Name: Protein Halifeliğin bağırsak iltihabı bir iltihabi bağırsak hastalığı fare modeli üzerinde sinyal tat etkileri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-09T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Keşfedin DSS ile indüklenen IBD fare modelinde protein halifeliğinin sinyal yolakları üzerindeki etkilerini. Bu yöntem, genetik faktörlerin bağırsak iltihabı üzerindeki rolünü anlamak için araştırmacılara yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser hibe Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (81671016, 31471008 ve 31661143030) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (DC010012, DC015819) ve Siyuan Vakfı tarafından desteklenmektedir.

Fareler içeren tüm deneylerin incelenmeli ve kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komiteler Zhejiang Üniversitesi tarafından onaylanmalıdır. Bu iletişim kuralı kullanmadan önce uygun kişisel koruyucu ekipman giymek için tavsiye edilir.
1. fareler ve DSS hazırlık
<ol><li>Nakavt (α-gustducin- / -) fareler ve yaş-, cinsiyet ve vücut ağırlığı eşlemeli vahşi tipi kontrol tutmak (α-gustducin+ / +) C57BL/6 fareler temiz kafeslerde tek tek. Not: Nakavt fareler ile C57BL/6 fareler üzerinde 20 nesiller için backcrossed ve neredeyse % 100 C57BL/6 genetik deneyimliyim.</li>
	<li>30 g dextran sülfat sodyum (DSS) tozu 1 L autoclaved su içinde çözülür. Çözüm son çalışma konsantrasyonu % 3 (w/v) olduğundan emin olmak için açık hale gelinceye kadar karıştırın. Not: DSS çözüm için 1 hafta kadar oda sıcaklığında veya 4 ° c kadar kullanmak depolanabilir.</li>
</ol>2. indüksiyon ve DSS kolit farelerde değerlendirilmesi
<ol><li>Tartmak ve her fare ilk vücut ağırlığı kaydetmek. Fareyi tek tek standart plastik kafes yerleştirin ve kafesleri etiket.</li>
	<li>Normal içme suyu için 7 gün için her iki grupta fareler var toplamda % 3 DSS çözüm ile Değiştir ad libitumerişin.</li>
	<li>Fare vücut ağırlığı ölçmek, DSS çözüm tüketimi, kayıt ve toplamak ve günlük DSS yönetimi sırasında her fare dışkı inceleyin. Önem düzeyi ishal ve rektal kanama gözlemlemek ve bu DSS kaynaklı hastalık Dizin12' ye dönüştürmek.</li>
	<li>Deneme sırasında ilk ağırlık ve hastalık dizin göre kilo kaybı yüzdesi kolit belirtileri değerlendirmek için hesaplanır. Not: Hastalık Dizin ishal ve rektal kanama gözlemleri birleştirerek attı ve aşağıdaki gibi tanımlanır: 0 (normal dışkı, kan yok), 1 (yumuşak dışkı, kan yok), 2 (yumuşak dışkı, kan), 3 (çok yumuşak dışkı, mütevazı kanama) ve 4 (sulu dışkı, önemli kanama)12. Hastalık Dizin her gün her fare için analiz edilir.</li>
	<li>7 günlük DSS tedavi sonunda, fareler tarafından servikal çıkığı kurban ve kalan deneyler ile devam edin.</li>
</ol>3. doku örneği hazırlanması
<ol><li>Sırtüstü pozisyonda fareyi getirin ve karın % 70 etanol ile cilt temiz. 3 cm uzunluğundaki ensizyon karın karın boşluğu ortaya çıkarmak için küçük makas ile dikmek.</li>
	<li>Forseps çifti dikkatle dalak diğer dokulardan ayırın sonra dalak kaldırmak ve boyutunu ölçmek için kullanın.</li>
	<li>Tanımlamak ve iki nokta üst üste forseps ile Asansör ve çevresindeki bıçaklanmasından ayırmak. Çekum ve rektum görünür hale gelene kadar tüm kolon çekin.</li>
	<li>İki nokta üst üste colonocecal kenar boşluğuna ve derin proksimal ve distal kolon, sırasıyla boşaltmak için leğen kemiği transecting izole et. O zaman, ölçmek ve izole kolon uzunluğu kaydedin. Kolon doku parçalanmış işlem sırasında zarar vermemeye dikkat et.</li>
	<li>İki nokta üst üste ile buz gibi fosfat tamponlu tuz (PBS) 10 mL kan ve dışkı eluate tamamen temizlenene kadar kaldırmak için bir sonda ile besleme iğne ile donatılmış bir 10 mL şırınga ile yıkayın.</li>
	<li>Histolojik kimlik için doku örnekleri eşit üç parçaya bölün:, orta, proksimal ve distal. Sonra dokuya %4 paraformaldehyde (PFA) ile gecede 4 ° C'de düzeltmek</li>
	<li>Sitokin ifade analizi için sıvı azot ile hızla tüm kolon dondurma ve-80 ° C'de kadar kullanmak saklayın.</li>
</ol>4. histolojik DSS kaynaklı kolit şiddeti değerlendirilmesi
<ol><li>Hematoksilen ve eozin (H & E) boyama<ol>
<li>Fiksasyon sonra % 30 sükroz 1 x PBS geceleme 15 mL tüp içinde bir çözümde doku örnekleri için cryoprotect daldırın.</li>
		<li>Doku en uygun kesme sıcaklığında (OCT) bileşik katıştırmak ve OKT sertleşir kadar-20 ° C'de yerleştirin.</li>
		<li>Bir cryostat için doku içeren OCT blok transfer, cryostat 12 µm ve dilim kalınlığı arama ayarlayın ve 12 µm kalınlığında donmuş bölümlerde toplamak.</li>
		<li>65 ° c cryostat 20 dk sıcak tabakta için toplanan doku bölümlerden ısı.</li>
		<li>Distile su kısaca bölümlerde yıkayın. Onlara çözüm 5 min için boyama hematoksilen ile leke ve daha sonra 5 min için dokunun su ile durulama.</li>
		<li>% 0.5 hidroklorik asit-etanol 30 s ve onları kaçmanın musluk suyu 1 dk. için durulama için bölümlerle ayırt etmek. Daha sonra 1 x PBS 1 dk. için yıkama gerçekleştirmek ve daha sonra 5 min için dokunun su ile durulama.</li>
		<li>Çamaşır doku bölümlerin % 70, % 75, % 80 ve % 95 alkol, her 2 min için çözüm boyama eozin 10 s. Counterstain için gerçekleştirin.</li>
		<li>Dehidratasyon % 95 alkol ve mutlak alkol 2 değişiklik her zaman 5 min için gerçekleştirin. Ksilen 5 min için 2 değişiklik içinde açık.</li>
		<li>Doku hasarı her fare, orta, proksimal ve distal kolonun gen nakavt ve H & E yukarıdaki boyama sonuçlarına göre yaban-tipi grupları için puan. Not: Hastalık dizinidir epitel hasar ve aşağıdaki gibi tanımlanır inflamasyon mukoza, submukoza, muscularis ve serosa bölgelerde kombine bir puan: 0 (doku hasarı ve iltihabı), 1 (odak doku hasarı ve iltihabı), 2 (düzensiz doku hasarı ve iltihabı) ve 3 (diffüz doku hasarı ve iltihabı)12,13. İki nokta üst üste, orta, proksimal ve distal bölümleri için fare başına üç puanları sonra her hayvan için bir toplam puan elde etmek için toplanır. Her grup için ortalama puanları sonra hesaplanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İmmünhistokimya14<ol>
<li>65 ° c cryostat 20 dk sıcak tabakta için toplanan doku bölümlerden ısı. Bölümleri 1 x PBS 3 kez, 10 dakika yıkayın. %3 hidrojen peroksit endojen peroksidaz ortadan kaldırmak 10 min için doku bölümlerde kuluçkaya. Bölüm 3 kez daha yıkayın. Dokular, oda sıcaklığında 1 h için arabellek (% 3 BSA, %0,3 non-iyonik deterjan, % 2 keçi serum, % 0,1 Sodyum azid 1 x PBS) veya daha fazla engelleme ile engelleyin.</li>
		<li>Engelleme arabellek aşağıdaki bağışıklık hücre türüne özgü birincil antikorlar içeren bir çözüm ile değiştirmek: CD45 lökosit için CD3 T hücreler için B hücreleri için B220, CD11b için makrofajlar ve nötrofiller için Ly6G. 4 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
		<li>Birincil antikorlar tarafından aspirasyon doku bölümleri kaldırın. 1 x PBS 3 kez, 10 min için bölümlerle yıkayın. Kuluçka streptavidin-HRP kompleksi, oda sıcaklığında ve ardından biotinylated ikincil antikor ile bölümleri kuluçkaya.</li>
		<li>Bir açık ya da koyu kahverengi renk geliştirmek ve immunoreactive hücreleri görselleştirmek için 3, 3'-diaminobenziding (DAB) çözüm bölümlerle kuluçkaya.</li>
		<li>Bölümleri Hematoksilen ve % 0,3 (v/v) sulandırılmış amonyak counterstain. Alan parlak görüntüleri 10 X büyütme mikroskop altında atın.</li>
		<li>Tarafından tanımlamak ve işaretli bağışıklık hücreleri epitel ve lamina propria (epitel altında) nüfusu ölçmek için bir görüntü işleme programı kullanın 2 maskeleri ayarlama: ilk maske renk algılama ayarlamak için renk-küp temel alan özellik kullanın eşik ve renkli DAB-reaktif alanları; kırılan ikinci maske epitel ve laminer propria muayene bölümünde toplam alanları belirlemek için kullanın. Muayene doku Ümumi sahəsi infiltre hücrelere boyama alanında bir oranı olarak immunoreactive hücre nüfusu hızlı.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. gen ifade değerlendirme DSS kaynaklı kolit
<ol><li>DSS-tedavi gen nakavt ve-80 ° C dondurucu dan farelerde vahşi-tip kolon doku almak ve doku için 25 mg lizis arabelleği 0.6 mL ekleyin, sonra bir homogenizer homojenize.</li>
	<li>Toplam RNA ve herhangi bir bulaşıcı genomik DNA ortadan kaldırmak için kullanılır DNaz ayıklamak için RNA ayıklama Kit'in Protokolü izleyin.</li>
	<li>Ayıklanan RNA kalitesini kontrol etmek için bir özel jel çalıştırın. Kendi 28S RNA bandı 18S grup parlak ise, kullanışlı olur. Bir microspectrophotometer üzerinde RNA konsantrasyonu belirlemek için RNA örnek 1 µL al.</li>
	<li>20 mM oligo (dT)12,13,14,15,16,17,18 astar 2.5 µL ve 1 µL Moloney fare lösemi ile toplam RNA'ın Mix 1 µg virüs (MMLV) transkriptaz. CDNA hazırlamak 60 dk 42 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>CDNA 1µL ileriye ve geriye doğru qPCR astar 0.5 µL ile IFN γ, Il TNF için karıştırma tarafından gerçek zamanlı PCR reaksiyonları ayarla-5, IL-13, IL-10, TGF-β1 ve β-aktin ek olarak 2 x floresan yeşil boya kontrol olarak.</li>
	<li>QPCR aşağıdaki parametrelerle çalıştırın: 45 95 ° C devredir 10 95 ° C 10 dk, ardından s, 50 ° C 25 s ve 72 ° C 20 s.</li>
	<li>Gen ifadesinin göreli miktar 2-ΔΔCt yöntemi15kullanarak hesaplar. Nispeten nakavt vsgen ifade seviyelerinde analiz. o farelerde tip vahşi.</li>
</ol>

<ol><li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Bowel Disease.</a> Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).</li>
<li>Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24510619">Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).</li>
<li>Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Commensal+Microbiota+and+Enteropathogens+in+the+Pathogenesis+of+Inflammatory+Bowel+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases.</a> Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).</li>
<li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptors+and+cells+for+mammalian+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The receptors and cells for mammalian taste.</a> Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).</li>
<li>Gilbertson, T. A., Khan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+mechanisms+of+oro-gustatory+detection+of+dietary+fat%3A+Advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges.</a> Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%CE%B313+colocalizes+with+gustducin+in+taste+receptor+cells+and+mediates+IP3+responses+to+bitter+denatonium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gγ13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium.</a> Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).</li>
<li>Perez, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).</li>
<li>Shigemura, N., Ninomiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+Molecular+Mechanisms+of+Taste+Signaling+and+Modifying%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).</li>
<li>Bezençon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+intestinal+cells+expressing+Trpm5+are+mostly+brush+cells+and+express+markers+of+neuronal+and+inflammatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells.</a> Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).</li>
<li>Lu, P., Zhang, C. -H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraoral+bitter+taste+receptors+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extraoral bitter taste receptors in health and disease.</a> The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).</li>
<li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28569761">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).</li>
<li>Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24510619">Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (25), Unit 15 (2014).</li>
<li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggravated+gut+inflammation+in+mice+lacking+the+taste+signaling+protein+%CE%B1-gustducin%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein α-gustducin.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).</li>
<li>Feng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cells+of+the+human+peripheral+taste+system%3A+Dominant+dendritic+cells+and+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Intestinal+Inflammation+in+DSS-induced+Model+of+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), 3678(2012).</li>
<li>Axelsson, L. -G., Landström, E., Goldschmidt, T. J., Grönberg, A., Bylund-Fellenius, A. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dextran+sulfate+sodium+%28DSS%29+induced+experimental+colitis+in+immunodeficient+mice%3A+Effects+in+CD4%2B-cell+depleted%2C+athymic+and+NK-cell+depleted+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice.</a> Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).</li>
<li>Egger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+Acute+Murine+Dextran+Sodium+Sulphate+Colitis%3A+Cytokine+Profile+and+Dose+Dependency%5BTitle%5D)+AND+%22Digestion%22%5BJournal%5D)">Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency.</a> Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).</li>
<li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Colitis+Modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+%28DSS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> Journal of Visualized Experiments. (35), 1652(2010).</li>
<li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuft+cells%2C+taste-chemosensory+cells%2C+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), New York, N.Y. 1329-1333 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Bu yöntem quantitively için istihdam edilecek özel tat gen mutasyonlar etkisi iltihap DSS kaynaklı IBD fare modeli belirlemek. Tam olarak yararlanmak için en iyi indüksiyon IBD önemli bir adımdır. Kolit gelişimi fare zorlanma, konut çevre, barsak mikroflorası yanı sıra ilgi genler de dahil olmak üzere çeşitli faktörler tarafından etkilenir. Bu fareler farklı dozlarda test etmek için az sayıda ve süreleri DSS yönetim ile bir pilot deneme gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Sırasında pilot deney, kilo kaybı, ishal, bağırs...

İltihabi bağırsak hastalığı (IBD), Crohn hastalığı (CD) ve ülseratif kolit (UC) iki ana türde koşullarından kronik remittent ya da ilerici inflamatuar bağırsak multifaktöriyel etyoloji1,2 ile karakterizedir . IBD gelişimi diyet, antibiyotik kullanımı, genetik gibi belirli çevresel faktörlere bağlıdır ve önemlisi, patojenik enfeksiyonlar. Ancak, etyoloji ve IBD temel yasal moleküler mekanizmaları hala pek açık değildir. Bu nedenle, çok sayıda kimyasal olarak indüklenen IBD hayvan modelleri inşa edilmiş ve patogenez ve düzenleyici mekanizmaları betimlemek ve insan tedavi3etkinliğini değerlendirmek için uygulanan.
Tat reseptörleri G protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) vardır ve iki önemli türü sınıflandırılır: tip ı (T1Rs) ve tatlı, umami ve acı bileşikleri algılayan II (T2Rs) yazın. Tat sinyal cascades tastant T1Rs veya T2Rs, heterotrimeric aktive α-gustducin ve Gβγ dimer oluşan ve Gβγ alt birimleri serbest bırakmak için önde gelen G protein bağlama tarafından başlatılır. Gβγ yan sırayla aşağı akım efektör enzim Fosfolifaz C-B2 (PLC-B2) uyarır. Aktif PLC-B2 sonra iki hücre içi ikincil haberci [inositol-1,4,5-trisphosphate (IP3) ve diacylglycerol] ve IP3 bağlanır içine phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate dag ve kanal-reseptör IP3 açmak R3, endoplazmik retikulum gelen kalsiyum iyonları serbest. Bu sonunda geçici reseptör potansiyel iyon kanal Trpm5 açılması ve serbest bırakmak-in nörotransmitter ATP tat sinirler4,5,6,7üzerine yol açar. Ancak, farklı ve bağımsız sinyal yollar tuzlu ve ekşi tadı tatlı, umami ve acı tadı8vardır. Buna ek olarak, tat GPCRs bileşenleri ve aşağı akım proteinler çeşitli ekstra oral dokularda mevcut. Son yıllarda yapılan çalışmalarda bu α-gustducin belirtilen, tat sinyal, asıl bileşen bulunan bağırsak mukoza ifade edilecek. Daha fazla çalışmaları ekstra oral doku9,10bileşenlerinde sinyal bu tadı işlevlerini anlamak için ihtiyaç vardır.
Burada açıklanan yöntemi tat sinyal proteinlerin ekstra oral dokularda işlevleri tanımlamak için kullanılır. Biz kimyasal olarak bağlı kolit modeli ile damak tadınızı sinyal Cascade'lerde operasyona için geliştirilen bir transgenik fare çizgi birleştirmek. Yordam sadeliği ve insan ülseratif kolit patolojik benzerlikler nedeniyle büyük ölçüde, dextran (DSS) sodyum sülfat-indüklenen IBD modeli en yaygın olarak kullanılan çeşitli kimyasal olarak bağlı kolit modelleri11arasında. Bu çalışmada, α-gustducin-eksik fareler bir temsilcisi fare çizgi olarak α-gustducin roman fonksiyonları gut mukozal bağışıklık ve iltihap 1) morfolojik değişiklikler doku analiz ve 2) raporlaması ifade farklılıkları ortaya çıkarmak için kullandığımız sitokinler kolon iltihabı ile ilgili. Bu yöntem genler için genetik olarak değiştirilmiş fare hatları ne zaman nicelik ve nitelik tat sinyal proteinleri (ve diğer proteinlerin gut) doku hasarı ve bağırsak iltihabı, belirlemek için kullanılabilir faiz mevcuttur. Bu yöntemin avantajları, olanaklı kılmak kullanıcı-eylemleri hem kimyasal DSS ve gen ilgi eksikliği kaynaklanan entegre verileri elde etmek. Bu yöntem, hassasiyeti artırmak ve ince bağırsak değişiklikler, hücresel ve moleküler düzeyde ortaya çıkarmak için daha fazla geliştirilebilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü >Antikor< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>550539</td><td></td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>555273</td><td></td></tr><tr><td>B220</td><td>BD Biosciences</td><td>550286</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>BD Biosciences</td><td>550282</td><td></td></tr><tr><td>Ly6G</td><td>BD Biosciences</td><td>551459</td><td></td></tr><tr><td>< güçlü > Reaktif< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Dekstran Sülfat Sodyum Tuzu (DSS)</td> <td>MP Biyomedikal</td><td>2160110</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-HRP kompleksi</td><td>BD Pharmingen</td><td>551011</td><td></td></tr><tr><td>H & E Boyama Kiti</td><td>BBI Yaşam Bilimleri</td><td>E607318</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)</td><td>Sangon Biotech</td><td>B548117</td><td></td></tr><tr><td>FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)</td><td>Roche</td><td>4913850001</td><td></td></tr><tr><td>MMLV Ters Transkriptaz, GPR</td><td>Clontech,TaKaRa</td><td>639574</td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa MiniBEST Evrensel RNA Ekstraksiyon Kiti&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>9767</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 mL Şırınga</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Aletler ve ekipmanlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>denge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>makası&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>forseps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>santrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>qPCR makinesi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>boyama kavanozları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imag-Pro Plus&nbsp;</td><td>Medya Sibernetik A.Ş. &nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protein halifeliğin bağırsak iltihabı bir iltihabi bağırsak hastalığı fare modeli üzerinde sinyal tat etkileri

Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model

İltihabi bağırsak hastalığı (IBD) ülseratif kolit ve Crohn hastalığı, dünyanın her yerinden insanlar milyonlarca yaşam kalitesini etkileyen dahil bağışıklık ile ilgili gastrointestinal bozukluklar biridir. IBD belirtileri karın ağrısı, ishal ve rektal kanama, hangi gut microbiota, gıda bileşenleri, Bağırsak epitel hücreleri ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimler neden olabilir içerir. Bağırsak epitel ve bağışıklık hücreleri ifade her anahtar gen kolon iltihabı nasıl etkileyeceğini değerlendirmek için önem taşımaktadır. G protein birleştiğinde tat reseptörleri G protein alt birimi α-gustducin ve sinyal diğer proteinler de dahil olmak üzere, bağırsaklarında bulduk. Burada, bir temsilcisi olarak α-gustducin kullanırız ve dextran sülfat sodyum (DSS) tarif-tat gen mutasyonlarının gut mukozal bağışıklık ve iltihap üzerindeki etkisini değerlendirmek için IBD modeli indüklenen. Bu yöntem gen nakavt teknoloji kimyasal olarak indüklenen IBD modeli ile birleştirir ve böylece yanı sıra exuberate ya da kolon DSS kaynaklı bağışıklık yanıtı nemlendirin diğer genler tat gen düşmesi sonucu değerlendirmek için uygulanabilir. Mutasyona uğramış fareler DSS ile hangi sırasında kendi vücut ağırlığı, dışkı ve rektal kanama izlenen kaydedildi ve belirli bir süre için uygulanmaktadır. Yönetimi sırasında farklı timepoints are euthanized bazı fareler, daha sonra boyutları ve ağırlıkları dalağı ve iki nokta üst üste ölçülür ve gut doku toplanan ve için işlenen histolojik ve gen ifade analizleri. Verileri bu aşırı kilo kaybı, ishal, bağırsak kanaması, doku hasarı ve iltihap vs. wild-tipi fareler α-gustducin nakavt sonuçları göster. İndüklenen enflamasyonu şiddeti fare suşları, konut çevre ve diyet tarafından etkilenir, DSS konsantrasyon ve yönetim süresi bir pilot deneyinde duruma getirilmesi özellikle önemlidir. Bu faktörler ayarlayarak, bu yöntem her iki anti - ve pro-inflamatuar etkileri değerlendirmek için uygulanabilir.

DSS kaynaklı IBD yordamı % 3 yöneten tarafından kurulmuştur DSS α-gustducin-nakavt (KO) ve vahşi-tipi (WT) fareler için içme suyu. WT fareler için karşılaştırıldığında, nakavt fareler daha şiddetli kolit aşırı kilo kaybı, ishal ve bağırsak (Şekil 1) kanama ile sergiledi. 7 gün DSS yönetim sonra doku bütünlüğü farklılıkları H &amp; E histolojik yöntemi olarak boyama kullanarak analiz edildi ve daha ağırlaştırılmış doku hasarı nakavt fareler WT farelerde (<stro...

Burada dextran sülfat sodyum (DSS) bağışıklık yanıtı düşmesi tadına bakma ilgili genlerin etkisini araştırmak için bir protokol mevcut-inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) fare modeli indüklenen.

Protein Halifeliğin bağırsak iltihabı bir iltihabi bağırsak hastalığı fare modeli üzerinde sinyal tat etkileri

Inflammatory bowel disease (IBD) is one of the immune-related gastrointestinal disorders, including ulcerative colitis and Crohn's disease, that affects ...

Bu yöntem ülseratif kolit ve Crohn hastalığı hakkında inflamatuar biyohastalık alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, sinyal proteinlerinin ilk anti ve proinfamtory etkilerini değerlendirmek için kullanılabilmesidir. Bu tekniğin etkisi yeni gelişmeler ve inflamasyon gaz anketi uzanır.Bu yöntem bağırsak iltihabı üzerinde genetik etkisi içine anlayışlar sağlayabilir rağmen. Ayrıca diyetler ve mikrobiyom gibi diğer faktörlere uygulanabilir. Genellikle, bu dönem için yeni bireyler hastalık skar dokusu işleme zor olduğu için mücadele edecek.Diseksiyon ve doku hazırlama adımları öğrenmek zor çünkü mistalia ve hücre dokusu yapıları değiştirilebilir bu yöntemin görsel gösteri önemlidir. Dekstran sülfat sodyum veya DDS kolit indüklemek için, düzenli içme suyu yerine 3%DSS çözeltisi, yedi gün boyunca lityum ekleyin. Her farenin gövde ağırlığının ölçülmesi, DSS çözüm tüketimi ve günlük dışkı üretimi.Yedi günlük tedavinin sonunda, fareyi supine pozisyonuna yerleştirin ve karında üç santimetre uzunluğunda orta hat kesisi yapmak için küçük makas kullanın. Hasat dalak ve boyutunu ölçmek. Sonra çevreleyen mezenter ayrılmasıiçin kolon kaldırmak için forsep

effects-taste-signaling-protein-abolishment-on-gut-inflammation-an

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Deneysel modeller inflamatuvar barsak hastalığı patogenezi ile ilişkili karmaşık doğal ve adaptif immün yanıtları incelemek için izin verdiler. Histolojik skorlama, pro-inflamatuar sitokinler ve miyeloperoksidaz aktivitesi ölçümü kullanarak, inflamatuvar barsak hastalığı görülen bu yanıtlar değerlendirmeye başlayabilirsiniz.

İBH DSS-kaynaklı Modeli Bağırsak Enflamasyon incelenmesi

Bu video, inflamatuar bir bağırsak hastalığı olan kimyasal kaynaklı bir kolit murin modeli oluşturmak için bir teknik göstermektedir. Farenin yeterli bir süre boyunca bir dekstran sodyum sülfat (DSS) çözeltisi tüketmesine izin verilir. Tüketildikten sonra, DSS kolondaki mukus ve epitel tabakası bariyerine zarar vererek, bağırsak mikroplarının alttaki dokuya girmesine izin verir - burada yerleşik bağışıklık hücreleri tarafından abartılı bir bağışıklık tepkisine aracılık etmek için algılanırlar...

Dekstran Sülfat Sodyum Kaynaklı Kolitin Murin Modelini Oluşturmak İçin Bir Teknik

Bu video, fare kolon dokusunun immünohistokimyasal boyanması yoluyla kimyasal kaynaklı kolitin değerlendirmesini göstermektedir. Lekeli bir doku bölümünde, hasarlı dokuda çok sayıda bağışıklığa duyarlı hücrenin varlığı, kolit sırasında bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonunu temsil eder.

Kolon Dokusu Kesitlerinin İmmünohistokimyasal Analizi ile Kimyasal Kaynaklı Kolitin Değerlendirilmesi

DNBS / TNBS indüksiyonlu kolit bir alternatif ve iltihabik barsak hastalığı patobiyolojisini incelemek için pahalı olmayan yöntemi sunmaktadır. Bu yazıda tartışılan protokolü farelerde ve sıçanlarda kolit başlatmak için DNBS başarılı uygulama özetliyor ve bir iyice konak-aracılı bağırsak yanıtları çalışma sağlar.

DNBS / TNBS kolit Modelleri: Koliti içine Trendleri ve Diyet Yağ Etkileri sağlanması

Burada, sinjeneik CD4 + CD45RByüksek T hücrelerinin T ve B hücresi eksikliği olan alıcılara evlat edinici transferi yoluyla farelerde kolon iltihabını indüklemek için bir protokol sunuyoruz. Klinik ve histopatolojik özellikleri insan inflamatuar barsak hastalıklarını taklit eder. Bu yöntem, kolon iltihabının başlaması ve hastalığın ilerlemesinin incelenmesine izin verir.

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Yüksek</sup&gt; Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

Burada, farelerde kolonoskopik güdümlü çimdik biyopsilerini indüklemek ve yara kapanışını gerçek zamanlı olarak izlemek için prosedürün ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz. Ayrıca yara yatağının histolojik, immünohistokimyasal ve moleküler analizleri için dokuların hazırlanması için yöntemler sağlanmaktadır.

Farelerde Kolonoskopik Güdümlü Çimdik Biyopsilerinin Yapılması ve Sonraki Doku Değişikliklerinin Değerlendirilmesi

Ücretsiz bilgisayar destekli bir sistem kullanılarak bağırsak iltihabının sistematik olarak puanlanması, ülser ve enflamatuar değişikliklerin varlığı ile karakterize kolit modellerindeki histopatolojik değişiklikleri nicel olarak karşılaştırmak için güçlü bir araçtır. Histolojik kolit skoru değerlendirmesi klinik gözlemleri güçlendirir ve veri yorumlamayı kolaylaştırır.

Murine Dextran Sodyum Sülfat Kaynaklı Kolit Modelinde Bağırsak İltihabı İçin Sistematik Puanlama Analizi

Bu protokolde bağırsak mikrobiyota antijenine özgü T hücreli benimseyen transfer kolit modeli tanımlanmıştır. CD4+ T hücreleri CBir1 TCR transgenik farelerden izole edilmiştir. Bunlar, alıcı Rag1/- farelere aktarılan ve bağırsak iltihabına yol açan immünodominant bağırsak mikrobiyota antijeni CBir1 flagellin için özeldir.

CBir1 TCR Transgenik CD4+ T Hücrelerinin İmmün Yetmezlikçi Farelere Benimsenen Transferi ile Bağırsak İltihabının İndüksiyonu

Genetik duyarlılık, mukozal bağışıklık ve intestinal mikroekolojik ortamın etkileşimi, inflamatuar barsak hastalığının (İBH) patogenezinde rol oynar. Bu çalışmada, IL-10 eksikliği olan farelere fekal mikrobiyota transplantasyonu uygulanmış ve kolonik inflamasyon ve kalp fonksiyonu üzerine etkisi araştırılmıştır.

Fekal Mikrobiyota Transplantasyonunun İnterlökin 10 Eksikliği Olan Fare Modelinde Terapötik Değerlendirmesi

Bu protokol, bir sıçan poşit modeli oluşturma yöntemini açıklar. İleal poş modeli, mikrocerrahi teknikler kullanılarak ileal poş-anal anastomoz (IPAA) ameliyatı yapılarak oluşturuldu. Ameliyattan sonra, sıçan 4 gün boyunca% 4 dekstran sülfat sodyum (DSS) ile tedavi edildi.

Dekstran sülfat sodyum kullanılarak proktokolektomi ve ileal poş-anal anastomoz sonrası bir sıçan kroşe modeli

Keşfedin DSS ile indüklenen IBD fare modelinde protein halifeliğinin sinyal yolakları üzerindeki etkilerini. Bu yöntem, genetik faktörlerin bağırsak iltihabı üzerindeki rolünü anlamak için araştırmacılara yardımcı olur.

Protein Halifeliğin bağırsak iltihabı bir iltihabi bağırsak hastalığı fare modeli üzerinde sinyal tat etkileri

Daha fazla video keşfet