Canlı Drosophila melanogaster yumurta Chambers Içinde endojen mrnas görselleştirme ve izleme

Burada, moleküler işaretleri kullanarak canlı Drosophila melanogaster yumurta odasında endojen mRNA kaçakçılığı görselleştirme, algılama, analiz ve izleme için bir protokol sunuyoruz, iplik disk konfokka mikroskopi, ve açık kaynak Analizi Yazılım.

Bu yöntem, polarize RNA lokalizasyonunun mekanizması ve işlevi hakkında RNA biyoloji alanındaki anahtar soruların yanıtlatılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, canlı dokularda endojen RNA ticaretinin gerçek zamanlı görselleştirilmesine olanak sağlamasıdır. Bu tekniğin etkileri Yeni terapötik hedefleri ortaya çıkarmak için bir potansiyele sahip olduğu için RNA ile ilgili hastalıkların tedavisi ne kadar uzanır.

Bu yöntem meyve sinek yumurta odasında RNA süreçleri içine fikir sağlayabilir rağmen, aynı zamanda zebra balığı veya kültür hücreleri gibi diğer sistemlere uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni bireyler tasarım ve moleküler işaret pervane teslim ile ilgili zorluklar nedeniyle mücadele edecek. Moleküler işaret mikroenjeksiyonu için 40X yağ hedefini seçin ve parçalanmış yumurta odasıyla birlikte mikroskop aşamasına bir kapak kayması monte edin.

Mikroenjeksiyon için düzgün odaklı orta ve geç gelişim aşamasında bir yumurta odası bulun. Sonra uygun enjeksiyon ve kompanzasyon basınçları ile bir mikroenjektör ayarlayın. Mikro manipülatör joystick kullanarak, yavaşça yağ damla içine moleküler işaret çözeltisi bir mikrolitre ile yüklü bir iğne indirin.

İpucunu görüş alanının çevresine doğru odaknoktası haline getirin. İğne ucundan havayı çıkarmak ve iğneden akış olduğundan emin olmak ve iğneyi ev pozisyonuna getirmek için temiz bir fonksiyon gerçekleştirin. Mikroenjekte edilecek yumurta odasına odaklanın ve iğneyi yumurta odasının kenarına yakın bir şekilde tekrar odak haline getirin.

Folikül hücrelerini hemşire hücrelerinden ayıran zarın odakta olması için hedefin z-konumunun ince bir ayarını yapın. İğneyi bir hemşire hücresine yerleştirin ve moleküler işaretleri 2-5 saniye boyunca enjekte edin. Tekrarlanabilir mikroenjeksiyon başarısını sağlamak için, mikro manipülatör ile odak içine iğne ucu nu getirirken folikül hücreleri ve enjekte edilecek hemşire hücreleri ayıran membran dikkatle odaklanmak.

Tüm moleküler işaretler enjekte edildiğinde, iğneyi yavaşça çıkarın ve ev pozisyonuna geri çekin. Görüntü edinimi için hedefi istenilen büyütmeye değiştirin. Sonra yeni amaç altında yumurta odası odaklanmak ve görüntü edinimi başlar.

Moleküler işaretçilerin nokta tespiti için, Resim J.'deki görüntüleri açın.Görüntüleri ICY'ye dönüştürmek için iCY aracını kullanın. Bir ölçek çubuğu otomatik olarak yığının üzerine yerlenir. Gerektiğinde ölçek çubuğunu denetçi penceresinden edin.

Ardından, ölçek çubuğunu özgün yığından kaldırmak için katman sekmesinin altındaki ölçek çubuğunun göz simgesini etkinleştirin. Algılama ve izleme, algılama ve nokta dedektörünü seçin ve sırasıyla giriş ve ön işleme parametreleri için geçerli dizi girişi algılama ve kanal sıfırını onaylayın. Dedektör için, yalnızca yığınlarda analizi gerçekleştirmek için yeterli z dilimi yoksa, 3D dalga boylarının kuvvet kullanımını kullanarak karanlık arka plan üzerinde parlak noktayı algıla'yı seçin.

Daha büyük noktalar için daha fazla ölçek ekleyerek her ölçek için ölçekler ve duyarlılık seçin ve diziden ilgi bölgesinin ilgi alanı için ayarlı olduğunu onaylayın. Filtreleme için, filtreleme ayarlı olmadığını onaylayın ve çıktı altında uygun dosya biçimini seçin. Spot dedektör sonuçları izleme analizi için kullanılacaksa, yüzme havuzuna export'u seçin.

Ortak yerelleştirme analizi için, diğer kanal için nokta algılamasını tekrarlayın. Moleküler işaret noktalarını izlemek için, algılama ve izleme, izleme, nokta izleme seçeneğini belirleyin ve nokta algılama yla aynı parametreleri kullanarak nokta dedektörünü çalıştırın. Tahmin parametrelerini tıklatın ve parametrelertahmin açılır penceresinde istenen hedef hareketi seçin.

Ardından çalıştır izlemeyi tıklatın. Parçaları görselleştirmek için algılama ve izleme, izleme ve izleme yöneticisini seçin. Renk izleme işlemcisi için etkinleştir'i seçin ve parçalar için bir renk seçin.

Parça işlemcisi ekle'den parça işlemcisi zaman klibini seçin. Denetim makarası penceresinde, geçerli zaman noktasından önce ve sonra gösterilecek algılama sayısını girin. Parça bilgilerini XML izleme dosyası olarak kaydedin ve sonuçların ekran görüntüsünü elde etmek için kamera simgesini kullanın.

Yığını z yönü boyunca yansıtmak için eklentiyi bulmak için arama çubuğunu kullanın ve açılır menüden maksimum projeksiyonu seçin. Denetçi penceresinde, görüntüyü istenilen yönlendirmeye ayarlamak ve döndürülen görüntünün ekran görüntüsünü elde etmek için sıra sekmesini, tuvali ve döndürmeyi seçin. Ardından ilgi alanı, 2B ilgi alanı bölgesini seçin, ilgi alanı şekli bölgesini seçin ve kırpma için görüntüdeki ilgi bölgesini seçin.

Zaman damgası yerlebir eklentisini yükleyin ve zaman damgasının nasıl yerleştirilip biçimlendirilene ilişkin talimatlar için açılır penceredeki yönergeleri izleyen bir zaman damgası ekleyin. Zaman aralığını değiştirmek veya eklemek için, sıra özellikleri penceresinde yapılan ları tıklatın. Denetçi penceresindeki katman sekmesinin altındaki ölçek çubuğunu geri eklemek için göz simgesini etkinleştirin.

Ardından zaman damgalı sonuçların ekran görüntüsünü alın ve görüntüyü hem TIFF hem de AVI formatlarında kaydedin. Bu yöntemde gösterildiği gibi, endojen mRNA'ların taşıma ve lokalizasyon modellerini, oogenezin çeşitli evrelerinde ve özellikle orta oogenezde ve sonra moleküler işaretler le görselleştirmek mümkündür. Aynı evredeki yumurta odalarına ayrı ayrı enjekte edildiğinde, farklı oskar spesifik moleküler işaretler aynı lokalizasyon modelini sunar.

Bir hemşire hücresinin sitoplazmasına enjekte edilen moleküler işaretler, bitişik hemşire hücrelerine ve yumurtaya serbestçe yayılır. Böylece, işaretleri hedefleri ile hibridize ve mikroenjeksiyon site dışında diğer sitelerde floresan sinyalleri oluşturmak edebiliyoruz. Orta oogenezde oskar GFP transgenik yumurta odalarında, elde edilen verilerin analizi, moleküler işaretler kullanılarak tespit edilen floresan sinyali ile genetik olarak tasarlanmış GFP etiketli Oskar mRNA'nın floresan sinyali için kapsamlı kolokalizasyon olduğunu göstermektedir.

Ayrıca, 5D yığınları hem hemşire hücresinde hem de yumurta sitoplazmasında uzun mesafe taşımacılığı için oskar mRNA yörüngelerini belirlemek için daha fazla analiz edilebilir. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra RNA biyolojisi alanında araştırmacıların Drosophila yumurta odasında endojen maternal mRNA ulaşımını ve lokalizasyonunu keşfetmelerinin önünü açmıştır.