Name: Dize birleştirme gRNA için özelleştirilebilir bir protokol klonlama (STAgR) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Öğrenin, CRISPR/Cas9 uygulamaları için çoklu gRNA vektörlerinin hızlı ve özelleştirilebilir klonlanması amacıyla geliştirilen STAgR yöntemini. Bu protokol, genetik mühendisliği araştırmalarında verimliliği artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Prof. Dr. Stephan Beck ve Prof. Dr. Jovica Ninkovic giriş için teşekkür ederiz, yardım ve STAgR yöntemi gelişmekte olan destek istiyorum. Tobias Klötzer, Anna Köferle ve Valentin Baumann yararlı yorumlar için. İş DFG (STR 1385/1-1) tarafından desteklenmiştir.

1. strateji klonlama STAgR tasarımını
<ol><li>Kaç gRNA kaset bir ifade vektör ve hangi sırada dahil olacağına karar verin. Hangi rehberleri ve gRNA belirlemek iskele her gRNAs için kullanılmalıdır. GRNAs herhangi bir çevrimiçi araç (Örneğin, www.benchling.com) kullanarak tasarlayın.</li>
</ol>2. astar ile çıkıntılar klonlama STAgR tasarımını
Not: Son gRNA anlamda protospacer dizisi ve ilk gRNA antisens sırasıyla eklenir vektör omurga (Şekil 1) amplifikasyon için kullanılan PCR astar. Kalan dizileri böylece anlam ve istenen sırada antianlamlı gRNAs ekleme dizeleri, güçlendirilmiş. İlk dize parça ilk gRNA bir çıkıntı olarak N20 serisi içeren bir ileri astar ve ikinci gRNA N20 serisi (geriye doğru tamamlayıcı) olarak bir çıkıntı ile ters bir astar ile güçlendirilmiş. Aşağıdaki parça buna göre oluşturulur.
<ol><li>N20 gRNA dizileri ileri amplifikasyon astar (Tablo 1) sarkma gibi STAgR DNA dizesi için ekleyin. Anlamda gRNA dizileri 5' (için geleneksel bir iskele) ileri astar "scf-FP" veya "sam-FP" (için bir MS2 içeren iskele) ekleyin. FP astar ilgili STAgR dize (Şekil 1) iskele/MS2 parçası tavlamak.</li>
	<li>Geriye doğru tamamlayıcı N20 gRNA sıra ters astar serileri ekleyin. RP astar belirli rehberleri ve kullanılan Dizgiler (hU6-RP, RP mU6, 7sK-RP, H1-RP) bağlı olarak seçin.</li>
</ol>3. nesil STAgR parçaları klonlama
<ol><li>PCR Gibson derleme için bireysel klonlama parçaları üretmek için yüksek sadakat (HF) arabellek, 10 mM dNTPs 1 µL, 0,25 µL çıkıntı-astar (100 µM), 10 10 µL kadar ayarlayarak gerçekleştirmek şablonu (dize veya vektör), 0,5 µL DNA HF polimeraz ng , Dimetil sülfoksit (DMSO) 1,5 µL ve son hacmi 50 µL yapmak için H2O ekleyin. Not: SAM Scaffold seçilirse plazmid "STAgR_Neo" bir şablon olarak omurga PCR için son gRNA için gRNA iskele dahil kullanmak için "STAgR_SAM" kullanın. STAgR plazmid ile altı gRNA kasetler için örneğin, altı PCR DNA ile beş şablonları ve şablon olarak vektör omurga ile dizeleri gereklidir.</li>
	<li>Aşağıdaki koşullar kullanarak bir thermocycler reaksiyonlar kuluçkaya: 98 ° C 1 döngüsü için 1 dk 30 sn; 38 98 ° C devredir 10 s, (için gRNA iskele) 59 ° C / 68 ° C (SAM döngü) 10 s, 30 72 ° C s (için ekler) / 1 dk 30 s (için vektörel çizimler); 1 çevriminde 10 dk 72 ° c.</li>
	<li>5.5 µL PCR reaksiyon gelen kaldırmak, yükleme boya eklemek ve % 1'özel jel güçlendirilmiş parçaları analiz. Yük (100 bp DNA merdiven/1 kb DNA merdiven) işlemi ve Çalıştır uygun jel çalışan bir jel için uygun bir DNA merdiven arabellek (Örneğin, TLE arabellek) 120 V 30 dk için.</li>
	<li>Jel çalışırken, Restriksiyon enzimi ve 0.5 µL ile sağlanan arabellek 5 µL eklemek Dpnkalan 44,5 µL PCR reaksiyon için ben (10 adet) ve 1 h 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya</li>
	<li>DNA arıtma manyetik boncuklar kullanarak gerçekleştirin.<ol>
<li>1 µL PCR ürününün başına 1.8 µL manyetik boncuklar ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın. (RT) Oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.</li>
		<li>Boncuk ve DNA parçalarının bir mıknatıs ile kalan sıvı ayırmak. Boncuk % 70 etanol ile iki kez tamamen resuspending olmadan Pelet durulama ile yıkayın.</li>
		<li>Bir pipet ile tüm etanol çıkarın ve kuru Pelet hava girsin.</li>
		<li>Yukarı ve aşağı pipetting tarafından 15-20 µL H2O Pelet dağıtılması ve boncuk sıvıdan bir mıknatıs kullanarak ayırın. Açık süpernatant için yeni bir tüp aktarın. Not: Alternatif olarak, sütunlara göre tepki temizlik kitleri kullanılabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Başka bir yerde29açıklandığı gibi bir spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonu belirlemek.</li>
</ol>4. Gibson derleme tepki ve bakteriyel dönüştürme
Not: Aşağıdaki adımları Gibson ve ark. adapte olmuşlardır 30.
<ol><li>Reaksiyon karıştırın ya da ticari bir Gibson klonlama setini kullanın ev yapımı bir Gibson hazırlayın.<ol>
<li>3 mL 1 M Tris (Tris (hydroxymethyl) aminomethane) birleştirmek-HCl pH 7.5, 1 M MgCl, 100 mM dGTP (deoxyguanosine trifosfat) 60 µL, 100 mM dATP (deoxyadenosine trifosfat) 60 µL, 100 mM dTTP (deoxythymidine trifosfat) 60 µL, 100 mM dCTP (60 µL 300 µL deoxycytidine trifosfat), 300 µL 1 m DTT (dithiothreitol), PEG-8000 (Polietilen glikol), 300 µL (Nikotinamid adenin dinükleotit) 100 mm NAD 1.5 g ve 6 mL 5 × izotermal tepki arabelleği elde etmek için H2O ekleyin. Not: Bölünmemeli arabellek-20 ° C'de en az 12 ay süreyle saklanabilir.</li>
		<li>Gibson derleme master için mix, 5 x izotermal tepki arabelleği 320 µL H2O 697 µL ile birleştirmek ve 10 U/µL T5 eksonükleaz 3 µL, 2 U/µL DNA polimeraz 20 µL ve 40 U/µL Taq DNA ligaz 160 µL ekleyin. Not: Bu karışımı bölünmemeli ve saklı-20 ° C'de en az 12 ay için olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Derleme ana Mix 7.5 µL Ekle ve vektör 2.5 µL ile kullanın. 2 x STAgR reaksiyon için molar vektör oranı 1:1 ama fazla 0.2 pmol DNA'ın toplam eklemek için kullanın. 2'den fazla gRNA ifade kaset, bir vektör oranı 1:3 eklemek için kullanın ama 0.5 pmol toplam DNA miktarı fazla olamaz. Not: Tüm güçlendirilmiş gRNA ifade kaset ekimolar miktarlarda kullanılması gerekir. Plazmid denetim vektör ama sindirilmemiş şablon vektör (ve/veya kendi kendine ligasyonu) için denetim yok ekler aynı miktarda içerir.</li>
	<li>Örnekleri buz üzerinde 45-60 dk. mağaza örnekleri için 50 ° C'de veya sonraki dönüşüm-20 ° C'de kuluçkaya. Not: Protokol burada duraklatılmış.</li>
	<li>Doğrudan karışımı yarısını kimyasal olarak yetkili bakteri dönüşümü.<ol>
<li>Kimyasal olarak yetkili TOP10 E. coli bakteri buz çözme.</li>
		<li>Gibson karışımı 5 µL yetkili bakterilerin 50 µL ekleyin. Tüp alt flicking tarafından karışımı yavaşça. 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>Isı şok tüpü 42 ° C su banyosu ya da 45 için bir ısı blok yerleştirerek gerçekleştirmek s.</li>
		<li>Tüpler geri buza koy. SOC orta 250 µL bakteri için eklemek ve onları titreyen bir kuluçka 30-45 dk 37 ° C'de kurtarmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sonra kurtarma, dönüştürülmüş bakteri % 1.5 lysogeny suyu (LB) ağar kaplamalar ampisilin içeren üzerine plaka (100 µg / mL) ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya</li>
</ol>5. STAgR klonlar bakteriyel koloni PCR tarafından seçilmesi
<ol><li>200 µL PCR reaksiyon tüpler (3 ila 24) en az iki takım da aynı şekilde etiketlenir her yapı için hazır olun.</li>
	<li>Bir set ile 100 µL LB orta 100 µg içeren dolgu / mL ampisilin.</li>
	<li>Bir bakteriyel koloninin biyolojik malzeme kapalı scratch için steril pipet ucu kullanın ve boş 100 µL PCR reaksiyon tüp alt kısmında yayıldı. Hemen ucunu LB orta içeren ikinci karşılık gelen tepki tüp aktarın.</li>
	<li>İpucu çevresinde bazı bakteri LB medyaya transfer edilir ve daha sonra kullanmak için 37 ° C'de kuluçkaya emin olmak için yavaşça girdap.</li>
	<li>PCR ana mix (reaksiyon başına 10 µL) ayarlayın.<ol>
<li>10, birleştirmek 10 µL Taq tampon, 2 µL 10 mM dNTPs, astar (100 µM), Taq polimeraz 0.5 µL 0.5 µL ve H2O 100 µL bir birime ekleyin.</li>
		<li>Aşağıdaki astar kullanın: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Etiketli PCR reaksiyon tüpler LB ortamı olmadan 10 µL PCR ana karışımı ekleyin.</li>
	<li>Aşağıdaki koşullar kullanarak bir thermocycler reaksiyonlar kuluçkaya: 1 döngüsü 38 94 ° C devredir 30 94 ° C 5 min için s, 30 55 ° C s, 72 ° C için 2 dk; 1 çevriminde 10 dk 72 ° c. Not: Uzama süresi (72 ° C adım) gRNA ifade kaset sayısı artırılmalıdır. Tablo 2 kullanarak ekler teorik boyutunu hesaplamak ve 1 kb başına 1 dk 72 ° C'de kullanın</li>
	<li>Yükleme boya ekleyin ve % 1'özel jel güçlendirilmiş parçaları analiz. Boyutlandırma için uygun bir DNA merdiveni yük (1kb DNA merdiven) ve 120 V 30 dk için arabellek (Örneğin, TLE arabellek) çalıştıran içinde uygun jel çalıştırın.</li>
	<li>Amplicon teorik boyutu Tablo 2 yardımı ile kullanılan rehberleri, gRNA iskele ve N20 sıraların sayısını bireysel boyutları kadar ekleyerek hesaplar. PCR koloninin sonuçlarından, doğru Grup boyutu ve bunların doğru vektörel çizimler liman olasılığı olup göre bakteriyel klonlar tanımlayın.</li>
	<li>2,5 mL gecede LB Kültür (ile 100 µg/mL ampisilin) daha önceden ayarladığı karşılık gelen 100 µL kültür ile aşılamak. 12 h için 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Plazmid DNA bir ticari plazmid mini kit ve üreticisinin yönergeleri31kullanarak ayıklayın.</li>
	<li>Aşağıdaki primerler kullanılarak plazmid dizi: StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) ve StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) tarafından Sanger sıralama.</li>
</ol>

<ol><li>Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+CRISPR-Cas+immune+systems+and+molecular+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Diversity of CRISPR-Cas immune systems and molecular machines.</a> Genome Biol. 16, 247(2015).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Pulecio, J., Verma, N., Mejia-Ramirez, E., Huangfu, D., Raya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-Based+Engineering+of+the+Epigenome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-Based Engineering of the Epigenome.</a> Cell Stem Cell. 21 (4), 431-447 (2017).</li>
<li>Köferle, A., Stricker, S. H., Beck, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26089986">Brave new epigenomes: the dawn of epigenetic engineering.</a> Genome Med. 7 (1), 59(2015).</li>
<li>Stricker, S. H., Koferle, A., Beck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+profiles+to+function+in+epigenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">From profiles to function in epigenomics.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (1), 51-66 (2017).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li>
<li>Maeder, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+RNA-guided+activation+of+endogenous+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes.</a> Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).</li>
<li>Lekomtsev, S., Aligianni, S., Lapao, A., Burckstummer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+and+reversion+of+chromosomal+translocations+using+CRISPR%2FCas+technology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Efficient generation and reversion of chromosomal translocations using CRISPR/Cas technology.</a> BMC Genomics. 17 (1), 739(2016).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+site-specific+chromosomal+translocations+in+embryonic+stem+cells+by+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Induction of site-specific chromosomal translocations in embryonic stem cells by CRISPR/Cas9.</a> Scientific Reports. 6, 21918(2016).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+genomic+fragment+deletion+and+functional+gene+cassette+knock-in+via+Cas9+protein+mediated+genome+editing+in+one-cell+rodent+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Large genomic fragment deletion and functional gene cassette knock-in via Cas9 protein mediated genome editing in one-cell rodent embryos.</a> Scientific Reports. 5, 17517(2015).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+genomic+fragment+deletions+and+insertions+in+mouse+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Large genomic fragment deletions and insertions in mouse using CRISPR/Cas9.</a> PLoS ONE. 10 (3), 0120396(2015).</li>
<li>Shen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+modification+by+CRISPR-Cas9+nickase+with+minimal+off-target+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects.</a> Nature Methods. 11 (4), 399-402 (2014).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
<li>Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapidly+evolving+homing+CRISPR+barcodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapidly evolving homing CRISPR barcodes.</a> Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).</li>
<li>Chavez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+Cas9-mediated+transcriptional+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming.</a> Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).</li>
<li>Bultmann, S., Stricker, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entering+the+post-epigenomic+age%3A+back+to+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Entering the post-epigenomic age: back to epigenetics.</a> Open Biology. 8 (3), (2018).</li>
<li>Vora, S., Tuttle, M., Cheng, J., Church, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+stop+for+the+CRISPR+revolution%3A+RNA+guided+epigenetic+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Next stop for the CRISPR revolution: RNA guided epigenetic regulators.</a> FEBS Journal. , (2016).</li>
<li>Maddalo, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25337876">In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system.</a> Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).</li>
<li>Nageshwaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+Guide+RNA+Cloning+for+Mammalian+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li>
<li>Wrighton, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology%3A+Multiplex+genome+engineering+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology: Multiplex genome engineering in eukaryotes.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (1), 6-7 (2018).</li>
<li>Yan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+CRISPR%2FCas9-based+genome+engineering+enhanced+by+Drosha-mediated+sgRNA-shRNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure.</a> Scientific Reports. 6, 38970(2016).</li>
<li>Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+CRISPR%2FCas9-based+genome+engineering+from+a+single+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector.</a> Nucleic Acids Research. 42 (19), 147(2014).</li>
<li>Cress, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPathBrick%3A+Modular+Combinatorial+Assembly+of+Type+II-A+CRISPR+Arrays+for+dCas9-Mediated+Multiplex+Transcriptional+Repression+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPathBrick: Modular Combinatorial Assembly of Type II-A CRISPR Arrays for dCas9-Mediated Multiplex Transcriptional Repression in E. coli.</a> ACS Synthetic Biology. 4 (9), 987-1000 (2015).</li>
<li>Port, F., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmenting+CRISPR+applications+in+Drosophila+with+tRNA-flanked+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs.</a> Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).</li>
<li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+step+generation+of+customizable+gRNA+vectors+for+multiplex+CRISPR+approaches+through+string+assembly+gRNA+cloning+%28STAgR%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR).</a> PLoS ONE. 13 (4), 0196015(2018).</li>
<li>Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitation of DNA and RNA.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymology. 498, 349-361 (2011).</li>
<li>Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManiatis%2C+T+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1982).</li>
<li>Koferle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CORALINA%3A+a+universal+method+for+the+generation+of+gRNA+libraries+for+CRISPR-based+screening%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening.</a> BMC Genomics. 17 (1), 917(2016).</li>
<li>Koferle, A., Stricker, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Universal+Protocol+for+Large-scale+gRNA+Library+Production+from+any+DNA+Source%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56264(2017).</li>
<li>Vidigal, J. A., Ventura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+one-step+generation+of+paired+gRNA+CRISPR-Cas9+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries.</a> Nature Communications. 6, 8083(2015).</li>
<li>Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+in+human+cells+using+all-in-one+CRISPR%2FCas9+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system.</a> Scientific Reports. 4, 5400(2014).</li>
<li>Xie, K., Minkenberg, B., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boosting+CRISPR%2FCas9+multiplex+editing+capability+with+the+endogenous+tRNA-processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (11), 3570-3575 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada gRNA ifade plazmid büyüklü küçüklü hızlı ve basit nesil izin STAgR için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı için gRNA Plasmid'ler ile 2 – 8 gRNA ifade kaset (veya iki MS2 RNA aptamers olmadan), tek adımlı nesil gRNA ifade vektör STAgR_Neo ve insan U6, fare U6, insan 7sK ve insan H1 Rehberleri28 kullanımı içine kullanılabilir ,32,33. Dörtten fazla kaset istenirse, bu verimliliği artırmak için en az iki farklı organizatörü/iskele türü kullanmak için tavsiye edilir. Başka vektörler, organizatör ve organizatörü kombinasyonları yanı sıra fazla 8 gRNA kasetler de mümkün olabilir; Ancak, bu test edilmemiştir. Her ne kadar Yöntem güvenilir ve tekrarlanarak çalışır deneyim, biz kritik adımlar belirlemiştir ve sorun giderme stratejileri beklenen sonucu hemen olmamalıdır. Deneyimlerimize göre bazı yaklaşım başarısı için çok önemli adımlardır: her şeyden önce vektör omurgasına ekler doğru molar oranları Gibson derleme adım (3:1) kullanılması önemlidir. Ancak, biz bile gRNA kaset numarası iki aştığında bazı gRNA setleri için ekler vektör 1:1 oranında yararlı olduğunu fark ettim. İkinci olarak, Gibson derleme tepki süresi yeterince uzun olmalıdır (en az 45 dk önerilir).
STAgR çok sayıda değişiklikleri ile istihdam edilebilir. Hedef sıraları, gRNA sayı ve iskele, organizatör ve vektör omurgalarına özelleştirilebilir ve serbestçe kombine. Ancak, her kombinasyon biraz farklı gereksinimleri olabilir. Bizim deneyim, orta veya yüksek sayıda gRNA kaset (> 4) istenen ama elde değil hemen, genellikle bireysel gRNA kaset vektör sırasını değiştirmek için bu sorunu aşmak için en hızlı yol olduğunu. Benzer şekilde, farklı gRNA rehberleri ve iskele birleştirerek daha etkili olmasını sağlar (ve böylece toplam zorunda koloni PCR gerekli sayıda düşürür) ne zaman birçok gRNA kasetler klonlanmış. Biz yanlış klonlar genellikle Gibson derleme sırasında yinelenen dizileri spontan birlikte tarafından oluşturulan bulundu. Her ne kadar bu yöntem verimliliğini azaltabilir, vektörel çizimler fonksiyonel gRNA alt kümeleri28ile eşzamanlı nesil aynı zamanda sonuçlanır.
GRNA vektörel çizimler içeren birden fazla gRNA ifade kaset çoğullama nesil farklı yöntemler21,22,23,24,25bir dizi ile bildirilmiştir, 26,27. Bazı aynı anda veya ardışık gRNA çiftleri22,34klonlama istihdam ederken, diğerleri Golden Gate derleme ve birkaç sıralı klonlama adımları25,35bağlıdır. Özel bir yaklaşım tarafından Xie vd., bir tek yaratıcı transkript36dışarı birkaç gRNAs kesmek için endojen hücresel tRNA işleme sistemi istihdam ederek kullanılmıştır. Advangetage bu yöntemin yalnızca bir organizatörü gereksinimdir; Yeni sentezlenmiş DNA parçalarının ihtiyacını her gRNA kombinasyon dezavantajıdır. Her gRNA yöntemi çoğullama avantajları ve dezavantajları vardır; STAgR verimlilik, düşük maliyetle mümkün gRNA kaset sayısının yüksek sadeliği birleştirir.
STAgR (ve diğer çoğullama sistemleri) büyük olasılıkla zebra balığı beyin28öncülük birden çok gen vivo, verimli (ve eşzamanlı) çalışmasının etkinleştirme vesile olacaktır. Başka bir gelecek gRNA çoğullama vektörel çizimler indüksiyon veya baskı tek gen aksine tam transkripsiyon programları manipülasyon için söz uygulamadır. Büyük olasılıkla, bu yaklaşımların dönüşüm hücre ve organların, bugün mümkün olduğundan çok daha yüksek bir dereceye kadar olacak izin verir.

Dize birleştirme gRNA (STAgR) klonlama kaset bir tek klonlama içinde adım birden çok gRNA ifade içeren ifade vektörlerin verimli gecede üretimi sağlayan bir yöntemdir. STAgR protokol sorumlusu uzmanlık veya malzeme üzerinde bağlı değildir ve özelleştirme için birden çok seçenek sunuyor.
Bakteriyel CRISPR protein Cas9 benzersiz bir kapasitesi vardır. Bulmak ve seçmeli olarak sadece doğal olarak meydana gelen crRNAs veya mühendislik gRNAs1kodlanmış DNA dizileri bağlamak yapabiliyor. Onun kullanımı moleküler bir araç olarak çok sayıda imkansız, olanaksız yaklaşımlar veya belirli hücresel modellere yakın zamana kadar sadece sınırlı sağlamıştır. Bunlar, hedeflenen gen mutasyonlar2, genom mühendislik3,4,5,6, transkripsiyon harekete geçirmek ve7,8susturmak gen düzenleme epigenome içerir. CRISPR evrensel konuşlandırılabilir, uygulama raporları bildiğim kadarıyla geniş hedef siteleri, hücre tipleri ve türler için adlı biri yok. Ancak, birçok CRISPR uygulama genomik manipülasyonlar (translokasyonlar9,10,11 orta ve büyük ölçekli genomik değişiklikler bir dizi de dahil olmak üzere birden çok gRNAs teslimde doğrudan veya dolaylı olarak bağlı 12 , 13), genom mühendislik (Cas9 nickases14kullanımı), koşullu allelleri11,15 veya seri mutasyonlar16üretimi ve stratejileri17izleme. Ayrıca, birden çok hedefleme siteler değildir diğer yaklaşımlar için (transkripsiyon mühendislik18, epigenome mühendislik19,20) kesinlikle zorunlu, ancak onlar sadece altında bu kez maksimum etkisi ulaşmak koşul.
Birkaç yararlı yöntem birden fazla gRNA ifade kaset21,22,23,24,25,26içeren gRNA vektörel çizimler oluşturmak için tarif var, 27. Burada, onun sadelik birleşimindeki outstanding ve (sadece bir gecede klonlama adım gereklidir) hız, düşük mal (DNA şablonlar birden çok kez yeniden kullanılabilir gibi), bir protokol STAgR, klonlama, dize derleme gRNA için mevcut customizability (için farklı gRNA sistemleri ve rehberleri) ve etkinliği (, gRNA kaset sayısının fazlalığı içeren vektörel çizimler nesil sağlar)28.
STAgR prensip olarak ifade vektörler kaç (1-2 gRNAs) ile oluşturmak için kullanılabilir, birkaç (3-5 gRNAs) ve bazı ifade kaset en yüksek sayısı (6-8 gRNAs)28defa bildirdi. Benzer şekilde, STAgR herhangi bir gRNA sıra, omurga veya organizatörü için geçerlidir. Polimeraz zincir reaksiyonları (PCR) ve Gibson derleme STAgR esas olarak ancak, dayalı olduğundan, gRNAs yüksek sıra benzerlikler ile alternatif bir yöntem kullanarak oluşturulan.

<table><tbody><tr><td>Gibson Master Mix ve tüm PCR'ler için</td> <td>Phusion Yüksek Kaliteli DNA Polimeraz</td><td>NEB</td><td>M0530L</td> Polimeraz</tr><tr><td>dNTP'ler</td><td>Yaşam Teknolojisi</td><td>Tüm PCR'ler için</td><td>R0191</td> dNTP'ler</tr><tr><td>dATP</td><td>Yaşam Teknolojisi</td><td>Gibson Master Mix için R0141 dNTP'ler</td><td></td></tr><tr><td>dCTP</td><td>Yaşam Teknolojisi</td> Gibson Master Mix için <td>R0151</td><td>dNTP'ler</td></tr><tr><td>dGTP</td><td>Yaşam Teknolojisi</td><td>Gibson Master Mix</td>dTTP Life Technology için <td>R0161</td> dNTP'ler</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>443666A</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>R0176S</td> AMPure XP Boncukları <td></td></tr><tr><td>DNA temizliği için</td><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td></tr><tr><td>Gibson Master Mix</td>DTT için<td>Tris HCL</td><td>Roth</td><td>9090.2</td></tr><tr><td></td><td>Gibson Master Mix</td>PEG 8000 VWR için <td>Yaşam Teknolojisi</td><td>R0861</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Gibson Master Mix</td>NAD için <td>RC-077</td></tr><tr><td></td><td>Cayman Chemicals Company</td><td>16077</td><td>Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>T5 için Eksonükleaz</td><td>NEB</td><td>M0363S</td><td>Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>için Taq DNA Ligaz</td><td>NEB</td><td>M0208S</td><td>Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>SigmaAldrich için</td><td>PHR1393-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNA Merdiveni 1 kb Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid Mini Kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid ve Primer Dizileri</td><td></td><td></td><td>Tüm diziler Figshare'de (https://goo.gl/UGdc3Q) mevcuttur.</td></tr><tr><td>TLE</td><td>Tampon</td>MgCl için <td>PanReacAppliChem</td><td>6381-92-6</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Gibson Master Mix</td>Top10 kimyasal olarak yetkin bakteri için <td>SigmaAldrich</td><td>M8266</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>C404003</td><td></td></tr><tr><td>SOC Orta</td><td>Thermo Scientific</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>Maya- SigmaAldrich</td><td></td><td>Y1625</td><td>Özü lizojenik et suyu (LB Media)</td></tr> <tr><td>NaCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>S7653</td><td>lizojenik et suyu için (LB Media)</td></tr> Lizojenik <tr>et suyu için <td>Peptone</td><td>SigmaAldrich</td><td>91249</td><td>(LB Media)</td></tr> <tr><td>Agar-Agar</td><td>SigmaAldrich</td><td>5040</td><td>lizojenik et suyu için (LB Media)</td></tr> <tr><td>Taq DNA</td><td>Polimeraz Quiagen</td><td>201203</td><td></td></tr></tbody></table>

dize birleştirme grna için özelleştirilebilir bir protokol klonlama (stagr)

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

Bakteriyel CRISPR/Cas9 sistem metodolojik seçenekleri yaşam bilim adamları için önemli ölçüde artmıştır. Onun kullanımı nedeniyle, genetik ve genomik mühendisliği sistemlerinin büyük bir aralığı için geçerli oldu. Ayrıca, birçok transkripsiyon ve epigenomic mühendislik yaklaşımlar şimdi genellikle mümkün ilk kez. CRISPR geniş uygulanabilirliği için bir neden önerebilirim, doğa yatıyor. Küçük gRNAs kompleks genomik hedefleri, protein Cas9 türevleri ve yerel moleküler sonuçları belirler. Ancak, pek çok CRISPR yaklaşım birden fazla gRNAs aynı anda teslim tek tek hücrelere göre değişir. Burada, biz dize derleme gRNA (STAgR) klonlama için özelleştirilebilir bir iletişim kuralı mevcut, çoğaltılmış gRNA basit, hızlı ve verimli nesil ifade vektörel çizimler içinde bir tek klonlama sağlayan bir yöntem adım. STAgR düşük maliyetli, çünkü gRNA ifade kaset uzun DNA şablonlar birden çok kez yeniden kullanılmış olabileceği gibi (Bu protokol için) bireysel hedefleme dizileri kısa çıkıntı astar tarafından tanıtıldı. Ayrıca, STAgR gRNAs, çok sayıda yanı sıra farklı gRNA türevleri, vektörel çizimler ve organizatör kombinasyonları tek adım birleşme olanak sağlar.

Eldeki protokol sonrası özelleştirilmiş çoğullama gRNA vektörler uygulanabilir (Şekil 1) üretimi yapar. Altı farklı gRNA kaset kullanarak STAgR yaklaşımların temsilcisi sonuçları Şekil 2' de tasvir edilmektedir. Resim 2 A STAgR adet (3.1-3.3 iletişim kuralı) elde etmek için kullanılan PCR tipik bir sonucu gösterir. Altı amplicons (BB, S1-S5) amaçları bireysel gRNA N20 dizileri içeren doğrusal DNA parçaları temsil eder. Plazmid omurga (BB) şimdi gRNA1 ve gRNA6 hedefleme dizileri ile genişletilir ve bu nedenle iki diğer PCR (S1 ve S5) Gibson derleme (Şekil 2A, Tablo 3) için için gerekli örtüşmelere sahip olur. Arıtma sonra en az 1 µg vektörel çizimler ve ekler için bir DNA verim elde edilebilir.
Sonra Gibson derleme, bakteriyel dönüştürme 100-700 bakteriyel kolonilerde sonuçlanmalıdır. Resim 2 B koloni PCR, altı gRNA kasetler ile STAgR protokol sonrası üzerinden 10 bakteri kolonileri temsil edici bir analizini gösterir. Jel Elektroforez üç klonlar göstermek belgili tanımlık beklenen amplicon büyüklük için tam derleme (Tablo 2) gösterir. Bir klon (Şekil 2B, No.18) boş ise diğer bir ile beş gRNA kasetler, içeren büyük olasılıkla alınan STAgR vektörler klonlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58556/58556fig1.jpg"> Resim 1 : STAgR astar tasarım bakış. İlk gRNA numarası ve iskele seçilmiş, sonra gRNA sipariş ve organizatörü ve son olarak, ne tür bir vektör kullanılması gereken vardır. Her gRNA için belirli bir ileri astar anlamda yönlendirme ve "sam-FP" ya da "scf-FP" ortak parçası sırayla hedefleme gRNA ile tasarlanmıştır. Benzer şekilde, bireysel ters astar karşılık gelen organizatörü sıra oluşturmak için (RP) sonraki gRNA N20 sırasını ters tamamlayıcı ile eritilmiş olan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58556/58556fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58556/58556fig2.jpg"> Resim 2 : Temsilcisi sonuçları altı farklı gRNA kaset kullanarak STAgR yaklaşımların. (A)bir ÇSYİ beş ekler hem de vektör STAgR_Tomato temsili örneği. 6 STAgR tepki hU6 ve mU6 rehberleri ve kurallı gRNA gibi SAM iskele kullanarak x (B) koloni PCR. 22 bakteri kolonileri analiz edildi, bunların tam derleme gösteren beklenen Grup 7 gösterdi. Merdiven: 1 kb birlikte, sayı baz çifti (bp) içinde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58556/58556fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Dize ve vektör için ileri astar</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>scaffold_fwd</td>
			<td>GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM_fwd</td>
			<td>GTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dize ve vektör için ters astar</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>hU6_rev</td>
			<td>CGGTGTTTCGTCCTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>mU6_rev</td>
			<td>CAAACAAGGCTTTTCTCCAAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>hH1_rev</td>
			<td>CTGGGAAAGAGTGGTCTCATACAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>h7SK_rev</td>
			<td>CCGAGGTACCCAAGCGG</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Astar dizileri gRNA iskele ve rehberleri için.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Organizatör ve iskele boyutlarda.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>hU6</td>
			<td>265 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>hH1</td>
			<td>225 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>mU6</td>
			<td>316 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>h7SK</td>
			<td>245 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA iskele</td>
			<td>83 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>İskele yapısı-SAMloop + gRNA</td>
			<td>143 bp</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Koloni PCR sonucu hesaplamak için her ifade kaset teorik boyutlarda.
<table><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>hU6</td>
			<td>hH1</td>
			<td>mU6</td>
			<td>h7SK</td>
			<td>STAgR_Neo</td>
			<td>STAgR_tdTomato</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA Scf</td>
			<td>400 bp</td>
			<td>360 bp</td>
			<td>451 bp</td>
			<td>380 bp</td>
			<td>3722 bp</td>
			<td>4487 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM</td>
			<td>460 bp</td>
			<td>420 bp</td>
			<td>511 bp</td>
			<td>440 bp</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: Organizatör ve iskele boyutlarda.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>hU6</td>
			<td>hH1</td>
			<td>mU6</td>
			<td>h7SK</td>
			<td>STAgR_Neo</td>
			<td>STAgR_tdTomato</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA Scf</td>
			<td>368 bp</td>
			<td>328 bp</td>
			<td>419 bp</td>
			<td>348 bp</td>
			<td>+74 kan basıncı</td>
			<td>67 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM</td>
			<td>428 bp</td>
			<td>388 bp</td>
			<td>479 bp</td>
			<td>408 bp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 4: STAgR adet PCR sonra hesaplanan boyutlarda.

Burada, dize derleme gRNA (STAgR), klonlama mevcut CRISPR/Cas9 yaklaşıyor kolayca gRNA vektörler multiplex için bir yöntem. STAgR basit, etkili ve özelleştirilebilir gRNA çoğullama yapar.

Dize birleştirme gRNA için özelleştirilebilir bir protokol klonlama (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Bakteriyel CRISPR-Cas9 sistemi yaşam bilim adamları için deneysel seçenekleri önemli ölçüde artmıştır. Ancak, birkaç CRISPR yaklaşımı birden fazla kılavuz RNA'nın tek tek hücrelere eşzamanlı olarak teslim ini gerektirir. String montaj gRNA klonlama tek bir klonlama adımında çok katlı gRNA ifade vektörlerinin basit ve hızlı bir şekilde üretilmesine olanak tanır.Ama STAgR sadece basit değil, aynı zamanda verimli, ucuz, ve özelleştirmek kolaydır. Başlamak için, STAgR DNA dizesi için n20 gRNA dizilerini çıkıntı olarak ileri amplifikasyon astarlarına ekleyin. Geleneksel bir iskele için ileri astar, İskele ileri astar, veya MS2 içeren bir iskele için SAM ileri astar için anlamlı gRNA dizileri beş asal ekleyin.Daha sonra, kullanılan belirli organizatörlere ve dizelere bağlı olarak RP astarlarını seçerek ters astar dizilerine N20 gRNA dizilerini ters tamamlayın. Gibson Assembly için bireysel klonlama parçaları oluşturmaya başlamak için, bir tüp için yüksek sadakat tampon 10 mikrolitre aktarın. 10 milimolar dNTPs bir mikrolitre ve her iki 100 mikromolar çıkıntı astar 0.25 mikrolitre ekleyin.DNA şablon dizesi veya vektör 10 nanogram ve DMSO 1,5 mikrolitre ekleyin. Son hacmi 49,5 mikrolitreye çıkaracak kadar su ekleyin ve 0,5 mikrolitre HF polimeraz ekleyin. Metin protokolünde belirtildiği gibi, reaksiyonları bir termocycler üzerinde kuluçkaya yatırın.Bundan sonra, PCR reaksiyonundan 5,5 mikrolitre aliquot alın. Tüm aliquots yükleme boya ekleyin ve% 1 agarose jel üzerine yükleyin. Boyutlandırma için uygun bir DNA merdiveni yükleyin ve jeli 120 voltta uygun bir jel çalıştıran tamponda 30 dakika çalıştırın.Jel çalışırken, kısıtlama enzimi ile sağlanan tampon beş mikrolitre ekleyin, ve 0.5 mikrolitre DpnI kalan 44.5 vektör PCR reaksiyonpcr sırasında kullanılan artık plazmid şablonu kaldırmak için. 37 derecede 30-60 dakika kuluçkaya yat. Amplicons doğru boyutta olduğundan emin olun.DNA arınmasını başlatmak için, bir mikrolitre PCR ürününe 1,8 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın. İki dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat. Bir mıknatıs kullanarak, DNA parçalarındaki boncukları artık sıvıdan ayırın.Boncukları yıkamak için peleti %70 etanolile tamamen yeniden sumadan durula. Bu yıkamayı bir kez daha tekrarlayın. Bir pipet kullanarak, tüm etanol çıkarın ve pelet hava kuru izin.Sonra 15 ila 20 mikrolitre su ekleyin ve pipet yukarı ve aşağı karıştırmak ve pelet eritmek için. Sıvı boncuk ayırmak için bir mıknatıs kullanın. Berrak süpernatant'ı yeni bir tüpe aktarın.Bundan sonra, DNA konsantrasyonlarını belirlemek için bir spektrofotometre kullanın. İlk olarak, metin protokolünde ayrıntılı olarak 5x isothermal reaksiyon arabelleği hazırlayın. Gibson Assembly Master Mix için, su 697 mikrolitre ile 5x isothermal reaksiyon tampon 320 mikrolitre birleştirir.3 mikrolitre T5 ekonülaz, 20 mikrolitre DNA polimeraz ve 160 mcirolitre Taq DNA ligaz ekleyin. Assembly Master Mix'in 7,5 mikrolitresini yeni bir tüpe aktarın. Daha sonra metin protokolünde belirtildiği gibi vektöre 2,5 mikrolitre ekleme ekleyin.Örnekleri 50 derecede 45-60 dakika kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, sonraki dönüşüm için örnekleri buzüzerinde veya 20 santigrat derecede saklayın. Bakterileri dönüştürmeye hazır olduğunuzda, buz üzerinde Kimyasal Olarak Yetkin TOP10 E.Coli bakterisini eritin.Sonra, yetkili bakterilerin 50 mikrolitre Gibson Mix beş mikrolitre ekleyin ve yavaşça tüp alt flicking tarafından karıştırın. 30 dakika boyunca buzda kuluçkaya yat. Bakterileri ısı şoketmek için tüpü 42 derece lik su banyosuna veya ısı bloğuna 45 saniye yerleştirin.Sonra tüpleri tekrar buza koy. Bakterilere 250 mikrolitre SOC orta ekleyin ve 30 ila 45 dakika boyunca sallayarak bir kuluçka makinesinde 37 santigrat derecede iyileşmelerine izin verin. Bakteriler iyileştikten sonra, mililitre ampisilin başına 100 mikrogram içeren %1,5 LB Agar plakaları üzerine plakalayın.Plakaları gece boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Başlamak için, her yapı için 200 mikrolitre PCR reaksiyon tüpleri en az iki set hazırlamak. Ampisilin mililitre başına 100 mikrogram içeren 100 mikrolitre LB orta ile reaksiyon tüpleri setleri birini doldurun.Steril pipet ucu kullanarak, bir bakteri kolonisindeki biyolojik materyali kazıyın ve boş bir 200 mikrolitrelik PCR reaksiyon tüpünün altına yayın. Pipet ucunu derhal LB orta içeren ikinci ilgili reaksiyon tüpüne aktarın. Bazı bakterilerin LB ortama aktarıldığından emin olmak için ucu etrafında swirl.Daha sonra kullanmak için 37 santigrat derecede kuluçka. Daha sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi, reaksiyon tüpü başına 10 mikrolitre PCR Master Mix hazırlayın. LB ortam olmadan, etiketli PCR reaksiyon tüplerine 10 mikrolitre PCR Master Mix ekleyin.Bir termocycler kullanarak, metin protokolünde belirtildiği gibi reaksiyonları kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, yükseltilmiş parçalara yükleme boyası ekleyin ve %1 agarose jel üzerine yükleyin. Boyutlandırma için uygun bir DNA merdiveni yükleyin ve jeli 120 voltta uygun bir jel çalıştıran tamponda 30 dakika çalıştırın.Kullanılan organizatörlerin, gRNA iskelelerinin ve N20 dizilerinin sayısını tek tek boyutlarını ekleyerek amplicon'un teorik boyutunu hesaplayın. Koloni PCR sonuçlarından, doğru bant boyutuna göre bakteriyel klonları belirlemek, ve doğru vektörleri barındırma olasılığı olup olmadığını. Karşılık gelen 100 mikrolitre kültürü kullanarak, mililitre ampisilin başına 100 mikrogram içeren bir 2.5 mililitrelik lb kültürü aşılamak.12 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Daha sonra, üreticinin talimatlarına göre plazmid DNA'sını çıkarmak için ticari bir plazmid mini kiti kullanın. Bu yordamda, string montaj gRNA klonlama hızlı bir şekilde gRNA ifade plazmidleri oluşturmak için kullanılır.STAgR parçalarını elde etmek için kullanılan PcR'lerin tipik bir sonucu burada görülmektedir. Altı amfuz, her biri uçlarında tek tek gRNA N20 dizileri içeren doğrusal DNA parçalarını temsil eder. Plazmid omurgagNA1 ve gRNA6 hedefleme dizileri ile genişletilmiş ve bu nedenle Gibson Assembly için diğer iki PCRs için gerekli çakışmalar sahip.Arınma sonrası, vektörler ve kesici uçlar için en az bir mikrogram DNA verimi elde edilebilir. Gibson Montaj sonra, bakteri dönüşümü 100-700 bakteri kolonileri sonuçlanır. Altı gRNA kasetli STAgR protokolünden sonra koloni PCR aracılığıyla 22 bakteri kolonisinin temsili analizi, yedi klonun tam montaj için beklenen amplicon boyutunu gösterdiğini göstermektedir.Diğer klonlar büyük olasılıkla bir ila beş gRNA kasetiçeren STAgR vektörleri aldı, bir klon ise tamamen boş. Bir kez hakim, bu teknik birkaç saat içinde yapılabilir. Düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse, bir çalışma haftasından daha kısa bir sürede çok sayıda çok sayıda gRNA ifade vektörü oluşturmanızı sağlar.Bu yordamı denerken, doğru atama ve N20 çıkıntı astar kombinasyonu dikkat etmek önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, kendi çok katlı kılavuzu RNA ifade vektörleri oluşturmak için nasıl iyi bir anlayışa sahip olmalıdır.

a-customizable-protocol-for-string-assembly-grna-cloning-stagr

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu çalışma, seçici olarak BioRad Gene Gun kullanılarak tahlil, bitkilerde hücre-altı organel hedefleyen için yeni bir yöntem tarif eder.

Gibson Meclisi ve Gen Tabancası kullanarak Tütün geçici Gen İfadesi

Özel plazmitlerin sentezi emek ve zaman alıcıdır. Bu protokol, özel DNA klonlama prosedürünün işini ve süresini azaltmak için Gibson montaj klonlamasının kullanımını açıklar. Açıklanan protokol ayrıca, geleneksel kes ve yapıştır DNA klonlamasına benzer maliyetle memeli ekspresyonu için güvenilir etiketli protein yapıları üretir.

Plazmid vektörler oluşturulması Gibson tertibatı kullanılarak insan uzama faktör-1α bir promotörün regülasyonu altında FLAG-etiketli Proteinlerinin İfade

DNA, düzeneğini kullanarak çok CRISPR vektörleri CRISPR çok sayıda yapı yapım tek klonlama reaksiyonda paralel yapılabilir basit bir işlem vektörleri. Domates kıllı kökleri CRISPR vektörleri doğrulamak ve mutant malzemeleri üretmek için mükemmel bir model sistem.

Domates Tüylü Roots Üretimi ile yüksek verim CRISPR Vektör İnşaat ve DNA Değişiklikler Karakterizasyonu

CRISPR ile ilişkili protein Cpf1, özel olarak tasarlanmış bir CRISPR RNA (crRNA) yardımıyla, istenilen noktalarda çift sarmallı DNA'yı parçalayıp yapışkan uçlar üretebilir. Bu karakteristiğe dayanarak, bir DNA montaj standardı (C-Brick) oluşturuldu ve kullanımını ayrıntılandıran bir protokol burada açıklandı.

Cpf1&#39;i Kullanarak C-Brick DNA Standart Montajı İçin Protokoller

Büyük ölçekli gRNA kitaplıkları oluşturmak için yöntemleri basit, verimli ve maliyet-etkin olmalıdır. Biz gRNA kütüphaneler hedef DNA Enzimatik sindirim üzerinde dayalı üretim için bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu yöntem CORALINA (kapsamlı gRNA Kütüphane üretimi kontrollü nükleaz faaliyetleri ile) pahalı özel Oligonükleotid sentezi için bir alternatif sunuyor.

Büyük ölçekli gRNA Kütüphane üretim herhangi bir DNA kaynaktan için evrensel bir iletişim kuralı

Burada, bir basit, verimli ve sgRNA klonlama düşük maliyetli yöntemi anlattı.

CRISPR Kılavuzu RNA memeli sistemler için klonlama

Dairesel RNA'lar üreten muhabir genleri klonlayıp analiz ediyoruz. Bu muhabir genler doğrusal birleştirme analiz etmek ve Alu elemanları içeren yapılar daha büyüktür. Dairesel RNA'ları araştırmak için yapılar hücrelere dönüştürülr ve doğrusal RNA çıkarıldıktan sonra RT-PCR kullanılarak ortaya çıkan RNA analiz edilir.

Dairesel RNA'ları Analiz Etmek Için Minigen İçeren Alu Elementin Kullanımı

Burada, i) CyanoGate modüler klonlama araç kiti kullanarak kendi kendini çoğaltan bir vektör monte etmek açıklayan bir protokol sokulması, ii) konjugasyon ile bir siyanobakteriyel konak içine vektör tanıtmak ve iii) transgenik siyanobakteri suşları karakterize bir plaka okuyucu veya akış sitometri.

CyanoGate Modüler Klonlama Araç Kiti Kullanılarak Konjugasyon ile Siyanobakterilerin Genetik Modifikasyonu

Bu protokolün amacı, Golden Gate klonlamaya dayalı modüler klonlama sistemini kullanarak çok genli yapıların montajı için ayrıntılı, adım adım bir kılavuz sağlamaktır. Ayrıca, deneyimlerimize göre en iyi montajı sağlamak için kritik adımlar hakkında önerilerde bulunmaktadır.

Modüler Altın Kapı Klonlama Kullanılarak Çok Genli Yapıların Hızlı Montajı

Moleküler biyoloji laboratuvarı ders öğrencileri için ders tabanlı bir lisans araştırma deneyimi (CURE) formatında uyarlanabilir bir Gibson Assembly moleküler klonlama modülü kullanılmıştır. Öğrenci öğrenme çıktılarının değerlendirilmesi, CURE'nin tamamlanmasından sonra moleküler klonlamada daha iyi bir anlayış ve güven gösterdi ve doğal ürün biyosentez araştırmaları için yeni plazmitler klonlandı.

Uyarlanabilir Bir Moleküler Klonlama Ders Tabanlı Lisans Araştırma Deneyimi ile Öğrenci Sonuçlarının İyileştirilmesi

Bu makale, Modüler Klonlamanın (MoClo) polisistronik operonların klonlanması için nasıl uyarlanabileceğini gösteren adım adım bir protokol sunmaktadır.

In-Cloning araç setini kullanarak Modüler Klonlama (MoClo) ile Polisistronik Operonların Standartlaştırılmış Modüler Montajı

Öğrenin, CRISPR/Cas9 uygulamaları için çoklu gRNA vektörlerinin hızlı ve özelleştirilebilir klonlanması amacıyla geliştirilen STAgR yöntemini. Bu protokol, genetik mühendisliği araştırmalarında verimliliği artırır.

Dize birleştirme gRNA için özelleştirilebilir bir protokol klonlama (STAgR)

Daha fazla video keşfet