Name: Metastatik kolorektal kanser hastalarında dolaşımdaki mikroRNA özel Panel tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Keşfedin metastatik kolorektal kanser hastalarında dolaşımdaki mikroRNA panel tespiti yöntemini. Bu teknik, düşük örnek miktarıyla güvenilir sonuçlar sağlayarak tedavi kararlarını destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada kısmen Roche S.p.A. ve İtalyan ilaç Ajansı (AIFA) tarafından finanse edildi.

Not: Tüm iyi laboratuar uygulaması (GLP) göre steril duman başlık altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
1. plazma toplama ve depolama
<ol><li>3 mL periferik kan örneği K3E EDTA tüp içinde toplamak.</li>
	<li>Tüp 1,880 x g 15dk için de oda sıcaklığında santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Aliquots 450 µL süpernatant plazmada kurtarmak.</li>
	<li>-80 ° C'de örnekleri kullanmak kadar saklamak. Not: Periferik kan tüpü 2s toplama içinde işlemek. Plazma tüpünden kurtarırken, lenfosit katman rahatsız etmeyin.</li>
</ol>2. miRNAs plazma numuneleri (malzemeler tablo) üzerinden dolaşan ayıklama
<ol><li>
Tüm gerekli çözümler hazırlamak ve örnekleri için ayıklama adımları çözülme.
	<ol>
<li>2-mercaptoethanol 375 µL 2 x denaturating ekleyin ve iyice karıştırın.</li>
		<li>ACS notu % 100 etanol 21 mL miRNA yıkama çözüm eklemek için ben ve mix de.</li>
		<li>ACS notu % 100 etanol 40 mL yıkama 2/3 ekleyin ve iyice karıştırın.</li>
		<li>Bir plazma aliquot oda sıcaklığında erimek ve ayıklama adımları başlamak için izin verir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Organik çıkarma
	<ol>
<li>Plazma örneği 400 µL RNase free 2 mL tüp içine aktarın.</li>
		<li>Vortexing tarafından mix ve kısaca santrifüj kapasitesi 400 µL 2 x denaturating çözüm ekleyin.</li>
		<li>Vortexing tarafından mix ve kısaca santrifüj kapasitesi 1 nM spike-in 4 µL ekleyin.</li>
		<li>Asit fenol kloroform 800 µL ekleyin.</li>
		<li>60 s ve 15dk için maksimum hızda (≥10, 000 x g) santrifüj için girdap.</li>
		<li>Üst sulu faz için taze bir tüp aktarın. Interphase rahatsız etmeyin. Not Ses kurtarıldı ve sigara acqueous faz içeren tüp atın. Not: 2 çözüm denaturing x 4 ° C'de depolanan ve bu sıcaklıkta sağlamlaştırmak. Kullanmadan önce sıcak 37 ° C, bazen 10-15 dk. ajitasyon çözüm asit fenol kloroform, değil üstüne karışımı yatıyor acqueous arabellek içeren alt aşaması çekilmeye dikkat et. Elüsyon çözüm veya nükleaz ücretsiz su ile 95 ° c Onceden Yeterli bir çözüm (örnek + % 10 aşırı başına 100 µL) hacmi ısıtmak dikkatli olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Küçük RNA zenginleştirme
	<ol>
<li>Etanol %100 hacmi 1/3 sulu Faz 2.2.6 adımından ekleyip iyice karıştırın.</li>
		<li>Bir taze koleksiyonu tüp her örnek için bir filtre kartuşu yerleştirin.</li>
		<li>Lysate, 700 µL filtre kartuşu ve 10.000 x g , santrifüj 30 adım 2.3.1 ve etanol aktarmak s.</li>
		<li>Eğer > 700 µL sol, karışımı filtrate taze bir tüp içinde yerleştirin ve tekrar adım 2.3.3; Tüm karışımı filtre kartuşu geçene kadar yineleyin.</li>
		<li>Akış yoluyla toplam hacmi ölçmek.</li>
		<li>2/3 birim etanol %100 filtrate ve iyice karıştırın ekleyin.</li>
		<li>İkinci filtre kartuşu bir taze toplama tüpü yerleştirin.</li>
		<li>Numune hacmi 700 µL kartuşun aktarmak ve 10.000 x g 30 s. atma için akış yoluyla santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Tüm karışımı filtre kartuşu geçene kadar 2.3.8 adımları yineleyin.</li>
		<li>MiRNA yıkama çözüm 1 700 µL filtre kartuşu uygulamak ve filtre kartuşu 10.000 x g de koleksiyon tuplü 15 s. atma için akış yoluyla santrifüj kapasitesi. Filtre Kartuşu aynı toplama tüpü yerleştirin.</li>
		<li>Yıkama çözüm 2/3 filtre kartuşu ve santrifüj filtre kartuşu 10.000 x g de koleksiyon tuplü 500 µL akışı aracılığıyla 15 s. atma için geçerlidir. Filtre Kartuşu bir taze toplama tüpü yerleştirin.</li>
		<li>Bir taze koleksiyonu tüp içinde filtre kartuşu yerleştirin ve 2.3.11 500 µL ile yıkama çözüm 2/3 arasındaki adımları yineleyin. Akışı aracılığıyla atın ve filtre kartuşu bir taze koleksiyonu tüp aktarmak.</li>
		<li>10.000 x g 1 dk. için filtre kartuşları ile tüpler santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Filtre Kartuşu bir taze 1,5 mL toplama tüp içine aktarmak ve Önceden ısıtılmış (95 ° C) elüsyon çözüm veya nükleaz ücretsiz su 100 µL ekleyin.</li>
		<li>30 için 10.000 x g , santrifüj miRNAs yeniden elde etmek ve-80 ° C'de depolamak için s Not: Bir beyaz çökelti yıkama çözüm 2/3 oluşabilir. Aşırı EDTA eriyik--dan serbest bırakmak bu. Bu kristaller pipetting adımları uyguladığınızda çizim kaçının.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. gerçekleştirmek ters transkripsiyon ve miRNA öncesi amplifikasyon (malzemeler tablo)
<ol><li>
Poliadenilasyon reaksiyonu gerçekleştirmek
	<ol>
<li>O zaman kısaca girdap ve santrifüj dönmeye içeriği aşağı buz üzerinde tüm reaktifler çözülme. Buna ek olarak, tezcan % 50 oda sıcaklığında ulaşmak izin 8000, PEG.</li>
		<li>Tepki her örnek için kokteyl 3 µL son hacmi elde etmek bir 0.5 mL santrifüj tüpü tepki karışımda hazırlayın. Aşağıdaki birimler artı % 10 aşırı cilt her reaktif için kullanın.</li>
		<li>1.7 µL RNase ücretsiz su, 10 Poli(a) arabellek x 0.5 µL, 0.5 µL 10 mM ATP ve son olarak 0.3 µL 5 ekleyin U/µL PolyA enzim.</li>
		<li>Kısaca girdap ve santrifüj dönmeye kokteyl mix içeriği aşağı.</li>
		<li>Örnek 2 µL tepki plaka veya tepki tüp her şey aktarmak ve kokteyl tepki 3 µL ekleyin. Kısaca girdap ve santrifüj dönmeye içeriği aşağı.</li>
		<li>Plaka/tüpler termal cycler yerleştirin ve aşağıdaki adımları uygulayın.</li>
		<li>45 dk (Poliadenilasyon adım) için 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>4 ° C'de aşağıdaki bir tutun ile 65 ° c 10 dk (stop reaksiyon), kuluçkaya</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tüp ligasyonu tepki gerçekleştirin.
	<ol>
<li>Her örnek ve aşırı hacminin % 10 bir santrifüj tüpü aşağıdaki birimler ile reaksiyon karışımda hazırlayın.</li>
		<li>Eklemek 0.4 µL RNase ücretsiz su, DNA ligaz tampon, 25 ligasyonu adaptör x 0.6 µL, 4,5 µL % 50 x 5 3 µL PEG 8000 ve RNA ligaz sonunda 1,5 µL.</li>
		<li>Kısaca girdap ve santrifüj dönmeye kokteyl mix içeriği aşağı.</li>
		<li>Mix 10 µL her şey/tepki tüp Poli(a) takip ürün içeren ekleyin. 1 dk. için 1900 devirde bir plaka shaker veya kısaca vortexing ve içeriği aşağı spin karıştırın.</li>
		<li>Aşağıdaki ayarlarla bir termal cycler plaka/tepki tüpler yerleştirin: kuluçka için bir sonraki ile 60 dk 60 ° C'de 4 ° C'de tutun Not: 8000 PEG çok viskoz % 50'dir. Oda alıyorum ve yavaş yavaş dağıtımı sıcaklığında kullanın. Plugger 10 için tutun her aspirasyon ve dağıtım adım sonra s reaktif yukarı ve aşağı akışı izin vermek için.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ters transkripsiyon tepki gerçekleştirin.
	<ol>
<li>Her örnek ve aşırı hacminin % 10 için aşağıdaki birimler ile bir santrifüj tüpü tepki karışımda hazırlayın.</li>
		<li>3.3 µL RNase ücretsiz su, 5 RT tampon, 1.2 µL dNTP mix (25 mM her), 1,5 µL evrensel RT astar x 20 x 6 µL ve sonunda 3 µL 10 x RT enzim karışımı ekleyin.</li>
		<li>Kısaca girdap ve santrifüj dönmeye kokteyl mix içeriği aşağı.</li>
		<li>Mix 15 µL her şey/tepki tüp ligasyonu ürün içeren ekleyin. 1 dk. için 1900 devirde bir plaka shaker veya kısaca vortexing ve içeriği aşağı spin karıştırın.</li>
		<li>Aşağıdaki ayarlarla bir termal cycler plaka/tepki tüpler yerleştirin.</li>
		<li>15 dakika (ters transkripsiyon) 42 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>4 ° C'de aşağıdaki bir tutun ile 85 ° c 5 min (stop reaksiyon) için kuluçkaya Not: RT ürün-20 ° C'de hafızaya ve 2 aya kadar kararlı olmaya devam edecektir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MiR-Amp reaksiyon (malzemeler tablo) gerçekleştirin.
	<ol>
<li>Her örnek ve aşırı hacminin % 10 bir santrifüj tüpü aşağıdaki birimler ile reaksiyon karışımda hazırlayın.</li>
		<li>17,5 µL RNase ücretsiz su, 2 x miR-Amp ana Mix 25 µL ve 2.5 µL 20 x miR-Amp astar karışımı ekleyin.</li>
		<li>Kısaca girdap ve santrifüj dönmeye kokteyl mix içeriği aşağı.</li>
		<li>Her örnek için yeni bir reaksiyon tabak ya da bir tepki tüp her iyi tepki Mix 45 µL aktarın. RT ürünün 5 µL her şey ya da bir tepki tüp ekleyin. 1 dk. için 1900 devirde bir plaka shaker veya kısaca vortexing ve içeriği aşağı spin karıştırın.</li>
		<li>Plaka/tepki tüpler içinde termal cycler yerleştirin ve Tablo 1' de gösterildiği gibi çalıştırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. gerçek zamanlı PCR gerçekleştirmek
<ol><li>Her cDNA Örnek 1:10 0,1 x TE arabellek sulandırmak.</li>
	<li>Kuyu/çoğaltır her örnek için sayısını hesaplayın. Aşağıdaki birimler bir santrifüj tüpü tepki karışımda fazla hacminin % 10 ekleyerek her örnek için hazır olun.</li>
	<li>4 µL RNase ücretsiz su, 2 x hızlı gelişmiş ana karıştırmak (Malzemelerin tablo) 10 µL ve seyreltilmiş cDNA sonunda 5 µL ekleyin.</li>
	<li>Vortexing tarafından mix ve kısaca içeriği spin santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Her şey, plaka mühür ve kısaca santrifüj kapasitesi için tepki karışımı 19 µL aktarın.</li>
	<li>Termal Protokolü (Tablo 2) bir RT-PCR sistem üzerinde gerçekleştir.</li>
</ol>

<ol><li>Luo, H. -Y., Xu, R. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+and+prognostic+biomarkers+with+therapeutic+targets+in+advanced+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22World+journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer.</a> World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).</li>
<li>Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+potential+liquid+biopsy+biomarkers+in+colorectal+Cancer%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review.</a> BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).</li>
<li>Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+panels+for+the+reliable+quantification+of+circulating+microRNAs+by+RT-qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR.</a> FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).</li>
<li>Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegnér, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+circulating+microRNA+expression+data+obtained+by+quantitative+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR.</a> Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).</li>
<li>Danese, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+miRNAs+for+colorectal+cancer%3A+Analysis+and+verification+of+current+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).</li>
<li>Zheng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+reference+genes+for+qPCR+detection+of+serum+microRNAs+in+colorectal+adenocarcinoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients.</a> PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).</li>
<li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+Original+TRIzol-Based+Technique+Improves+the+Extraction+of+Circulating+MicroRNA+from+Serum+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+laboratory%22%5BJournal%5D)">Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples.</a> Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).</li>
<li>Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+extraction+kits+and+RT-qPCR+systems+adapted+to+high-throughput+platform+for+circulating+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs.</a> Scientific reports. 5, 9430(2015).</li>
<li>Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporting+Recommendations+for+Tumor+Marker+Prognostic+Studies+%28REMARK%29%3A+explanation+and+elaboration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+medicine%22%5BJournal%5D)">Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration.</a> PLoS medicine. 9 (5), (2012).</li>
<li>Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+using+circulating+miRNAs+as+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li>
<li>Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circulating+microRNA+biomarkers+in+plasma+and+serum+using+quantitative+reverse+transcription-PCR+%28qRT-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR).</a> Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).</li>
<li>Cheng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+Processing+Conditions+Substantially+Influence+Circulating+microRNA+Biomarker+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels.</a> PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).</li>
<li>Moret, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+an+improved+protocol+for+plasma+microRNA+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction.</a> PloS one. 8 (12), (2013).</li>
<li>Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+small+noncoding+RNAs+from+human+serum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of small noncoding RNAs from human serum).</a> Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443(2014).</li>
<li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

miRNAs küçük RNA'lar (18-25 nükleotid uzunluğunda) 3' UTR bölge hedeflerinin mesajcı RNA bağlama ve inhibe ve/veya aşağılayıcı, yetenekli kodlamayan. Böylece gen ifade düzenleyiciler translasyonel düzeyde kabul edilebilir. Son on yılda birkaç miRNAs kanser başlatma ve geliştirme, tanı, teşhis ve tedavisi için yararlı klinik biyolojik geliştirmelerde ile ilişkili. RNases tarafından korunan, miRNAs kan, plazma, serum, idrar ve tükürük, potansiyel kullanışlılığı klinik pratikte10büyüyen bir ilgi yol ...

CRC temsil eden üçüncü en sık malignite ve dördüncü ölüm sebebi kanser ile ilgili dünya çapında tanısı. Bugüne kadar bevacizumab (B), vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve cetuximab (C) veya panitumumab (P), monoklonal antikorlar karşı epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), yönetmen karşı Monoklonal antikor onaylanmış olan birinci basamak tedavi kemoterapi (CT) rejimleri ile birlikte.
K-RAS ile N-RAS gen mutasyonlar tek klinik olarak yararlı biyolojik anti-EGFR tabanlı CT yararlanmak en az olan hastalar belirleme yeteneğine sahip olan Yanıt CT B tabanlı akıllı biyolojik aramak için çeşitli çalışmalar yapılmıştır rağmen hala güvenilir ve etkili ilaçların klinik pratikte1kullanmak için önemli bir eksikliği olduğunu.
miRNAs çeviri hedef genlerin düzenleyen ve embriyo ve karsinojenezis dahil olmak üzere çok sayıda Fizyopatolojik işlemlerinde çok önemli bir rol oynamak küçük RNA'lar (18-25 nükleotid uzunluğunda) vardır. Bu moleküller biyolojik sıvı plazma/serum, idrar ve non-invaziv örnekleme2için kullanmak için sağlam biyolojik işler balgam gibi son derece kararlı. MiRNAs anjiogenik yolu yer Masası, biz tanımlamak için amaçlayan yeni biyolojik metastatik CRC (mCRC) olan hastalarda klinik sonuçlar oluşabileceğini yetenekli dolaşan bir B tabanlı CT rejimi ile tedavi.
52 bir dizi analiz randomize potansiyel multicenter içinde B tabanlı CT ile tedavi edilen mCRC hastaların evre III deneme "İtalyan deneme içinde gelişmiş kolorektal kanser" (Itaca). Mevcut iletişim kuralı yerel Etik Komitesi tarafından kabul edildi (Comitato Etico alan Vasta e Istituto bilimsel Enstitüsü Romagnolo başına lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, No 674) 19th Eylül 2007 tarihinde. Tüm hasta Onam kanı örnek toplama önce verdi. Her bir hasta için Venöz kan örneği tedavi öncesi ve (sonra 8 hafta) ilk klinik değerlendirme, temel miRNA ifade ve hasta sonuç ile ilgili olarak tedavi sırasında onun modülasyon değerlendirmek için toplandı.
Edebiyat bir arama, biz insan plazmada tespit olduğu bilinmektedir anjiogenik işlemle ilişkili 21 miRNAs seçilmiş: vardır-miR-107, sahip-miR-126-3 p, vardır-miR-145-5 p, vardır-miR-194-5 p, vardır-miR-199a - 5p, vardır-miR-200b - 3p, vardır-miR-20b - 5p , vardır-miR-21-5 p, sahip-miR-210-3 p, sahip-miR-221-3 p, sahip-miR-24-3 p, vardır-miR-27a - 3p, vardır-miR-29b - 3p, vardır-miR-335-5 p, vardır-miR-424-5 p, vardır-miR-497-5 p, vardır-miR - 520d - 3p, vardır-miR-92a - 3p, vardır-miR-17-5 p ve vardır-miR-155-5 p. Biz de sahip-miR-223-3 p ve seçilen vardır-mir-484 endojen normalleştirme3,4,5,6ve cel-miR-39 spike bileşeni olarak eksojen normalleştirme için C. elegans arıtılmış. Tüm veri normalizations 2 ̂ ̄(ΔΔCt) yöntemiyle yapıldı.
MiRNAs dolaşan algılama molekülleri plazmada çok düşük düzeylerde varsa ve onların amplifikasyon kısa sırasına verilen kimyasal olarak zordur çünkü bazı teknik sorunlar sunar. Bu nedenlerden dolayı biz fenol ile organik çıkarma ve sütunlara göre bir cam elyaflı metodoloji dikkate alır bir yordam seçildi. MiRNA ayıklama dolaşan sıvı biyopsi alanında bir konu olduğunu ve biz en güvenilir olmak göstermiştir bir ticari kiti seçili tutar ve kurtarılan verimleri7,8kalite açısından. Biz tersine çevirmek için bir iletişim kuralı seçili selectivity geliştirmek için bir adaptör 5' ve Poli(a) kuyruğu için 3' olgun miRNA eklenmesi ve reaksiyon özgüllüğü tarafından miRNAs uyarlamak.
Sağlamlık yöntemi göz önüne alındığında, biz özel plakaları önceden benekli probları yinelenen her örnekte değerlendirmek RT-PCR ile tasarlanmış ve her plaka içinde 2 hasta şekil 1' de gösterildiği gibi analiz.

<table><tbody><tr><td>Rnaz içermeyen Safe-lock 1,5 mL tüpler</td><td>Eppendorf</td><td>0030 123.328</td><td></td></tr><tr><td>Rnaz içermeyen Safe-lock 2 mL tüpler</td><td>Eppendorf</td><td>0030 123.344</td><td></td></tr><tr><td>Rnaz içermeyen 20 & mikro; L ipuçları</td><td>Starlab</td><td>S1123-1810</td><td></td></tr><tr><td>Rnase içermeyen 200 & L ipuçları</td><td>Starlab</td><td>S1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>Rnase içermeyen 1.000 & L ipuçları</td><td>Starlab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>mirVana PARIS RNA ve Doğal Protein Saflaştırma</td><td>Kiti Thermo Fisher</td><td>AM1556</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gelişmiş miRNA cDNA Sentez Kiti</td><td>Thermo Fisher</td><td>A28007</td><td></td></tr><tr><td>%100 etanol anidrous ACS sınıfı</td><td>Carlo Erba Reaktifleri</td><td>414605</td><td></td></tr><tr><td>2-merkapto-etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>4444558</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gelişmiş miRNA Testleri</td><td>Thermo Fisher</td><td>A25576</td><td></td></tr><tr><td>7500 Gerçek Zamanlı PCR Sistemi</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4406984</td> 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1.000 &<td></td></tr><tr><td> L laboratuvar pipetleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tezgah üstü mikrosantrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vorteks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tezgah üstü ısıtma bloğu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çeker ocak</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 mL PCR tüpleri</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metastatik kolorektal kanser hastalarında dolaşımdaki mikrorna özel panel tespiti

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

Orada sıvı biyopsi için kanser tanı, teşhis ve tedavi kontrolü, ilgi klinik uygulaması için güvenilir ve yararlı biyolojik gereksinimini oluşturma artmaktadır. Burada, ayıklamak için bir iletişim kuralı mevcut ters uyarlamak ve kolorektal kanser (CRC) hastalarda plazma örneklerinden miRNAs dolaşan ifade düzeyini değerlendirin. MikroRNA (miRNAs) kodlamayan RNA'ların translasyonel düzeyinde hedef genlerin ifade düzenleyen ve pro - ve anti-anjiogenik işlevi, Fizyopatoloji da dahil olmak üzere önemli bir rol oynamaktadır 18-25 nükleotid uzunluğunda, sınıfıdır çeşitli organları. miRNAs serum ve onları ideal biyolojik kanser tanı, teşhis ve tedavi karar için dolaşan ve izleme işler plazma gibi biyolojik sıvı stabildir. MiRNA ayıklama dolaşan hem organik hem de sütun tabanlı yöntemleri içerir hızlı ve etkin bir yöntemle gerçekleştirildi. MiRNA retrotranscription için biz 3' ve bir bağdaştırıcı, 5' in rasgele miRNA öncesi amplifikasyon tarafından takip olgun miRNAs ligasyonu Poliadenilasyon dikkate alır bir çok adım yordam kullanılır. Nicel gerçek zamanlı Polimeraz zincir tepkimesi (PCR qRT) tarafından test edilecek, özel bir 24-miRNA bölmesi seçili ve miRNA probları dizi özel Tabaklarda gördü. Biz qRT-PCR plaka ishal üstünde bir gerçek zamanlı PCR sistemi uygulandı. Temizlik miRNAs normalleştirme için GeNorm yazılım (v. 3.2) kullanarak seçildi. Veri ifade suite yazılımı (v 1.1) kullanarak analiz edildi ve istatistiksel analizleri gerçekleştirilmiştir. Bu yöntem güvenilir ve teknik olarak sağlam olduğu ortaya çıktı ve plazma ve/veya serum gibi sıvı örnekleri biyomarker düzeyleri değerlendirmek için yararlı olabilir.

Analiz ettik angiogenez ilgili dolaşan miRNAs ilerleme-Alerjik hayatta kalma (PFS) ile ilgili olarak bir panel, genel olarak hayatta kalma (OS) ve objektif yanıt oranı (ORR) B tabanlı CT ile hasta tedavi 52 mCRC içinde Plazma numuneleri böyle biyolojik değerlendirilmesi teknik zorluklardan dolayı zordur. Biz hasta plazma örnekleri, ters transkripsiyon ve öncesi amplifikasyon miRNA çıkarılması için kurulan yöntemleri kullanılır. Üreticinin yönergelerini izleyerek ve sadece gerekli, özellik...

Biz mikroRNA (miRNAs) dolaşan ifade düzeylerini değerlendirmek için bir protokol kanserli hastalarda plazma örnekleri mevcut. Özellikle, biz piyasada bir kit miRNA çıkarma ve ters transkripsiyon dolaşan için kullanılır. Son olarak, gerçek zamanlı önceden benekli sonda özel plakaları kullanarak 24 seçili miRNAs oluşan bir panel analiz ettik.

Metastatik kolorektal kanser hastalarında dolaşımdaki mikroRNA özel Panel tespiti

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Bu yöntem, çeviriaraştırma alanındaki anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin dolaşan biyobelirteçler ile hasta prognozu arasındaki ilişki gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, düşük miktarda giriş materyali ile kolay ve güvenilir bir metodoloji ile dolaşan biyobelirteçlerden oluşan bir panelin ekspresyonunu değerlendirme şansıdır. Bu tekniğin etkileri kanser hastalarının tedavisine kadar uzanır, çünkü hastaların karar verme ve tedavi takibinde yararlı olan dolaşan biyobelirteçleri belirleyebilir.Ayrıca, bu yöntem biyobelirteçanalizi dolaşan içine fikir sağlayabilir. Ayrıca hastalığın moleküler karakterizasyonu için doku biyomarker ekspresyon analizi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Çıkarma adımlarını öğrenmek zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir.Başlamak için, plazma örneğinin 400 mikrolitresini RNase içermeyen, iki mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra, tüpe 400 mikrolitre denaturing çözeltisi ekleyin. Bir-nanomolar spike-in dört mikrolitre ekleyin.Çözeltiyi karıştırdıktan sonra 800 mikrolitre asit fenol-kloroform ekleyin. 60 saniye boyunca çözeltiyi girdap ve maksimum hızda 15 dakika santrifüj. Daha sonra, üst sulu fazda bulunan lysate'yi temiz bir tüpe aktarın ve interfazı bozmamaya özen gösteriyor.Kurtarılan sulu fazın hacmini ölçün ve lysate'ye 1/3 hacim etanol ekleyin. Ardından, filtre kartuşu yeni bir toplama tüpüne yerleştirin. Etanol-lysate karışımının 700 mikrolitreye kadarını filtre kartuşuna aktarın.Filtre kartuşu 10,000 kat yerçekiminde 30 saniye santrifüj edin. Ardından, akış yoluyla toplam hacmini ölçün. Sonra, filtrat etanol hacminin 2/3 ekleyin ve iyice karıştırın.Yeni bir toplama tüpüne ikinci bir filtre kartuşu yerleştirin. Ardından, numunenin 700 mikrolitrekadarını kartuşa aktarın ve akış tan zindanetmeden önce 30 saniye boyunca 10.000 kat yerçekiminde santrifüj yapın. Filtre kartuşu için 700 mikrolitre mikrorna yıkama çözeltisi ekleyin ve 15 saniye boyunca 10.000 kat yerçekiminde bir toplama tüpüyle santrifüj edin.Akış tan atın ve filtre kartuşu'nu aynı tüpe geri koyun. Bundan sonra, filtre kartuşu yeni bir toplama tüpüne taşıyın. Ardından, kartuşa önceden ısıtılmış elüsyon çözeltisi 100 mikrolitre ekleyin.MikroRNA'ları kurtarmak için filtre kartuşu 30 saniye boyunca 10.000 kat yerçekiminde santrifüj edin. Metin protokolüne göre poliadenilasyon reaksiyonkarışımı kokteylini hazırlayın. Numunenin iki mikrolitresini bir reaksiyon plakasının her kuyuya aktarın.Sonra, her kuyuya reaksiyon kokteylinin üç mikrolitresini ekleyin. Girdap ve kısa bir süre içeriğini aşağı spin plaka santrifüj. Ardından, plakayı bir termal döngüye yerleştirin ve metin protokolünde belirtilen yordamı izleyin.Bir santrifüj tüp içinde ligasyon reaksiyon karışımı kokteyl hazırlayın. Daha sonra, reaksiyon plakaher kuyuya kokteyl 10 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, bir dakika için bir shaker üzerinde reaksiyon plaka içeriğini karıştırın, 900 rpm, plaka kısa bir santrifüj izledi.Bundan sonra, reaksiyon plakasını bir termal döngüye yerleştirin ve metin protokolünde belirtilen yordamı uygulayın. Ters transkripsiyon reaksiyonu gerçekleştirmek için, metin protokolüne göre bir santrifüj tüpünde reaksiyon karışımını hazırlayın. Daha sonra, ligasyon ürünü içeren plakaher kuyuya karışımı 15 mikrolitre ekleyin.Bir dakika için 1, 900 rpm bir shaker üzerinde plaka içeriğini karıştırın, plaka kısa bir santrifüj ardından. Ardından, plakayı bir termal döngüye yerleştirin ve metin protokolünde belirtilen yordamı izleyin. Daha sonra miR-Amp reaksiyon karışımını hazırlayın ve yeni bir reaksiyon plakasının her kuyuya 45 mikrolitre karışımı ekleyin.Bundan sonra, reaksiyon plakasının her kuyuya BEŞ mikrolitre RT ürünü ekleyin. Bir dakika için 1, 900 rpm bir shaker üzerinde plaka karıştırın, plaka kısa bir santrifüj ardından. Ardından, plakayı bir termal döngüye yerleştirin ve metin protokolünün tablo birinde özetlenen yordamı izleyin.İlk olarak, TE tampon her cDNA örnek seyreltmek. Daha sonra, bir santrifüj tüp IÇINDE PCR reaksiyon karışımı hazırlayın. hacmin %10'u fazla dır.Plakanın her kuyusu için reaksiyon karışımının 19 mikrolitresini aktarın. Plakayı kapatın ve kısa bir süre santrifüj edin. Son olarak, metin protokolünün ikinci tablosunda belirtildiği gibi, bir RT-PCR sisteminde termal protokolü gerçekleştirin.Bu vaka serisinin tüm plazma örneklerine eklenecek en iyi konsantrasyonun hangisi olduğunu seçmek için başak kontrolüseri seyreltmeleri yapıldı. Bu protokol sayesinde her hastadaki tüm biyobelirteçlerin yanı sıra genel vaka serisinde tek bir biyomarker in değerlendirilmesi mümkün oldu. Bu protokolde, kemoterapi rejimi ile tedavi edilen kolorektal kanserli hastalarda progresyonsuz sağkalım, genel sağkalım ve objektif yanıt oranı ile ilgili anjiyogeneze bağlı sirkülasyon miRNA'lardan oluşan bir panel analiz edildi.MiRNA'nın ekspresyon düzeyleri ile ilk klinik değerlendirme arasında karşılaştırıldığında has-miR-155-5p'de artış gözlendi. Bu artış daha kısa PFS ve Os ile ilişkiliydi. Bu yordamı çalışırken, bir duman başlık altında fenol-kloroform kullanarak adımları gerçekleştirmek için hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, dolaşımdaki proteinlerin izolasyonu ve analizi veya kodlama RNA'ları gibi diğer yöntemler, dolaşan biyobelirteçlerden oluşan daha kapsamlı bir panelin değerlendirilmesi gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.Bu teknik, gelişiminden sonra sıvı biyopsi alanında araştırmacıların kanser hastalarında dolaşan biyobelirteçlerin ekspresyonunu keşfetmelerinin önünü açmıştır. Kan ve kimyasal reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu işlemi gerçekleştirirken eldiven ve laboratuvar kaplaması gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

detection-circulating-microrna-custom-panel-patients-with-metastatic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu videoda, organik ekstraksiyon kullanılarak kolorektal kanser hastalarının plazma örneklerinden dolaşımdaki mikroRNA'nın ekstraksiyonu ve ardından cam elyaf kolon zenginleştirme işlemi açıklanmaktadır. miRNA'lar serum ve plazma gibi biyolojik sıvılarda stabildir, bu da onları kanser teşhisi, prognozu ve tedavi kararı verme ve izleme için ideal dolaşımdaki biyobelirteçler haline getirir. Bu yöntem, hastalarda klinik sonuçları tahmin edebilen yeni dolaşımdaki biyobelirteçlerin tanımlanmasına...

Dolaşımdaki miRNA Ekstraksiyonu: Organik Ekstraksiyon ve Küçük RNA Zenginleştirme Yoluyla Plazma Örneklerinden miRNA'yı İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Bu protokol, dolaşımdaki miRNA'ların kontaminasyonunu önlemek ve NSCLC'deki biyobelirteç özelliklerini değerlendirmek için NSCLC hastalarının plazmasında salınan eksozomlarda miRNA profillemesinin Proteinaz K ve RNAse tedavileri ile ticari bir eksozom izolasyon kiti aracılığıyla gerçekleştirilmesinin fizibilitesini açıklar.

qPCR sayesinde küçük hücre dışı akciğer kanseri (KHDAK) Hasta Plazma içinde Exosomal miRNA Analizi: Bir Uygulanabilir Sıvı Biyopsi Aracı

Burada, miRNA in situ hibridizasyon kullanarak meme kanseri hasta örneklerinde miRNA ekspresyonunu tespit etmek için bir protokol sunuyoruz.

miRNA kullanarak Meme Kanseri Dokularındaki miRNA İfade Klinikopatolojik Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme

Boya bazlı bir kimya ve damlacık dijital PCR teknolojisi kullanılarak hücresiz mikroRNA'ların miktar tayini için hassas ve doğru bir yöntem açıklanmaktadır.

MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

Amplifikasyona ihtiyaç duymadan biyolojik substratlardaki molekülleri barkodlayarak ve sayarak gen ekspresyonunu ölçen çoğullanmış yüksek verimli bir gen ekspresyon platformunun kullanımını açıklıyoruz. Platformu, irritabl bağırsak sendromu olan ve olmayan kişilerde tam kandaki mikroRNA (miRNA) ekspresyonunu ölçmek için kullandık.

İrritabl Bağırsak Sendromu içinde miRNA&#39;lar Sirkülasyon tedirginlikler bir Çoklanmış Yüksek verim Gen İfadesi Platformu Kullanma Algılanan

Burada, BioMILD kabul edilen detaylı Protokolü deneme erken akciğer kanseri teşhis için dolaşımdaki mikroRNA imza Sınıflandırıcısı sınama gerçekleştirmek için eleme mevcut.

MikroRNA tabanlı sıvı biyopsi: Plazma miRNA imza Sınıflandırıcısı (MSC) akciğer kanseri süzmek için bir deneyim

Biz son derece hassas yayılmasından insan kolorektal kanseri tespiti (CRC) hücre dokuları kolonileşmesi izin vermek için burada PDX kaynaklı CRC organoid hücrelere yeşil flüoresan protein (GFP) lentiviral parçacıkların verimli iletim için bir protokol göster stereo-floresan mikroskobik gözlem ile alıcı fareler içine onların enjeksiyon önce.

Bir hasta kaynaklı kolon tümöründen kültürlü GFP Lentivirus transduced Organoids tarafından oluşturulan Micrometastases yüksek-duyarlı tespiti

Burada, sirkülasyon tümör hücrelerini (CTCs) karakterize eden fenotifik ve moleküler özellikleri tanımlamak için entegre bir iş akışı sunuyoruz. Tek ve kümelenmiş CTCs 'lerin canlı immünostasyon ve robotik mikromanipülasyonunu, alt analiz ve metasrin-tohumlama yeteneğinin değerlendirilmesi için tek hücre bazlı tekniklerle birleştiriyoruz.

Akım moleküler Analizi ve metastatik potansiyel değerlendirme için sirkülasyon tümör hücrelerinin mikromanipülasyon

Burada, hastanın biyolojik sıvılarında (biyoluidler) bulunan DNA 'Yı dolaşarak tümör somatik mutasyonları tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) tabanlı yöntem, tümör mutasyonu allelik frekansının (MAF) ölçülmesini sağlar ve tümör yanıtının tanı ve temporal izlenmesi için minimal invaziv bir tamamlayıcı kolaylaştırır.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Protokol, mikroRNA ve çoğullanmış proteinleri aynı anda tespit etmek ve ölçmek için formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku ile tandem bir immünofloresan hibridizasyon testini tanımlar.

Yeni Bir Tespit ve Miktar Belirleme Yöntemi Olarak Kilitli Nükleik Asit Yerinde Hibridizasyon Yoluyla MikroRNA Amplifikasyonu ve Tanınması

Keşfedin metastatik kolorektal kanser hastalarında dolaşımdaki mikroRNA panel tespiti yöntemini. Bu teknik, düşük örnek miktarıyla güvenilir sonuçlar sağlayarak tedavi kararlarını destekler.

Metastatik kolorektal kanser hastalarında dolaşımdaki mikroRNA özel Panel tespiti

Daha fazla video keşfet