3%27+degradation+and+trap+mRNA+decay+products%3A+implications+for+the+localization+of+mRNAs+by+MS2-MCP+system%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system.</a> RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).</li>
<li>Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+beacons%3A+Fluorescent+probes+for+detection+of+endogenous+mRNAs+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).</li>
<li>Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+distribution+and+transport+of+mRNAs+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).</li>
<li>Tyagi, S., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+beacons%3A+probes+that+fluoresce+upon+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization.</a> Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon-based+approach+for+live-cell+imaging+of+RNA+transcripts+with+minimal+target+engineering+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1550(2017).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+microRNAs+by+combining+molecular+beacon+probes+with+T7+exonuclease-assisted+cyclic+amplification+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).</li>
<li>Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+quantification+of+specific+microRNA+using+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Research. 40 (2), e13(2012).</li>
<li>Ko, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+color-tunable+molecular+beacon+to+sense+miRNA-9+expression+during+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis.</a> Scientific Reports. 4, 4626(2014).</li>
<li>Vet, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+four+pathogenic+retroviruses+using+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).</li>
<li>Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+beacons+for+protein-DNA+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular beacons for protein-DNA interaction studies.</a> Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).</li>
<li>Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Functional+Roles+of+Molecular+Beacon+as+a+MicroRNA+Detector+and+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).</li>
<li>Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Beacon+Nano-Sensors+for+Probing+Living+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells.</a> Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).</li>
<li>Ban, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genetic+Purification+of+Ventricular+Cardiomyocytes+from+Differentiating+Embryonic+Stem+Cells+through+Molecular+Beacons+Targeting+IRX-4%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).</li>
<li>Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+beacon-based+real-time+PCR+detection+of+primary+isolates+of+Salmonella+Typhimurium+and+Salmonella+Enteritidis+in+environmental+and+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples.</a> BMC Microbiology. 9, 97(2009).</li>
<li>McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+Oogenesis%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).</li>
<li>Bastock, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="https://www.cell.com/current-biology/abstract/S0960-9822(08)01196-2">Drosophila oogenesis.</a> Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).</li>
<li>Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+oskar+RNA+regulates+oskar+translation+and+requires+Oskar+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein.</a> Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).</li>
<li>Mhlanga, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+colocalisation+of+oskar+mRNA+and+trans-acting+proteins+revealed+by+quantitative+imaging+of+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte.</a> PLoS One. 4 (7), e6241(2009).</li>
<li>Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2018/04/03/294447.abstract">PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiencies+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+contact-mediated+quenching+in+oligonucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), e122(2002).</li>
<li>Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiny+molecular+beacons+for+in+vivo+mRNA+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).</li>
<li>Dean, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+%28pulling%29+of+needles+for+gene+delivery+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor%22%5BJournal%5D)">Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection.</a> Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).</li>
<li>Alami, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+of+TDP-43+mRNA+granules+is+impaired+by+ALS-causing+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations.</a> Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).</li>
<li>Jackson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+Hairpin+DNA-Functionalized+Gold+Nanoparticles+for+Imaging+mRNA+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells.</a> Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).</li>
<li>Zimyanin, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+oskar+mRNA+transport+reveals+the+mechanism+of+posterior+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization.</a> Cell. 134 (5), 843-853 (2008).</li>
<li>Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiny+molecular+beacons%3A+LNA%2F2%27-O-methyl+RNA+chimeric+probes+for+imaging+dynamic+mRNA+processes+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells.</a> ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).</li>
<li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+cytosolic+delivery+of+molecular+beacon+conjugates+and+flow+cytometric+analysis+of+target+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), e69(2008).</li>
<li>Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-linked+molecular+beacons+for+efficient+delivery+and+rapid+mRNA+detection+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 32 (6), e58(2004).</li>
<li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+false-positive+signals+with+nuclease-vulnerable+molecular+beacons+in+single+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (16), e105(2007).</li>
<li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).</li>
<li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+imaging+software+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological imaging software tools.</a> Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).</li>
<li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li>
<li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+germ+granules+are+structured+and+contain+homotypic+mRNA+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Commununications%22%5BJournal%5D)">Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters.</a> Nature Commununications. 6, 7962(2015).</li>
</ol>

Yazarlar, ifşa etmek için ilgi çakışması yoktur.

Drosophila yumurta odalarında endojen mRNA ticaretinin canlı görselleştirme artık pinmol yazılımı ile kolayca tasarlanabilen, spesifik, verimli ve çekirdeksiz dirençli MBS kullanımına dayanır. MBs bir hedef mRNA (tercihen bölgeler ikincil yapısı ücretsiz) içinde benzersiz dizileri algılamak için tasarlanmış spesifik problar, bir transkript olası son derece çözülmüş algılama yapma. Diğer dokular/hücre türleri için bu tekniği/Protokolü benimseyen tek sınırlama, faiz numunesi için MB tesliminin verimliliği...

Uzamsal ve temporal çözünürlüğe sahip dinamik olayları görselleştiren hücre biyolojisi çalışmaları, floresan bazlı canlı hücre görüntüleme tekniklerinin geliştirilmesi ile mümkün hale gelmiştir. Şu anda, In vivo mRNA görselleştirme RNA aptamer-protein etkileşimleri dayalı teknolojiler aracılığıyla elde edilir, organık boyalar RNA aptamer kaynaklı floresans ve nüklik asit prob tavlama1,2, 3. hepsi teklif yüksek özgüllük, hassasiyet ve sinyal-to-background oranı. Ancak RNA aptamer merkezli yaklaşımlar, bir transgeni protein veya organik boya bağlama için gerekli olan yapay yapısal motiflerle RNA 'ya ifade etmek üzere tasarlanan kapsamlı genetik manipülasyon gerektirir. Örneğin, MS2/MCP sistemi, bakteriyofaj MS2 kat proteini (MCP) için bağlayıcı dizinin birden fazla tandem tekrarı içeren bir RNA yapısını ifade eden bir transgeni ve bir floresan proteini kodlayan başka bir transgeni ifade etmesini gerektirir. MCP4,5' e kullanılmış. Bu tür ikincil yapısal motiflerin RNA 'ya ilavesi, hantal floresan etiketli bir proteinle birlikte, yerli RNA süreçlerinin6' nın etkilenmesi konusunda endişeler ortaya çıkmış olabilir. Bu endişeyi ele alan ve ek benzersiz avantajlar sunan bir teknoloji, nüklik asit bazlı yaklaşımdır, moleküler işaretler (MBs). MBS, endojen mrb 'lerin Multiplex tespitine, tek nüklemotid varyasyonlarının ayrımcılığını ve hedef mRNA7,8ile hibridizasyon hızlı kinetiği için izin verir. MBS onlar hedeflerine melezleşme bir kez bir flororojenik Konformasyonel değişikliği geçiren önce bir sönük saç iğne kat kalır oligonükleotit problar (Şekil 1C)9. Birkaç grup, hem kodlama olmayan Rnas 'ları (MicroRNAs ve lncrnas)10,11,12,13, RNA retrovirüsler14 ve dinamik DNA-proteini algılamak için MBS kullanmanın başarısı vardı etkileşimleri15. Onlar başarıyla çeşitli organizmalar ve dokularda, zebra balığı embriyo16, nöronlar13, tümör dokusu17, ayrım kardiyomiyosit18ve Salmonella gibi görüntüleme için istihdam edilmiştir 19 yaşında.
Burada yaşam D. melanogaster yumurta odalarında endojen mrnas için tasarım, teslimat ve algılama yaklaşımı, aktif moleküler taşıma dinamik aralığını yakalamak için yeterince hızlı bir mikroskopi set-up ile birleştiğinde açıklanmaktadır. D. melanogaster yumurta odası, erken germline kök hücre bölünmesi ve maternal gen ifadesinden bölümsel vücut planı20' ye kadar çok çeşitli gelişim çalışmaları için ideal bir çok hücreli model sistemi olarak hizmet vermiştir. 21 yaşında. Yumurta odaları kolayca izole edilir, büyük ve saydam, ve ex vivo analiz saatlerce dayanabilir, onları görüntüleme denemeleri için son derece kolay hale. Çok iş aktif tercüme edilmeden önce ayrık alt hücre bölgelere maternal transkriptleri asimetrik lokalizasyonu üzerinde duruldu. Özellikle, Oskar mRNA lokalizasyonu ve oocayt posterior Pole sonraki çeviri ölümcül bir bicaudal embriyo fenotipi22önlemek için sıkıca düzenlenmiş bir şekilde gerçekleşmesi gerekir. Oskar mRNA, Hemşire hücreleri denilen 15 germline hücrelerinde yazılmış ve aktif olarak sitoplazmik köprüler aracılığıyla taşınan, halka kanalları denilen, oocyte içine, Olgun yumurta olur ve sonuçta döllenen germline hücre (Şekil 1a ). Uzun menzilli hücre içi seyahat ile birlikte, Oskar mrnp ve gelen protein faktörleri dinamik işe alma ve değişimi ile ilgili zaten mevcut bilgi önemli miktarda, Oskar bir tercih aday yapmak çalışma mRNA yaşam döngüsünün birçok süreçleri. MBs mRNA lokalizasyonu süreci ile ilgili detayları açığa ve Drosophila oogenesis sırasında mRNA taşıma kontrol protein faktörlerinin düzenleme ve fonksiyon deşifre etmede enstrümantal olmuştur. Özellikle, MBS 'yi hemşire hücrelerine mikro injeksiyon ve canlı hücre görüntüleme deneyleri yaparak, endojen mrb 'ların takibi mümkündür8,23.
Burada sunulan yol haritası, doğal hücresel ortamında endojen mRNA 'yı izlemek için veri analizini gerçekleştirirken, MBs kullanarak canlı bir hücre görüntüleme deneyi yaparak, görüntüleme verilerini elde ederek tam bir sürecin adımlarını sunar. Adımlar değiştirilebilir ve daha fazla kendi laboratuar ayarı içinde diğer dokular/hücre türleri ile çalışan araştırmacılar ihtiyaçlarını karşılamak için optimize edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Spektroflorometre</td>, <td>Fluoromax-4, Horiba-Jobin Yvon,</td><td>n/a,</td><td>Foton sayma spektroflorometresi,</td></tr><tr><td>Kuvars küvet,</td><td>Fireflysci (eski Precision Cells, Inc.)</td><td>701MFL</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 cımbız</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td>İnce cımbız, tek tek yumurta odalarını ayırmak için çok önemlidir</td></tr><tr><td>Halokarbon yağı 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Kapak kayması, No.1 22 mm x 40 mm</td><td>VWR</td><td>48393-048</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Leica MZ6, Leica Microsystems, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>CO2 meyve sineği anestezi pedi</td><td>Genesee Scienific</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL pH 7.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1185-53-1</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Eğirme diski konfokal mikroskop</td><td>Leica DMI-4000B Yokogawa CSU 10 eğirme diski ile donatılmış ters mikroskop Leica Microsystems, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>PatchMan NP 2 Mikromanipülatör</td><td>Eppendorf Inc.</td><td></td><td></td>920000037</tr><tr><td>FemtoJet Mikroenjektör</td><td>Eppendorf Inc.</td><td></td><td></td>920010504</tr><tr><td>Enjeksiyon iğnesi: Femtotips II</td><td>Eppendorf Inc.</td><td></td><td></td>930000043</tr><tr><td>Yükleme ucu: 20 &mu; L Mikro Yükleyici</td><td>Eppendorf Inc.</td><td></td><td></td>930001007</tr><tr><td>Mikro Kapaklı gözlük no. 1 veya 1,5, 22 mm x 40 mm</td><td>VWR</td><td>48393-026; 48393-172</td><td></td></tr><tr><td>Kuru maya</td><td>Herhangi bir bakkal</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Bilgisayar, > 20 GB RAM</td><td></td><td></td> İşleme <td>çoğu bilgisayarda gerçekleştirilebilse de, daha yüksek yetenekler işlem hızını artıracaktır</td></tr></tbody></table>

canlı drosophila melanogaster yumurta chambers içinde endojen mrnas görselleştirme ve izleme

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Floresan bazlı görüntüleme teknikleri, ışık Mikroskopisinde gelişmelerle birlikte, hücre biyologlarının canlı hücre görüntüleme çalışmaları konusunda devrim yarattı. RNAs algılama yöntemleri, seminal çalışmalarda siteye özel mRNA lokalizasyonu ile gen ifadesi yönetmeliğine bağlı olarak büyük ölçüde genişledi. Dinamik mRNA süreçleri artık mRNAs 'ı algılayan yaklaşımlar aracılığıyla, dinamik moleküler davranış aralığını yakalamak için yeterince hızlı olan mikroskopi ayarlarıyla birlikte görselleştirilebilir. Moleküler işaret teknolojisi, yaşayan hücrelerde endojen transkriptleri doğrudan tespit edebilen bir hybridizasyon tabanlı bir yaklaşımdır. Moleküler işaretler, yalnızca benzersiz bir hedef dizisine hibridizasyon üzerine floresan olan, saç iğne şeklinde, dahili olarak bastırılmış, tek nüklotid ayrımcılık nüklenik asit probları vardır. Gelişmiş Floresan mikroskopisi ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile birleştiğinde, mRNAs 'ın hücre içi hareketinin uzamsal ve temporal takibini gerçekleştirmesini sağlar. Bu teknoloji, endojen transkriptleri tespit edebilen tek yöntem olmasına rağmen, hücre biyologlar canlı hücre görüntüleme için böyle problar tasarlama zorlukları nedeniyle henüz tam olarak bu teknolojiyi kucakladı değil. Yeni bir yazılım uygulaması olan pinmol, canlı hücre içindeki mRNA hedef bölgelerine verimli bir şekilde melezleşme etmek için en uygun problar gelişmiş ve hızlı tasarım sağlar. Buna ek olarak, yüksek çözünürlüklü, gerçek zamanlı görüntü edinme ve akım, açık kaynak görüntü analiz yazılımı, mRNA 'nın yaşam döngüsünde yer alan dinamik süreçlerin temelinin karmaşıklığının daha ince bir değerlendirilmesine yol açan, rafine edilmiş bir veri çıktısı için izin verir.
Burada tasarım ve Drosophila melanogaster yumurta odalarına moleküler işaretler teslim için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Endojen maternal mRNAs 'ın doğrudan ve son derece spesifik tespiti ve görselleştirilmesi, iplik diski konforkop mikroskobu ile gerçekleştirilir. Görüntüleme verileri, oocayt içinde özel bölgelere taşınan ve lokalize olan mRNAs 'ın dinamik hareketi hakkında ayrıntılı bilgi almak için ICG yazılımında nesne algılama ve izleme kullanılarak işlenir ve analiz edilir.

Pinmolkullanarak, birkaç MBS bir mRNA hedefi için tasarlanabilir (Şekil 1B-C). Sentez ve arıtma sonrasında, seçilen MBs karakterizedir ve in vitro analizini kullanarak karşılaştırılır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58545/58545fig1.jpg"> Şekil 1: endojen MRI 'ların canlı hücre görüntülemesinde teknik ve doku tanımı. (A...

Burada, moleküler işaretleri kullanarak canlı Drosophila melanogaster yumurta odasında endojen mRNA kaçakçılığı görselleştirme, algılama, analiz ve izleme için bir protokol sunuyoruz, iplik disk konfokka mikroskopi, ve açık kaynak Analizi Yazılım.

Canlı Drosophila melanogaster yumurta Chambers Içinde endojen mrnas görselleştirme ve izleme

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Bu yöntem, polarize RNA lokalizasyonunun mekanizması ve işlevi hakkında RNA biyoloji alanındaki anahtar soruların yanıtlatılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, canlı dokularda endojen RNA ticaretinin gerçek zamanlı görselleştirilmesine olanak sağlamasıdır. Bu tekniğin etkileri Yeni terapötik hedefleri ortaya çıkarmak için bir potansiyele sahip olduğu için RNA ile ilgili hastalıkların tedavisi ne kadar uzanır.Bu yöntem meyve sinek yumurta odasında RNA süreçleri içine fikir sağlayabilir rağmen, aynı zamanda zebra balığı veya kültür hücreleri gibi diğer sistemlere uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni bireyler tasarım ve moleküler işaret pervane teslim ile ilgili zorluklar nedeniyle mücadele edecek. Moleküler işaret mikroenjeksiyonu için 40X yağ hedefini seçin ve parçalanmış yumurta odasıyla birlikte mikroskop aşamasına bir kapak kayması monte edin.Mikroenjeksiyon için düzgün odaklı orta ve geç gelişim aşamasında bir yumurta odası bulun. Sonra uygun enjeksiyon ve kompanzasyon basınçları ile bir mikroenjektör ayarlayın. Mikro manipülatör joystick kullanarak, yavaşça yağ damla içine moleküler işaret çözeltisi bir mikrolitre ile yüklü bir iğne indirin.İpucunu görüş alanının çevresine doğru odaknoktası haline getirin. İğne ucundan havayı çıkarmak ve iğneden akış olduğundan emin olmak ve iğneyi ev pozisyonuna getirmek için temiz bir fonksiyon gerçekleştirin. Mikroenjekte edilecek yumurta odasına odaklanın ve iğneyi yumurta odasının kenarına yakın bir şekilde tekrar odak haline getirin.Folikül hücrelerini hemşire hücrelerinden ayıran zarın odakta olması için hedefin z-konumunun ince bir ayarını yapın. İğneyi bir hemşire hücresine yerleştirin ve moleküler işaretleri 2-5 saniye boyunca enjekte edin. Tekrarlanabilir mikroenjeksiyon başarısını sağlamak için, mikro manipülatör ile odak içine iğne ucu nu getirirken folikül hücreleri ve enjekte edilecek hemşire hücreleri ayıran membran dikkatle odaklanmak.Tüm moleküler işaretler enjekte edildiğinde, iğneyi yavaşça çıkarın ve ev pozisyonuna geri çekin. Görüntü edinimi için hedefi istenilen büyütmeye değiştirin. Sonra yeni amaç altında yumurta odası odaklanmak ve görüntü edinimi başlar.Moleküler işaretçilerin nokta tespiti için, Resim J.'deki görüntüleri açın.Görüntüleri ICY'ye dönüştürmek için iCY aracını kullanın. Bir ölçek çubuğu otomatik olarak yığının üzerine yerlenir. Gerektiğinde ölçek çubuğunu denetçi penceresinden edin.Ardından, ölçek çubuğunu özgün yığından kaldırmak için katman sekmesinin altındaki ölçek çubuğunun göz simgesini etkinleştirin. Algılama ve izleme, algılama ve nokta dedektörünü seçin ve sırasıyla giriş ve ön işleme parametreleri için geçerli dizi girişi algılama ve kanal sıfırını onaylayın. Dedektör için, yalnızca yığınlarda analizi gerçekleştirmek için yeterli z dilimi yoksa, 3D dalga boylarının kuvvet kullanımını kullanarak karanlık arka plan üzerinde parlak noktayı algıla'yı seçin.Daha büyük noktalar için daha fazla ölçek ekleyerek her ölçek için ölçekler ve duyarlılık seçin ve diziden ilgi bölgesinin ilgi alanı için ayarlı olduğunu onaylayın. Filtreleme için, filtreleme ayarlı olmadığını onaylayın ve çıktı altında uygun dosya biçimini seçin. Spot dedektör sonuçları izleme analizi için kullanılacaksa, yüzme havuzuna export'u seçin.Ortak yerelleştirme analizi için, diğer kanal için nokta algılamasını tekrarlayın. Moleküler işaret noktalarını izlemek için, algılama ve izleme, izleme, nokta izleme seçeneğini belirleyin ve nokta algılama yla aynı parametreleri kullanarak nokta dedektörünü çalıştırın. Tahmin parametrelerini tıklatın ve parametrelertahmin açılır penceresinde istenen hedef hareketi seçin.Ardından çalıştır izlemeyi tıklatın. Parçaları görselleştirmek için algılama ve izleme, izleme ve izleme yöneticisini seçin. Renk izleme işlemcisi için etkinleştir'i seçin ve parçalar için bir renk seçin.Parça işlemcisi ekle'den parça işlemcisi zaman klibini seçin. Denetim makarası penceresinde, geçerli zaman noktasından önce ve sonra gösterilecek algılama sayısını girin. Parça bilgilerini XML izleme dosyası olarak kaydedin ve sonuçların ekran görüntüsünü elde etmek için kamera simgesini kullanın.Yığını z yönü boyunca yansıtmak için eklentiyi bulmak için arama çubuğunu kullanın ve açılır menüden maksimum projeksiyonu seçin. Denetçi penceresinde, görüntüyü istenilen yönlendirmeye ayarlamak ve döndürülen görüntünün ekran görüntüsünü elde etmek için sıra sekmesini, tuvali ve döndürmeyi seçin. Ardından ilgi alanı, 2B ilgi alanı bölgesini seçin, ilgi alanı şekli bölgesini seçin ve kırpma için görüntüdeki ilgi bölgesini seçin.Zaman damgası yerlebir eklentisini yükleyin ve zaman damgasının nasıl yerleştirilip biçimlendirilene ilişkin talimatlar için açılır penceredeki yönergeleri izleyen bir zaman damgası ekleyin. Zaman aralığını değiştirmek veya eklemek için, sıra özellikleri penceresinde yapılan ları tıklatın. Denetçi penceresindeki katman sekmesinin altındaki ölçek çubuğunu geri eklemek için göz simgesini etkinleştirin.Ardından zaman damgalı sonuçların ekran görüntüsünü alın ve görüntüyü hem TIFF hem de AVI formatlarında kaydedin. Bu yöntemde gösterildiği gibi, endojen mRNA'ların taşıma ve lokalizasyon modellerini, oogenezin çeşitli evrelerinde ve özellikle orta oogenezde ve sonra moleküler işaretler le görselleştirmek mümkündür. Aynı evredeki yumurta odalarına ayrı ayrı enjekte edildiğinde, farklı oskar spesifik moleküler işaretler aynı lokalizasyon modelini sunar.Bir hemşire hücresinin sitoplazmasına enjekte edilen moleküler işaretler, bitişik hemşire hücrelerine ve yumurtaya serbestçe yayılır. Böylece, işaretleri hedefleri ile hibridize ve mikroenjeksiyon site dışında diğer sitelerde floresan sinyalleri oluşturmak edebiliyoruz. Orta oogenezde oskar GFP transgenik yumurta odalarında, elde edilen verilerin analizi, moleküler işaretler kullanılarak tespit edilen floresan sinyali ile genetik olarak tasarlanmış GFP etiketli Oskar mRNA'nın floresan sinyali için kapsamlı kolokalizasyon olduğunu göstermektedir.Ayrıca, 5D yığınları hem hemşire hücresinde hem de yumurta sitoplazmasında uzun mesafe taşımacılığı için oskar mRNA yörüngelerini belirlemek için daha fazla analiz edilebilir. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra RNA biyolojisi alanında araştırmacıların Drosophila yumurta odasında endojen maternal mRNA ulaşımını ve lokalizasyonunu keşfetmelerinin önünü açmıştır.

visualizing-tracking-endogenous-mrnas-live-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Bireysel hazırlanması Drosophila</emCanlı Görüntüleme için> Yumurta Chambers

Büyük boyutları ve nispeten basit organizasyonları nedeniyle, Drosophila hemşire hücreleri canlı hücre görüntüleme çalışmaları için idealdir. Bu video, hücrelere eksojen bileşiklerin verilmesi için bir mikroenjeksiyon yöntemini açıklar ve öne çıkan protokol, endojen mRNA transkriptlerini görselleştirmek için kullanılan moleküler işaretler (MB'ler) adı verilen floresan oligonükleotid probları ile prosedürü gösterir.

Drosophila Hemşire Hücrelerinin Mikroenjeksiyonu: Bir Hücre İçi Dağıtım Yöntemi

Bireyin GFP etiketli proteinlerin ya autofluorescent yapıların canlı görüntüleme için bir...

GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Oosit

Bu protokolde açıklanan dik görüntüleme yöntemi, gelişmekte olan bir Drosophila melanogaster yumurtasının kutuplarının ayrıntılı olarak görüntülenmesine olanak sağlar.  Bu uçtan bakış, foliküler epitelde çoklu hücre tiplerinin düzenlemelerine ve morfolojilerine yeni bir bakış açısı sağlar.

Dik Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta Odaları

Işık tabakası bazlı floresan mikroskopisi gelişim biyolojisinde en değerli araçtır. Karşılaştırmalı çalışmalarda önemli bir konu ortam değişkenliğidir. Protokolümüz, birden fazla örneğin eşzamanlı canlı görüntülenmesi için deneysel bir çerçeveyi açıklar ve bu nedenle bu sorunu pro-aktif olarak ele alıp gidermektedir.

Örnek Oda Bazlı Işık Tabakası Floresan Mikroskoplarında Birden Fazla Böcek Embriyosunun EşZamanlı Canlı Görüntülenmesi

Drosophila'da, oosit çekirdeği oogenez sırasında mikrotübül bağımlı göçe uğrar. Burada, yumurta odaları ex-vivo üzerinde canlı görüntüleme yaparak göçü takip etmek için geliştirilen bir protokolü açıklıyoruz. Prosedürümüz, iplik disk konfokal mikroskopi kullanarak çok konumlu 3D hızlandırılmış filmler elde etmek için yumurta odalarını 12 saat boyunca canlı tutar.

Drosophila Oosyte'de Nükleer Göç

Erken Drosophila embriyosunda, birçok organel hareketlidir. Prensip olarak, belirli floresan problar aracılığıyla canlı olarak görüntülenebilirler, ancak yumurta kabuğu embriyoya doğrudan uygulamayı önler. Bu protokol, bu tür probların mikroenjeksiyon yoluyla nasıl tanıtılacağını ve daha sonra parçacık  görüntü velosimetrisi yoluyla toplu organel hareketinin nasıl analiz edileceğini açıklar.

Drosophila Embriyolarında Lipid İçeren Organellerin Sitoiskelete Bağımlı Ticaretinin Görselleştirilmesi

Bu protokol, geleneksel GFP/mCherry etiketi yaklaşımları kullanılarak tespit edilmesi zor olan düşük bolluktaki proteinlerin veya translasyon sonrası modifikasyonların canlı görüntülenmesini sağlamak için özelleştirilmiş antikor bazlı floresan etiketlemeyi ve erken Drosophila embriyolarına enjeksiyonu açıklar.

Floresan Antikor Enjeksiyonu ile Canlı Drosophila Embriyolarında Düşük Bolluktaki Proteinlerin ve Translasyon Sonrası Modifikasyonların Görselleştirilmesi

Burada, Drosophila yumurtalık nişindeki germ hattı kök hücrelerinin (GSC'ler) asimetrik bölünmesinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Spektrozom proteini Par-1'in yeşil floresan proteini (GFP) füzyonunu her yerde ifade eden bir transgenik çizgi kullanıyoruz.

Kadın Drosophila melanogaster Germline Kök Hücre Nişlerinin Genişletilmiş Canlı Görüntülenmesi

Öğrenin canlı Drosophila melanogaster yumurta odacıklarında endojen mRNA taşınımını moleküler işaretçiler ve konfokal mikroskopi ile gerçek zamanlı görselleştirme. Bu yöntem RNA biyolojisi ve tedavi hedefleri keşfi için değerli bilgiler sunar.

Canlı Drosophila melanogaster yumurta Chambers Içinde endojen mrnas görselleştirme ve izleme

Daha fazla video keşfet