Name: Nitrik oksit VASP fosforilasyon ölçme tarafından kan trombosit tabanlı algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Öğrenin kan trombositlerini kullanarak nitrik oksit algılama yöntemini. P-VASP fosforilasyon ölçümü ile nanomolar duyarlılıkta in vitro ve in vivo nitrik oksit tespiti yapabilirsiniz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser NIH intramural hibe Dr Alan N. Schechter tarafından finanse edildi.

Not: Kan örnekleri NIH Kan Bankası'ndan elde (IRB onaylı protokolü: 99-CC-0168).
1. kan örnek hazırlama
Not: Trombosit aktivasyon önlemek için yavaş yavaş kan alıp birkaç kez tüp ters çevirme tarafından sitrat ile karışımı yavaşça.
<ol><li>
Trombosit açısından zengin plazma (PRP) hazırlık
	<ol>
<li>30 – 50 mL kan bir 20 G veya daha büyük çaplı iğne kullanarak çizmek ve 1:9 oranı veya asit sitrat Dekstroz (ACD) (85 mM TRISODYUM sitrat, 66.6 mM sitrik asit, 111 mM glikoz, pH 4.5) 1:6 oranında sodyum sitrat (% 3.8) içeren bir tüp içine ekleyin.</li>
		<li>Aliquot 5 mL taze toplanan tam kan boş 15 mL konik tüpler içine de. Tam kan, 120 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Dikkatle trombosit (trombosit açısından zengin plazma, PRP) içeren süpernatant üst kısımlarından bir plastik transfer pipet ile toplamak. Not: 1.1.3. adımdaki PRP deneylerde kullanılmaya hazır durumda olan veya daha fazla işlem için hazırlamak için trombosit yıkanmış. Santrifüjü (adım 1.1.2) kırmızı kan hücreleri ve beyaz hücreler içerir ve daha fazla olabilir elde edilen yumuşak Pelet yıkanmış kırmızı kan hücreleri (RBC) elde etmek için saf — adım 1.3. görmek Deneme kan çizdikten sonra içinde 2 h bitmiş olması gerekir. PRP (süpernatant) toplarken, PRP/RBC arabirim üzerinde birikmiş buffy kat içeren lökosit topluluğu kaçının.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Yıkanmış trombosit hazırlık (isteğe bağlı)
	<ol>
<li>Santrifüj PRP 400 x g oda sıcaklığında 10 dakika için de toplanan. Süpernatant atın ve trombosit granül koruyun.</li>
		<li>Yavaşça granül 400 x g oda sıcaklığında 10 dakika için de 5 mL CGS tampon (120 mM NaCl, 12.9 mM TRISODYUM sitrat ve 30 mM glikoz, pH 6,5) ve santrifüj de ekleyerek yıkayın.</li>
		<li>Trombosit granül değiştirilmiş Tyrode arabellek (134 mM NaCl, 0,34 mM NaH2PO4, 2,9 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glikoz pH 7,4) 3 mL ile resuspend.</li>
		<li>Trombosit seyreltik (1: 100 — örnek olarak, trombosit 990 µL Rees-Ecker çözüm içinde 10 µL) Rees Ecker çözüm ve hemasitometre olarak say.</li>
		<li>Trombosit 3 x 108 hücre/ml yoğunluğu Tyrode arabelleği ekleyerek ayarlayın.</li>
		<li>Trombosit süspansiyon için 1 h 37 ° C'de deneme başlamadan önce kuluçkaya. Not: Yıkanmış trombosit için 5-8 h 37 ° C'de sabit</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Yıkanmış kırmızı kan hücreleri (RBC) hazırlanması
	<ol>
<li>Toplandıktan sonra adım 1.1.3 2500 x g oda sıcaklığında 10 dakika için de elde yumuşak Pelet santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant atın ve 2500 x g oda sıcaklığında 10 dakika için de RBC Pelet PBS 5 mL aralıklarla tarafından ile yıkayın. Bu adım için 3 kez tekrarlayın.</li>
		<li>PBS atın ve yıkanmış RBCs daha fazla deneyler için kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. deoxygenation
<ol><li>1 mL PRP karışımı ekleyin (1.1.4 adımda hazırlanan. veya 1.2.4.) ve (adım 1. 3'hazır.) RBCs, kauçuk tıpa ile kapalı bir polipropilen şişe içine istenilen hematokrit. Örneğin, % 20 hematokrit RBCs 200 µL PRP 800 µL için ekleyin. Not: Hematocrits % 0 önerilir % 40. Trombosit cam yüzey için uygun bir cam şişe veya balon kullanmayın.</li>
	<li>Helyum gaz tankı için kapalı şişe içine bağlı iğne takın ve gaz çıkış 26 G iğne (Şekil 1) ekleyerek olursunuz.</li>
	<li>Yavaş yavaş, oda sıcaklığında şişe girdap. Not: O gaz kalibre edilir kabarcık izin vermez. Yavaş gaz akışı Bu yordam için tercih edilir ve aşırı hızlı o gaz akışı için artan hemoliz yol açar. Son derece deneysel Kur geometri üzerinde bağlı olarak deneme tarafından belirlenecek en verimli gaz akışı gerekir.</li>
	<li>Düzenli olarak bir eş oksimetre kullanarak kısmi oksijen basıncı (pO2) ölçerek deoxygenation süreci izler. Not: Bizim ellerimizde 10 dk deoxygenation azalır pO2 için nitrit azaltma tarafından RBCs. deoxygenation devam gerekli olan 25 mmHg daha fazla 10 mmHg pO2 azaltmak yaptı; Ancak, bu artan hemoliz ve boş hücre hemoglobin (Şekil 2) artışlara yol açtı.</li>
</ol>3. kırmızı kan hücresi nitrit azaltma
<ol><li>PBS (pH 7,4) 1 mL NaNO2 500 mM hisse senedi çözümü nitrit yapmak 0.0345 g içine ekleyin. 500 mM NaNO2 250 µM NaNO2 (25 x) tarafından seri seyreltme PBS (pH 7,4) oranında seyreltin.</li>
	<li>Bir microsyringe kullanarak, nitrit (40 µL) septum son toplam 1 ml örnek 10 µM konsantrasyonları elde etmek için PRP ve RBCs deoxygenated örneği içine enjekte et. Not: Bu deneyde kullanılan nitrit son konsantrasyonları 10 µM var.</li>
	<li>Örnek 37 ° C'de 10 dakika veya daha uzun kuluçkaya. Not: Farklı tür deneyler için maksimal nitrit azaltılması için gerekli nitrit ile RBC kuluçka tam süresini ayarlayın.</li>
	<li>Tıpa ve pipet 1 mL örnek bir microcentrifuge tüpüne kaldırın.</li>
	<li>Vasıl 200 x g oda sıcaklığında 3 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>300 µL trombosit süspansiyon üst bölümünden süpernatant pipet ve bir 1:9 oranı ACD (pH 6,5) ile karıştırın. RBC Pelet atmak.</li>
	<li>Trombosit süspansiyon vasıl 500 x g için oda sıcaklığında 4 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Buz gibi lizis arabelleği (150 mM NaCl, 50 mM Tris, %0,5 NP-40, pH 7,4) 80 µL eklemek proteaz inhibitörü içeren kokteyl III (1:500) trombosit unsurlardandır.</li>
</ol>4. Batı VASP kurutma
<ol><li>Her örnek protein 2 ayrı % 10 SDS-sayfa jeller için yük 15 µg. Not: B-mercaptoethanol içerir, sert sıyırma arabellek P-VASPSer239 ve VASP antikorları membran kaldıramazsınız; Bu nedenle, P-VASP Ser239 ve VASP ayrı ayrı çalıştırılması gerekir.</li>
	<li>Jelleri 120 V 1,30 h ve transferi nitroselüloz membran için çalıştırın.</li>
	<li>Blok non-spesifik bağlama %5 yağsız Kuru süt ile.</li>
	<li>Gecede 4 ° C'de için P-VASPSer239 (1:500), VASP (1:1, 000) ve GAPDH (1:1, 000) ile membran kuluçkaya</li>
	<li>45 dakika oda sıcaklığında membran ile horseradish peroksidaz (HRP) ikincil antikor kuluçkaya.</li>
	<li>Membran Imager makine ile açığa ve ImageJ kullanarak bant yoğunluğunu ölçmek.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reaction+between+nitrite+and+deoxyhemoglobin.+Reassessment+of+reaction+kinetics+and+stoichiometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).</li>
<li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li>
<li>Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+a+cellular+nitric+oxide%2FcGMP%2Fphosphodiesterase-5+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).</li>
<li>Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+nitrite+on+coagulation+processes+demonstrated+by+thromboelastography%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+oxide%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography.</a> Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).</li>
<li>Wajih, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+red+blood+cell+S-nitrosation+in+nitrite+bioactivation+and+its+modulation+by+leucine+and+glycose%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose.</a> Redox Biology. 8, 415-421 (2016).</li>
<li>Akrawinthawong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometric+analysis+of+the+inhibition+of+platelet+reactivity+due+to+nitrite+reduction+by+deoxygenated+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 9 (3), e92435(2014).</li>
<li>Friebe, A., Koesling, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nitric+oxide-sensitive+guanylyl+cyclase%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase.</a> Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).</li>
<li>Srihirun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+inhibition+by+nitrite+is+dependent+on+erythrocytes+and+deoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation.</a> PLoS One. 7 (1), e30380(2012).</li>
<li>Smolenski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+regulation+of+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+serine+239+phosphorylation+in+vitro+and+in+intact+cells+using+a+phosphospecific+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).</li>
<li>Burkhart, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+comprehensive+and+quantitative+analysis+of+human+platelet+protein+composition+allows+the+comparative+analysis+of+structural+and+functional+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways.</a> Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).</li>
<li>Parakaw, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+inhibition+and+increased+phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+following+sodium+nitrite+inhalation%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+oxide%22%5BJournal%5D)">Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation.</a> Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).</li>
<li>Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+%28P-VASPSer239%29+in+platelets+is+increased+by+nitrite+and+partially+deoxygenated+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 13 (3), e0193747(2018).</li>
<li>Mal Cortese-Krott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+soluble+guanylate+cyclase+in+RBCs%3A+preserved+activity+in+patients+with+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease.</a> Redox Biology. 14, 328-337 (2018).</li>
<li>Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+the+focal+adhesion+protein+VASP+in+vitro+and+in+intact+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letter%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets.</a> FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).</li>
</ol>

Dr. Alan Schechter Ulusal Sağlık Enstitüleri kalp-damar hastalıklarının tedavisi için nitrat tuzları kullanımı için verilen birkaç patent üzerinde ortak bir mucit olarak listelenir. Bu patentler için klinik geliştirme ama diğer tazminat NIH lisans dayalı telif alır.

Trombosit kolayca etkinleştirilir beri trombosit içeren işlenmesi nazik örnekleri gereklidir. Hızlı pipetting ve güçlü sallayarak kaçınılmalıdır. Trombosit inhibitörleri gibi prostacyclin (PGI2) trombosit aktivasyon önlemek için kullanılabilir; Ancak, bu bazı sinyal yolları içinde trombosit etkileyebilir. Trombosit granül kursları, ACD trombosit süspansiyonlar ekleyebilir ve düşük hızlı Santrifüjü kullanabilirsiniz.
Taze hazırlanmış trombositlerin PRP yayılan, en fazla 2 saat sınırl...

Trombosit kan pıhtılaşması için çok önemli megakaryocytes türetilen küçük hücreli disk şeklindeki oluşuyor. Pıhtılaşma cascade vasküler duvar yaralanma sonra yayımlanan çeşitli biyoaktif molekülleri (örneğin, kollajen veya ADP) tarafından başlatılır. Kan pıhtılaşma işlemi, nitrik oksit (NO) tarafından çeşitli effectors arasında değiştirilebilir. Hayır, doğal memeli hücreleri tarafından üretilen, çok yönlü fizyolojik sinyalleri biridir. Bir güçlü vazodilatör, nörotransmitter ve birçok işlevleri bir kaç isim için bağışıklık modülatör olarak davranır. Kan dolaşımında, Hayır da pıhtılaşması kan trombosit toplama engelleyerek ölçüde düzenleyecek yardımcı olur. No kan olasılıkla kaynaklarından biridir nitrit, No bir habercisi hizmet etmek için gösterilen bir inorganik iyon Kırmızı kan hücreleri (RBCs) ile tepki, nitrit Hayır olarak azalır ve deoxyHb methemoglobin (metHb)1' e okside. Hayır RBCs yayımlanan vazoaktif ve vasorelaxation2neden olur. Bu nitrit azaltma yolu bir başka hiçbir üretimi, ile birlikte hareket eden ve klasik üretimi yol hipoksik koşulları, endotelyal nitrik oksit sentaz tarafından tamamlayan yoludur.
Trombosit kendilerini nitrit NO azaltmak mümkün değildir ama onun hazır bulunma için çok hassas. Sağlam trombosit içinde nanomolar içinde Hayır cGMP aralığını artırır (EC50 = 10 nM) ve fosforilasyon VASP (EC50 0,5 = nM)3. Bu nedenle, trombosit mükemmel bir sensör nitrit azaltma RBCs ve hiçbir yayın kana olarak sunabilir. Trombosit aktivasyon - aggregometry ve Tromboelastografi (TEG) gibi ölçüde doğrudan ölçebilirsiniz birkaç yöntem vardır4,5. Ancak, bu yöntem pahalı özel araçları ve malzeme oldukça büyük miktarda gerektirir. Aynı zamanda mümkün olan olayları izlemek aşağı akım, Hayır sonra RBCs, platelet yüzey protein ifadesindeki –6P-selektin gibi değişiklikleri kullanarak üzerinden serbest bırakılır. Hayır da trombosit7cGMP miktarını artırmak için bilinir. Daha önce biz hiçbir yayın içine kan deoxygenated RBC8tarafından nitrit azaltma sonra izlemek için cGMP kullanılır. Bu çok hassas bir yöntem olduğunu kanıtladı; Ancak, cGMP kısa ömürlü bir moleküldür ve geniş iş onun algılama içerir. Başka bir olasılık, sunulan protokolünde açıklanan vazodilatör uyarılmış Fosfo (VASP) fosforilasyon kullanır-Hayır kan içinde var olup olmadığını belirlemek için protein. VASP bir substrat-sGC/cGMP yolu9NO ile etkileşim üzerine fosforile protein kinaz G etkinleştirme var. Algılanabilir VASP fosforilasyon oluşur çok düşük Hayır konsantrasyonları, trombosit kanda herhangi bir varlığı çok hassas bir dedektör yapabiliriz. VASP yüksek trombosit ifade edilir, ancak diğer kan hücreleri seçerek trombosit10içeren olayları takip etmek sağlayan değil.
Bu iletişim kuralının temel amacı ayrıntılı yöntemi tam kan trombosit ile etkileşimi VASP fosforilasyon11,12izleyerek kullanarak hiçbir sürümde tespiti için tarif etmektir. Açıklanan yöntemi düşük erken teşhis yok konsantrasyonları - teorik olarak mevcut iletişim kuralı standart Western blot ulaşılabilir teknikleri çoğu laboratuvar kullanımı nedeniyle cGMP belirlenmesi daha duyarlı kılan nanomolar aralığında sağlar Ayarlar.

<table><tbody><tr><td>Tri-sodyum sitrat</td><td>NIH kan bankası</td><td></td><td></td>tarafından tedarik</tr><tr><td>Sitrik asit</td><td>NIH kan bankası</td><td></td><td></td>tarafından tedarik</tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G7528-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl; sodyum klorür</td><td>Sigma</td><td>S-7653 1kg</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4; sodyum fosfat monobazik, monohidrat</td><td>Mallinckrodt Kimyasal</td><td>7892-04</td><td></td></tr><tr><td>KCl; potasyum klorür</td><td>Mallinckrodt Kimyasal</td><td>6858</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3; sodyum bikarbonat</td><td>Mallinckrodt Kimyasal</td><td>7412-12</td><td></td></tr><tr><td>HEPES; N-[2-Hidroksietil]piperazin-N'-[-etansülfonik asit]</td><td>Sigma</td><td>H3375-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (1 M); magnezyum klorür</td><td>Kalite Biyolojisi</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2; kalsiyum klorür</td><td>Sigma</td><td>C5080-500G</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Dar ağızlı HDPE Ekonomi şişeleri</td><td>Nalgene</td><td>2089-0001</td><td></td></tr><tr><td>Kırmızı septum durdurucu NO.29</td><td>Fisherbrand</td><td>FB57877</td><td></td></tr><tr><td>NaNO2-; sodyum nitrit</td><td>Sigma</td><td>S2252-500G</td><td></td></tr><tr><td>TRIZMA Tabanı; Tris [hidroksimetil] aminometan</td><td>Sigma</td><td>T8524-250G</td><td></td></tr><tr><td>NP-40; 4-Nonilfenil-polietilen glikol</td><td>Sigma</td><td>74385-1L</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyl seti III</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>Fosfo-VASP (Ser239) antikoru</td><td>Hücre sinyalizasyon teknolojisi</td><td>3114</td><td></td></tr><tr><td>VASP antikoru</td><td>Hücre sinyalizasyon teknolojisi</td><td>3112</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Tavşan mAb</td><td>Hücre sinyalizasyon teknolojisi</td><td>2118</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M-6250-10ml</td><td></td></tr><tr><td>Peroksidaz AffiniSaf Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L)</td> <td>Jackson İmmüno Araştırma Laboratuvarları</td><td>111-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrat</td><td>BIO-RAD</td><td>1705060-200ml</td><td></td></tr><tr><td>CO-oksimetre (ABL 90 flex)</td> <td>Radyometre</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nitrik oksit vasp fosforilasyon ölçme tarafından kan trombosit tabanlı algılama

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Trombosit kan bileşenleri uygun kan pıhtılaşması için sorumlu vardır. Onların işlevi son derece çeşitli yolları tarafından düzenlenir. En güçlü vazoaktif ajanlar, nitrik oksit (NO), biri de trombosit toplama güçlü bir inhibitörü olarak hareket edebilir. Doğrudan hiçbir algılama kan yok half-life milisaniyelik aralığı için sınırlar boş hücre hemoglobin ile onun yüksek reaktivite nedeniyle çok zor olduğunu. Şu anda, müdahaleler sadece tahmin edilir sonra herhangi bir değişiklik, nitrit ve nitrat (nitrat-nitrit-Hayır metabolik yolu üyeleri) ölçülen değişiklikleri dayalı. Ancak kesin, bu ölçümler vis bir vis gerçek doğal olarak yüksek temel nitrit nedeniyle herhangi bir değişiklik yorumlamak ve büyüklükte birkaç emir hiçbir kendisinin beklenen değişiklikler yüksek düzeylere nitrat oldukça zordur. Bu nedenle, bir Hayır doğrudan algılamak olanak sağlayacak doğrudan ve basit yöntem geliştirme gecikmiş olduğunu. Bu iletişim kuralı hiçbir sensör kan trombosit olarak son derece hassas bir potansiyel kullanımı giderir. HİÇBİR jeneratörler ilk trombosit zengin plazma (PRP) ve yıkanmış trombosit preparatları ve nitrit ve deoxygenated kırmızı kan hücreleri kullanımını açıklar. VASP fosforilasyon, serin 239 (P-VASPSer239) No var olup olmadığını belirlemek için kullanılır VASP protein yüksek trombosit ifade edilir ve bu hızla oluşturulduğunda fosforile da mevcuttur aslında doğrudan kan içinde yok olup olmadığını belirlemek için bu yolu kullanmak için eşsiz bir fırsat yol açar.

PO2 değerleri arasında 50-80 mmHg venöz kan örnekleri var. Deoxygenation helyum tarafından hızla pO2 10 en az artan deoxygenation zaman biraz daha fazla düşüşler pO2içinde 25 mmHg olarak azalır. Ancak, deoxygenation artan zaman da boş hücre hemoglobin (görsel olarak plazma giderek kırmızı rengi Şekil 2 ' de görülen ortak oksimetre tarafından belirlenen) önemli ölçüde yüksek düzeyde yol açar (Şekil ...

Burada, trombosit potansiyelini kullanmak son derece hassas nitrik oksit sensör kan olarak adrese bir iletişim kuralı mevcut. Nitrik oksit jeneratörler ilk trombosit hazırlık ve nitrit ve deoxygenated kırmızı kan hücreleri kullanımını açıklar.

Nitrik oksit VASP fosforilasyon ölçme tarafından kan trombosit tabanlı algılama

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

Bu protokol trombositlerin hem in vitro hem de in vivo kan içinde son derece hassas nitrik oksit sensörü olarak potansiyel kullanımını ele alır. Artmış Fosforiile Vazodilatör-Uyarılmış Fosfoprotein veya P-VASP serine 239 trombositnnitrik oksit bazı avantajları vardır, nanomolar soylarda nitrik oksit varlığını tespit etmek de dahil olmak üzere. Sağlıklı bir donörden 30 ila 50 mililitre tam kan toplandıktan sonra iki saat içinde, santrifüj için uygun sayıda 15 mililitre konik tüplere beş mililitre kan ekleyin.Supernatants üst kısmından trombosit açısından zengin plazmayı dikkatlice toplamak için plastik bir transfer pipetkullanın. Pelet ikinci bir santrifüj ile plazma açısından zengin trombositler ve yavaşça CGS tampon beş mililitre pelet yıkayın. Oda sıcaklığında 10 dakika 400 g santrifüj.Santrifüj sonunda, modifiye Tyrode tampon üç mililitre pelet resuspend. Saymak için bir hemositometre kullanın ve trombosit süspansiyonlarının yoğunluğunu taze Tirrode tamponunda mililitre başına sekizinci hücrelere kadar üç kez 10'a ayarlayın. Sonra trombosit süspansiyonlarını 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın.Bu arada, santrifüj ile tüm kan örneklerinin plakasız plazma katmanlarından kırmızı kan hücrelerini toplamak yıkama başına PBS beş mililitre dört yıkar izledi. Son yıkamadan sonra, supernatants atın ve kauçuk durdurucular ile kapalı polipropilen şişelerde uygun deneysel hematokrit plazma açısından zengin trombosit bir mililitre ile kırmızı kan hücreleri karıştırın. Her septa içine bir helyum gaz tankına bağlı bir iğne yerleştirin ve gaz çıkışları yapmak için 26 gauge iğne takın.Sonra yavaş yavaş oda sıcaklığında şişe girdap ve deoksijenasyon sürecinin izlenmesi için kısmi oksijen basıncı ölçmek için bir oksimetre kullanın. Oksijen azalma hızı helyum akış hızı ve karıştırma hızına bağlıdır. Bu nedenle, bu son derece deneysel kurulum geometrisi bağlıdır gibi bir deney başlamadan önce oksijenasyon zamanı optimize edilmelidir.Kırmızı kan hücresi nitrit azaltma için, 10 mikromolar son konsantrasyon elde böylece PRP ve RBC deoxygenated örnekleri içine septum yoluyla nitrit enjekte etmek için bir mikroşiniş kullanın. Numuneleri en az 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve her numunenin bir mililitresini santrifüj için mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Yeni mikrosantrifüj tüpler içine supernatants üst kısmından trombosit süspansiyon 300 mikrolitre aktarın ve bir ila dokuz oranında her tüp asit sitrat dekstroz ekleyin.Trombositleri tekrar santrifüj edin ve her tüpe üç proteaz inhibitörü kokteyli içeren 80 mikrolitre buz soğuk lisis tamponunda peletleri yeniden askıya alın. Daha sonra, her örnekten 15 mikrogram proteini iki ayrı %10 SDS-PAGE jellerine yükleyin. 1.3 saat boyunca 120 volt jelleri çalıştırın.Çalışma sonunda, jelleri tek tek azot selüloz membranlarına aktarın ve %5 yağsız kuru süt hacmiile spesifik olmayan herhangi bir bağlamayı engelleyin. Membranları bir gecede uygun primer antikorlarla dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve ardından oda sıcaklığında 45 dakika boyunca uygun bir sekonder at turp peroksidaz antikorile etiketleyin. Daha sonra uygun bir görüntü analiz programı ile bant yoğunluğunu ölçmek için bir görüntüleyici ile membranlar maruz.Sağlıklı venöz kan örneklerinin kısmi oksijen basınç değerleri 50 ila 80 milimetre arasında cıvaya sahiptir. Helyum ile deoxgenation hızla 10 dakika içinde cıva 25 milimetre oksijen kısmi basıncı azalır. Kısmi oksijen basıncının daha da azalması, daha fazla oksijensizleşme süresi ile sağlanabilir.Artan deoksijenasyon giderek kırmızı renk plazma ile belirtildiği gibi hemolizi düzeylerinde artışa yol açar. Bu deoksijenasyon un bir etkisidir ve helyumsuz karıştırılan örneklerde hemol eksikliğinden kaynaklandığı gibi kendini karıştırmaktan kaynaklanmaz. Trombositlerdeki vazodilatör uyarılmış fosfoprotein veya VASP ve Fosforilasyonlu-VASP ekspresyonu düzeyleri, batı lekesi ile saptanır.Kısa ömürlü nitrik oksit donör ile tedavi, tedaviden sonraki 10 saniye içinde trombositlerde fosforilasyonlu vazodilatör uyarılmış fosfoprotein ekspresyonunu arttırır. Ayrıca, Fosforitane-VASP veya P-VASP düzeyleri, NO donörün trombosit açısından zengin plazma ile inkübasyonundan 10 dakika sonrasına kadar sabit kaldı ve bu da RbC'lerin mevcut P-VASP düzeylerini etkilemeden trombositlerden ayırmak için yeterli zaman olduğunu gösterdi. Nitrit ayrıca deoksijenadan arındırılmış RBC varlığında trombositP-VASP düzeylerini artırır.Burada P-VASP'nin total VASP'ye oranı hematokrit seviyesine bağlıdır. VASP trombositile yüksek oranda ifade edilir ve nitrik oksit varlığında hızla fosforilasyona neden olur. Bu nedenle, bu protokol çeşitli fizyolojik uyaranlar tarafından nitrik oksit indüksiyon uyşuiçin bir yöntem sağlar.Bu yöntemle trombositte artmış P-VASP'yi inhale nitrit in vivo ile nitrik oksit stimülasyonunun bir belirteci olarak başarıyla kullandık. Biyolojik bir numune ile trombosit ile çalışmanın her zaman uygun kişisel koruma ekipmanı kullanılarak yapılması gerektiğini unutmayın.

platelet-based-detection-nitric-oxide-blood-measuring-vasp

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Endo-PAT 2000 kullanıyorsanız endotel fonksiyonunu değerlendirmek için bir non-invaziv prosedür gösterilmiştir.

Endo-PAT 2000 ile Endotel Vazodilatör Fonksiyon değerlendirilmesi

Nitrik oksit (NO) endojen üretimi biyolojik fonksiyonları çok çeşitli düzenler. Bu NO dayalı sinyal bozulması veya düzensizliği birçok insan hastalıkları dahil olduğu giderek daha açık hale gelmektedir. Yöntem NO metabolitleri insan hastalığı için yeni tanısal veya prognostik biyolojik sağlayabilir ilgili ölçmek için.

Nitrik Oksit Biyoaktivite içlin Analitik Teknikler

Vasküler hücre fonksiyonu, hücre içi habercilerin aktivitesine bağlıdır.  Burada tarif edilen, izole bir aortun bireysel endotel ve düz kas hücrelerinde fizyolojik ve farmakolojik uyaranlara yanıt olarak hücre içi kalsiyum ve nitrik oksit seviyelerinin ölçülmesine izin veren bir ex vivo iki foton görüntüleme yöntemidir.

Hücre içi Ca İki foton Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Bir İzole Sıçan Aort Kullanım ve Endotel Nitrik Oksit Üretimi ve düz kas hücreleri

Bu yazıda floresan boya tr yüz eşzamanlı algılama ve hücre içi nitrik oksit görselleştirme (NO) ve süperoksit anyon (O 2 diaminofluorescein-2 diasetat (DAF-2DA) ve dihydroethidium (DHE) kullanarak adapte nispeten kolay bir yöntem tarif .- ) sırasıyla, taze bir obezite fare modelinin sağlam aorta izole edilmiştir.

Bozulmamış Arterlerin endotel katmanı Nitrik Oksit ve Süperoksit En Yüz Algılama

Burada, nitrik oksit ve biyolojik olarak ilgili türevlerini, yüksek hassasiyete sahip kemilüminesans bazlı testler kullanarak tespit etmek için protokoller sunuyoruz.

Nitrik Oksit ve Türevlerinin Otoksidasyon ve Nitroslu Bileşiklerden Tespiti için Kemilüminesans Bazlı Testler

Enükleasyonlu kırmızı kan hücrelerinin protein aktivasyonundaki dinamik değişiklikleri yakalamak, daha sonra değerlendirilmek üzere akut uyaranlardaki dinamik değişikliklerin korunması gibi metodolojik zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Sunulan protokol, ilgili protein değişikliklerinin korunmasını ve analizini ve müteakip tespitini sağlayan numune hazırlama ve boyama tekniklerini açıklar.

Kırmızı Kan Hücresi Proteinlerinde Dinamik Değişikliklerin İmmün Boyama Tabanlı Tespiti

İnsan safen ven endotel hücrelerini (hSVEC'ler) izole etmek ve kültürlemek için bir protokol tanımladık. Ayrıca, hSVEC'lerde mekanik gerilimi incelemek için kesme gerilmesi ve gerilme üretmek için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz.

İnsan safen ven endotel hücre izolasyonu ve kontrollü kayma stresi ve gerilme seviyelerine maruz kalma

Süperoksit anyonunun oluşumu, trombositlerin uyarılması için gereklidir ve düzensiz ise trombotik hastalıklar için kritik öneme sahiptir. Burada, süperoksit anyonlarının seçici tespiti ve redoksa bağımlı trombosit regülasyonunun incelenmesi için üç protokol sunuyoruz.

Trombositlerde Süperoksit Anyon Oluşumunun Tespiti için Alternatif Yöntemler 

Ayarlanabilir yoğunluğa sahip RGD ile işlevselleştirilmiş avidin-biyotin bağları kullanılarak tek göç eden trombositlerin görüntülenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlanır ve trombositlerin avidin-biyotin bağını koparmak için yeterli kuvvet ürettiğini ortaya çıkarır.

RGD İşlevselleştirilmiş Avidin-Biotin Bağları Kullanarak Trombosit Migrasyonunu İncelemek İçin Bir İn Vitro Test

Prokoagülan trombosit oluşumu, artmış tromboz riski ile ilişkilendirilmiştir. Burada, prokoagülan trombositlerin ayırt edici özellikleri olan fosfatidilserin ve mikrovezikül salınımının maruziyetini ölçmeyi amaçlayan, yıkanmış trombositleri insan kanından izole etmek için kesin bir protokol sunulmaktadır.

İnsan Saflaştırılmış Trombositlerinden Fosfatidilserin Maruziyeti ve Mikrovezikül Salınımının Ölçülmesiyle Prokoagülan Trombosit Karakterizasyonu

Bu protokol, trombin ve plazmin üretiminin eşzamanlı ve zaman çözümlü ölçümünü mümkün kılan Nijmegen Hemostaz Testini tanımlar; böylece pıhtılaşma ve fibrinolizin entegre bir değerlendirmesi sağlanır. Test, geleneksel hemostatik testlerin kapsamının ötesinde araştırma ve klinik ortamlarda hemostatik dengenin karakterizasyonunu iyileştirmeyi amaçlamaktadır.

Nijmegen Hemostaz Testi: Tek bir Kuyiyada Trombin ve Plazmin Üretiminin Eşzamanlı Florojenik Ölçümü

Öğrenin kan trombositlerini kullanarak nitrik oksit algılama yöntemini. P-VASP fosforilasyon ölçümü ile nanomolar duyarlılıkta in vitro ve in vivo nitrik oksit tespiti yapabilirsiniz.

Nitrik oksit VASP fosforilasyon ölçme tarafından kan trombosit tabanlı algılama

Daha fazla video keşfet