Name: Apoptozis ters sonra yeni kurulan meme kanser kök hücre benzeri hücre akış sitometrik algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Öğrenin meme kanserinde apoptozis tersine dönüş sonrası kanser kök hücre benzeri hücre geçişini akış sitometri ile izole etme yöntemini. Bu teknik saf hücre popülasyonları elde ederek kanser nüksü mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser yenilikçi teknoloji Fonu yenilik teknoloji Komisyonu tarafından desteklenen: finansman desteği devlet anahtar laboratuvar, Agrobiotechnology (CUHK), Lo Kwee-Seong Biyomedikal Araştırma Fonu ve Lee Hysan Vakfı. Y.X. CUHK üzerinden yüksek lisans öğrencilik tarafından desteklenmiştir.

1. meme kanseri hücreleri kök hazırlanması
<ol><li>Kültür MCF-7 ve 10 mL % 10 ısı inaktive fetal Sığır serum (FBS) 100 mm çanak ile takıma fenol red ücretsiz Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta hücrelerde MDA-MB-231. Kültür T47D fenol red-Alerjik RPMI 1640 Orta 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş 10 ml % 10 ısı-FBS ve % 1 v/v penisilin-streptomisin (PS) 100 mm çanak inaktive olur. Bir % 5 CO2/95% hava hücre kültür kuluçka 37 ° C'de kültür hücreleri. Not: Fenol kırmızısı floresans tabanlı algılama etkiler ama aynı zamanda onun östrojen benzeri efektler31nedeniyle meme kanser hücrelerinin büyümesini potansiyel bir etkisi vardır. Örneğin, fenol red progesteron reseptör ve büyüme MCF-7 hücreleri31teşvik. Bu da T47D hücreleri31büyümesini teşvik.</li>
	<li>Yıkama hücrelerle fosfat 2 mL serum fizyolojik (PBS) iki kez arabelleğe alınmış. MCF-7 ve MDA-MB-231 ve % 0.25 tripsin-EDTA T47D hücrelere 2 mL % 0.05 tripsin-EDTA 2 mL ekleyin. Not: Uygunsuz bir konsantrasyon ifade deseninin CD44 ve CD2432gibi bazı hücre yüzey işaretlerinin etkileyebilir iken tripsin-EDTA konsantrasyonu hücreler farklı meme kanseri hücre tipleri arasında ayrılması için değişiklik.</li>
	<li>Bulaşıkları %5 CO2/95% hava bir atmosfer altında 37 ° C'de 5 min için kültür. Sık sık dekolmanı aşırı sindirim hücrelerden tripsin-EDTA tarafından önlemek için mikroskop altında hücre kontrol.</li>
	<li>Üzerinde % 90 hücreleri ayırdığınızda, yemek için tamamlanan RPMI orta 5 mL ekleyin ve birkaç kez hücre katmanı yüzey üzerinde pipette.</li>
	<li>Hücreleri bir 15 mL konik tüp ve santrifüj 300 x g ve 4 ° C 5 min için transfer. Not: Genellikle, confluency % 70 ulaştığında 6 x 10-6 hücreler bir 100 mm yemek elde edilebilir.</li>
	<li>Süpernatant atın ve granül 106 hücreler/100 μL FACS arabelleği (% 0.5 BSA ve % 0.1 Sodyum azid içeren PBS) adlı bir 1.5 mL microcentrifuge tüp resuspend.</li>
	<li>Hücreleri çeşitli tüpler içine bölün. MCF-7 hücreler için hücreleri 4 tüpler içine bölmek: iki izotip kontrol eder, CD24 tek adıma CD24 olumlu denetim ve bir çift boyama için boyama.</li>
	<li>T47D hücreler için hücreleri 3 tüpler içine bölmek: ikisi izotip kontrol eder ve bir çift boyama için.</li>
	<li>MDA-MB-231 hücreler için hücreleri 4 tüpler içine bölmek: iki izotip kontrol eder, CD44 tek adıma CD44 olumlu denetim ve bir çift boyama için boyama.</li>
	<li>Santrifüj tüpleri tekrar vasıl 300 x g ve 4 ° C'de 5 dakika süreyle süpernatant atmak ve Fc blok 1:50 FACS arabelleği seyreltilmiş ekleyin.</li>
	<li>Santrifüjü 300 x g , karanlığın içinde 20 dk için buz üzerinde örnekleri kuluçkaya ve 4 ° C'de 5 dakika süreyle süpernatant atın.</li>
	<li>İnsan CD44 karşı monoklonal antikor fluorochrome Birleşik ekleyin (PerCP-Cy5.5) ve CD24 (PE) (FACS arabellekte) 1:40 ve 1:10 dilutions çift içinde boyama grupları. CD44 olumlu denetim için eklemek (PerCP-Cy5.5) MDA-MB-231 için ve CD24 (PE) MCF-7 hücreleri aynı konsantrasyonu sırasıyla ekleyin. Not: CD44 ve C24 kombinasyonu meme CSC çalışma26,27,28,29,30' u sık kullanılan.</li>
	<li>İzotip kontrol grubu için PerCP-Cy5.5 fare Igg2b, κ 1:40 eklemek seyreltme izotip denetimin genişliği CD44 antikorlar ve PE fare Igg2a, κ 1:10 kadar seyreltme CD24 antikorlar, 106 hücreler/100 μL izotip kontrol olarak. Not: İzotip antikorları ilgi denetimlerinde negatif denetimleri33tavsiye edilir.</li>
	<li>(Kimden adım 1.12 ve 1.13) örnekleri için 30 dk santrifüj 300 x g de karanlıkta 4 ° C'de kuluçkaya ve 4 ° C'de 5 dakika süreyle süpernatant atın.</li>
	<li>Pelet iki kez PBS ve santrifüj 300 x g ve 4 ° C 5 min için 500 μL ile yıkayın.</li>
	<li>Pelet PBS ve 40 µm naylon mesh filtreden 0.5 mL floresans aktif hücre sıralayıcıda çalıştırmadan önce resuspend.</li>
	<li>Perdeleme ve tazminat amaçlı MCF-7 hücre PE Birleşik anti-CD24 antikorlar ile leke ve PerCP-Cy5.5-Birleşik anti-CD44 antikor pozitif denetimleri hücrelerle MDA-MB-231 leke. İzotip denetimleriyle negatif kontrol eder (Şekil 1) lekeli hücreler kullanın.</li>
	<li>CD44 hücrelerle toplamak-/CD24+ işaretleri içeren koleksiyon Orta (% 20 ısı inaktive FBS ve % 2 v/v ile PS takıma fenol red-Alerjik RPMI 1640 orta) 1 mL yuvarlak alt polistiren 12 x 75 mm tüpler. 300 g ve RT x 5 min için tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Not: Meme kanseri hücrelerinin CSC benzeri hücrelerde CD44 tanımlanan+/CD24- hücreleri26,27,28,29,30ve kanser hücrelerinin kök meme CD44 tanımlanan-/CD24+ hücreleri18 (Şekil 1).</li>
	<li>Sıralanmış meme olmayan kök kanser hücrelerinin % 5 CO2 hücre kültür kuluçka 37 ° C'de daha fazla kültür için taze koleksiyonu Orta içeren kültür tabağına plaka.</li>
</ol>2. apoptotik indüksiyon ve algılama
<ol><li>1 mM staurosporine12,34 DMSO hazırlayın. Tedavi MCF-7 grup için bir 15 mL konik tüp içinde son hacim (2,5 μm kalınlığında staurosporine) ilâ 10 mL yapmak MCF-7 hücre tamamlanan orta 1 mM staurosporine 25 μL ekler. Pipet içeriği eşit karıştırmak için.</li>
	<li>Kültür orta hücrelerden kaldırmak için bir kez PBS 2 mL hücrelerle yıkayın. Daha sonra 2,5 μm kalınlığında staurosporine ile orta 10 mL MCF-7 hücreleri hücre yoğunluğu % 70 confluency ulaştığında apoptosis ikna etmek 6 h için ekleyin.</li>
	<li>1 mM paklitaksel35,36 DMSO hazırlayın. Tedavi T47D grubu için bir 15 mL konik tüp 10 mL (5 mikron paklitaksel) son hacmi telafi etmek için T47D hücrelerinin tamamlanan orta 1 mM paklitaksel 12.5 μL ekleyin. Pipet içeriği eşit karıştırmak için.</li>
	<li>Kültür orta hücrelerdeki kaldırmak ve PBS 2 mL hücrelerle bir kez yıkayın. Daha sonra 5 mikron paklitaksel ile orta 10 mL T47D hücreleri hücre yoğunluğu % 70 confluency ulaştığında apoptosis ikna etmek 10 h için ekleyin. Not: Yeni bir hücre satır ilk kez kullanıldığı her yerde indüksiyon zaman ve Apoptozis neden indükleyicileri konsantrasyonu optimize edilmelidir.</li>
	<li>Çözücü tedavi MCF-7 grubu için steril dimetil sülfoksit (DMSO) 25 μL 15 mL konik tüp içinde tamamlanan orta MCF-7 hücre 10 mL (yani, % 0.25 v/v DMSO) son bir hacim için telafi etmek için ekleyin. Pipet içeriği eşit karıştırmak için.</li>
	<li>Kültür orta çözücü tedavi MCF-7 hücrelerden kaldırmak için bir kez PBS 2 mL ile yıkayın. Daha sonra 6 h için % 0.25 v/v DMSO ile orta 10 mL çözelti denetimi olarak STS için ekleyin.</li>
	<li>Çözücü tedavi T47D grubu için bir 15 mL konik tüp 10 mL son hacim (yani, % 0.05 v/v DMSO) telafi etmek için T47D hücrelerinin tamamlanan orta steril DMSO 5 μL ekleyin. Pipet içeriği eşit karıştırmak için.</li>
	<li>Kültür orta çözücü tedavi T47D hücrelerden kaldırmak için bir kez PBS 2 mL ile yıkayın. Daha sonra 10 h için % 0.05 v/v DMSO ile orta 10 mL paklitaksel için solvent denetimi olarak ekleyin.</li>
	<li>Tedavi hücre morfolojik değişiklikleri gözlemledikten, bağışıklık hücreleri ile 50 için nM Mitotracker kırmızı CMXRos ve 250 ng/mL Höchst 33342 ve başka bir 20 min için bir atmosfer altında 37 ° C'de % 5 CO2/95% hava kuluçkaya. Tipik apoptotik hücre morfolojisi bir 60 x confocal lazer mikroskop (Şekil 2) tarama altında gözlemlemek. Not: Tipik apoptosis morfoloji içerir hücre büzülme, membran blebbing, mitokondri parçalanma ve nükleer yoğunlaşma ama sağlam hücre membran12,13,14,15 ile ,18,37.</li>
</ol>3. yalıtım apoptotik hücreler ve Apoptozis ters yordamı
<ol><li>Apoptotik uyarıcı ve solvent-tedavi edilen MCF-7 veya 3 mikron Caspase-3/7 yeşil algılama boya 106/mL içinde belgili tanımlık karanlık bir atmosfer altında 37 ° C'de 30 dk % 5 CO2/95% hava için hücre konsantrasyonu, hücrelerle T47D leke.</li>
	<li>40 µm naylon mesh ile hücreleri sıralamak için sıralayıcıda çalıştırmadan önce filtre.</li>
	<li>Amacıyla geçişi için ilk büyük nüfus (R1) kapı ve enkaz nokta ileri dağılım ve yan dağılım (Şekil 3) ile grafik olarak çizme tarafından hariç.</li>
	<li>Tedavi edilmezse hücre negatif bölge (R2) kapı için bir negatif kontrol Caspase-3/7 yeşil algılama boya eklemeden kullanın (Şekil 3A).</li>
	<li>Staurosporine12,18,34 24 h ile tedavi ve boya ile olumlu bir denetim olarak lekeli hücreleri olumlu bölge (R3) kapı için kullanın (Şekil 3B).</li>
	<li>Pozitif hücrelerinin (R3) yuvarlak alt polistiren 12 x 75 mm tüpler koleksiyonu Orta (aynı koleksiyon orta adım 1,18) (Şekil 3C-3D) 1 mL içeren uyarıcı tedavi gruplarında toplamak. 300 g ve RT x 5 min için tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
	<li>Negatif hücreleri (R2) yuvarlak alt polistiren 12 × 75 mm tüpler ile 1 mL çözücü tedavi gruplarında koleksiyon orta adım 3.6 (rakamlar 3E-3F) olduğu gibi toplamak. Not: Hücreleri (örneğin 10.000 hücreleri) küçük bir bölümünü toplanan ve etkin caspases işaretçisi desen kontrol etmek sıralayıcıda yeniden çalıştırın. Caspase negatif bölgede sıralanmış çözücü tedavi hücrelerinin % 90 üzerinde gösterilir veya sıralanmış uyarıcı tedavi hücrelerinin % 90'ı caspase pozitif bölgede üzerinde gösterilir, bu kendine hakim hücre nispeten saf (rakamlar 3 C-3F) olduğu düşünülmektedir. Aksi takdirde, sıralama bölge ve/veya Sıralayıcı sıfırlamanız gerekir.</li>
	<li>Taze koleksiyonu Orta sıralanmış hücrelerde resuspend ve onları 12-iyi doku kültürü plakaları ve % 5 CO2/95% hava bir atmosfer altında 37 ° C'de kültür apoptosis ters için 7 gün için temel olarak belirler.</li>
</ol>4. onay apoptozis hücre Caspase-harekete geçirmek
<ol><li>Annexin-bağlama arabellek (pH 7,4) hazırlamak için Mix 10 mM HEPES, 140 mM NaCl ve 2.5 mM CaCl2 . Arabellek 4 ° C'de depolayın ve ışığa maruz için tampon kaçının.</li>
	<li>100 µg/mL çalışan bir çözüm propidium iyodür (PI), annexin-bağlama arabellek 45 µL PI hisse senedi çözümde sulandrarak 5 µL 1 mg/ml tarafından hazırlayın. Çözüm 4 ° C'de depolayın ve çözüm ışığa maruz kaçının. Not: PI potansiyel bir alkil ve dikkatle ele alınmalıdır.</li>
	<li>Olduğu gibi adımlar 2,1-2.5 uyarıcı tedavi hücreleri hazırlayın.</li>
	<li>Uyarıcı tedavi MCF-7 veya T47D hücreleri Orta hücre katmanı üzerinden hücreleri ayırmak için 3-5 x pipetting tarafından toplamak. Hücreleri 15 mL konik tüp aktarın.</li>
	<li>300 g ve RT x 5 dk. atma süpernatant, santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>106/mL 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde hücre konsantrasyonu, tamamlanan orta hücrelerle resuspend ve 3 mikron Caspase 3/7 yeşil algılama boya 37 ° C'de 30 dk için karanlıkta hücrelerle leke</li>
	<li>5 dk. atmak için supernatants vasıl 300 x g ve RT santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Buz gibi PBS ve santrifüj 300 x g , 1 mL hücrelerle yıkayın ve 4 ° C'de 5 dakika süreyle atın supernatants.</li>
	<li>Annexin-bağlama arabellek 100 μL annexin V eşlenik Ekle 5 μL ile hücrelerde resuspend ve 100 µg/ml 1 µL çalışma çözüm her 100 μL hücre süspansiyon için PI ve oda sıcaklığında 15 dk için hücreleri kuluçkaya. Not: Annexin V ve PI sık birlikte akış sitometresi38,39,40apoptotik hücrelerde etiketlemek için kullanılır.</li>
	<li>Annexin-bağlama arabellek, karışımı 400 µL yavaşça ekleyin. Buz üzerinde örnekleri üzerinde bir akış sitometresi çalıştırmadan önce tutmak.</li>
</ol>5. meme CSC benzeri hücreleri tarafından akış sitometresi ölçümü
<ol><li>Tersine çevrilen MCF-%7 0.05 tripsin-EDTA ile her iki uyarıcı veya çözücü tedavi grubu'hasat. T47D hücreleri uyarıcı veya çözücü tedavi her iki grupta veya % 0.25 tripsin-EDTA olduğu gibi adımları 1.2-1.5 ile hasat.</li>
	<li>İnsan CD44 karşı monoklonal antikor fluorochrome Birleşik hücrelerle leke (PerCP-Cy5.5) ve CD24 (PE) adım 1.12 olduğu gibi. Bu arada, adım 1,13 olduğu gibi izotip denetimleri hazırlamak.</li>
	<li>Hücreleri üzerinde bir akış sitometresi çalıştırın ve CD44 hücrelerle yüzdesi tespit+/CD24- işaretleri.</li>
</ol>

<ol><li>McGuire, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World+Cancer+Report+2014.+Geneva%2C+Switzerland%3A+World+Health+Organization%2C+International+Agency+for+Research+on+Cancer%2C+WHO+Press%2C+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Nutrition%22%5BJournal%5D)">World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015.</a> Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).</li>
<li>Slamon, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+chemotherapy+plus+a+monoclonal+antibody+against+HER2+for+metastatic+breast+cancer+that+overexpresses+HER2%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2.</a> New England Journal of Medicine. 344 (11), 783-792 (2001).</li>
<li>Geyer, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lapatinib+plus+capecitabine+for+HER2-positive+advanced+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lapatinib plus capecitabine for HER2-positive advanced breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 355 (26), 2733-2743 (2006).</li>
<li>Cameron, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+III+randomized+comparison+of+lapatinib+plus+capecitabine+versus+capecitabine+alone+in+women+with+advanced+breast+cancer+that+has+progressedon+trastuzumab%3A+updatedefficacy+andbiomarker+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">A phase III randomized comparison of lapatinib plus capecitabine versus capecitabine alone in women with advanced breast cancer that has progressedon trastuzumab: updatedefficacy andbiomarker analyses.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 112 (3), 533-543 (2008).</li>
<li>Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+topoisomerase+poisons+as+antitumor+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs.</a> Annual Review of Biochemistry. 58, 351-375 (1989).</li>
<li>Hertel, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+antitumor+activity+of+gemcitabine+%282%27%2C2%27-difluoro-2%27-deoxycytidine%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the antitumor activity of gemcitabine (2',2'-difluoro-2'-deoxycytidine).</a> Cancer Research. 50 (14), 4417-4422 (1990).</li>
<li>Ni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+expression+of+nuclear+factor+kappa+B+%28NF-kappa+B%29+in+multiple+myeloma%3A+downregulation+of+NF-kappa+B+induces+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Analysis of expression of nuclear factor kappa B (NF-kappa B) in multiple myeloma: downregulation of NF-kappa B induces apoptosis.</a> British Journal of Haematology. 115 (2), 279-286 (2001).</li>
<li>Richardson, P. G., Mitsiades, C., Hideshima, T., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bortezomib%3A+proteasome+inhibition+as+an+effective+anticancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bortezomib: proteasome inhibition as an effective anticancer therapy.</a> Annual Review of Medicine. 57, 33-47 (2006).</li>
<li>Dumontet, C., Jordan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-binding+agents%3A+a+dynamic+field+of+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics.</a> Nature Review Drug Discovery. 9 (10), 790-803 (2010).</li>
<li>Dean, M., Fojo, T., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+stem+cells+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour stem cells and drug resistance.</a> Nature Review Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).</li>
<li>Pirozzi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+cancer+stem+cells%2C+epithelial-mesenchymal+transition+and+circulating+tumor+cells+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition and circulating tumor cells in lung cancer.</a> Oncology Reports. 29 (5), 1763-1768 (2013).</li>
<li>Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversibility+of+apoptosis+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Reversibility of apoptosis in cancer cells.</a> British Journal of Cancer. 100 (1), 118-122 (2009).</li>
<li>Tang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+survival%2C+DNA+damage%2C+and+oncogenic+transformation+after+a+transient+and+reversible+apoptotic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (12), 2240-2252 (2012).</li>
<li>Xie, X., Wang, S. S., Wong, T. C. S., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genistein+promotes+cell+death+of+ethanol-stressed+HeLa+cells+through+the+continuation+of+apoptosis+or+secondary+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Genistein promotes cell death of ethanol-stressed HeLa cells through the continuation of apoptosis or secondary necrosis.</a> Cancer Cell International. 13 (1), 63(2013).</li>
<li>Wang, S. S., Xie, X., Wong, C. S., Choi, Y., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HepG2+cells+recovered+from+apoptosis+show+altered+drug+responses+and+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatobiliary+%26+Pancreatic+Diseases+International%22%5BJournal%5D)">HepG2 cells recovered from apoptosis show altered drug responses and invasiveness.</a> Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 13 (3), 293-300 (2014).</li>
<li>Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Harwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+CaspaseTracker+biosensor+system+for+detecting+anastasis+and+non-apoptotic+caspase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity.</a> Scientific Reports. 5, 9015(2015).</li>
<li>Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+tracking+anastasis%2C+a+cell+survival+phenomenon+that+reverses+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li>
<li>Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+reversal+promotes+cancer+stem+cell-like+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Apoptosis reversal promotes cancer stem cell-like cell formation.</a> Neoplasia. 20 (3), 295-303 (2018).</li>
<li>Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+anastasis+in+vivo+by+CaspaseTracker+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detecting anastasis in vivo by CaspaseTracker biosensor.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).</li>
<li>Li, J., Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+in+apoptosis+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Caspases in apoptosis and beyond.</a> Oncogene. 27 (48), 6194-6206 (2008).</li>
<li>Green, D. R., Amarante-Mendes, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+point+of+no+return%3A+mitochondria%2C+caspases%2C+and+the+commitment+to+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Results+and+Problems+in+Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The point of no return: mitochondria, caspases, and the commitment to cell death.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 24, 45-61 (1998).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).</li>
<li>Ricci-Vitiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+human+colon-cancer-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells.</a> Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).</li>
<li>O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+colon+cancer+cell+capable+of+initiating+tumour+growth+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice.</a> Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).</li>
<li>Cioffi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+distinct+population+of+CD133%28%2B%29+CXCR4%28%2B%29+cancer+stem+cells+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of a distinct population of CD133(+) CXCR4(+) cancer stem cells in ovarian cancer.</a> Scientific Reports. 5, 10357(2015).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
<li>Ponti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+stem+cells+transition+between+epithelial+and+mesenchymal+states+reflective+of+their+normal+counterparts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts.</a> Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2013).</li>
<li>Sheridan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44%2B%2FCD24-+breast+cancer+cells+exhibit+enhanced+invasive+properties%3A+an+early+step+necessary+for+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis.</a> Breast Cancer Research. 8 (5), R59(2006).</li>
<li>Phillips, T. M., McBride, W. H., Pajonk, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response+of+CD24%28-%2Flow%29%2FCD44%2B+breast+cancer-initiating+cells+to+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation.</a> Journal of the National Cancer Institute. 98 (24), 1777-1785 (2006).</li>
<li>Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+activity+of+phenol+red%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Estrogenic activity of phenol red.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 57 (3), 169-178 (1998).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Different+Cell-Detaching+Methods+on+the+Viability+and+Cell+Surface+Antigen+Expression+of+Synovial+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li>
<li>Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+flow+cytometry+data%3A+a+guide+for+the+perplexed%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed.</a> Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).</li>
<li>Belmokhtar, C. A., Hillion, J., Ségal-Bendirdjian, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staurosporine+induces+apoptosis+through+both+caspase-dependent+and+caspase-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Staurosporine induces apoptosis through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms.</a> Oncogene. 20 (26), 3354-3362 (2001).</li>
<li>Saunders, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel-induced+apoptosis+in+MCF-7+breast-cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 breast-cancer cells.</a> International Journal of Cancer. 70 (2), 214-220 (1997).</li>
<li>Miller, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel-induced+apoptosis+is+BAK-dependent%2C+but+BAX+and+BIM-independent+in+breast+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel-induced apoptosis is BAK-dependent, but BAX and BIM-independent in breast tumor.</a> PLoS One. 8 (4), e60685(2013).</li>
<li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+a+review+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: a review of programmed cell death.</a> Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).</li>
<li>Ng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+voltage-gated+potassium+channels+in+the+fate+determination+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of voltage-gated potassium channels in the fate determination of embryonic stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 165-177 (2010).</li>
<li>Lo, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV3+channel+negatively+regulates+cell+cycle+progression+and+safeguards+the+pluripotency+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">TRPV3 channel negatively regulates cell cycle progression and safeguards the pluripotency of embryonic stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 403-413 (2016).</li>
<li>Talanian, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificities+of+caspase+family+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Substrate specificities of caspase family proteases.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (15), 9677-9682 (1997).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Vermeulen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+activity+defines+colon+cancer+stem+cells+and+is+regulated+by+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment.</a> Nature Cell Biology. 12 (5), 468-476 (2010).</li>
<li>Shaw, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+mammosphere+assay+protocol+for+the+quantification+of+breast+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).</li>
<li>Desiderio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+fucosylation+has+a+pivotal+role+in+invasive+and+metastatic+properties+of+head+and+neck+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Increased fucosylation has a pivotal role in invasive and metastatic properties of head and neck cancer stem cells.</a> Oncotarget. 6 (1), 71-84 (2015).</li>
<li>Gupta, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+State+Transitions+Give+Rise+to+Phenotypic+Equilibrium+in+Populations+of+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stochastic State Transitions Give Rise to Phenotypic Equilibrium in Populations of Cancer Cells.</a> Cell. 146 (4), 633-644 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı meme kanseri olmayan kök hücreleri geçiş meme CSC benzeri hücrelere apoptosis ters bir sonucu olarak algılamak için doğrudan ve net bir şekilde açıklar. Tersine çevrilen bu hücreler CSC özelliklerinin onay immünyetmezligi fareler18,24,26 benn in vitro mammosphere oluşumu tahlil ve in vivo xenograft nakli kullanarak yardımcı ,27,...

Kanser ülkeler dünya çapında1ağır yükü neden ölüm önde gelen nedenidir olmuştur. Meme kanseri görülme sıklığı ve mortalite açısından hem de kanser1her türlü arasında kadın hastalarda sık ve yaygın yüksek. Kanser heterojenite nedeniyle ilaçlar genellikle kemoterapi kanser hücre ölüm2,3,4elde etmek için kullanılır. Ortak kemoterapötik ilaçlar kez DNA5,6hedef, ancak, hızla büyüyen hücreler9, protein sentezi7,8 ve/veya Mikrotubul dynamics sırasında en etkilenirler durgun kanser kök hücre (CSC) s gibi genellikle daha az etkilenen10hücrelerdir. CSCs vardır, bu nedenle, daha büyük olasılıkla daha sonra neden ilaç direnci ve Kanser nüks10,11tedavi sonrası hayatta kalmak. Bu nedenle, CSCs ortadan kaldırılması kanser tedavisi için önemli bir konu haline gelmiştir ve CSCs kökeni incelenmesi gereklidir.
Apoptozis ters olgusu üzerinde daha fazla çalışmalar son on yılda12,13,14,15,da16,17,18 gerçekleştirilmiş , 19. bu kavramı ortaya çıkması daha önce bu yaygın olarak hücreleri geri dönüşümsüz caspase harekete geçirmek sonra apoptosis geçirecek kabul edildi. Caspases karmaşık apoptotik oluşumu ve aşağı akım yüzeylerde20bölünme gibi apoptozis, başlatma ve yürütme aşamaları kilit rolü oynamak protein enzimler bir aileyiz. Cellat caspases caspase 3 veya caspase 7 gibi aktivasyonu "dönüş yok" apoptoz21olarak kabul edilmiştir. Ancak, araştırmacılar son zamanlarda apoptosis ters tüp bebek her ikisi de oluşur ve sırasında hangi hücrelerin içinde vivo, hatta caspase harekete geçirmek '12den sonra,13,14 apoptosis kurtarabilirsiniz gözlenen , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. Ayrıca, agresif özellikler daha yüksek direnç özgün apoptotik uyarıcı ve daha yüksek invasiveness algılanır tersine çevrilmiş kanser gibi hücreleri15. Bu nedenle, CSC benzeri hücre yüzdesi daha yüksek sonunda daha malign özellikleri apoptosis ters18sonra katkıda tedavi edilmezse hücrelere kıyasla tersine çevrilmiş nüfus olurdu önerilmiş.
Daha önce birçok çabaları vitro ve daha da önemlisi, apoptozis ters içinde vivo izlemek için büyük ölçüde bu işlemi16,17,19evrenselliğini teyit yardımcı yapılmıştır. Ancak, ters hücre sonuçlarını sistemik bir çalışma nedeniyle gerçekten apoptosis ters uğramıştır hücre yalıtım yetersiz bulunmuyor. Saf apoptotik hücreler almak ve yeniden elde etmek onları için daha fazla çalışma için bir ihtiyaç vardır. Bu sayede apoptosis için "dönüş yok"21 marker olarak geleneksel olarak iyi kabul edilen işaretçiyi cellat caspase etkinleştirme kullanın ve floresan aktif hücre (caspase-aktive hücreleri lekeli ayırımcılık FACS) sıralama kullanmak caspase-3/7 yeşil algılama boya ile. Boya kovalent bir kısa amino asit dizisi, tanınan ve 3/7 active caspases tarafından i ciddi DEVD bağlanır. Bölünme sitozol nerede DNA'yı bağlar ve güçlü floresans yayar çekirdeği translocate boya yayın yardımcı olur. Bu yordamı kullanarak bir toplu hücre nüfus içinde bazı hücreler apoptosis geçirmiş değil önler.
CSCs veya tümör başlatılıyor hücreleri tek bir kullanarak birçok solid tümör tespit edilen veya bir arada çeşitli yüzey marker(s) ve bu hücreler çok az sayıda form tümörler immünyetmezligi fareler22,23için yeterli, 24,25,26,27. CD44 ve CD24 sık meme CSC çalışmalar ve CD44 kullanılmıştır+/CD24- hücreleri meme CSCs26,27,28,29 tanımlanan , 30. son zamanlarda, biz apoptosis ters ve CSCs önerilen ilişkisi onaylamak ve tersine çevrilmiş meme kanseri hücreleri artan tümör şekillendirme yeteneği tüp bebek ve ile vivo kazandı göstermek için deneyler bir dizi gerçekleştirdiyseniz bir CSC işaretleri18hücrelerle yükseltilmiş yüzdesi. Her ne kadar biz değil hariç olasılığını meme CSCs daha iyi hayatta kalmak ve böylece apoptosis ters sonra tekrar ne zaman biz olmayan kök kanser hücreleri ve konu izole olduğunu da önemlisi, zenginleştirilmiş onları apoptosis tersine çevrilmesine, CSC başlangıçta olmayan kök içinde ortaya çıkacak olmayan kanser hücre nüfus, düşündüren kök kanser hücreleri apoptosis ters sırasında CSCs yüzdesi artışa katkıda bulunabilir.
Bu makalede apoptosis ters sonra meme CSC benzeri hücreleri meme kanseri olmayan kök hücreleri geçiş göstermek ve bu geçiş akış sitometresi tarafından tespit etmek için amaçlamaktadır. Meme kanseri olmayan kök hücreleri başlangıçta CD44 izole ederek hazır mısın-/CD24+ meme kanseri hücreleri FACS tarafından. O zaman, apoptozis indüklenen ve morfolojik değişiklikler, mikroskop altında doğruladı. Daha sonra apoptotik hücreler olumlu etiketli-Caspase 3/7 yeşil algılama boya tarafından FACS tarafından izole ve daha da apoptotik indükleyicileri apoptosis ters için yokluğunda kültürlü. Tersine çevrilen hücreleri CSC işaretleri ile akış sitometrik çözümlemesi için kurtarma 7 gün sonra lekeli. CD44 hücrelerle+/CD24 yeniden tersine çevrilmiş nüfus- işaretçileri görünür düşündüren CSC benzeri hücreleri olmayan kök kanser hücrelerinin geçiş apoptosis ters sırasında oluştu.
Apoptozis ters birden fazla kanseri gözlenen yanı sıra normal primer hücre hücre hatları ile in vitro12,13farklı apoptotik uyaranların tedavi. Bu işlem aynı zamanda Drosophila içinde takip edilmiştir içinde vivo16,17,19model. Temel mekanizma ile ilgili fazla bilgi Kanser nüks farklı kanser hastalığı modelleri ve CSCs kökeni bu el yazması açıklandığı gibi tekniği kullanılarak elde edilebilir.

<table><tbody><tr><td>MCF-7</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC)</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC)</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>T47D</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC)</td><td>HTB-133</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Reaktif</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.05% tripsin-EDTA</td><td>İnvitrojen</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>% 0.25 tripsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 annexin V konjuge</td><td>Invitrogen</td><td>A35109</td><td></td></tr><tr><td>sığır serum albümini</td><td>USB</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl < alt > 2 < / alt > ve orta nokta 2H < alt > 2< / alt >O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent kaspaz-3/7 yeşil floresan boya</td><td>Invitrogen</td><td>C10423</td><td></td></tr><tr><td>dimetil sülfoksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fc bloğu</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>fetal sığır serumu</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td>ısıyla inaktive edilmiş</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>USB</td><td>16926</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos</td> İnsan CD24'e karşı <td>Invitrogen</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>monoklonal antikorları</td><td>BD Biosciences</td><td>555428</td><td>PE Klon: ML5 Lot: 5049759 RRID:</td></tr><tr><td>İnsan CD44'e karşı AB_395822 monoklonal antikorlar</td><td>BD Biosciences</td><td>560531</td><td>PERCP-CY5.5 Klon: G44-26 Lot: 7230770 RRID: AB_1727485</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>paklitaksel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7402</td><td></td></tr><tr><td>PE Fare IgG2a, & İzotip Kontrolü</td><td>BD Biosciences</td><td>554648</td><td>Klon: G155-178 (RUO) RRID: AB_395491</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>İnvitrojen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Fare IgG2b, & İzotip Kontrolü</td><td>BD Biosciences</td><td>558304</td><td>Klon: 27-35 RRID: AB_647257</td></tr><tr><td>fosfat tamponlu salin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21600010</td><td></td></tr><tr><td>propidium iyodür</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 orta</td><td>Invitrogen</td><td>11835055</td><td>fenol kırmızı içermeyen</td></tr><tr><td>sodyum azid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>staurosporin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Ekipman</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm kültür kabı</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>12 oyuklu doku kültürü plakaları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci 40 & mu; m naylon örgü</td><td>BD Biosciences</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>FACSuite yazılım paketi v1.0</td><td>BD Biosciences</td><td>651360</td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse</td><td>BD Biosciences</td><td>651155</td><td></td></tr><tr><td>FluoView FV1000 konfokal mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td>60X objektif</td></tr><tr><td>FV10-ASW Viewer yazılımı Ver.4.2b</td><td>Olympus-yuvarlak</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>tabanlı polistiren 12 &zamanlar; 75 mm tüpler</td><td>BD Biosciences</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>S3e ayırıcı</td><td>Bio-Rad</td><td>1451006</td><td></td></tr></tbody></table>

apoptozis ters sonra yeni kurulan meme kanser kök hücre benzeri hücre akış sitometrik algılama

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Temel mekanizmaları belirsiz kalırken Kanser nüks onkolog tarafından uzun eğitim gördü. Son zamanlarda, biz ve diğerleri apoptosis ters adında bir fenomen çeşitli hücre modelleri farklı uyaranlara altında artan tumorigenicity yol açar bulundu. Önceki çalışmalarda bu işlem tüp bebek ve içinde vivo izleme üzerinde duruldu; Ancak, yalıtım gerçekten ters hücre elde, hangi anlayışımız apoptosis ters sonuçları üzerinde sınırlar henüz. Burada, biz bir Caspase-3/7 yeşil algılama boya aktif caspases ile etiket hücrelere apoptotik indüksiyon sonra yararlanın. Hücre pozitif sinyaller ile daha da floresan aktif hücre (FACS) kurtarma için sıralama sıralanır. Confocal mikroskobu altında morfolojik muayene apoptotik durumu FACS önce onaylamak yardımcı olur. Tumorigenicity bir artış kez yükselmesi kanser kök hücre (CSC) yüzdesi olarak bağlanabilir-tarihlerde hücreleri. Ayrıca, meme kanseri heterojen göz önüne alındığında, bu CSC benzeri hücreler kaynağını tanımlayan kanser tedavisi için kritik olacaktır. Böylece, meme kanseri olmayan kök hücreleri apoptosis uyarının harekete geçirilmesine karşılık, caspase aktive hücreleri izole ve Apoptozis ters işlemi yapmadan önce hazırlayın. Akış Sitometresi Analizi meme CSC benzeri hücreleri meme CSC benzeri hücreleri apoptosis ters sırasında Meme kanseri olmayan kök hücrelerden aktarıldığı gösteren tersine çevrilmiş grubunda yeniden görünmesini ortaya koymaktadır. Özet olarak, bu iletişim kuralı tarafından akış sitometresi apoptotik meme kanseri hücrelerinin yalıtım ve CSC yüzde ters işlem hücrelerdeki değişiklikler tespiti içerir.

Kanser hücrelerinin CD44 ilk sıralama meme CSC benzeri hücreleri kök olmayan meme geçiş incelemek için-/CD24+ meme kanseri hücrelerinin ihtiyaç. MCF-7 hücre satırı için hangi yaklaşık %0.15 hücreler özgün nüfus (Şekil 1), bu adımı CSC imleçli CSC zenginleştirme apoptosis tersine çevirme sırasında olasılığını dışlamak yardımcı oldu. Hiçbir hücre özgün nüfus CSC imleçli olsaydı, tam tersine, gibi T47D hücreleri (Şekil ...

Burada, apoptotik meme kanseri hücreleri floresan aktif hücre sıralayarak yalıtmak ve daha fazla meme kanseri olmayan kök hücreleri meme kanser kök hücre gibi hücrelere geçişten sonra apoptosis ters akış sitometresi tarafından algılamak için bir iletişim kuralı mevcut.

Apoptozis ters sonra yeni kurulan meme kanser kök hücre benzeri hücre akış sitometrik algılama

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Apoptotik ters hücrelerin gerçek popülasyonlarının izolasyonları daha önce bir sorun olmuştur, bu da apoptosis ters sonuçları hakkındaki anlayışımızı büyük ölçüde sınırlatır. Bu protokol bize apoptotik ters hücrelerin saf popülasyonları oluşturmak için izin verir. Bu tekniğin en büyük avantajı, kullanılan malzeme ve ekipmanların farklı kurumda yaygın olarak bulunmasıdır.Bu teknik kolayca apoptosis ters uğramıştır hücrelerin saf popülasyonları izole etmek için uygulanabilir. Daha önce bildirildiği gibi, normal hücreler de apoptosis ters geçmesi olabilir, meme kanseri hücreleri dışında, farklı kemo hücreleri, yanı sıra normal hücreler, başlatılabilir ve çeşitli apoptotik uyaranlar kullanılabilir. Ters hücre apoptosis ve hızlı sıralama geçti çünkü, iyileşme oranı genellikle düşüktür.Daha büyük bir başlangıç hücre numarası son verimi artırmak için rekombinant olduğunu. Başlamak için, kültür MCF-7, MDA-MB-231, başlamak için, kültür MCF-7, MDA-MB-231 ve T47D hücreleri, metin protokolüne göre. Bundan sonra hücreleri Iki kez PBS ile yıkayın, sonra MCF-7'ye yüzde 0.05 tripsin-EDTA yüzde 0.05 tripsin-EDTA iki mililitre ekleyin, ve MDA-MB-231 hücreleri, MCF-7 ve MDA-MB-231 hücreleri, ve t47D hücrelerine yüzde 0.25 tripsin-EDTA yüzde 0.25 tripsin-EDTA iki mililitre.T47D hücrelerine. Hücreleri 5 dakika boyunca 37 santigrat derecede, %5 karbondioksit hücre kültürü kuluçka makinesinde yetiştirin. Hücreler kuluçkaya yatarken, tripsin-EDTA ile aşırı sindirimi önlemek için hücrelerin bir mikroskopla ayrılmasını kontrol edin.Hücrelerin yüzde 90'ından fazlası ayırıldığında, tabağa tamamlanmış beş mililitre tamamlanmış RPMI ortamı ekleyin ve hücre katmanı yüzeyinin üzerine birkaç kez pipet ekleyin. Sonra, hücreleri 15 mililitrelik konik tüplere aktarın ve santrifüj. Supernatant atın ve 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerde FACS tampon ile pelet yeniden askıya.Daha sonra, hücreleri birkaç tüpe bölün. Tüpleri bir kez daha santrifüj edin ve süpernatantatın. Daha sonra, örneklere seyreltilmiş Fc bloğu ekleyin.Numuneleri tekrar santrifüj etmeden önce, karanlıkta 20 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, supernatant atın. Daha sonra, insan CD44 karşı florokrom konjuge monoklonal antikorlar ekleyin, ve CD24, insan CD44 karşı, ve CD24, bir ila 40, ve 1-10 seyreltme, sırasıyla, çift boyama gruplarına.Pozitif kontroller için, olumlu kontroller için CD44 antikorları ekleyin, MDA-MB-231 hücrelerine CD44 antikorları, MDA-MB-231 hücrelerine CD24 antikorları ekleyin ve MCF-7 hücrelerine CD24 antikorları ve MCF-7 hücrelerine CD24 antikorları sırasıyla 40'a kadar ve 1 ila 10 seyreltme ekleyin. PerCP-Cy5.5 Fare IgG2b Kappa, PerCP-Cy5.5 Fare IgG2b Kappa, CD44 antikorları için bir izotop kontrolü olarak hücrelere bir ila 40 oranında seyreltilmiş ekleyin. Sonra, PE Mouse IgG2a Kappa ekleyin, Sonra, PE Mouse IgG2a Kappa ekleyin, CD24 antikorlar için bir izotop kontrolü olarak hücrelere bir ila 10 oranında seyreltilmiş.Numuneleri karanlıkta 4 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra, örnekleri 300 g's Then'de santrifüj edin, örnekleri 300 g'de santrifüj edin ve dört santigrat dereceyi beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve PBS 500 mikro litre pelet iki kez yıkayın.Daha sonra, daha önce açıklandığı gibi santrifüj tekrarlayın. PBS 0,5 mililitre pelet yeniden askıya ve 40 mikrometre naylon örgü ile süspansiyon filtre. Daha sonra süspansiyonu floresan tarafından aktive edilmiş bir hücre ayırıcısı aracılığıyla çalıştırın.CD44 negatif hücreleri ve bir mililitre toplama ortamı içeren yuvarlak alt tüplerde CD24 pozitif belirteçleri toplayın. Sonra tüpleri santrifüj edin ve süpernatantı atın. Daha sonra, daha fazla kültür için taze toplama ortamı içeren bir kültür çanak sıralanmış meme olmayan kök kanser hücreleri plaka.İlk olarak, DMSO bir millimolar staurosporine kullanın, metin protokolüne göre, orta 2.5 mikro-molar staurosporin hazırlamak için. Ardından, kültür ortamını hücrelerden çıkarın. Bir kez PBS iki mililitre ile hücreleri yıkayın, bundan sonra, MSF-7 hücrelerine altı saat boyunca staurosporin e-mililitre ekleyin, apoptoz neden, hücreler yüzde 70 confluent olduğunda.Sonra, DMSO bir milimolar paclitaxel hazırlamak. Sonra, 12.5 mikro-litre ekleyin Sonra, 15 mililitre konik tüp 10 mililitre son bir hacim makyaj T47D hücrelerinin tamamlanmış orta 1 milimolar paclitaxel 12,5 mikro-litre ekleyin. Kültür ortamını hücrelerden çıkarın ve hücreleri 2 mililitre PBS ile yıkayın.Daha sonra, hücreler yüzde 70 kesişme ulaştığında apoptosis neden 10 saat apoptosis indüklemek için 10 saat boyunca hücrelere paclitaxel orta ekleyin. Bundan sonra, solvent le tedavi edilen MCF-7 grubundan ortayı çıkarın ve iki mililitre PBS ile yıkayın. Sonra, 10 mililitre ekleyin 0.25 yüzde DMSO orta Sonra, staurosporine için çözücü kontrolü olarak altı saat boyunca yüzde 0,25 DMSO orta 10 mililitre ekleyin.Kültür ortamını çözücü olarak işlenmiş T47D grubundan çıkarın ve hücreleri iki mililitre PBS ile yıkayın. Sonra, 0.05 yüzde DMSO orta 10 mililitre ekleyin Sonra, paklele için çözücü kontrolü olarak 10 saat boyunca yüzde 0,05 DMSO orta 10 mililitre ekleyin. Sonra, hücreyi lekeleyin ve %5 karbondioksit kuvözde 37 derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın.Tedavi edilen hücrelerin morfolojik değişikliklerini gözlemlemek için 60 kez konfokal lazer tarama mikroskobu kullanın. Leke hem apoptotic indükleyici ve solvent tedavi MCF-7 ve T47D hücreleri ve solvent tedavi MCF-7 ve T47D hücreleri karanlıkta 30 dakika boyunca 37 derece santigrat yüzde beş karbondioksit inkübatör. Floresan aktive hücre ayırıcı kullanarak, toplama orta bir mililitre içeren yuvarlak alt tüplerin indükleyici tedavi gruplardan pozitif hücreleri toplamak.Daha sonra, tüpleri daha önce açıklandığı gibi santrifüj edin ve süpernatant atın. Bir mililitre toplama ortamı ile yuvarlak alt tüplerde solvent ile tedavi edilen gruplardan negatif hücreleri toplayın. Tüpleri santrifüj edin ve süpernatantatın.Bundan sonra, taze toplama ortamında sıralanmış hücreleri yeniden askıya alın. Hücreleri 12 kuyulu doku kültür plakalarına yerleştirin ve apoptoz ters ilerliği için yedi gün boyunca kültür. Yüzde 0.05 tripsin-EDTA ile hem indükleyici hem de solvent le tedavi edilen gruplarda ters MCF-7 hasat edin.yüzde 0.05 tripsin-EDTA ile. Daha sonra, her iki indükleyici t47D hücreleri hasat Sonra, hem indükleyici hem de solvent tedavi gruplarda T47D hücreleri hasat 0.25 yüzde tripsin-EDTA. Hücreleri insan CD44 ve CD24'e karşı florokrom konjuge monoklonal antikorlarla lekelendirin.Hücreler leke iken, daha önce gösterildiği gibi isotip kontrolleri hazırlamak. Son olarak, hücreleri akış sitometresi üzerinde çalıştırın ve CD44 pozitif ve CD24 negatif belirteçleri olan hücrelerin yüzdesini algıla. Bu protokolde, meme kök dışı kanser hücrelerinden meme CSC benzeri hücrelere geçiş gözlenmiştir.Kök olmayan kanser hücrelerinin izolasyonu ilk olarak MCF-7 hücrelerinde yapıldı. Apoptotik indükleyiciler eklendikten sonra tipik morfolojik değişiklikler gözlendi ve ilaç çekilmesi nden sonra benzer morfolojisi olan apoptozdan kurtarılan hücreler. Kaart aktive edilmiş hücreler, caspace aktivasyonu olmayan hücrelere göre daha yüksek floresan yoğunluğuna göre etiketlendi ve sıralandı.Apoptotik indüksiyon işlemi sırasında, çözücü, olguprosedürünün veya çözücünün kendisinin geçiş nedeni olduğu ihtimalini dışlamak için kullanıldı. Apoptotik-indükleyici tedavi gruplarındaki kaart-aktive edilmiş hücrelerin neksin beş pozitif ve PI negatif olduğu saptadı ve bu hücreler apoptotik hücreler olduklarını düşündürdü. Apoptotik hücreler, çözücü olarak tedavi edilen gruplarla karşılaştırıldığında, iyileşme künyesinde toplanmış ve kültürlenmiştir, akış sitometrik analizi, cd44 pozitif ve CD24 negatif kadranda ters meme kök dışı kanser hücre popülasyonunda görünen hücreler olduğunu göstermiştir.Gaging akış analizi ve hücre sıralama önemlidir, yeterli kontrol laboratuarlarda hazırlanmalıdır. Bu in vitro apoptoz ters işlem saf apoptotik kanser hücrelerini izole yana, in vivo tümörigenez varlıkları gibi deneyler hücreleri gerçek ters sonuçlarını anlamak için yapılabilir. Bu teknik kanser nüks nedeni ışık tutuyor, bu nedenle, potansiyel kanser hastalarında tekrar oluşumunu önlemek için araştırılabilir.Lütfen kurumunuzda ki biyogüvenli seviye düzenlemelerine göre hücre kültürü deneyleri yaparken kendinizi düzgün bir şekilde korumayı unutmayın.

flow-cytometric-detection-newly-formed-breast-cancer-stem-cell-like

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu videoda, floresanla aktive edilen hücre sıralayıcı veya FACS kullanarak baş ve boyun skuamöz karsinom hücre hatlarından kanser kök benzeri hücrelerin bir alt popülasyonunun izolasyonunu açıklıyoruz. İzole edilmiş yan hücre popülasyonu, daha fazla aşağı akış analizi için kullanılabilir.

Kanser Tarafı Popülasyon Ayrımcılığı Deneyi: Hoechst Boya Akıntı Testi Kullanılarak Kanser Kök Benzeri Hücreleri İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Yüzen mamosfer tahlilleri, süspansiyon koşullarında hayatta kalan ve farelere implante edildiğinde gelişmiş tümör oluşumu gösteren kök benzeri meme kanseri hücrelerinin alt kümesini araştırabilir.  Bu protokol, kök ile ilişkili transkripsiyonel manzaranın analizini kolaylaştırırken, in vivo tümörijenez için bir vekil olan küre oluşturma yeteneğinin uygun bir in vitro ölçümünü sağlar.

İnsan Göğüs Kanseri dokuları ve hücre hatlarından gelen Mammosphere Oluşumu Testi

Kanser kök benzeri hücrelerin tümör nüksü ve tedavilere dirençteki rolünü anlamak son on yılda büyük ilgi gören bir konu haline gelmiştir. Bu makale, baş ve boyun skuamöz karsinom hücre hatlarından (HNSCC) kanser kök benzeri hücrelerin alt popülasyonunun izolasyonunu ve karakterizasyonunu açıklamaktadır.

Bir Baş-Boyun Skuamöz Hücre Karsinomu subpopülasyonu olması Kök Hücre Özellikleri İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Bu prosedür, bir aspirin-fumarat prodürününün anti-NFκB ve anti-kanser kök hücre aktivitesini nasıl sentezlediğimizi ve karakterize ettiğimizi gösterecektir.

NFKB Aktivite ve Meme Kanseri Kök Hücreler önler Sentezi ve bir Aspirin-fumarat ön-ilacının Karakterizasyonu

Kök hücre popülasyonlarının biyolojik örneklerden karakterize edilmesine ve izole edilmesine izin veren yöntemler, kanser ve ötesinde kök hücre hedefli tedavilerin ilerletilmesi için kritik önem taşır. Burada, boya tetiklemeli yan popülasyon fenotipini kullanarak kanser kök hücre izolasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Biyolojik Örneklerden Kanser Kök Hücrelerini Algılamak ve Arıtmak İçin DNA Boya Tarafından Tetiklenen Yan Populasyon Fenotipi Kullanmak

Bu protokol, ilacın belirlenmesi için, hastanın türetildiği kürlerin oluşumunu, proliferasyonun ölçülmesi, sitotoksisite testi, akış sitometri, immünofluoresesans boyama ve konfoksel görüntüleme gibi aşağı akış analizini açıklar. anti-neoplastik terapötik olarak adayların potansiyeli. Bu protokol her hasta ve hastalığın aşaması için spesifik ilaçların tanımlanması ile hassas ilacı destekler.

Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir

Bu metodolojinin amacı, kanser hücre hatlarındaki kanser kök hücrelerini (CSC) ve primer insan tümör örneklerini küre oluşturma protokolü ile sağlam bir şekilde, fonksiyonel tahliller ve akış sitometrisi ve Batı ile henotypik karakterizasyon kullanarak tanımlamaktır. Leke.

Jinekolojik ve Meme Kanseri Tümörlerinden Kanser Kök Hücre Kürelerinin Alınması

Bu deneysel protokol, BCSC'lerin meme kanseri hücre ve doku örneklerinden izolasyonunun yanı sıra BCSC fenotipini ve fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılabilecek in vitro ve in vivo testleri tanımlamaktadır.

İnsan Meme Kanseri Kök Hücrelerinin Hücre ve Doku Örneklerinden İzolasyonu ve Fonksiyonel Değerlendirmesi

Apoptoz, erken ve geç apoptotik biyobelirteçlerin akış sitometrik analizi ile karakterize edilebilir. Serviks kanseri hücre hattı SiHa, bir tezgah üstü akış sitometresi kullanılarak Actinomycin D ile tedaviden sonra apoptoz biyobelirteçleri için analiz edildi.

Aktinomisin D ile Tedavi Edilen SiHa Serviks Kanseri Hücrelerinde Apoptotik Biyobelirteçlerin Akış Sitometrik Analizi

Zebra balığı T-akut lenfoblastik lösemi modelindeki hareketsiz hücreleri tanımlamak için hücre proliferasyon boyaması kullandık. Leke, bölünmeyen hücrelerde tutulur ve hücre proliferasyonu sırasında azaltılır, bu da daha fazla sorgulama için hareketsiz hücrelerin seçilmesini sağlar. Bu protokol, hücresel sessizlik bağlamında kendini yenilemeyi incelemek için işlevsel bir araç sağlar.

Zebra Balığı T Hücreli Akut Lenfoblastik Lösemi Modelinde Hareketsiz Hücrelerin Hücre Proliferasyonu Boyama Kullanılarak Tanımlanması 

Bu protokol, tümör olmayan meme epitel hücrelerinde Apoptoz İnhibörü 5 (Api5) tarafından indüklenen kanser kök noktasını incelemek için mamosfer oluşum testinin oluşturulma yöntemini açıklar. Birincil nesil mamutsferlerden toplanan lizatlar, kök hücre benzeri özelliklerin indüksiyonunu değerlendirmek amacıyla farklı kök belirteçleri için analiz edilir.

Mamokür Testi, tümör olmayan meme epitel hücre hatlarında Api5 kaynaklı kök konumunu ortaya koydu

Öğrenin meme kanserinde apoptozis tersine dönüş sonrası kanser kök hücre benzeri hücre geçişini akış sitometri ile izole etme yöntemini. Bu teknik saf hücre popülasyonları elde ederek kanser nüksü mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Apoptozis ters sonra yeni kurulan meme kanser kök hücre benzeri hücre akış sitometrik algılama

Daha fazla video keşfet