qKAT: nicel Semi-automated yazmaktan katil hücreli immünglobulin benzeri reseptör gen
6 Mart 2019
Nicel katil hücre immünglobulin benzeri reseptör (kır) yarı otomatik (qKAT) yazarak sayı türü kır genler kendi uygulama için nüfus ve hastalığı Derneği çalışmalarda kopyalamak için basit, yüksek performans ve düşük maliyetli bir yöntemdir.
Bu yöntem haplotip çeşitliliği ve bunun hastalıkla nasıl ilişkili olduğu gibi NK hücre reseptör genetiği ile ilgili anahtar soruları yanıtlayabilir. Bu yöntemin görsel gösterimi, otomasyon süreci ve veri analizi de dahil olmak üzere laboratuarınızdaki protokolün ayarlanmasına yardımcı olacaktır. Bu tekniğin başlıca avantajları, geleneksel yöntemlerin aksine, nicel KIR otomatik yazımı anlamına gelen qKAT'ın yüksek iş sahibi olması ve gen kopya numarası sağlamasıdır.
qKAT hastalık ilişkisi hakkında bilgi verebilir. Bu tekniğin etkileri HIV ve hepatit C gibi viral enfeksiyonlar için tedavi için yararlı olabilir, kanser, kök hücre nakli, ve gebelik bozuklukları. qKAT, kir ve HLA molekülleri arasındaki ekspresyon ve fonksiyonel etkileşimlerin araştırılmasının yanı sıra popülasyon genetiğinin incelenmesinde de uygulanabilir.
qKAT, özellikle iki KIR geninin eksonlarını ve bir referans genini hedef alan 10 çokkatlı reaksiyondan oluşur. Bu protokolde, belirli astarlar verilen genin alellerini tespit etmek için tasarlanmıştır ve PCR sonuçları kısa amplikonlarla sonuçlanır. Bundan sonra, pcr amplifikasyonu gerçek zamanlı olarak izlemek için çift etiketli spesifik hidroliz probları kullanılır.
Kopya numarası analizi, hedef KIR genlerinin bir referans genine göreli niceliğini kullanır. qKAT yüksek iş yapma tekniği olarak tasarlanmış ve ayarlanmıştır. Bu nedenle, her reaksiyon 1.000 numunenin hemen altında yapılabilir.
Aşağıdaki adımlar, her 96 kuyulu DNA plakasının hazırlanması ve kapamasında yer alan adımları göstermektedir. Başlangıç olarak, DNA'yı ölçtükten sonra, DNA'yı 96 kuyuluktaki bir plakada seyreltin. Bilinen bir kopya numarası ve şablon olmayan bir denetimiçeren en az bir denetim örneği ekleyin.
Plakayı 450 gs'de iki dakika santrifüj edin. Daha sonra, 384-iyi qPCR plakaları içine dört katına her örnek dağıtmak. Bundan sonra, hava 24 saat boyunca oda sıcaklığında temiz bir alanda DNA kuru.
10 384-iyi plakalar için bir qKAT reaksiyonu ayarlamak için, ilk, qPCR tampon, astar defrost ve dört santigrat derece aliquots prob aliquots. Ana karışımı metin protokolüne göre buz üzerinde hazırlayın. Daha sonra, ana karışımı 96 kuyulu derin kuyuplakasına eşit olarak dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın.
Kurutulmuş gDNA örnekleri ile plakanın her kuyuya ana karışımın 9,5 mikrolitresini dağıtın. Bundan sonra, folyo ile plaka mühür ve hemen dört derece santigrat de saklayın. Birden fazla 384-well DNA plakası üzerinde ana karışımı dağıtım eğer sıvı işleme sisteminin iğneleri temizlemek için kısa bir su yıkama yapmayı unutmayın.
Plakayı 450 gs'de gDNA örnekleriile üç dakika santrifüj edin. Daha sonra, DNA'yı yeniden askıya almak ve hava kabarcıklarını dağıtmak için plakayı 4 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Plakayı bir gecede kuluçkaya yatırdıktan sonra, hava kabarcıklarını dağıtmak için santrifüjü tekrarlayın.
Ardından, plakayı soğutulmuş depoya yerleştirin. QPCR makinesini bir mikroplaka işleyicisine bağlayın. Daha sonra, mikroplaka işleyicisini metin protokolüne göre programlayın.
Çalışma tamamlandıktan sonra, robotqPCR makineden plaka toplamak ve atmak dock yerleştirin. Amplifikasyon tamamladıktan sonra qPCR yazılımını açın. Navigator sekmesinin altında, kaydedilen reaksiyon deneme dosyasını bir plaka için açın.
Ardından, Yeni Çözümleme Oluştur penceresini açın ve 2. Ardından Filtre Tarak'ı seçin ve STAT6 için toplanan verilerin seçildiğinden emin olun. Uygun renk telafisini seçin.
Hesapla'yı tıklatın ve ardından dosyayı kaydet'i tıklatın. Verileri Fit Points yöntemiyle çözümlemek için yeni çözümleme penceresi açın ve Fit Points yöntemi için uygun ayarları seçin. Ardından, STAT6 için doğru filtreleri ve renk karşılıklarını seçin.
Gürültü bandını arka plan gürültüsünü hariç tutmak için ayarlayın. Bundan sonra, Çözümsekmesini açın ve sığdırmazlık noktalarını üçe ayarlayın ve Sığdırmayı Göster'i seçin. Değişiklikleri kaydedin ve kir genleri için Fit Point ve 2.
QPCR yazılımında Navigator sekmesini açın ve Sonuç Toplu Dışa Aktarma'yı seçin. Ardından, deneme dosyalarını içeren klasörü açın ve bunları pencerenin sağ tarafına aktarın. İleri'yi tıklatın ve dışa aktarma dosyasının adını ve konumunu seçin.
Bundan sonra, ilgi alanının analiz türünü seçin ve İleri'yi tıklatın. Dışa aktarma işlemini başlatmak için İleri'yi tıklatmadan önce dosyanın adının, dışa aktarma klasörünün ve çözümleme türünün doğru olduğundan emin olun. Dışa aktarma durumu Tamam'a değiştiğinde, ekran otomatik olarak bir sonraki adıma taşınır.
Seçili dosyaların tümünün başarıyla dışa aktarıldığından emin olun ve Bitti'yi tıklatın. Ardından, dışa aktarılan plakaları tek tek tepkilere bölmek ve dosyaları kopya numarası çözümleme yazılımı yla okunabilir bir yazılıma dönüştürmek için metin protokolündeki komut dosyalarını kullanın. Ardından, kopya numarası çözümleme yazılımını açın ve komut dosyaları tarafından oluşturulan metin dosyalarını yüklemek için gerçek zamanlı PCR sonuç dosyasını içe aktar'ı seçin.
Son olarak, Çözümle'yi seçin ve en sık örnek kopya numarasını seçerek çözümleme gerçekleştirin. Bu protokolde, yarı otomatik yazı, veya qKAT, sayı tipi KIR genleri kopyalamak için kullanılmıştır. KIR2DL4 için en sık kopya numarası iki kopya iken KIR3DS1 için en sık kopya numarası sıfır dır.
Bu prosedürü denerken, DNA'nın doğru bir şekilde ölçülmediğinden emin olmak, buz üzerindeki tüm adımları gerçekleştirmek ve reaktiflerin ışıktan kaplandığından emin olmak son derece önemlidir. Ayrıca KIR genleri için bilinen LD kurallarına uymayan numuneler için ham veriler üzerinde kapsamlı kontroller yapmak da önemlidir. Bu prosedürü takiben, ek soruları yanıtlamak için sıralama gibi başka yöntemler de yapılabilir, örneğin, füzyon genlerinin varlığı veya yeni alellerin tanımlanması gibi.
Bu yöntem, geliştirilmesinden sonra, immünogenetik alanında araştırmacıların NK hücre biyolojisi, hastalık direnci ve insan üremesindeki KIR rolünü keşfetmelerinin önünü açmıştır.
Genel Bakış
Kantitatif killer hücre immünoglobulin benzeri reseptör (KIR) yarı otomatik tipleme (qKAT), KIR genlerini tiplemek için kullanılan yüksek kapasiteli bir yöntemdir. Bu teknik, NK hücresi reseptör genetiğinin ve çeşitli hastalıklar üzerindeki etkilerinin anlaşılmasına yardımcı olur.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- İmmünogenetik
- Popülasyon genetiği
- Hücre biyolojisi
Arka Plan
- KIR genleri bağışıklık yanıtında kritik bir rol oynar.
- Haplotip çeşitliliğinin anlaşılması, hastalık ilişkisi çalışmalarında önemlidir.
- Geleneksel yöntemler genellikle düşük kapasiteli ve maliyetlidir.
- qKAT, gen kopya sayısı bilgisini verimli bir şekilde sağlar.
Çalışmanın Amacı
- KIR gen tiplemesi için yüksek kapasiteli bir yöntem geliştirmek.
- KIR genetiği ile hastalık arasındaki ilişkiyi araştırmak.
- İmmünogenetik araştırmaları ve popülasyon çalışmalarını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- KIR geni tespiti için spesifik primerlerin tasarımı.
- KIR genlerini ve bir referans geni hedefleyen multipleks reaksiyonların kullanımı.
- Amplifikasyonun izlenmesi için gerçek zamanlı PCR.
- Kopya sayısı değerlendirmesi için özel yazılımlar aracılığıyla veri analizi.
Temel Sonuçlar
- qKAT, tek bir çalışmada yaklaşık 1.000 örneği işleyebilir.
- KIR2DL4 ve KIR3DS1 için en sık görülen kopya sayıları belirlenmiştir.
- Yöntem, KIR geni kopya sayılarının belirlenmesinde güvenilirliğini kanıtlamıştır.
- KIR'nin hastalıklardaki rolünün daha ileri düzeyde araştırılmasını kolaylaştırmıştır.
Sonuçlar
- qKAT, immünogenetik alanındaki araştırmacılar için değerli bir araçtır.
- Sağlıklı ve hastalıklı durumlarda KIR gen fonksiyonlarının anlaşılmasını geliştirir.
- Yöntem, popülasyon genetiğindeki çeşitli uygulamalara uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Uygunluğu
KIR gibi polimorfik immün reseptör lokuslarının doğru genotiplendirmesi, immünoloji ve transplantasyon araştırmalarında hedef doğrulamanın risklerini azaltmak için kritik öneme sahiptir. qKAT, geniş kohortlarda yüksek çözünürlüklü kopya sayısı analizine olanak tanıyarak, NK hücre aracılı hastalık direnci ve terapötik yanıta ilişkin mekanistik içgörüleri destekler. Bu yetenek, genetik varyasyonu hastalık modellerindeki fonksiyonel sonuçlarla ilişkilendirerek erken keşif aşamasındaki öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Haplotip çeşitliliğini ve bunun NK hücre reseptörü fonksiyonu üzerindeki etkisini netleştirmek için KIR gen kopya sayısı varyasyonunun sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Ölçeklenebilir örnek işleme için 96 ve 384 kuyucuklu formatlarla uyumlu, yarı otomatik, yüksek kapasiteli genotipleme sağlar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Hidroliz probları içeren multiple gerçek zamanlı PCR kullanarak tüm KIR genleri için kantitatif ve tekrarlanabilir kopya sayısı verileri sağlar.
- Operasyonel Değer: Referans gen normalizasyonu ve önceden tanımlanmış analiz iş akışları (2. Türev Maksimum, Uyum Noktaları) aracılığıyla analiz standardizasyonunu destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Viral enfeksiyon, kanser ve transplantasyon gibi hastalık bağlamlarında KIR-HLA etkileşimlerinin araştırılmasını kolaylaştırır.
- Operasyonel Değer: Yeni alellerin keşfi için aşağı akış sekanslama veya fonksiyonel analizlerde kullanılabilecek haplotip-bilgilendirici veriler üretir.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
qKAT, hedef hipotez testinden preklinik doğrulamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine, özellikle immün efektör mekanizmaların terapötik etkinliği etkilediği durumlarda uygun bir şekilde yerleşmektedir.
- Keşif Biyolojisi: KIR kopya sayısını hastalıkla ilişkili fenotiplerdeki NK hücre aktivitesine bağlayarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: İmmün aracılı modellerde bileşik taraması için tanımlanmış KIR genotiplerine sahip, kullanıma hazır biyolojik sistemler sağlar.
- Analitik: Kopya sayısı belirleme ve deneysel gruplar arasında istatistiksel karşılaştırma için uygun göreceli nicelleştirme verileri sunar.
- Translasyonel Araştırma: Genetik profillemeyi, immün rekonstitüsyon veya graft-versus-host hastalığı modellerindeki preklinik süreklilikle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: İmmünoloji, onkoloji ve üreme sağlığı portföyleri genelinde uygulanabilir, yeniden kullanılabilir bir genotipleme platformu olarak tasarlanmıştır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Polimorfik lokusların yüksek çözünürlüklü genetik profillemesi yoluyla, immün hedef doğrulamasındaki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış reaktif kullanımı, soğuk zincir master mix hazırlığı ve otomatik plaka işleme süreçleri ile tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Erken faz çalışmalarda geniş ölçekli genetik stratifikasyona olanak tanıyarak devam/durdur (go/no-go) kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Farklı tedavi yanıtlarıyla ilişkili KIR haplotipleri tanımlayarak, riskten arındırılmış ilerlemeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Gerçek zamanlı PCR kurulumu, primer/prob tasarımı ve kopya sayısı analiz yazılımı konusunda uzmanlık gerektirir.
- 384 kuyucuklu plakalara uyumlu qPCR cihazlarına ve otomasyon için mikroplaka taşıyıcılara bağlıdır.
- DNA kantifikasyonu, plakalama tutarlılığı ve kontaminasyon kontrollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- İnsan dışı modellere veya alternatif referans genlere genişletildiğinde adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Hassas DNA kantifikasyonu ihtiyacı, ışığa karşı korunan reaktifler ve LD kuralına uyum için ham veri kalite kontrolü gibi pratik sınırlamaları kapsar.
