Name: Mikrosıvısal tahlil endotel hücrelere (hiPSC-ECs) insan indüklenen Pluripotent kök hücre kaynaklı lökosit yapışma değerlendirme için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Öğrenin, mikrosıvısal tahlil kullanarak hiPSC-EC'lerde lökosit yapışmasını ve inflamatuar yanıtları değerlendirme yöntemini. Bu protokol damar biyolojisi araştırmaları için güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar aşağıdaki hibe kabul etmek istiyorum: Avrupa Araştırma Konseyi (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC); Hollanda Organ-on-Chip girişim, Milli Eğitim Bakanlığı, kültür ve bilim (024.003.001) Hollanda hükümeti tarafından finanse edilen bir NWO yerçekimi projesi.

1. hazırlanması çözümleri ve Kimyasalları
<ol><li>Tam insan Endothelial-SFM Orta (EC-SFM tam) trombosit-yoksul plazma elde edilen serum (% 1), temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 20 ng/mL) ve vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF, 50 ng/mL) insan Endothelial-SFM (görmek tablo ekleyerek hazırlamak Malzemeler). Orta 0,22 µm gözenek filtre ile filtre ve 4 ° C'de 2 hafta için saklayın.</li>
	<li>Fetal Sığır serum (% 10), ekleyerek tam RPMI orta hazırlamak 2-mercaptoethanol (0,05 nM), L-glutamine (% 1), penisilin-streptomisin (25 U/mL) RPMI Orta ( Tablo malzemelerigörmek). 4 ° C'de 3 haftaya kadar saklayın.</li>
</ol>2. kaplama mikrosıvısal fişleri
<ol><li>Steril biochip 10 cm steril Petri kabına yerleştirin.</li>
	<li>Fibronektin çalışma çözüm fosfat tamponlu tuz (PBS) olmadan Ca2 +/Mg2 + 50 µg/mL nihai bir konsantrasyon için hisse senedi çözümde başlamaktan tarafından hazırlayın. Çalışma çözüm biochip başına 80 µL tahmin ediyoruz.</li>
	<li>Fibronektin çalışma çözüm 10 µL biochip her kanal enjekte. Bir pipet ile küçük 10 µL ipuçlarını kullanın ve kanal giriş ve Pipet Ucu (Şekil 1 c, sol) arasında sıkı bir temas kurmaya emin olun.</li>
	<li>Biochip içeren Petri kabına kapağını kapatın ve bir oksijen odası (Şekil 2B) yerleştirin. Gecede odası 4 ° C'de depolayın. Odası nemlendirmek için temiz bir kağıt mendil oksijen odasının altındaki yer ve 5 mL steril H2O. ekleyin</li>
	<li>Önce tahlil, ertesi gün önceden biochip kuluçka 37 ° C'de ısıtın.</li>
</ol>3. hiPSC-ECs hazırlanması
Not: Burada açıklanan iletişim kuralında, hiPSC-ECs farklılaşmış, saf, cryopreserved ve yukarıda açıklanan8olarak çözdürülen.
<ol><li>Tezcan ve plaka hiPSC-ECs içinde tam EC-SFM tam bir %0,1 jelatin kaplı T75 şişesi, üç dört gün önce tahlil içine.</li>
	<li>EC-SFM 10 ng/mL ile TNFα takıma tam ekleyerek hiPSC-ECs ile TNFα gecesi öncesinde tahlil, teşvik ve kuluçkaya geceleme (~ 12 h) yukarıda açıklanan 7olarak 37 ° C'de.</li>
</ol>4. hiPSC-ECs ayrılma ve tohumlama mikrosıvısal çip içine
<ol><li>Tahlil gününde, hiPSC-ECs şişeye kuluçka makinesi almak ve hücrelerin mikroskop altında incelemek. HiPSC-ECs % 80 – 100 birleşmesi ve tipik bir EC benzeri morfoloji var emin olun.</li>
	<li>Şişeye hücre kültür kapağın aktarın.</li>
	<li>HiPSC-ECs şişeye ortamından Aspire edin.</li>
	<li>Kısaca hücre kültürü PBS 10 mL olmadan Ca2 +/Mg2 +ekleyerek yıkayın. PBS Aspire edin.</li>
	<li>4 mL şişe 1 x ayrılma enzim başına ekleyin. (RT) (Şekil 1B) Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Ayrışma reaksiyonu 8 mL şişe başına insan Endothelial-SFM orta ekleyerek durdurmak. Yavaşça bağlantısını kesin ve hiPSC-ECs süspansiyon 5 mL pipet kullanarak 15 mL konik tüp içinde toplamak.</li>
	<li>Toplam süspansiyon hücreleri sayar.</li>
	<li>300 x g 3 dk RT. az için hücreleri santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Süpernatant Aspire edin ve 1.5 x 107 hücre/mL nihai bir konsantrasyon için hücre Pelet EC-SFM tam resuspend.</li>
	<li>Kuluçka makinesi üzerinden biochip ile Petri kabına çıkar ve hücre kültür hood için transfer.</li>
	<li>Fibronektin çözüm mikrosıvısal çip Tüm kanallardan Aspire edin.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 6 µL bir pipet ile bir küçük 10 µL ucu (Şekil 1 c, orta) kullanarak her kanal içine enjekte. Hücre süspansiyon de enjeksiyon önce karıştırılır emin olun ve hücre yağış kaçının.</li>
	<li>Biochip mikroskop altında incelemek ve hücrelerin eşit şekilde dağıtılır ve hücre yoğunluğu yüksek olduğundan emin olun (Şekil 2C).</li>
	<li>37 ° C'de 15 dakika biochip kuluçkaya</li>
	<li>EC-SFM FULL of 40 µL orta rezervuar içine her kanal her iki taraftan ekleyin.</li>
	<li>Biochip 37 ° C'de (Şekil 1 c, sağ) 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>EC-SFM FULL of başka bir 50 µL rezervuarlar içine her kanal her iki taraftan ekleyin.</li>
</ol>5. insan lökosit hazırlanması
Not: Burada açıklanan protokolünde bir piyasada bulunan Monositik hücre satır (THP-1) kullanıldı. Alternatif olarak, periferik kan mononükleer hücreler veya nötrofil kullanılabilir. Yalıtım periferik kan monosit ve nötrofil standart prosedür11kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bir hücre kültür başlıklı bu paragrafta açıklanan tüm adımları gerçekleştirin.
<ol><li>Lökosit 50 mL konik tüp içinde toplamak.</li>
	<li>Lökosit PBS 10 mL olmadan Ca2 +/Mg2 +ile yıkayın. 300 x g RT (Şekil 1 d) adlı 3 dk de hücreleri santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet PBS 1 ml DiOC6 boya ile resuspend (λex 485 = nm, λem 501 = nm) (1:5, 000). 10 dk RT. az karanlık hücrelerde kuluçkaya</li>
	<li>Lökosit PBS 10 mL olmadan Ca2 +/Mg2 +ile yıkayın. Hücreleri 300 x g RT. tekrar çamaşır adım 3 dakika için de bir kez daha santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Toplam süspansiyon hücreleri sayar.</li>
	<li>Süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet 2. 5 x 106 hücre/mL nihai bir konsantrasyon tam RPMI orta resuspend.</li>
</ol>6. mikrosıvısal pompa hazırlanması
<ol><li>8-kanal manifold mikrosıvısal pompalı bir araya getirin.</li>
	<li>Pompa yüklü işletim yazılımı ile bir bilgisayara bağlayın.</li>
	<li>Mikrosıvısal yazılım başlatın ve Açık protokol tıklatarak iletişim kuralını yükleyin ve üstünde belgili tanımlık PC mikrosıvısal protokolü seçin gidin.</li>
	<li>Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı ve pompa Kurulum klasörünü seçip Tahlil adım Çalıştır'ıtıklatarak bağlanın.</li>
	<li>Doğru akış hızı denetimi kanallarda geometrisini tanımlar: Güncelleştirme geometri Geometri Kur klasöründe seçin ve Tahlil adım Çalıştır'ıtıklatın. Not: Geometri ayrıntıları şırınga ve kullanılacak kanallar aynı olduğundan emin olun (geometri kimliği = 1, kanal sayısı = 8, kanal genişliği 800.0 µm, Kanal derinliği = 120.0 µm, şırınga hacmi = 250 µL =) ve örnek viskozitesi (sıvı viskozitesi = 1,0).</li>
	<li>Pompa giriş kablosu (turuncu) yerleştirerek %80 etanol içeren 50 mL konik tüp yıkayın. Çıkış kablosu (yeşil) 50 mL konik boş tüp (atık konteyner) yerleştirin.</li>
	<li>Silinerek geçiş/pompa silinerek geçiş klasörü seçin ve Tahlil adım Çalıştır'ı tıklatın (yıkayın cilt 2000 µL, yıkama birim adım = 250 µL, silinerek geçiş yön = çıkış =). Bir kez daha çamaşır adımı yineleyin.</li>
	<li>Adımlarla (adım 6,6-6,7), hücre kültürü sınıf su ve insan Endothelial-SFM kültür orta yıkama pompası yineleyin.</li>
	<li>Manifold yıkama adımıyla devam edin.</li>
	<li>El ile vana şırınga ve manifoldu arasında yanında duvar ilanı 3-şekilde bağdaştırıcı doğru konuma (sola döndü OFF göstergesi) açın.</li>
	<li>Küme geçerli kanal/açık adım Silinerek geçiş/Manifold yıkama klasörü seçin ve manifold bütün vanaları açmak için Çalıştırmak tahlil adım ' ı tıklatın.</li>
	<li>Manifold el ile 5 mL hücre kültür sınıf su takip şırıngadan 5 mL % 80 etanol de iterek yıkayın.</li>
	<li>Manifold şırıngadan insan Endothelial-SFM kültür orta 5 mL iterek yıkayın.</li>
	<li>Manifold içinde sıkışıp kalırlar tüm büyük hava kabarcıkları kaldırın. Bunu yapmak için 10 cm Petri kabına orta ile 8-şey PIN bağdaştırıcısı yerleştirin ve tüm büyük hava kabarcıkları yok olana şırınga ile itme/çekme gerçekleştirmek (küçük baloncuklar bir sorun değildir).</li>
	<li>Silinerek geçiş/Manifold yıkama klasöründe Kümesi geçerli kanal/kapat adımını seçin ve manifold bütün vanaları kapatmak için Çalıştırmak tahlil adım ' ı tıklatın.</li>
	<li>Yeşil çıkış kablosunu pompası manifold bağdaştırıcısına bağlayın.</li>
	<li>3-yollu vana şırınga kapatmak için tekrar OFF konumuna geçin.</li>
	<li>Silinerek geçiş/kablo silinerek geçiş klasörü seçin ve tek tek, her bağlantı noktası RPMI orta ile yıkamak için Tahlil adım koşmak tüm kabarcıklar her kablo kaldırılır kontrol ettikten tıklatın (birim dağıtmak 100 µL =). Not: Manifold her Vana teker teker açılan, diğer kanallar tutmak kapalı iken 1 8 ve 100 μL orta için tek tek her kanalı ile reçete. Sıvı her iğnesinden yayınladığından emin olun. Hiçbir sıvı ortaya çıkıyor, bir hava kabarcığı veya bir takunya belirtisi tek.</li>
</ol>7. mikrosıvısal çip için hazırlanması canlı görüntüleme
<ol><li>Mikrosıvısal kurulumları hazırız ve canlı görüntüleme odası 37 ° C için önceden dengelenmiş ve %5 (Şekil 3A, B) CO2 düzeyine ulaşır emin olun.</li>
	<li>Biochip kuluçka makinesi almak ve mikroskop çip tutucu içinde konumlandırın. Chip sahibi sahne (Şekil 3 c) görüntüleme mikroskobunun bağlayın.</li>
	<li>Biochip pompa manifold üzerinden bağlanmak için 8 pinlik bağdaştırıcı çip çıkış rezervuar yakın yerleştirin ve orta tüm pins derinleştirmek olmakla birlikte tamamen bağlamayın.</li>
	<li>Silerek geç seçin | Çip için bağlamak klasör ve tıklayın çip bağlanma öncesi RPMI orta dağıtmak için Tahlil adım çalıştırmak (birim dağıtmak 30 mL =). Bir kez orta reçete, 8 pinlik bağdaştırıcı biochip prize takın. Not: Bu adımda, tüm kanallar üzerinde (açık) ayarlanır ve orta 30 µL her kanalı ile reçete ve bu kanalları (kapalı) kapalı olarak ayarlanır. Bu baloncuklar mikrosıvısal çip kanallarına tanıtılacaktır hava sağlar.</li>
	<li>El ile bir pipet ile biochip tüm giriş rezervuarlar ortamından Aspire edin.</li>
	<li>Silerek geç seçin | Chip silinerek geçiş ağıl ve tıkırtı her bir-yanında-kanaldan ölü hücreler/enkaz kurtulmak için bir kanal aracılığıyla EC-SFM tam orta 40 mL sıvı için Tahlil adım çalıştırmak (silinerek geçiş cilt 40 µL, maksimum silinerek geçiş kesme = 40 dynes/cm2=).</li>
</ol>8. akış yapışma tahlil ve görüntü edinme
<ol><li>El ile ilgi bir pipet ile kanal giriş rezervuarı ortamından Aspire edin.</li>
	<li>Lökositlerin 100 µL adım 5.6 ilgi kanal giriş rezervuarı ekleyin. Not: Hücreleri tek hücre süspansiyon yapmak karışımı yavaşça.</li>
	<li>Hücre tahlil | Adım açıklama klasörü, Küme geçerli kanal/adım açıklamasını seçin ve, ilgi sadece geçerli kanal kanal listesinde seçin ve On (açık) ayarlayın ve tüm diğer yedi kanallar (kapalı) Off için ayarla.</li>
	<li>Hücre tahlil seçin | Adım açıklama ağıl ve tıkırtı Tahlil adım çalıştırın. Not: Değişken akış hızı dağıtımı 5 min için kanal üzerinden giriş rezervuar lökosit süspansiyon çekmek için sürekli negatif basınç geçerli olduğunu emin olun (Shear kümesi = sabit, yamultma stres = -0,5 din/cm2, süre = 00:05:00, Gecikme inceden inceye gözden geçirmek = 00:00:00). Yamultma stresin negatif değer akışının doğru yönü sağlar.</li>
	<li>Giriş rezervuar kalan lökosit Aspire edin.</li>
	<li>Tam RPMI orta 100 µL giriş havzanın ekleyin. Hücre tahlil/adım açıklama klasörü seçin ve tüm sigara yapışık lökosit yıkamak için kanal RPMI orta ile 5 min için sıvı için Tahlil adım çalıştırmak tıklayın (Shear kümesi = sabit, yamultma stres -0,5 din/cm2, süre = = 00: 05:00, tarama gecikme = 00:00:00).</li>
	<li>En az 3-4 farklı pozisyonlar (temsilcisi alanları yakalanır emin olmak için) yapıştırılır lökosit görüntüye kanalının görüntülerden elde etmek.</li>
	<li>8.1-8.7 kanallar tüm kalan işlev değerlendirmesi için yineleyin. Not: Aynı anda birden fazla kanal çalıştırmak mümkündür. Bunu yapmak için adım 8.3 sırasında ilgi tüm kanallarını açın. ve tüm yukarıda belirtilen adımları 8.4 –8.7 faiz birden fazla kanal için gerçekleştirin.</li>
</ol>9. tahlil tamamlanıyor ve mikrosıvısal pompa temizleme
<ol><li>Deneme işlemini tamamladıktan sonra verebilir ve tüm görüntüleri RAW formatta kaydedebilirsiniz.</li>
	<li>Sonuçları kaydedilirken, mikrosıvısal pompa ve protokol temizlik manifold çalıştırın.</li>
	<li>Mikrosıvısal pompa için koşmak Silinerek geçiş/pompa silinerek geçiş ağıl ilk hücre kültür sınıf su 4 mL ventriküler tarafından % 80'i 4 mL tarafından takip 6,6-6,7 adımlarda açıklandığı gibi etanol makinası pompa birkaç dakika hava çalıştırarak.</li>
	<li>Manifold temizlemek için şırınga ile Silinerek geçiş/Manifold yıkama adım çalıştırın. Şırınga ve manifold boru hattı betonarme donatı olarak açıklandığı adımlar 6.10-6.11 yıkama % 80 etanol ile ilk ve sonraki hücre kültür sınıf su ile açmak için adımları izleyin. Manifold hava yolu ile belgili tanımlık tenkıye iterek kuru. Şırınga Vana ve manifold vanalar adımları 6,10 ve 6.15 bölümünde açıklandığı gibi kapatın.</li>
</ol>10. yapisan lökosit sayma
<ol><li>Karşıdan yükleyip görüntü işleme yazılımı14 http://cellprofiler.org. Not: Görüntü bu çalışmada işleme yazılımı sürüm 2.1.1 kullanılarak gerçekleştirildi. Daha yeni bir sürümü kullanıyorsanız, boru hattı küçük uyum gerektirebilir.</li>
	<li>Boru hattı Count_leukocytes.cpipe. indir Dosyasını tıklatın | Alma | Boru hattı dosyasından ve boru hattı Count_leukocytes.cpipeseçmek için PC'de gidin.</li>
	<li>Sürükle ve bırak giriş modülleri dosya listesi penceresinde yapisan lökositlerin alınan ham görüntüleri ile bir klasör | Görüntüleri analiz için bölüm.</li>
	<li>Lökosit analiz modülleri ile tipik boyutunu belirtmek | IdentifyPrimaryObjects. Minimum ve maksimum çapı yapisan lökositlerin piksel olarak belirtin.</li>
	<li>Analiz modülleri ile filtre uygulama ölçütlerini seçin | FilterObjects. Nesnelerin en az kabul edilen alan piksel olarak belirtin.</li>
	<li>Analiz analiz görüntüleri düğmesine basarak başlatın. Not: PİŞMEMİŞ imge işleme alınacaktır ve sonuçları bir varsayılan çıkış klasöründe kaydedilir. Image.txt çıkış dosyası (bir resim, yani, her alınan görüş alanı her sayı karşılık gelir) işlenmiş her görüntü yapisan lökosit sayıları içeren.</li>
</ol>

<ol><li>Vestweber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+leukocytes+cross+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">How leukocytes cross the vascular endothelium.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (11), 692-704 (2015).</li>
<li>Hajishengallis, G., Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+modulators+of+inflammatory+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Endogenous modulators of inflammatory cell recruitment.</a> Trends in Immunology. 34 (1), 1-6 (2013).</li>
<li>Molema, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+endothelial+responsiveness+to+cytokines%2C+molecular+causes%2C+and+pharmacological+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+thrombosis+and+hemostasis%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in endothelial responsiveness to cytokines, molecular causes, and pharmacological consequences.</a> Seminars in thrombosis and hemostasis. 36 (3), 246-264 (2010).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Cell+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial Cell Heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), a006429(2012).</li>
<li>Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology%3A+a+decade+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 1-16 (2016).</li>
<li>Lin, Y., Gil, C. H., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation%2C+Evaluation%2C+and+Application+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation, Evaluation, and Application of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Endothelial Cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (11), 2014-2025 (2017).</li>
<li>Halaidych, O. V., Freund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Responses+and+Barrier+Function+of+Endothelial+Cells+Derived+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Responses and Barrier Function of Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. , (2018).</li>
<li>Orlova, V. V., vanden Hil, F. E., Petrus-Reurer, S., Drabsch, Y., ten Dijke, P., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+expansion+and+functional+analysis+of+endothelial+cells+and+pericytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).</li>
<li>Orlova, V. V., Drabsch, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionality+of+endothelial+cells+and+pericytes+from+human+pluripotent+stem+cells+demonstrated+in+cultured+vascular+plexus+and+zebrafish+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functionality of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells demonstrated in cultured vascular plexus and zebrafish xenografts.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (1), 177-186 (2014).</li>
<li>Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Flow+Adhesion+Assay+to+Study+Leucocyte+Recruitment+to+Human+Hepatic+Sinusoidal+Endothelium+Under+Conditions+of+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), 1-6 (2014).</li>
<li>Muller, W. A., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+of+transendothelial+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Assays of transendothelial migration in vitro.</a> Methods in enzymology. 443, 155-176 (2008).</li>
<li>Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Human+Umbilical+Vein+Endothelial+Cells+and+Their+Use+in+the+Study+of+Neutrophil+Transmigration+Under+Flow+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), 1-5 (2012).</li>
<li>Vajen, T., Heinzmann, A. C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+Flow-based+Assays+to+Investigate+Leukocyte+Recruitment+on+Cultured+Vascular+Cells+and+Adherent+Platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).</li>
<li>Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+Migration+into+Inflamed+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Leukocyte Migration into Inflamed Tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı ile TNFα, lökosit yapışma hiPSC-ECs canlı görüntüleme ve otomatik yapisan lökosit sayma kullanarak akış tahlil için işlevsel değerlendirme gibi pro-inflamatuar uyaranlara hiPSC-EC tedavi karakterizasyonu açıklar.
HiPSC-ECs ile TNFα gecede uyarılması genellikle ECs içinde aktif bir pro-inflamatuar fenotip gösteren uzun sonuçlanır. En iyi duruma getirme aşamasında E-selektin, ICAM-1, VCAM-1 düzeyleri FACs7,8ve primer insan umbilikal ven ECs (HUVECs) tarafından doğrulanması gerekir ifade pozitif denetimler olarak eklenmek üzere tavsiye vardır.
En iyi hiPSC-ECs ayrılma ve yoğunluk tohum konfluent monolayer hücre kümeleri kurma olmadan ulaşmak için ve takunya kanal ulaşmış gerekir. Lökosit hemen perfüzyon hücre yağış önlemek ve her kanal raporlaması sürekli konsantrasyon korumak için önce yeniden askıya almak için önemlidir. İnsan periferik kan lökosit, nötrofil ve monosit gibi kullanılabilir veya Monositik hücre hatları, THP-1 veya HL-60 alternatif olarak kullanılabilir gibi kurulmuş.
Mikrosıvısal kurulum montaj ve akış tahlil sırasında hiPSC-ECs ve/veya yapıĢık lökosit dekolmanı oluşturacağından mikrosıvısal boru ve kanal hapsolmak üzerinden hava kabarcıklarını önlemek için önemlidir. Sıvı akışkan arabirimi veya ek yıkama adımları birleşme mikrosıvısal Kur hazırlanması sırasında hava kabarcıklarını önlemek için yardımcı olabilir.
Bu protokol nerede bir hücreleri hazırlar ve ikinci mikrosıvısal sistemi ve akış tahlil hazırlar iki operatörleri tarafından çalıştırılır tavsiye edilir. Bu ECs mikrosıvısal fiş içine işleme önce sabit bir zaman penceresi içinde kaplama ve hassasiyet ve tekrarlanabilirlik sonuçları geliştirir sağlar. Buna ek olarak, bu da kör deneyler ayarlama sonuçlar içinde önyargı önlemek sağlar.
Otomatik görüntü işleme boru hattı ile başarılı hücre algılama için görüntüleri yüksek sinyal gürültü oranı ile odak ve autofluorescence hücre kümeleri gibi spesifik olmayan nesnelerin önlemek için önemlidir. Çok önemli tanımlanması gerekir yapisan lökositlerin tipik boyutu minimum ve maksimum sınırlarını doğru belirlenmesi önemlidir. Bir ImageJ içinde bir satır ölçüm aracını kullanarak lökosit tipik boyutunu tahmin edebilirsiniz. Örneğin, bizim analizi, biz 10,3-17,1 µm (Şekil 4 c) fiziksel boyutuna karşılık gelen 9-15 piksel aralığı kullanılır. Yanlış bir Aralık, örneğin, 3-15 piksel (3,4-17,1 µm) kullanırken tek bir lökosit değil bir hücre tanımlanır, ama yerine onun subparts ayrı nesneler (Şekil 4 d) olarak tanımlanır. Bu tespit edilmesi için nesnelerinin sayısı yanlış yol açar.
Lökosit sağlanan adaptif eşik yöntemi kullanılarak algılanabilir daha düşük yoğunluklu ve daha küçük çok sayıda nesne yüzey alanı. Bu yer autofluorescence nedeniyle veya diğer non-spesifik floresan sinyallerini alır. Kendi alanında tek bir lökosit, tipik alandan daha düşükse yine de, bu belirsiz nesneler (Şekil 4 c) en az kabul edilen yüzey alanı tanımlayarak filtre uygulanabilir.
Burada anlatılan akış tahlil lökosit yapışma için bu iki hücre arasındaki etkileşimin elucidating bir EC monolayer doğrudan değerlendirme türleri, ama diğer hücre türleri, çoğu perisitlerden damar duvarındaki sunmak gibi ve de olabilir dikkate almaz sağlar lökosit ekstravazasyonu15Yönetmelikte katılmak. 3D kültür microenvironment diğer hücre tipleri ile entegre sistem fizyolojik uygunluğunu geliştirmek olabilir. Bu sınırlamaları rağmen akışı tahlil inflamatuar yanıt burada açıklanan değerlendirilmesi için değerli bir araç temel karakterizasyonu ve hastalık için hiPSC-ECs modelleme uygulamaları sağlar.

İltihap birçok patolojik koşullar, kardiyovasküler dahil olmak üzere ve nörodejeneratif hastalıklar, sepsis ve advers ilaç yanıt (advers) önemli bir rol oynamaktadır. Endotel hücreleri (ECs) inflamatuar yanıt E-selektin, hücreler arası adezyon molekülü-1 (ICAM-1) ve vasküler hücre adezyon molekülü-1 (VCAM-1) onların yüzeyi gibi yanlısı tutkal reseptörlerinin indüksiyon yoluyla düzenlenmesinde önemli bir rol oynamak 1 , 2. farklı dokularda mikrovasküler ECs heterojenite inflamatuar yanıt3,4sergi bilinmektedir. Ayrıca, genetik arka plan veya belirli genetik koşullar inflamatuar yanıt bireyler arasında farklılıklar neden olabilir; Bu nedenle erişim için ECs farklı bireyler olması önemlidir. Daha yakın, hemen hemen herhangi bir kişi elde edilebilir, insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSCs)5, ECs6,7,8, güvenilir ve yenilenebilir kaynağı olarak hizmet gösterilmiştir 9. bu nedenle, inflamatuar yanıt ve lökosit istihdam hiPSC-ECs değerlendirme aynı zamanda arası bireysel farklılıklarına belirtileri sağlamak ve için bir araç olarak kullanmak için sadece bazı genetik bozukluklar, modelleme için değerlidir Kişiselleştirilmiş tıp içinde belgili tanımlık gelecek.
Akış deneyleri lökosit endotel etkileşim eğitim için yararlı bir araç sağlar. Mikrosıvısal aygıtların gelişmeler fizyolojik sıvı akış koşulları üreme ile vasküler yatak özel kesme stres düzeyleri hassas kontrol sağlar. Canlı görüntüleme lökosit yakalama, inişli çıkışlı, tarama, yapışma ve hicret olayların çağlayan izleme sağlar. Lökosit endotel etkileşim çalışmaya çeşitli akış deneyleri geliştirilmiştir, ancak, onlar tüm birincil ECs10,11,12,13yararlanmak. Burada, insan lökosit yapışma için hiPSC-ECs fizyolojik akış altında değerlendirilmesi için tahlil detaylı olarak anlatacağız. Bu yordam, biz bir mikrosıvısal çip ile sekiz paralel kanal içine tohum hiPSC-EC stimülasyon gibi tümör nekrozis faktör alfa (TNFα), ayrılma, pro-inflamatuar uyaranlara ile en iyi duruma getirilmiş koşulları açıklanmaktadır. HiPSC-ECs perfüzyon mikrosıvısal fiş fluorescently etiketli lökositlerin süspansiyon için adım adım bir protokol tanımlamak, hücre görüntüleme yaşadığımız ve yapışık lökosit sayma otomatik.
Bu protokol inflamatuar hiPSC-ECs uyuşturucu tarama, hastalık modelleme ve kişiselleştirilmiş rejeneratif tıp yanıt-e doğru değerlendirilmesi için yararlıdır.

<table><tbody><tr><td>Vena8 Endotel + biyoçip</td><td>Cellix Ltd</td><td>V8EP-800-120-02P10</td><td></td></tr><tr><td>Mirus Evo Nanopump</td><td>Cellix Ltd</td><td>MIRUS-EVO-POMPA</td><td>1 x şırınga pompası; 1 x VenaFluxAssay Yazılımı; < / > 1 x Boru Kiti; güç kaynağı ve kabloları.</td></tr><tr><td>8 kanallı manifold MultiFlow8</td><td>Cellix Ltd</td><td>MIRUS-MULTIFLOW8</td><td></td></tr><tr><td>Nemlendirilmiş kutu</td><td>Cellix Ltd</td><td>NEM KUTUSU</td><td></td></tr><tr><td>Floresan görüntüleme sistemi Leica AF6000</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektron çarpan şarj bağlantılı cihaz kamerası</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100</td><td></td></tr><tr><td>Biyolojik güvenlik kabini/laminer akış başlığı</td><td>Temiz hava</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 hücre kültürü inkübatörü</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUV</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Hitachi</td><td>himac-CT6EL</td><td></td></tr><tr><td>El tipi pipetleyici (P-10 (10 mL), P-200 (200 & mikro; L), P-1000 (1.000 & mikro; L)</td> <td>Gilson uluslararası</td><td>4807 (10 & mikro; l), 4810 (200 & mikro; l), 4809 (1000 & mikro; l)</td><td></td></tr><tr><td>Steril plastik pipet</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606180 (5ml), 607180 (10ml)</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>VWR/ Duran Group</td><td>391-0860</td><td></td></tr><tr><td>Kültür şişeleri (75 cm2)</td><td>CELLSTAR</td><td>658,170</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj tüpü (15 mL)</td><td>CELLSTAR</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td> Şirket</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Domuz derisinden elde edilen jelatin, A tipi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin (Sığır plazması)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14190-169</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Endotelyal-SFM</td><td>Ömrü Teknolojiler</td><td>11111-044</td><td></td></tr><tr><td>İnsan VEGF 165 IS, birinci sınıf</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-109-386</td><td></td></tr><tr><td>İnsan FGF-2, birinci sınıf</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-842</td><td></td></tr><tr><td>Trombositten fakir Plazma Türetilmiş Serum, sığır</td><td>Biyomedikal Teknolojileri</td><td>BT-214</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan TNF-&alfa;</td><td>Tebu-bio</td><td>300-01A-A</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select</td><td>Life Technologies</td><td>12563029</td><td></td></tr><tr><td>DiOC6(3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318426</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Orta</td><td>Ömür Teknolojileri</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol (50 mM)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (5.000 U/mL)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Damıtılmış su</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15230-089</td><td></td></tr><tr><td>Etanol mutlak</td><td>Merck</td><td>1.00983.2500</td><td></td></tr><tr><td>VCAM-1</td><td>R& E-Selectin</td><td>Ar-Ge FAB5649P</td><td></td>D sistemleri</tr><tr><td></td><td> D sistemleri</td><td>BBA21</td><td></td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>Ar-Ge D sistemleri</td><td>BBA20</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Yazılım sürümü</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Cellrofiler CellProfiler</td><td></td><td>2.1.1</td><td></td></tr><tr><td>VenaFluxAssay Yazılımı</td><td>Cellix Ltd</td><td>2.3.a</td><td></td></tr></tbody></table>

mikrosıvısal tahlil endotel hücrelere (hipsc-ecs) insan indüklenen pluripotent kök hücre kaynaklı lökosit yapışma değerlendirme için

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Endotel hücreleri (ECs) inflamatuar yanıt düzenlenmesi için temel sınırlama veya lökosit işe alım iyi karakterize bir çağlayan ile etkilenen doku içine upregulated olan yanlısı tutkal reseptörlerinin kolaylaştırılması üzerinde Akyuvar hücre yüzeyine inflamatuar tetiği üzerine. İnflamatuar yanıt bireyler nüfus arasındaki farklılık gösterebilir ve genetik arka plan bu farklılıklara katkıda bulunabilir. İnsan indüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSCs) güvenilir bir kaynak olarak ECs (hiPSC-ECs), böylece hücrelerin genetik kimlik ve herhangi bir genetik varyantların yakalama sınırsız bir kaynak veya bağış mutasyonlar gösteren gösterilmiştir. hiPSC-ECs bu nedenle donör özgü hücrelerdeki inflamatuar yanıt model oluşturma için kullanılabilir. İnflamatuar yanıt lökosit yapışma için fizyolojik akış altında hiPSC ECs belirlenerek modellenebilir. Adım adım bu iletişim kuralı deneysel kurulum ve inflamatuar hiPSC ECs yanıt-e doğru değerlendirilmesi için veri analizi ve lökosit yapışma fizyolojik akış altında analiz ayrıntılı açıklamasını sağlar.

İlk olarak, hiPSC-ECs cevaben stimülasyon ile pro-inflamatuar Ajan TNFα incelenmesi gerekir, daha önce açıklandığı gibi7. TNFα tedavi için 12 h E-selektin, upregulation 6 h zirve ile tedavi başladıktan sonra tetikler. Ayrıca, ICAM-1 upregulated 6-12 h sonrası tedavi yöntemidir. Her ne kadar biz VCAM-1'in beklenen upregulation gözlemlemek değil, genellikle birincil insan göbek damar endotel hücrelerinde (HUVECs) görülmektedir. Lökosit yapışma tahlil için en uygun olması için gece (12 h) TNFα tedavi bulduk.
En iyi hiPSC-ECs ayrılma bir tek hücre süspansiyon hücre kümeleri ücretsiz sonuçlanmalıdır. Şekil 2C en iyi hiPSC-EC yoğunluğu şu enjeksiyon sonra göstermektedir. Tipik olarak, 15 dk sonra enjeksiyon hiPSC ECs kanal altına ekleyin ve (Şekil 2B) yayılmaya başlar. 1 h enjeksiyon sonra hiPSC-ECs kanal boyunca iyi yaymak monolayer formu ve akış tahlil (Şekil 2E) başlamak hazır olacak.
Daha kolay, özellikle lökosit ECs monolayer için uygun ve genellikle zordur çünkü hücre kimliği adım yapar gibi lökosit floresan kaydedici ve etiketleme için faz kontrast albümdeki resim miktar, otomatik faydalıdır farklı hücre tipleri ayırt etmek yazılım için.
Ücretsiz açık kaynak görüntü işleme yazılımı yapisan lökosit otomatik miktar için çok yararlıdır. Burada iletişim kuralında tanımlanan boru hattı lökositlerin (Şekil 4A) Floresan görüntülerin adaptif eşik kullanarak birincil nesne kimliği üzerinde temel alır. Filtreleme tanımlanan nesneleri Ayrıca en az bir alana dayalı hücre artıkları, autofluorescence veya herhangi bir diğer non-spesifik floresan sinyal (Şekil 4 C, D) gibi yanlış tanımlanan nesneleri filtreler.
Örneğin, sağlıklı bağış veya genetik bozukluğu olan hastalar gibi bağımsız hiPSCs üzerinden ECs farklılaşmış, iki bağımsız grup karşılaştırılması bir mikrosıvısal çip ile sekiz paralel kanal sağlar. Tedavi edilmemiş ECs veya bir ICAM-1 engelleme antikor ile ön arıtma gibi ek denetimler iyi10,11dahil edilebilir. İki ya da üç mikrosıvısal çip bir anda işlenebilir. Sonuçlar sağlamlık için en az üç bağımsız biyolojik deneyler bağımsız günlerde gerçekleştirilen önerilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58678/58678fig1.jpg"> Resim 1 : HiPSC-ECs ve lökosit hazırlanması akışı tahlil için. (A)hiPSC-ECs pro-inflamatuar uyarıcı (TNFα) ön arıtma. HiPSC-ECs enzimatik ayrılma, aralıklarla ve resuspension (B) şematik gösterimi. (C) şematik Gösterim kanallarını (C, sol), enjeksiyon hiPSC-EC süspansiyon (C, orta) kaplama ve hücre kültür orta eklenmesinden sonra hiPSC-ECs ek olarak mikrosıvısal çip. (D) floresan boya DiOC6 ve resuspension ile etiketleme lökosit çamaşır adım şematik gösterimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58678/58678fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58678/58678fig2.jpg"> Resim 2 : HiPSC-ECs mikrosıvısal çip. (A)mikrosıvısal çip bir Petri kabına 10 cm. (B) oksijen odası kuluçka için kullanılır. (C, D, E) HiPSC-ECs mikrosıvısal içinde temsilcisi görüntülerini 0 dk (C), 15 dk (D), (E) 1s sonra enjeksiyon kanal. Ölçek çubuğu 200 µm. = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58678/58678fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58678/58678fig3.jpg"> Şekil 3 : Canlı hücre görüntüleme ve lökosit perfüzyon testin deneysel Kur. (A, B) Fotoğraf (A) ve şematik gösterimi (B) canlı hücre görüntüleme ve akış tahlil deneysel Kurulum: (1) - (%5 CO2, 37 ° C, nemlendirilmelidir) bağlı canlı görüntüleme odası, (2) ile ters floresan mikroskop - mikrosıvısal pompa, (3) - 8-Kanal Manifold, (4) - PC için mikroskop kontrol ve görüntü alma, (5) - PC mikrosıvısal pompa kumandası için. (C) mikrosıvısal çip bir plaka sahibi sabit ve mikroskop motorlu aşamasında monte 8-kanal manifold eklenen boru ile. (D) akış tahlil önemli adımlardan şematik gösterimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58678/58678fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58678/58678fig4.jpg"> Şekil 4 : Görüntü analiz ve otomatik algılama yapisan lökositlerin. (A) görüntü işleme yazılımı lökosit tanımlaması için belirtilen ayarları ile iletişim penceresi. En az temel tanımlanan nesneleri (B) belirtilen süzme ile görüntü işleme yazılımı iletişim penceresi kriterleri kabul yüzey alanı (SAdk = 70 piksel). (C) lökositlerin doğru kimlik ve küçük yüzey alanı (SA) belirsiz nesnelerin filtre uygulama örneği (piksel (MIN, Max) tipik çap = (9, 15); Süzme ölçütleri SAdk = 70 piksel). Kabul edilen nesneleri yeşille tasvir edilir ve atılan nesneleri mor tasvir edilir. (D) örnek bir yanlış kimlik tipik çap hatalı dizi nedeniyle lökositlerin (tipik çap için piksel (MIN, Max) = (3, 15); Süzme ölçütleri SAdk = 70 piksel). Kabul edilen nesneleri yeşille tasvir edilir ve atılan nesneleri mor tasvir edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58678/58678fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Adım adım bu iletişim kuralı deneysel kurulum ve inflamatuar hiPSC ECs yanıt-e doğru değerlendirilmesi için veri analizi ve lökosit yapışma fizyolojik akış altında analiz ayrıntılı açıklamasını sağlar.

Mikrosıvısal tahlil endotel hücrelere (hiPSC-ECs) insan indüklenen Pluripotent kök hücre kaynaklı lökosit yapışma değerlendirme için

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Bu yöntem insan pluripotent kök hücre biyolojisi alanında insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı endotel hücrelerinin işlevselliği ve inflamatuar yanıtları hakkında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, lökosit adezyonunun insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı endotel hücrelerine değerlendirilmesi için deneysel kurulum ve veri analizinin ayrıntılı bir açıklamasını sağlamasıdır. Mikroakışkan talaş kaplama için steril bir biyoçipi 10 santimetrelik steril Petri kabına yerleştirin ve biyoçipin her kanalına 10 mikrolitre taze hazırlanmış fibronektin çalışma solüsyonu enjekte etmek için 10 mikrolitrelik pipet ucu kullanın.Petri kabının üzerini kapatın ve bir gece boyunca dört derece nemli bir odaya koyun. Ertesi sabah, 37 derecelik bir inkübatör de biyoçip önceden ısıtın, ve yeniden askıya insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı endotel hücreleri askıya 80 ila% 100 yeni bir endotel hücre serum içermeyen ortamda istenilen konsantrasyonda confluent hücre kültüründen hasat. Daha sonra, mikroakışkan çipin tüm kanallarından fibronektin çözeltisini aspire edin ve her kanala altı mikrolitre hücre enjekte etmek için 10 mikrolitrelik pipet ucu kullanmadan önce hücreleri homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için iyice karıştırın.Hücrelerin yüksek hücre yoğunluğuile eşit olarak dağıtıldığını doğrulamak için mikroskop altındaki biyoçipi inceleyin. 37 santigrat derecede 15 dakika sonra, her kanalın her iki tarafındaki orta rezervuarlara 40 mikrolitre endotel hücresi serumsuz orta FULL ekleyin. Ve biyoçipi bir saatliğine kuvöze geri ver.Daha sonra, her kanalın her iki tarafındaki rezervuarlara 50 mikrolitre daha endotel hücresi serumsuz orta FULL ekleyin. Tohumlu hücrelerin canlı görüntülemesi için, mikroakışkan kurulumların hazır olduğunu, canlı görüntüleme odasının 37 santigrat dereceye kadar dengelendiğine ve CO2 seviyesinin %5'e ulaştığını ve biyoçipi mikroskop yongatutucuya yerleştirin ve çip tutucuyu mikroskop görüntüleme aşamasına monte edin. Biyoçipi manifold aracılığıyla pompaya bağlamak için, sekiz iğneli adaptörü çipin çıkış rezervuarlarına yakın bir yere yerleştirin ve pimleri tamamen bağlamadan ortamdaki tüm pimleri derinleştirin.Mikroakışkan pompa yazılımında, washout/Connect to chip'i seçin ve her pin üzerinden 30 mikrolitre RPMI ortamı dağıtmak için Assay Adımını Çalıştır'ı tıklatın. Sonra biyoçip çıkış içine sekiz iğneli adaptör takın. Biyoçipin tüm giriş rezervuarlarından ortamı el ile aspire etmek için bir pipet kullanın ve ölü hücreleri ve döküntüleri temizlemek için 40 mikrolitre endotel hücresi serumsuz orta tam ile bir seferde bir kanal ayarı yapmak için Washout/Chip Washout ve Run Taht Adım'ı seçin.Tüm kanallar yıkandığında, 100 mikrolitre insan lökositi ile ilgi kanalının giriş haznesinden gelen ortamı nİVMI ortasında mililitre başına altı hücreye 2,5 çarpı 10'a kadar seyreltilmiş olarak değiştirin. Hücre Atama/Adım açıklamasını tıklatın ve Geçerli Kanal/Adım açıklamasını ayarlayın ve ilgi kanalını Açik'a, diğer yedi kanalı da Kapalı olarak ayarlayın. Hücre Atama Adımı açıklamasını seçin ve Assay Adımını Çalıştır'ı tıklatın.Giriş haznesinde kalan lökositleri 100 mikrolitre tam RPMI orta ile değiştirin. Ve herhangi bir yapışmaz lökosit kaldırmak için RPMI orta ile beş dakika kanal perfuse hücre Assay Adım ve Çalıştır Assay Adım tıklatın. Daha sonra bağlı lökositleri görselleştirmek için kanaldaki en az üç ila dört farklı pozisyondan görüntüler edinin.Yapışkan lökositleri ölçmek için CellProfiler görüntü işleme yazılımını açın ve Kont Lökositler Boru Hattı dosyasını içeri aktarın. Giriş modülleri altında Görüntüler'i seçin ve dosya listesi penceresine yapışık lökositlerin ham görüntüleriyle klasörü sürükleyip bırakın. Analiz modülleri altında Birincil Nesneleri Tanımla'yı seçin ve yapışkan lökositlerin piksellerde en az ve maksimal çaplarını gösterir.Analiz modülleri altında FilterObjects'i seçin. Ardından filtreleme ölçütlerini seçin ve piksellerde nesnelerin en az kabul edilen alanını girin ve analize başlamak için Görüntüleri Analiz Et'i tıklatın. Optimal insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı endotel hücre bölünmesi hücre kümeleri içermeyen tek bir hücre süspansiyonu ile sonuçlanmalıdır.Tipik olarak, 15 dakika enjeksiyondan sonra endotel hücreleri kanalın altına bağlanır ve yayılmaya başlar. Enjeksiyondan bir saat sonra endotel hücreleri kanal boyunca iyi yayılmış bir monolayer oluşturmalıdır ve bu noktada Akış taliminde kullanıma hazırdırlar. Gösterildiği gibi serbest açık kaynak görüntü işleme yazılımının kullanılması, tanımlanan nesnelerin en az alana göre filtrelemesine ve hücre enkazı, otofloresan veya diğer spesifik olmayan floresan sinyali gibi yanlış tanımlanmış nesnelerin dışlanmasına olanak tanır.Bu prosedürü çalışırken, pro-inflamatuar sitokinler ile stimülasyon optimize etmek ve pozitif bir kontrol olarak birincil insan umbilikal ven endotel hücreleri dahil hatırlamak önemlidir. Birincil memeli hücre ve hücre hatları ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken laboratuvar paltosu, eldiven ve göz koruması gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

microfluidic-assay-for-assessment-leukocyte-adhesion-to-human-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Endotel koloni oluşturan hücreleri (ECFCs) intrensek göstermeyen sağlam klonal bir proliferatif potansiyeli olan endotel hücreleri...

Endotel Colony Forming Hücrelerinin Fenotipik ve Fonksiyonel Karakterizasyonu İnsan Göbek Kordonu Kanı türetilen

Fotolitografi tarafından kazınmış ve PDMS imal Mikroakışkan akışı odaları EC disfonksiyonu ve inflamasyon ile ilişkili fonksiyonel sonuçlarını araştırmak için uygulanır. Temsili bir deneyde, diferansiyel kayma gerilmesi yeteneği sitokin aktive AK monolayers için monositik hücre adezyon modüle gösterilmiştir.

On-Chip Endotel İnflamatuar fenotipleme

Enfeksiyon bölgelerinde aktif endotele nötrofil bağlılık konağın inflamatuvar yanıt ayrılmaz bir bileşenidir. Için izin veren bir nötrofil bağlayıcı bir testtir Bu raporda...

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

Karaciğer lökosit işe özgü karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri ile kaplı olan hepatik sinüzoidler özel kanallar içinde gerçekleşir. Fizyolojik kesme stresi koşulları altında, insan karaciğer sinüzoidal endotelyumda lökosit işe faz kontrast mikroskopisi bu işlemi altında yatan moleküler mekanizmaların açıklanması kolaylaştırabilir.

Kayma Stres İnsan Karaciğer Sinüzoidal Endoteline altında Koşullarına Lökositer İşe Alım Eğitim için Bir Akış Adezyon Deneyi

Burada, biz araştırmacı bir fare dolaşım sistemine endotel kaynaklı yapışma molekülleri ile kaplanmış bir odayı bağlayarak lökosit işe dinamikleri ex vivo değerlendirmek için izin veren bir protokol mevcut. Göreceli biyolojik şartlar altında lökosit değerlendirme sağlar, bu yöntem önemli avantajlar sunar.

Bir Flow Koşullarında lökosit-endotel Etkileşimleri değerlendirilmesi Ex vivo Autoperfused Microflow Odası Deneyi

Bu akış yapışma deneyi T hücresi epitel hücre etkileşimleri basit, çok etkili bir model sağlar. Bir şırınga pompası kayma gerilimi oluşturmak için kullanılır ve konfokal mikroskopi ölçümü için görüntü yakalar. Bu çalışmaların amacı, etkili akış koşulları kullanılarak T hücre yapışmasını ölçümüdür.

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

Bu el yazması endotele fizyolojik özelliklerini recapitulate mikrodamarlar mühendisi bir enjeksiyon kalıplama yöntemi sunar. Mikroakışkan tabanlı süreç böyle akışı, hücresel kompozisyon, geometri ve biyokimyasal geçişlerini olarak Uyarlanabilen koşullar, patent 3D damar ağları oluşturur. üretim süreci ve potansiyel uygulama örnekleri açıklanmıştır.

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

Vasküler endotel sıkıca lökosit işe alım denetler. Yetersiz lökosit ekstravazasyonu insan inflamatuar hastalıklar için katkıda bulunur. Bu nedenle, roman yasal unsurları endotel harekete geçirmek için arama enflamatuar bozuklukları için geliştirilmiş terapiler tasarlamak gereklidir. Burada, lökosit enflamasyon sırasında kaçakçılığı değiştirebilirsiniz roman endotel düzenleyiciler ayırdetmek için kapsamlı bir metodoloji açıklayın.

Deneyleri roman endotel düzenleyiciler inflamatuvar yanıtta yer alan karakterize etmek için eleme

Lökosit heyecanla damar hücreleri ve trombositlerin damar duvar yaralanma sonra veya enflamasyon sırasında etkileşim. Burada, lökosit ve hücresel eşleri arasındaki etkileşimler altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize etmek için basit bir laminar akış tabanlı tahlil açıklayın.

Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

Burada hemojenik endotel hücrelerinin insan pluripotent kök hücrelerinden yaklaşık 1 hafta içinde yönlendirilmiş farklılaşması için basit bir protokol sunulmaktadır.

Hemojenik Endotel Hücrelerinin İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Yönlendirilmiş Farklılaşması

Burada, pluripotent kök hücrelerin beyin mikrovasküler endotel hücresi (BMEC) benzeri hücrelere farklılaşmasını sağlayan genişletilmiş endotel hücre kültürü yöntemi (EECM) olan bir protokolü açıklıyoruz. Bu hücreler endotel hücre adezyon molekülü ekspresyonunu gösterir ve bu nedenle in vitro immün hücre etkileşimlerini incelemek için uygun bir insan kan-beyin bariyer modelidir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Olgun Bir İmmün Fenotipli Beyin Mikrovasküler Endotel Hücre Benzeri Hücrelere Farklılaşması

Öğrenin, mikrosıvısal tahlil kullanarak hiPSC-EC'lerde lökosit yapışmasını ve inflamatuar yanıtları değerlendirme yöntemini. Bu protokol damar biyolojisi araştırmaları için güvenilir bir yaklaşım sunar.

Mikrosıvısal tahlil endotel hücrelere (hiPSC-ECs) insan indüklenen Pluripotent kök hücre kaynaklı lökosit yapışma değerlendirme için (Video) | JoVE Journal

Mikrosıvısal tahlil endotel hücrelere (hiPSC-ECs) insan indüklenen Pluripotent kök hücre kaynaklı lökosit yapışma değerlendirme için

Daha fazla video keşfet