Kuruluş ve tümör dilim analizini Explants tanı testleri için bir önkoşul olarak
29 Kasım 2018
Biz üretimi, yetiştirme ve fare akciğer tümörleri türetilmiş organotypic dilimleri sistematik analizi için bir yöntem sağlar. Biz de dilim kalınlığı için en iyi duruma getirme ve tümör dilimleri tedavisi için ilaç konsantrasyonları seçin anlatan.
Bu yöntem, tümör dilimi eksperlerinde ilaç yanıt çalışmalarının tanısal amaçlara hizmet edebileceği klinik öncesi araştırmalarda anahtar soruların yanıtlatına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, dilim eksbitkilerinin kısa bir süre için mekansal olarak dağılmış fonksiyonlar da dahil olmak üzere yerli dokuların karmaşık biyolojisini modelleyebiliyor olmasıdır. Bu yöntem, rürin akciğer tümörlerinden alınan dilimlerin kullanımına ışık tokus edebilse de, insan dokuları da dahil olmak üzere diğer doku tiplerine de uygulanabilir.
Başlamak için vibratome hazırlayın ve kılavuzda belirtilen talimatlara göre bir VibraCheck gerçekleştirin. Daha sonra 24 kuyulu plakanın her kuyuyu penisilin ve streptomisin ile desteklenen hank'in dengeli tuz çözeltisinin bir mililitresi ile doldurun ve plakayı buzda tutun. Göğsün açığa çıkıp hayvanın gerilmesini sağlayacak şekilde strafor kapağına yerleştirilen ötenazili farenin dört patisine de 25 kalibrelik iğneler yerleştirin.
Sprey açıkta kalan cilt yüzeyine% 70 alkol. Karından göğsüne ve boyun bölgesine kadar açık deri kesmek için açılı bir pozisyonda yerleştirilen makas kullanın. Forceps kullanarak her iki tarafta cilt germek ve 25-gauge iğneler ekleyin.
Karın bölgesini kesin. Sonra akciğer ve kalp ortaya çıkarmak için göğüs kafesi ve diyafram açık kesin. Çevre doku keserek nefes borusu ortaya çıkar.
Akciğerleri inceleyin, kalple birlikte. Donmaya yerleştirilen Pen-Strep ile takviye buz gibi hbss 30 mililitre lik içeren 50 mililitrelik bir tüp içine dokuları yerleştirin ve mümkün olduğunca çabuk bir sonraki adıma geçin. Şimdi tümör taşıyan akciğerleri 10 santimetrelik doku kültür plakasına aktarın.
Akciğer loblarını ayırmak için steril makas ve forseps kullanın ve dilimlemek için yüzeyde tümörolan lobları seçin. Düz bir doku parçası yüzeyi oluşturmak için steril bir neşter kullanarak tümör çevreleyen normal akciğer veya ek tümör dokusunun bir kısmını kayma önlemek ve kesmek için filtre kağıt bir parça üzerinde bir tümör dokusu ile bir akciğer lob yerleştirin. Düz tarafı siyanoakrilat yapıştırıcıdamlabatırın ve vibratom numune tutucuya yerleştirin, böylece tümör bıçağı dik bir pozisyonda karşılar ve 2-3 dakika kurumasını bekleyin.
Vibratom numune tutucuyu metal tampon tepsisine yerleştirin. Doku tampona batırılınceye kadar tepsiyi Pen-Strep ile takviye edilmiş soğuk HBSS ile doldurun. Tampon tepsiyi, aletle birlikte verilen Pleksiglas kapakla kaplayın ve tepsiyi beyaz bir buz banyosuna yerleştirin ve dilimleme sırasında dokuyu serin tutmak için buz ekleyin.
Beyaz buz banyosunu vibratome takın. Sonra uygun dilimleme ayarlarını seçin ve dilimlemeye başlayın. Vibratome bıçağı dilimleme konumuna getirin ve dilimleme penceresini ayarlayın.
24 kuyulu bir tabakta dilimleri toplamak için steril çalgıları kullanın ve kalem-Strep ile birlikte bir mililitre hbss ile birlikte iyi ve buz üzerinde tutun. Dilimleme sırasını takip ederken, 24 kuyulu plakanın her kuyuyu deney planına göre işaretleyin. Sıfır saat veya kültürsüz referans olarak kültürlü dilimler bitişik bir doku dilimi toplayın.
Dokunun üst, orta ve alt temsil etmek için en az üç referans dilimleri toplayın. Dilimleme tamamlandıktan sonra sabitleme ve işlemeye devam edin. Bundan sonra, titanyum ızgaraları yerleştirerek kuyu başına kültür orta 2,5 mililitre içeren altı kuyulu bir plaka hazırlayın.
Titanyum ızgara ve orta arasında hiçbir hava kabarcıkları oluşan emin olun. Bir dilimi ızgaraya yüklemek için altı kuyulu plakayı açılı bir konumda tutun, böylece ortamın bir kısmı ızgarayı kaplayın. Daha sonra ızgara üzerinde orta dilim yerleştirin ve yaymak için forseps kullanın.
Dilimleri yerleştirdikten sonra, altı kuyulu plakaları 37 derece lik nemli bir kuluçka makinesinin içine yerleştirilen döner kuluçka ünitesine %95 02 ve %5 CO2 ile yükleyin. Döndürme döngüsünü başlatın. Uzun süreli ekim için doku dilimleri içeren ızgara kaldırmak ve altı kuyu plaka boş bir kuyuya yerleştirmek için steril forseps kullanarak her gün kültür ortamı doldurmak.
Ortamın %70'ini taze kültür ortamıyla değiştirin ve ızgarayı geri yerleştirin. Döndürme döngüsünü daha önce olduğu gibi devam edin. Tümör dilimleri üzerinde ilaç tedavisi için altı kuyu plaka içine seyreltilmiş ilaç veya araç kontrolü ile medya 2.5 mililitre ekleyin.
Titanyum ızgaraları kuyulara yerleştirin ve dilimleri daha önce olduğu gibi ızgaraların üzerine yerleştirin. Tedavileri 24 saat yaptıktan sonra sabitleme ve işleme ye devam edin. İstenilen dilimi sabitlemeye başlamak için, 2-3 mililitre PBS ile doldurulmuş ıslatılmış bir filtre kağıdı içeren 10 santimetrelik bir plakaya forceps kullanarak dikkatlice aktarın ve yüzdürün.
Daha sonra filtre kağıdını bir çift forsepsle çıkarın ve bir histo kasetine yerleştirin. Filtre kağıdını histo kasetine aktarın. Sonraki adımlar için dilimkonumunu işaretlemek için doku diliminin üstüne seyreltilmiş hematoksilin bir damla ekleyin.
Kaseti kapatın ve %4 nötr tamponlu formalin çözeltisine aktarın ve gece boyunca dört derece santigrat derecede bırakın. Protokolün açıklandığı şekilde kasetin yıkanması ve işlenmesinden sonra histo kasetini açın ve sabit dilimi filtre kağıdından dikkatlice kaldırmak için neşter kullanın. Filtre kağıdını atın ve dilimi sıvı parafin içeren bir kalıba aktarın.
Eşit bölümleme sağlamak için katıştırma kalıbının altına doku basmak için düz bir ağırlık kullanın. Histo kasetinin alt kısmını kalıbın üstüne yerleştirin. Üzerine sıvı parafin ekleyin.
Ve kalıp 30 dakika soğuk bir tabakta soğumasını bekleyin. Bundan sonra parafin bloğundan soğutulmuş kalıp ayırın. FFPE doku dilimi bloklarının dört mikrometre ince bölümlerini hazırlamak için bir mikrotom kullanın.
Dokuyu çevreleyen parafin fazlalığından kurtulun. Doku boyunca eşit bölümler elde etmek için bloğun açısını ayarlayın, böylece blok yüzeyinin bıçak ile ilgili olarak yatay olarak yönlendirilir. İnce bir fırça kullanarak cam slaytların üst kısmından başlayarak parafin gömülü doku diliminin sıralı doku bölümlerini toplayın.
Ortasına derin doku katmanları bölümleri toplamaya devam edin, cam slaytlar alt kısmı takip. Her doku diliminin farklı katmanlarından nesne slaytlarına bölümlerin toplanması, canlılık, hücre göçü veya biyomarker ifadesinde kültürkaynaklı degradelerin yakalanmasını sağlamak için yapılır. Bölümleri topladıktan sonra protokolde açıklandığı gibi işleme ve ileri analizile devam edilir.
Doku dilimi kalınlığı kültürlü dilimlerin canlılığını etkileyebilir. Bu durumda, 250 mikrometre kalınlığında dilimler, kalın dilimlerin dilimler boyunca oksijen veya besin difüzyonundaki eksikliklere yatkın hale gelmesi nedeniyle 200 mikrometre kalınlığındaki dilimlere göre artmış nekroz degradelerini göstermektedir. Ancak, 160 mikrometrelik ince dilimler büyük nekrotik alanlar muhtemelen bu kırılgan ve kıvrılma eğilimindedir olarak dilimlerin konumlandırılması sırasında teknik işleme neden içerir.
NKX2-1 analizi, iyi diferansiye akciğer adenokarsinomu bir belirteç, ifade önemli ölçüde sıfır saat kültürsüz dilimleri ile karşılaştırıldığında kültürlü dilimler içinde değiştirilmiş olmadığını göstermektedir. NKX2-1 ekspresyonunun kantitatif analizi, ekstre işleminin adenokarsinom dokusunun farklılaşma durumunu gözle görülür şekilde etkilemediğini düşündürerek, ifadenin kültürlü ve kültürsüz dilimlerde önemli ölçüde değiştirilmediğini doğruladı. Tümör doku dilimleri hedefli ilaçların etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir olup olmadığını test etmek için, onlar DMSO veya bileşiklerin titrated miktarları ile tedavi edildi.
4EBP1 mTOR yolu fosforilasyon hedefleyen bir mikromolar daktolisib ile tedavi edildiğinde inhibe edildi. MAP kiziaz yolunu hedefleyen 0.5 mikromolar selumetinib ERK1/2 fosforilasyonunun inhibe edilmesinde etkili oldu. Bu videoyu izledikten sonra nasıl çalışmak ve eleştirel değerli tümör dokularından taze kesilmiş dilimleri analiz etmek için iyi bir anlayışa sahip olmalıdır.
Bizim eski postdoc, Katja Narhi, önemli ölçüde IMI Predect Konsorsiyumu Doku Dilimi Platformu meslektaşları ile işbirliği içinde bu yöntemin kurulmasına katkıda bulunmuştur.
Genel Bakış
Bu makale, murin akciğer tümörlerinden organotipik dilimler üretme ve analiz etme yöntemini sunar. Etkili tedavi için dilim kalınlığının ve ilaç konsantrasyonunun optimizasyonunu detaylandırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Onkoloji
- Preklinik Araştırma
Arka Plan
- Organotipik dilimler, doğal dokuların karmaşık biyolojik işlevlerini modelleyebilir.
- Bu teknik, insan dokuları da dahil olmak üzere çeşitli doku türlerine uygulanabilir.
- Tümör dilimlerinde ilaç yanıtı çalışmaları teşhise yardımcı olabilir.
- Murin akciğer tümörleri, tümör biyolojisini incelemek için bir model olarak hizmet eder.
Çalışmanın Amacı
- Akciğer tümörü dilimlerini analiz etmek için sistematik bir yaklaşım geliştirmek.
- Tümör dilimlerinde ilaç tedavisi için koşulları optimize etmek.
- Farklı doku türlerine uyarlanabilen bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Vibratom ve doku kültürü plakalarının hazırlanması.
- Tümör taşıyan akciğer dokularının dilimlenmesi ve kesimi.
- Dilimlerken nemli bir inkübatörde kültürlenmesi.
- Dilimlerde ilaç tedavisi ve sonrasında analiz için sabitlenmesi.
Ana Sonuçlar
- Murin akciğer tümörlerinden organotipik dilimlerin başarılı bir şekilde üretilmesi.
- Dilimliğin kalınlığı ve ilaç konsantrasyonlarının optimizasyonu gösterildi.
- Yöntem, kontrollü bir ortamda ilaç yanıtlarının incelenmesine olanak tanır.
- Elde edilen bilgiler diğer doku türlerine uygulanabilir.
Sonuçlar
- Geliştirilen yöntem, tümör biyolojisine olan anlayışımızı artırır.
- Preklinik ilaç testleri için değerli bir araç sağlar.
- Gelecek çalışmalar bu yaklaşımı insan dokularına genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Tumor slice explants preserve native tissue architecture and intratumor heterogeneity, enabling physiologically relevant preclinical models for diagnostic and drug response studies. This approach supports target validation by maintaining spatially resolved signaling and stromal interactions critical for mechanistic de-risking. Systematic analysis of heterogeneous markers prior to treatment ensures predictive confidence in downstream translational applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by preserving spatially distributed oncogenic functions such as signaling activities and stromal infiltration.
- Operational Value: Enables functional target validation through analysis of marker expression heterogeneity in adjacent slices as a prerequisite for drug studies.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by maintaining differentiation status (e.g., NKX2-1 expression) during short-term culture, reducing false-positive target assumptions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with quantifiable outputs for downstream compound evaluation.
- Operational Value: Standardizes slice preparation and cultivation on rotating incubation units to improve viability and reproducibility across experiments.
- Scalability: Facilitates platform reuse through optimization of slice thickness (e.g., 200-micrometer) to minimize necrosis gradients and technical artifacts.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery through preclinical validation by enabling evaluation of drug-induced marker alterations in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Assesses pathway-specific drug effects (e.g., mTOR via 4EBP1 phosphorylation, MAPK via ERK1/2 inhibition) in intact tissue contexts.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by capturing culture-induced gradients in viability, migration, or biomarker expression via layered section analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early biology to lead identification by providing quantitative, spatially resolved biomarker data essential for hypothesis testing and assay readiness.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by preserving native tissue architecture and multicellular interactions.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slice thickness optimization and daily medium replenishment on rotating incubation units.
- Analytics: Enables quantitative comparison of conditions via sequential section collection to capture viability and expression gradients across tissue layers.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by analyzing drug-treated slices for alterations in differentiation and pathway markers.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for systematic analysis of heterogeneous tissue markers as a prerequisite across tumor types and drug classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through preservation of intratumor heterogeneity and stable marker expression during short-term culture.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via rotating incubation units and optimized slice thickness (200-micrometer) to reduce necrosis and handling artifacts.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by enabling evaluation of targeted drug efficacy (e.g., dactolisib, selumetinib) on pathway phosphorylation in physiologically relevant models.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization via systematic analysis of adjacent slices as zero-hour references to distinguish cultivation effects from drug responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in vibratome-based tissue slicing and histological processing for sequential section analysis.
- Dependent on instrumentation including rotating incubation units, microtomes, and embedding systems for FFPE sectioning.
- Necessitates cross-team standardization of slice thickness optimization and reference slice collection (top, center, bottom) to account for heterogeneity.
- Involves adaptation considerations across model systems, as thin slices (160-micrometer) may curl during handling while thick slices (250-micrometer) risk diffusion-limited necrosis.
- Practical limitation: Slice thickness must be empirically optimized per tissue type to balance viability, structural integrity, and oxygen/nutrient diffusion.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:42
Collection of Tumor-bearing Lungs
2:08
Generation and Cultivation of Precision-cut Lung Tumor Slices, and Treatment with Inhibitors
5:58
Fixation and Processing of the Tissue Slices
7:27
Processing and Analysis of Formalin-fixed and Paraffin-embedded (FFPE) Tissues
8:33
Results: Assessment of Viability, Specific Marker Expression, and Targeted Drug Treatment on Adenocarcinoma Tissue Slices
10:26
Conclusion
