Nitrik oksit VASP fosforilasyon ölçme tarafından kan trombosit tabanlı algılama

Bu protokol trombositlerin hem in vitro hem de in vivo kan içinde son derece hassas nitrik oksit sensörü olarak potansiyel kullanımını ele alır. Artmış Fosforiile Vazodilatör-Uyarılmış Fosfoprotein veya P-VASP serine 239 trombositnnitrik oksit bazı avantajları vardır, nanomolar soylarda nitrik oksit varlığını tespit etmek de dahil olmak üzere. Sağlıklı bir donörden 30 ila 50 mililitre tam kan toplandıktan sonra iki saat içinde, santrifüj için uygun sayıda 15 mililitre konik tüplere beş mililitre kan ekleyin.

Supernatants üst kısmından trombosit açısından zengin plazmayı dikkatlice toplamak için plastik bir transfer pipetkullanın. Pelet ikinci bir santrifüj ile plazma açısından zengin trombositler ve yavaşça CGS tampon beş mililitre pelet yıkayın. Oda sıcaklığında 10 dakika 400 g santrifüj.

Santrifüj sonunda, modifiye Tyrode tampon üç mililitre pelet resuspend. Saymak için bir hemositometre kullanın ve trombosit süspansiyonlarının yoğunluğunu taze Tirrode tamponunda mililitre başına sekizinci hücrelere kadar üç kez 10'a ayarlayın. Sonra trombosit süspansiyonlarını 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın.

Bu arada, santrifüj ile tüm kan örneklerinin plakasız plazma katmanlarından kırmızı kan hücrelerini toplamak yıkama başına PBS beş mililitre dört yıkar izledi. Son yıkamadan sonra, supernatants atın ve kauçuk durdurucular ile kapalı polipropilen şişelerde uygun deneysel hematokrit plazma açısından zengin trombosit bir mililitre ile kırmızı kan hücreleri karıştırın. Her septa içine bir helyum gaz tankına bağlı bir iğne yerleştirin ve gaz çıkışları yapmak için 26 gauge iğne takın.

Sonra yavaş yavaş oda sıcaklığında şişe girdap ve deoksijenasyon sürecinin izlenmesi için kısmi oksijen basıncı ölçmek için bir oksimetre kullanın. Oksijen azalma hızı helyum akış hızı ve karıştırma hızına bağlıdır. Bu nedenle, bu son derece deneysel kurulum geometrisi bağlıdır gibi bir deney başlamadan önce oksijenasyon zamanı optimize edilmelidir.

Kırmızı kan hücresi nitrit azaltma için, 10 mikromolar son konsantrasyon elde böylece PRP ve RBC deoxygenated örnekleri içine septum yoluyla nitrit enjekte etmek için bir mikroşiniş kullanın. Numuneleri en az 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve her numunenin bir mililitresini santrifüj için mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Yeni mikrosantrifüj tüpler içine supernatants üst kısmından trombosit süspansiyon 300 mikrolitre aktarın ve bir ila dokuz oranında her tüp asit sitrat dekstroz ekleyin.

Trombositleri tekrar santrifüj edin ve her tüpe üç proteaz inhibitörü kokteyli içeren 80 mikrolitre buz soğuk lisis tamponunda peletleri yeniden askıya alın. Daha sonra, her örnekten 15 mikrogram proteini iki ayrı %10 SDS-PAGE jellerine yükleyin. 1.3 saat boyunca 120 volt jelleri çalıştırın.

Çalışma sonunda, jelleri tek tek azot selüloz membranlarına aktarın ve %5 yağsız kuru süt hacmiile spesifik olmayan herhangi bir bağlamayı engelleyin. Membranları bir gecede uygun primer antikorlarla dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve ardından oda sıcaklığında 45 dakika boyunca uygun bir sekonder at turp peroksidaz antikorile etiketleyin. Daha sonra uygun bir görüntü analiz programı ile bant yoğunluğunu ölçmek için bir görüntüleyici ile membranlar maruz.

Sağlıklı venöz kan örneklerinin kısmi oksijen basınç değerleri 50 ila 80 milimetre arasında cıvaya sahiptir. Helyum ile deoxgenation hızla 10 dakika içinde cıva 25 milimetre oksijen kısmi basıncı azalır. Kısmi oksijen basıncının daha da azalması, daha fazla oksijensizleşme süresi ile sağlanabilir.

Artan deoksijenasyon giderek kırmızı renk plazma ile belirtildiği gibi hemolizi düzeylerinde artışa yol açar. Bu deoksijenasyon un bir etkisidir ve helyumsuz karıştırılan örneklerde hemol eksikliğinden kaynaklandığı gibi kendini karıştırmaktan kaynaklanmaz. Trombositlerdeki vazodilatör uyarılmış fosfoprotein veya VASP ve Fosforilasyonlu-VASP ekspresyonu düzeyleri, batı lekesi ile saptanır.

Kısa ömürlü nitrik oksit donör ile tedavi, tedaviden sonraki 10 saniye içinde trombositlerde fosforilasyonlu vazodilatör uyarılmış fosfoprotein ekspresyonunu arttırır. Ayrıca, Fosforitane-VASP veya P-VASP düzeyleri, NO donörün trombosit açısından zengin plazma ile inkübasyonundan 10 dakika sonrasına kadar sabit kaldı ve bu da RbC'lerin mevcut P-VASP düzeylerini etkilemeden trombositlerden ayırmak için yeterli zaman olduğunu gösterdi. Nitrit ayrıca deoksijenadan arındırılmış RBC varlığında trombositP-VASP düzeylerini artırır.

Burada P-VASP'nin total VASP'ye oranı hematokrit seviyesine bağlıdır. VASP trombositile yüksek oranda ifade edilir ve nitrik oksit varlığında hızla fosforilasyona neden olur. Bu nedenle, bu protokol çeşitli fizyolojik uyaranlar tarafından nitrik oksit indüksiyon uyşuiçin bir yöntem sağlar.

Bu yöntemle trombositte artmış P-VASP'yi inhale nitrit in vivo ile nitrik oksit stimülasyonunun bir belirteci olarak başarıyla kullandık. Biyolojik bir numune ile trombosit ile çalışmanın her zaman uygun kişisel koruma ekipmanı kullanılarak yapılması gerektiğini unutmayın.