Mikrosıvısal tahlil endotel hücrelere (hiPSC-ECs) insan indüklenen Pluripotent kök hücre kaynaklı lökosit yapışma değerlendirme için

Adım adım bu iletişim kuralı deneysel kurulum ve inflamatuar hiPSC ECs yanıt-e doğru değerlendirilmesi için veri analizi ve lökosit yapışma fizyolojik akış altında analiz ayrıntılı açıklamasını sağlar.

Bu yöntem insan pluripotent kök hücre biyolojisi alanında insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı endotel hücrelerinin işlevselliği ve inflamatuar yanıtları hakkında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, lökosit adezyonunun insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı endotel hücrelerine değerlendirilmesi için deneysel kurulum ve veri analizinin ayrıntılı bir açıklamasını sağlamasıdır. Mikroakışkan talaş kaplama için steril bir biyoçipi 10 santimetrelik steril Petri kabına yerleştirin ve biyoçipin her kanalına 10 mikrolitre taze hazırlanmış fibronektin çalışma solüsyonu enjekte etmek için 10 mikrolitrelik pipet ucu kullanın.

Petri kabının üzerini kapatın ve bir gece boyunca dört derece nemli bir odaya koyun. Ertesi sabah, 37 derecelik bir inkübatör de biyoçip önceden ısıtın, ve yeniden askıya insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı endotel hücreleri askıya 80 ila% 100 yeni bir endotel hücre serum içermeyen ortamda istenilen konsantrasyonda confluent hücre kültüründen hasat. Daha sonra, mikroakışkan çipin tüm kanallarından fibronektin çözeltisini aspire edin ve her kanala altı mikrolitre hücre enjekte etmek için 10 mikrolitrelik pipet ucu kullanmadan önce hücreleri homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için iyice karıştırın.

Hücrelerin yüksek hücre yoğunluğuile eşit olarak dağıtıldığını doğrulamak için mikroskop altındaki biyoçipi inceleyin. 37 santigrat derecede 15 dakika sonra, her kanalın her iki tarafındaki orta rezervuarlara 40 mikrolitre endotel hücresi serumsuz orta FULL ekleyin. Ve biyoçipi bir saatliğine kuvöze geri ver.

Daha sonra, her kanalın her iki tarafındaki rezervuarlara 50 mikrolitre daha endotel hücresi serumsuz orta FULL ekleyin. Tohumlu hücrelerin canlı görüntülemesi için, mikroakışkan kurulumların hazır olduğunu, canlı görüntüleme odasının 37 santigrat dereceye kadar dengelendiğine ve CO2 seviyesinin %5'e ulaştığını ve biyoçipi mikroskop yongatutucuya yerleştirin ve çip tutucuyu mikroskop görüntüleme aşamasına monte edin. Biyoçipi manifold aracılığıyla pompaya bağlamak için, sekiz iğneli adaptörü çipin çıkış rezervuarlarına yakın bir yere yerleştirin ve pimleri tamamen bağlamadan ortamdaki tüm pimleri derinleştirin.

Mikroakışkan pompa yazılımında, washout/Connect to chip'i seçin ve her pin üzerinden 30 mikrolitre RPMI ortamı dağıtmak için Assay Adımını Çalıştır'ı tıklatın. Sonra biyoçip çıkış içine sekiz iğneli adaptör takın. Biyoçipin tüm giriş rezervuarlarından ortamı el ile aspire etmek için bir pipet kullanın ve ölü hücreleri ve döküntüleri temizlemek için 40 mikrolitre endotel hücresi serumsuz orta tam ile bir seferde bir kanal ayarı yapmak için Washout/Chip Washout ve Run Taht Adım'ı seçin.

Tüm kanallar yıkandığında, 100 mikrolitre insan lökositi ile ilgi kanalının giriş haznesinden gelen ortamı nİVMI ortasında mililitre başına altı hücreye 2,5 çarpı 10'a kadar seyreltilmiş olarak değiştirin. Hücre Atama/Adım açıklamasını tıklatın ve Geçerli Kanal/Adım açıklamasını ayarlayın ve ilgi kanalını Açik'a, diğer yedi kanalı da Kapalı olarak ayarlayın. Hücre Atama Adımı açıklamasını seçin ve Assay Adımını Çalıştır'ı tıklatın.

Giriş haznesinde kalan lökositleri 100 mikrolitre tam RPMI orta ile değiştirin. Ve herhangi bir yapışmaz lökosit kaldırmak için RPMI orta ile beş dakika kanal perfuse hücre Assay Adım ve Çalıştır Assay Adım tıklatın. Daha sonra bağlı lökositleri görselleştirmek için kanaldaki en az üç ila dört farklı pozisyondan görüntüler edinin.

Yapışkan lökositleri ölçmek için CellProfiler görüntü işleme yazılımını açın ve Kont Lökositler Boru Hattı dosyasını içeri aktarın. Giriş modülleri altında Görüntüler'i seçin ve dosya listesi penceresine yapışık lökositlerin ham görüntüleriyle klasörü sürükleyip bırakın. Analiz modülleri altında Birincil Nesneleri Tanımla'yı seçin ve yapışkan lökositlerin piksellerde en az ve maksimal çaplarını gösterir.

Analiz modülleri altında FilterObjects'i seçin. Ardından filtreleme ölçütlerini seçin ve piksellerde nesnelerin en az kabul edilen alanını girin ve analize başlamak için Görüntüleri Analiz Et'i tıklatın. Optimal insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı endotel hücre bölünmesi hücre kümeleri içermeyen tek bir hücre süspansiyonu ile sonuçlanmalıdır.

Tipik olarak, 15 dakika enjeksiyondan sonra endotel hücreleri kanalın altına bağlanır ve yayılmaya başlar. Enjeksiyondan bir saat sonra endotel hücreleri kanal boyunca iyi yayılmış bir monolayer oluşturmalıdır ve bu noktada Akış taliminde kullanıma hazırdırlar. Gösterildiği gibi serbest açık kaynak görüntü işleme yazılımının kullanılması, tanımlanan nesnelerin en az alana göre filtrelemesine ve hücre enkazı, otofloresan veya diğer spesifik olmayan floresan sinyali gibi yanlış tanımlanmış nesnelerin dışlanmasına olanak tanır.

Bu prosedürü çalışırken, pro-inflamatuar sitokinler ile stimülasyon optimize etmek ve pozitif bir kontrol olarak birincil insan umbilikal ven endotel hücreleri dahil hatırlamak önemlidir. Birincil memeli hücre ve hücre hatları ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken laboratuvar paltosu, eldiven ve göz koruması gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.