Name: Anti-mitotik Therapeutics apoptotik yanıtı değerlendirmek için DR3 Overexpressing hücre satırları oluşturma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Öğrenin, retroviral enfeksiyonla DR3 aşırı ekspresyonlu stabil hücre hatları oluşturmayı ve antimitotiklerle apoptozu incelemeyi. Bu yöntem, gen fonksiyonu araştırmaları için güvenilir araçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser hibe 53110000117 (GW için) ve Tsinghua Üniversitesi'nden (X.W. için) 043222019 tarafından desteklenmiştir.

Burada açıklanan tüm fare deneyleri kabul ve uygun olarak kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Tsinghua Üniversitesi'nde gerçekleştirilen lütfen unutmayın.
1. nesil DR3 Overexpression hücre hatları
<ol><li>3 tam uzunlukta DR3 cDNA ekleyerek plazmid DR3 ifade (pMXs-IRES-DR3-bayrak) için inşa x C-terminus retroviral vektör pMXs-IRES-Blasticidin BamHI/XhoI kısıtlama sitelerdeki içine bayrak.</li>
	<li>60 mm yemekleri ile Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal Orta (DMEM) 4 mL hücrelerde Plat-A büyümek. Hücrelerin % 80 - % 90 izdiham ulaştığınız zaman, ertesi gün transfect 2 μg plazmid pMXs-IRES-DR3-bayrağının bulunduğu hücreleri transfection reaktif kullanarak ( Tablo malzemelerigörmek) göre üreticinin el ile20.</li>
	<li>72 h sonra süpernatant toplamak, 0,45 mikron steril filtre kullanarak ortamın filtrate ve viral süspansiyon karanlıkta 4 ° C'de bırakın.</li>
	<li>DMEM 60 mm tabak HT29 hücrelerin büyümesine ve % 5 CO237 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
	<li>Hücreleri % 30 - % 50 izdiham ulaştığınız zaman, ertesi gün 1,5-dimetil-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide viral süspansiyon mililitre başına 8 μg huzurunda viral süspansiyon 2 mL hücrelerle bulaştırmak. Sonra 4-6 h, kuluçka 37 ° C'de, viral süspansiyon Aspire edin, taze DMEM 4 mL ekleyin ve bulaşık kuluçka makinesi için dönmek.</li>
	<li>Yemekler 24 h postinfection medyadan atın ve dikkatli bir şekilde hücreleri prewarmed PBS 2 mL ile yıkayın. Tripsin-EDTA 1 mL hücrelere ekleyin ve 3 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Hücrelerin çoğu ayırdıktan 10 X büyütme, mikroskop altında gözlemleyerek sonra 2 mL ile trypsinization tam DMEM % 10 fetal Sığır serum (FBS) içeren, kes. 15 mL tüp hücre süspansiyon toplamak ve hücreleri 200 x g (RT) Oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet 10 mL DMEM resuspend. De hafifçe yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın. Hücreleri tarafından 30, 100 ve 300 faktörler sulandırmak. Tohum DMEM 1 µg/mL blasticidin içeren 20 mL 150 mm yemeklerin hücrelerde. %5 CO2 37 ° C inkübatör, ~ 1-2 hafta kuluçkaya.</li>
	<li>Bu dönemde, koloniler 10 X büyütme, ters bir mikroskop ile her gün gözlemlemek. Koloni çapı yaklaşık 1-2 mm olduğunda iyi izole kolonileri tabak dibinde işaret.</li>
	<li>Orta Aspire edin ve önceden ısıtılmış PBS 3 mL hücrelerle yıkayın. Tripsin-EDTA 2 mililitre bir 60 mm çanak ekleyin. Autoclaved steril klonlama silindir kadar almak için steril forseps kullanın ve 60 mm çanak yerleştirin. Tripsin-EDTA içeren silindir al ve yavaşça onları üzerinde işaretli kolonilere yerleştirin. Klonlama her silindir sadece bir koloni içerir ve yakındaki koloniler ile kirlenmesini önlemek emin olun.</li>
	<li>Çanak da kuluçka için 3 dakika geri.</li>
	<li>3 dakika sonra ilişkisi kesildi olup olmadığını görmek için 10 X büyütme, mikroskop altında hücreleri denetleyin. Hücreleri kaldırdın, kültür orta 70 μL tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için her silindir için ekleyin. Hücre süspansiyon 200 μL pipet ile karışımı yavaşça. Bu işlem sırasında silindir oynatmamaya emin olun.</li>
	<li>Hücre süspansiyon DMEM 1 mL de başına içeren iki 24-şey tabak her koloni aktarın. Hücre süspansiyon iyi başına 30 μL plaka A ekleyin ve ilgili, 70 μL plaka B. etiket tabakları düzgün kuyuları ve bunları da kuluçka makinesine koy.</li>
</ol>2. DR3 Overexpression hücre kültürünü doğrulanması
<ol><li>Plaka B hücreleri % 90 izdiham olduğunda, medyayı çıkarın ve dikkatle PBS 1 mL hücrelerle yıkayın. Tamamen PBS kaldırmak ve SDS-sayfa yükleme arabellek x 1 50 μL içeren hücreleri parçalayıcı. Hücre lysates 24-şey plaka 1,5 mL santrifüj tüpleri için aktarmak ve örnekleri için 100 ° C'de 10 dakika kaynatın</li>
	<li>Örnekleri % 10 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) jel 80 V 15dk için sabit bir gerilim ve sonra 120 V 1 h için çalıştırın.</li>
	<li>Islak transfer 400 sürekli mevcut sırasında tarafından bir polivinilidin florid (PVDF) membran protein aktarım mA 2 h için.</li>
	<li>DR3 ifade ile Anti-bayrak antikor, bir negatif kontrol (Şekil 1) vahşi tipli HT29 hücreleri kullanarak farklı klonlar test. TBST içinde çözünmüş 5.000 %5 bardakyağsız süt bir faktörle birincil antikor seyreltik (% 0,1 içeren Tris arabelleğe alınmış serum ara-20). Membran ile bayrak antikor 4 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Bu decoloring bir shaker RT. yenileme, 200 devirde üzerinde TBST her 5 dk 15 dk zaman yıkama toplam sallayarak membran TBST ile yıkayın.</li>
	<li>Membran ile Anti-fare ikincil antikor 10.000 %5 bardakyağsız süt için 5-6 h 4 ° C'de bir faktörle seyreltilmiş kuluçkaya.</li>
	<li>Membran adım 2.5 açıklandığı gibi tekrar yıkayın.</li>
	<li>Batılı gelişmiş Kemiluminesan (ECL) substrat kullanarak bayrak ifade algılamak ve membran bir jel dokümantasyon sistemi ile görüntü ( Tablo malzemelerigörmek). Pozitif klonlar DR3 ifade klonlar tanımlayın.</li>
	<li>6-şey plaka plaka B pozitif klonlar için karşılık gelen ve 10 cm yemekleri büyüyen kadar hücreleri yükseltmek devam klonlar plaka A aktarın. Pozitif klonlar büyüyen hücre donmuş hisse senetleri yapmak ve bunları-80 ° c ileride kullanmak üzere saklamak.</li>
</ol>3. Antimitotic ajanlar hücre apoptotik cevaben değerlendirilmesi
Not: Diazonamide tübülin kararsız hale diğer ajanlar21aynalar kanser hücre büyümesini inhibe olağanüstü etkinliğini vardır deniz doğal ürünün yeni bir sınıftır. Ancak, eylem onun modu belirsizdir. Antimitotic ajanlar hücre hücresel yanıt sınamak için paklitaksel ve diazonamide vahşi tipli HT29 hücreleri ve HT29-DR3 hücreleri tedavi etmek için kullanılmıştır. Uyuşturucu dimetil sülfoksit (10 mM stokları yapmak DMSO) çözünmüş ve, sonra daha fazla için farklı konsantrasyonlarda seyreltilmiş: 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1.000 nM, 3000 nM ve 10.000 DMSO nM.
<ol><li>HT29 ve HT29-DR3 hücreleri tarafından trypsinization toplamak. Bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücre yoğunluğu ölçmek. O zaman, iyi başına 3 x 104 hücre yoğunluğu, DMEM 12-şey levha hücrelerde tohum. Ertesi gün 10 nM diazonamide ekleyip %1 DMSO bir negatif kontrol kullanabilirsiniz. Tedavi 48 saat sonra 10 X büyütme (resim 2), mikroskop altında hücreler görüntü.</li>
	<li>Tohum HT29 ve HT29-DR3 DMEM 96-şey levha şey başına 3 x 103 hücre yoğunluğu, hücreleri ve 37 ° C'de gecede büyümeye izin Sonra eklemek diazonamide konsantrasyonları doz tırmanan 0,3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM ve 100 nM % 1 DMSO bir negatif kontrol kullanarak her şey için.</li>
	<li>Tedavi 48 saat sonra üreticinin kılavuzuna göre bir ışıldama tabanlı hücre canlılığı tahlil kit kullanarak hücre canlılığı ölçmek.<ol>
<li>Kuluçka makinesi 96-şey plaka çıkarmak ve RT yaklaşık 30 dakika standı bırakın. Daha sonra her şey için tahlil reaktifler 50 µL plaka hücreleri parçalayıcı 2 min için RT sallamak ve başka bir 10 dk. belirleme ışıldama Mikroplaka Okuyucu (Şekil 3) kullanarak her iyi RT, plaka kuluçkaya ekleyin. Not: Hücre canlılığı her göreli ışıldama yoğunluğu için gösterir bu denetimin de % 1 DMSO ile tedavi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>6-hafta-yaşlı kadın BALB/c Çıplak fareler bir in vivo çalışmada14için kullanın. Not: Fareler patojen-Alerjik belirli koşullarda muhafaza.<ol>
<li>HT29 ve HT29-DR3 hücre trypsinize ve o zaman, 37 ° C'de prewarmed DMEM kullanarak trypsinization bırak Hücre süspansiyon 50 mL tüp içinde toplamak ve hücreler için 10 dk RT. atma süpernatant az 1000 devirde santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet FBS olmadan DMEM ortamda resuspend. Hücreleri tekrar santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet PBS içinde resuspend.</li>
		<li>Bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak ve 2.5 x 10 bir konsantrasyon hücrelere seyreltik7 hücre/mL PBS kullanarak. Tümör HT29 veya HT29-DR3 hücre süspansiyon 200 μL subkutan enjeksiyon yoluyla her fare (5 x 106 hücreler/fare)22sağ kanat oluşturmak.</li>
		<li>Çap pergeli her 2 d sonra nakli kullanarak tümör birimi (TV) ölçmek. Aşağıdaki formülü kullanarak TV hesaplamak: TV = 1/2 L x g x G (burada, W: tümör genişliği, L: tümör uzunluk). Ortalama tümör hacmi yaklaşık 100 mm3ulaştığında, fareler ve denetimi veya tedavi grubu rastgele (n = 6 grup başına) ve tedavi başlatmak.</li>
		<li>Paklitaksel çözüm aşağıdaki gibi hazırlayın. İlk olarak, paklitaksel tamamen etanol toplam hacminin % 5 içinde dağıtılması ve daha sonra %5 polyoxyl 35 son hacminin hidrojene Hint yağı ekleyin. Son olarak, D5W birimle kalan % 90 makyaj (%5 Dekstroz sudaki pH 7,4).</li>
		<li>Paklitaksel 20 mg/kg 3 doz, intravenöz enjekte her iki hafta boyunca. Tümör cilt ve vücut ağırlığı 3 x hafta14ölçmek. Deneme bitirmek ve vücut ağırlığının % 20 oranında azalır veya tümör hacmi yaklaşık 2000 mm3ulaşır hayvanlara ötenazi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Recillas-Targa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+strategies+for+gene+transfer%2C+expression%2C+knockdown%2C+and+chromatin+influence+in+mammalian+cell+lines+and+transgenic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals.</a> Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).</li>
<li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+BCR%2FABL-induced+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Animal models of BCR/ABL-induced leukemias.</a> Leukemia & Lymphoma. 11, 57-60 (1993).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+correction+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+ex+vivo+gene+therapy.+The+New+England%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England.</a> Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).</li>
<li>Roesler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third-generation%2C+self-inactivating+gp91%28phox%29+lentivector+corrects+the+oxidase+defect+in+NOD%2FSCID+mouse-repopulating+peripheral+blood-mobilized+CD34%2B+cells+from+patients+with+X-linked+chronic+granulomatous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease.</a> Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).</li>
<li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+adenovirus+and+its+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Update on adenovirus and its vectors.</a> Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).</li>
<li>Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+heart+gene+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">The evolution of heart gene delivery vectors.</a> The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).</li>
<li>Zhou, J., Giannakakou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+microtubules+for+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry+-+Anti-Cancer+Agents%22%5BJournal%5D)">Targeting microtubules for cancer chemotherapy.</a> Current Medicinal Chemistry - Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).</li>
<li>Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-targeted+agents%3A+when+mitochondria+become+essential+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).</li>
<li>Bhalla, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-targeted+anticancer+agents+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis.</a> Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).</li>
<li>Jordan, M. A., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+as+a+target+for+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microtubules as a target for anticancer drugs.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).</li>
<li>Bhat, K. M., Setaluri, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-associated+proteins+as+targets+in+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).</li>
<li>Bates, D., Eastman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+destabilising+agents%3A+far+more+than+just+antimitotic+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).</li>
<li>Qi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-mitotic+chemotherapeutics+promote+apoptosis+through+TL1A-activated+death+receptor+3+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells.</a> Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).</li>
<li>Marsters, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apo-3%2C+a+new+member+of+the+tumor+necrosis+factor+receptor+family%2C+contains+a+death+domain+and+activates+apoptosis+and+NF-kappa+B%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B.</a> Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).</li>
<li>Chinnaiyan, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+by+DR3%2C+a+death+domain-containing+receptor+related+to+TNFR-1+and+CD95%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95.</a> Science. 274 (5289), 990-992 (1996).</li>
<li>Xu, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+receptor+3+mediates+TNFSF15-+and+TNFalpha-induced+endothelial+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 55, 109-118 (2014).</li>
<li>Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TL1A-induced+NF-kappaB+activation+and+c-IAP2+production+prevent+DR3-mediated+apoptosis+in+TF-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).</li>
<li>Nakayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathways+of+TWEAK-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Multiple pathways of TWEAK-induced cell death.</a> Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).</li>
<li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+cloning%3A+powerful+tools+in+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics.</a> Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).</li>
<li>Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diazonamide+toxins+reveal+an+unexpected+function+for+ornithine+delta-amino+transferase+in+mitotic+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).</li>
<li>Hassan, M. S., von Holzen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Model%3A+Xenograft+Mouse+Models+in+Esophageal+Adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma.</a> Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).</li>
<li>Potter, H., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transfection by electroporation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 9, Unit9 3 (2010).</li>
<li>Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+effects+of+transfection%3A+the+potential+for+misinterpretation+of+gene+expression+data+generated+from+transiently+transfected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells.</a> Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).</li>
<li>Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+responses+in+the+HeLa+proteome+subsequent+to+transient+plasmid-mediated+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).</li>
<li>Omidi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+the+toxicogenomics+and+the+genotoxic+potential+of+a+cationic+lipid-based+gene+delivery+nanosystem+in+human+alveolar+epithelial+a549+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Mechanisms+and+Methods%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar bildirmek için bir şey yok.

Bu makale, HT29-DR3 istikrarlı hücre satırlarını oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. HT29-DR3 hücreleri bir moleküler mekanizmaları tarafından antimitotic aracıları tarafından indüklenen apoptosis DR3 katkıda çalışmak için sağlar. Bu yaklaşım çok yönlü ve tekrarlanabilir. Yordamın başarılı olmasını sağlamak için Protokolü'nün dört anahtar adımlar dikkate alınması gerekir. İlk olarak, bir yüksek üretmek için yeterli virüs titresi bu Plat-A hücreleri % 80 - % 90 izdiham ne zaman DNA transfection gerçekleştirmek içi...

Kapaklı gen ekspresyonu kez ilgi genlerin fonksiyonun çalışmaya istihdam edilmektedir. İki yöntem, geçici ve istikrarlı transfection, hücre ve moleküler biyoloji DNA veya RNA bir parçasını bir konak hücre1,2eklemek için yüksekokul kullanılır. Genetik değişiklik yalnızca kısa bir süre için muhafaza edilebilir böylece geçici transfected DNA veya RNA kızı hücrelere geçirilemez. Öte yandan, stabil transfected hücrelerde eksojen genler ifadesini hücre içinde sürdürülmesi konak hücre genomu içine entegre edilmiştir. Böylece, istikrarlı transfection genellikle ayrılmış bir araştırma içine uzun vadeli genetik düzenleme yöntemidir. Xenografts in vivo modellerinde fare içine3çalışma olarak istikrarlı hücre kültürünü de nakledilen. Kararlı transfection iki kategoriye ayrılabilir: viral ve nonviral. Nonviral transfection için karşılaştırıldığında, viral enfeksiyon genler bir daha yüksek verimlilik4,5,6,7ile insan hücreleri daha çok içine aktarabilirsiniz. Ayrıca, tek bir klon istikrarlı hücre satırından homojenliği ve klonal saflık avantajı sunar.
Kontrolsüz hücre büyümesi ve bölünme kanser en ayırt edici özellikleri vardır. Klinik ayarları'nda, adl tip-in tümör8için birincil tedavi antimitotic ajanlardır. Ancak, bazı önemli kısıtlamalar antimitotic ajanların göz ardı edilemez. İlk olarak, bu chemotherapies istenmeyen kanserli hücreleri ile birlikte normal hücreleri de öldürebilir ve böylece, ciddi yan etkileri8' de neden olabilir. İkinci, antitubulin ilaçların tümörler, tübülin'ın her yerde ifade birçok farklı dokuların bir hücre iskeleti protein9,10olarak rağmen her türlü karşı etkili değildir. Antitubulin ajanlar karşı umut verici etkinlik gösterdi neden o belirsizdir yumurtalık, akciğer ve hematolojik kanser klinik tedavi, ancak değil böbrek, iki nokta üst üste ya da pankreas kanserlerinin11. Son olarak, hatta hastalarda tümör aynı tip antimitotics için farklı beklenmedik bir şekilde yanıt verebilirsiniz. Farklı hastaların klinik tedavi12' görülen farklı sonuçlar elde antimitotic ajanlara duyarlılığını etkiler bir anahtar efektör molekül olabilir. Böylece, potansiyel fark hassasiyetleri antimitotic tedaviye hastaların tedavi müdahaleler13en iyi duruma getirmek için dikkate alınmalıdır.
Bir yüksek-den geçerek tüm-genom siRNA kitaplık ekranı DR3 nakavt hassas hücreler bir rol DR3 için kemoterapi kaynaklı apoptosis14' te göstermek için antimitotic ilaçlara dirençli hale gösterdi. Tümör nekroz faktör reseptör (TNFR) süper bir üyesi olarak, hücre apoptosis çeşitli sistemleri15,16,17,18arabuluculuk DR3 bildirilmiştir. Böylece, biz kararlı hücre hatları DR3 hangi apoptosis antimitotic uyuşturucu neden moleküler mekanizmaları incelemek için overexpressing kurmak için yola çıktı. DR3 overexpression çalışmak için bir uygun hücre modeli insan kolon kanseri hücre satırı DR3 eksikliği bulundu HT29 ile sağlanabilir. Ayrıca, klinikte, Kolon kanserlerinin duyarsız antimitotic uyuşturucu19.
Bu makalede, bir HT29-DR3 istikrarlı cep hattından retroviral enfeksiyon nesil sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Biz daha fazla western Blot kullanarak bu hücrelerde DR3 ifade doğrulamak ve antimitotic ajanlara duyarlılık bir hücre canlılığı tahlil ve morfolojik gözlem kullanarak değerlendirmek gösterir. Hücreler tek klonlar güçlendirilmiş ve böylece, homojen bir genetik arka plan avantajına sahip. Buna ek olarak, DR3 bayrak etiketinde hücresel DR3 görselleştirme için mikroskobu ve gen ifade ve protein etkileşim analizi tarafından biyokimyasal yaklaşım izin. Ayrıca, hücreler tümör ilerleme antimitotics vivo içinde14yanıt olarak daha ileri düzeyde çözümlemek farelerde xenografted olabilir.
Burada sunulan HT29-DR3 hücre sistemi nasıl antimitotics kanser hücreleri14öldürmek moleküler mekanizmaları eğitim için etkili bir araç teklif etti. Overexpression ve devirme hücre hatları gen fonksiyon türleri çalışmak için yaygın araçları olduğundan, bu iletişim kuralı kolayca adapte faiz veya diğer hücre satırları diğer genler ve böylece, yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım döndü.

<table><tbody><tr>%<td>10 FBS ve %1 Penicilin/Streptomisin ile Takviyeli</td> <td>DMEM</td><td>İnvitrojen</td><td>C11965500BT</td></tr><tr><td>Lüminesan Hücre Canlılık Testi</td><td>Promega</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>Paklitaksel</td><td>Selleck</td><td>S1150</td><td></td></tr><tr><td>pMXs-IRES-Blasicidin</td><td>Hücre Biyolabs</td><td>RTV-016</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>İnvitrojen</td><td>C14190500BT</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.25)</td> <td>İnvitrojen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>1,5-Dimetil-1,5-diazaundekametilen polimetobromür</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-134220</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare ikincil antikoru</td><td>Jackson ImmumoResearch</td><td>115-035-166</td><td></td></tr><tr><td>anti-Bayrak antikoru</td><td>Sigma</td><td>F-3165</td><td></td></tr><tr><td>HT29 hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>plat-A hücre hattı</td><td>Hücre Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Immobilon-P</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Klonlama Silindiri</td><td>Sigma</td><td>C1059</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Görüntüleme Çok Modlu Okuyucu</td><td>Biotek</td><td>BTCYT3MV</td><td></td></tr><tr><td>CKX53 Ters Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>12 oyuklu hücre kültürü plakaları</td><td>Yuva</td><td>712001</td><td></td></tr><tr><td>60 mm hücre kültürü plakaları</td><td>Yuva</td><td>705001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL santrifüj tüpleri</td><td>yuva</td><td></td><td></td>601052</tr><tr><td>0.22 & mu; m steril filtre</td><td>Milipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5810000327</td><td></td></tr><tr><td>96 Kuyu Beyaz Polistiren Mikroplaka&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3903</td><td></td></tr><tr><td>Batı ECL Yüzey</td><td>BIO-RAD</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000</td><td>GE Sağlık Hizmetleri</td><td>ImageQuant LAS 4000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Renk Açıcı Çalkalayıcı&nbsp;</td><td>HINOTECH</td><td>TS-2000A</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl-1</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik hücre sayacı</td><td>BIO-RAD</td><td>TC 20</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr></tbody></table>

anti-mitotik therapeutics apoptotik yanıtı değerlendirmek için dr3 overexpressing hücre satırları oluşturma

Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics

Işlev bir genin ilgi eğitim seviyesine ifadenin, ifadesini devirme hücre hatları ile azalan veya artan ifadesini overexpression hücre hatları ile gibi manipüle ederek elde edilebilir. Geçici ve istikrarlı transfection eksojen gen ekspresyonu için sık sık kullanılan iki yöntem vardır. İse nerede sürekli olarak belirtilecektir konak hücre genomu entegre olmak eksojen genler istikrarlı transfection sağlar geçici transfection sadece kısa vadeli ifade için yararlıdır. Sonuç olarak, istikrarlı transfection genellikle araştırma için uzun vadeli genetik düzenleme istihdam edilmektedir. Burada etiketli ölüm reseptör 3 (DR3 DR3 işlevi keşfetmek için) overexpressing bir istikrarlı hücre satırı oluşturmak için basit bir protokol açıklayın. Tek klonlar retroviral bir enfeksiyondan sonra homojenliği ve istikrarlı hücre hatları saflığı korumak için aldık. Bu iletişim kuralı kullanılarak oluşturulan istikrarlı hücre hatları DR3-eksik HT29 hücreleri hassas antimitotic ilaçlara, böylece HT29 hücreleri apoptotik yanıtta başlamaktan render. Ayrıca, DR3 bayrak etiketinde iyi DR3 antikor kullanılamamasıdır için dengeler ve hangi tarafından apoptosis antimitotic ajanlar neden moleküler mekanizması biyokimyasal çalışma kolaylaştırır.

Stabil DR3 ifade HT29 hücrelerin karakterizasyonu Şekil 1' de gösterilen. Bir negatif kontrol hizmet, vahşi-türü hücre eksojen gen ekspresyonu gösterme iken klonlar DR3, çeşitli düzeylerde hızlı. Burada sadece beş klonlar, göstermek aralarında 1 clone ve 5 DR3 en üst düzeyde ifade eder. Klon 1 ve 5 aşağıdaki deneyler için seçtik.
Diazonamide yönetim sonra HT29 ve HT29-DR3 hücre morfolojisi 10 X büyü...

Bir gen gen işlev eğitim ilgi overexpressing bir istikrarlı hücre kültürünü kuran istikrarlı transfection-toplama tek klonlar tarafından via retroviral enfeksiyon transfecting sonra yapılabilir. İşte bu şekilde oluşturulan HT29-DR3 hücre hatları tarafından hangi ölüm reseptör 3 (DR3) antimitotics kaynaklı apoptosis katkıda mekanizmaları aydınlatmak göstermektedir.

Anti-mitotik Therapeutics apoptotik yanıtı değerlendirmek için DR3 Overexpressing hücre satırları oluşturma

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell ...

Hücrelerdeki genlerin aşırı ifade etmesi gen fonksiyonlarını incelemenin önemli bir yoludur. Retrovirüs ile stabil transfeksiyon endojen genlerin konak genomuna entegre olmasını ve sürekli olarak ifade edilmesine olanak sağlar. Retroviral enfeksiyonun tek kolonilerini tespit ettik ve FLAG etiketli DR3'ü aşırı ifade eden sabit hücre hatları oluşturduk.Hücre hatları iyi DR3 antikor yetersizliği telafi ve DR3 fonksiyon çalışma sonrası in vitro ve in vivo için mükemmel araçlar sağladı. Retroviral enfeksiyonun tek bir kolonisini tespit ederek DR3 aşırı ekspresyon hücre hatlarını oluşturduk. Tek koloniden gelen hücre hatları homojenliği ve saflığı koruyabilir.Buna ek olarak, protokol kullanımı kolay ve basittir. Bu prosedüre başlamak için, dört mililitre DMEM ile 60 milimetrelik yemeklerde plat-A hücrelerini bir gecede büyütün. Hücreler %80 ila %90 birleştiğinde, üreticinin kılavuzunda belirtildiği gibi iki mikrogram inşa plazmid ile transfeksiyon reaktifi kullanın.72 saat sonra, supernatant toplamak. 0,45 mikrometre steril filtre kullanarak, ortamı filtreleyin ve viral süspansiyonu dört santigrat derecede karanlıkta tutun. Daha sonra, DMEM ile 60 milimetrelik bir çanak bir gecede HT29 hücreleri büyümek, 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile hücreleri kuluçka.Hücreler %30 ila %50 birleştiğinde, mililitre viral süspansiyon başına sekiz mikrogram polibren varlığında iki mililitre viral süspansiyon ile enfekte edin. Enfekte hücreleri 37 derecede 4-6 saat kuluçkaya yatırın. Sonra, viral süspansiyon aspire.Dört mililitre taze DMEM ekleyin ve kabı kuvöze geri verin. Enfeksiyon sonrası 24 saat, bulaşıkları medya kaldırmak ve dikkatle önceden ısıtılmış PBS iki mililitre ile hücreleri yıkayın. Bir mililitre tripsin EDTA ekleyin ve hücreleri 37 derecede üç dakika kuluçkaya yatırın.10 kat büyütme bir mikroskop kullanarak, çoğu müstakil olduğundan emin olmak için hücreleri gözlemleyin. Bundan sonra, tripsinizasyonu durdurmak için %10 FBS içeren iki mililitre DMEM ekleyin ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpte toplayın. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 kez g santrifüj ve supernatant çıkarın.Hücre peletini 10 mililitre DMEM'de yeniden askıya alın ve karıştırmak için hafifçe pipet yukarı ve aşağı. Daha sonra, 30, 100 ve 300 faktörleri ile hücreleri seyreltin. Tohum hücreleri her mililitre başına bir mikrogram konsantrasyonda blasticidin içeren DMEM 20 mililitre içeren 150 milimetrelik yemekler.Yaklaşık bir ila iki hafta boyunca % 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede kuluçka. Bu dönemde, kolonileri her gün gözlemlemek için 10 kat büyütme de ters bir mikroskop kullanın. Kolonilerin çapı yaklaşık 1-2 milimetre olduğunda çanak altındaki iyi izole edilmiş kolonileri işaretleyin.Kuluçka süresi tamamlandığında, orta aspire ve önceden ısıtılmış PBS üç mililitre ile hücreleri yıkayın. 60 milimetrelik bir tabağa iki mililitre tripsin EDTA ekleyin. Otoklavlı steril klonlama silindirlerini almak ve bunları tabağa yerleştirmek için steril çifenler kullanın.Sonra, şimdi her tripsin EDTA yaklaşık 30 mikrolitre içerecek silindiralmak ve yavaşça işaretli koloniler üzerinde yerleştirin. Yemeği üç dakika boyunca kuvöze geri verin. Bundan sonra, bir mikroskop altında hücreleri kontrol edin onlar müstakil olduğundan emin olmak için.Hücreler kalktığında, 70 mikrolitre kültür de tripsin inaktive etmek için her silindire orta. Hücre süspansiyonuna hafifçe karıştırmak için 200 mikrolitrelik pipet kullanın ve karıştırma sırasında silindiri hareket ettirmemeye özenin. İki adet 24 kuyuluk plaka yışın ve her kuyuya A ve plaka B.Add bir mililitre DMEM ekleyin.A plakasının her kuyuya 30 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve B plakasının ilgili kuyularına 70 mikrolitre ekleyin. B plakasındaki hücreler %90 birleştiğinde, ortamı çıkarın ve hücreleri bir mililitre PBS ile dikkatlice yıkayın. PBS tamamen kaldırıldı ve hücreleri lyse için 1X SDS-PAGE yükleme tampon 50 mikrolitre ekleyin.Beş dakika sonra hücre lisatını 24 kuyulu plakadan 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın. Örnekleri 100 derecede 10 dakika kaynatın. Örnekleri 15 dakika boyunca 80 volt sabit voltajda %10 SDS jel üzerinde ve ardından 120 voltta bir saat çalıştırın.Daha sonra proteini iki saat boyunca 400 miliamperlik sabit bir akımla ıslak aktarım la poliviniliden florür membranına aktarın. TBST'de çözünmüş olan yağsız sütte primer antikor5,000 faktörle seyreltin. Flag antikorını membrana ekleyin ve bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın.200 RPM'ye ayarlanmış renklendirici bir çalkalayıcı kullanarak membranı TBST ile 15 dakika yıkayın ve Her beş dakikada bir TBST'yi yenileyin. Daha sonra, %5 yağsız sütte 10,000 faktörile fare karşıtı ikincil antikor seyreltin. Membranı seyreltilmiş sekonder antikorla beş ila altı saat boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Daha önce açıklandığı gibi tekrar renklendirme shaker üzerinde membran yıkayın. Bundan sonra, membran görüntü ve FLAG ifade algılamak için Batı gelişmiş kemilüminesans ve jel dokümantasyon sistemi kullanın. İlk olarak, hem HT29 hem de HT29-DR3 hücrelerini trypsinization ile toplayın ve hücre yoğunluğunu ölçmek için otomatik hücre sayacı kullanın.Hücreleri, kuyu başına 30,000 hücre yoğunluğunda DMEM ile 12 kuyulu plakaların kuyularına tohumlar ve %5 karbondioksitle bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, negatif kontrol olarak% 1 DMSO kullanarak hücreleri içeren her kuyuya diazonamide 10 nanomolar ekleyin ve% 5 karbondioksit ile 37 derece santigrat bir kuvöz plakaları aktarın. 48 saatlik tedaviden sonra, hücreleri mikroskop altında 10 kat büyütülebilir şekilde görüntüleyin.Daha sonra, hem HT29 hem de HT29-DR3 hücrelerini dmem ile 96 kuyulu plaka kuyularına, her kuyuda 3.000 hücrenin yoğunluğuna yerleştirin ve bir gecede 37 derecede büyümelerini bekleyin. Ertesi gün, metin protokolünde belirtildiği gibi doz arttıran diazonamide konsantrasyonları ekleyin. 48 saatlik tedaviden sonra, hücrenin canlılığını ölçmek için parlaklık bazlı hücre canlılığı test kiti kullanın.96 kuyulu plakayı kuvözden çıkarın ve yaklaşık 30 dakika oda sıcaklığında bekletin. Daha sonra her kuyuya 50 mikrolitre ar-geri satım ekleyin ve hücreleri yıkamak için oda sıcaklığında iki dakika boyunca tabağı sallayın. 10 dakika oda sıcaklığında plaka kuluçka ve sonra her kuyunun parlaklık belirlemek için bir mikroplaka okuyucu kullanın.DR3'ü ifade eden HT29 hücrelerinin karakterizasyonu, klonların farklı DR3 düzeylerini ifade ederken, yabani tip hücrelerin eksojen gen ekspresyonu göstermediğini ortaya koymaktadır. Genler bir ve beş DR3 en yüksek düzeyde ifade etmek için görülür, ve böylece daha fazla deney için seçilir. HT29 ve HT29-DR3 hücrelerinin morfolojisi diazonamid ile 48 saat tedavi edildikten sonra gözlenir.HT29-DR3 hücreleri kırık bir hücre zarı ve hücre enkazı ile bariz apoptoz görüntüler. Ancak, HT29 hücreleri bir yuvarlak hücre şekli sergileyen bozulmamış hücreleri ile sadece mitotik arrest göstermektedir. Bu hücre tiplerinin hücre canlılığı daha sonra diazonamide üç nanomolar ile 48 saat tedavi edildikten sonra belirlenir.HT29-DR3 hücrelerinde hücre ölümü %80'in üzerinde görülürken, ebeveyn HT29 hücreleri mitotik arrest şeklinde sadece hafif bir yanıt gösterir. Bu, DR3'ün aşırı ekspresyonunun bu hücrelerdeki diazonamide bağlı apoptotik yolu yeniden oluşturduğunu gösterir. Uygun seri seyreltmeler tek klonların optimum yoğunluk elde etmek için önemlidir.Ayrıca her klon silindirsadece bir koloni içerdiğinden emin olmak ve yakındaki koloniler kirletici önlemek için önemlidir. DR3 aşırı ekspres hücre hatları in vitro moleküler mekanizmaların biyokimyasal çalışma kolaylaştırdı. HT29-DR3 hücrelerinin deri altı enjeksiyonu ile HT29-DR3 ksenogreftleri ürettik ve in vivo'da antimitotik ajanlara bağlı apoptoz mekanizmalarının ayrıntılı olarak geliştirilmesine yardımcı oldu.Bu protokol diğer hücre hatlarında ilgi genleri incelemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, gen nakavt fonksiyonel çalışma için başka bir yoldur, ve protokolümüz gen nakavt sistemlerine adapte edilebilir. Bu nedenle, genellikle gen fonksiyonlarını açıklamak için geçerlidir.Virüs rölesini güvenlik bertarafı için belirli konteynerlere çöplere bırakmayı unutmayın.

establishing-cell-lines-overexpressing-dr3-to-assess-apoptotic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Biz aşırı ekspresyonu veya shRNA insan Ramos B-hücre hattı ve bu hücrelerin nasıl somatik hipermutasyon ölçmek için yapıları içeren. Retroviral veya lentiviral enfeksiyonları nasıl gerçekleştirileceği...

Spesifik genlerin aşırı ekspresyonu veya demonte sonra Ramos B Hücreleri somatik hipermutasyon Değerlendirilmesi

E4orf4 ile uyarılan hücre ölümüne ACF kromatin yeniden faktör katkı ölçüldü. Protokol doksisiklin tedavi ACF alt birimleri ACF1 ve SNF2h koşullu devirme neden olduğu hücre klonlarının seçimi içermektedir, ve indüklenebilir hücre hatlarında E4orf4 ile uyarılan hücre ölümü ölçmek için DAPI tahlil kullanımı.

E4orf4 Bağlı Hücre Ölümü üzerine Nakavt Etkilerinin Gen Ekspresyonu ve Ölçüm Şartlı Nakavt için Hücre hatları hazırlanması

Mitoz geçiren kanser hücrelerinde fenantridin PJ-34 sitotoksik aktivite canlı konfokal görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak belgelenmiştir. PJ-34 eradike insan meme kanseri MDA-MB-231 mitoz İlave sentrozom barındıran hücreler. Normal iki odak mitoz farklı olarak, ekstra-sentrozom PJ-34 varlığında iki kutup mili kümelenmiş değildi.

Anormal Mitoz ile İlişkili Hücre Ölümü Canlı Kanser Hücreleri Konfokal Görüntüleme Uyacakları

Burada, bitişik ölü veya ölmekte olan hücrelerle fiziksel etkileşim yoluyla canlı hücrelerde indüklenen hücre içi sinyal olaylarının belirlenmesi için bir protokol sunuyoruz. Protokol, fagositik alımlarının veya çözünür aracıların salınmasının aksine, ölü hücrelerin reseptör aracılı tanınmasıyla indüklenen sinyal olaylarına odaklanır.

Hücre içi Komşu maruz kalan hücreler, apoptotik hücre ölümü ile etkileşim yoluyla canlı hücreler İndüklenen sinyal olaylarının tanımlanması

Biz burada pre-harekete geçirmek CD8 sitotoksisite araştırmak için bir protokol tarif+ T hücreleri kanser hücrelerine karşı apoptotik kanser hücreleri aracılığıyla gerçek zamanlı mikroskobu tespit ederek. Bu protokol mekanizmaları myeloid hücre kaynaklı T hücre bastırma arkasında araştırmak ve T hücreleri ile abluka bağışıklık baskılayıcı myeloid hücre yenileyici amaçlı bileşikler değerlendirmek.

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya

Bu kağıt akış sitometresi-tabanlı bir tahlil kimyasal inhibitörleri ekran kitaplıklarına inhibitörleri ve T hücre reseptör sinyal etkileyen hedefleri tanımlaması için kullanır. Yöntem tanımlamak burada da yüksek üretilen iş gösterimleri için genişletilebilir.

T-hücre reseptör üzerinden tarama kimyasal inhibitörü kütüphanelerin sinyal arabulucu tanımlaması

Burada, 2D kültürden çok daha iyi in vivo tümörlerin fiziko-kimyasal degradelerini taklit eden 3D kanser hücresi kürelerinin içinde canlanıyor ve ölümü değerlendirmek için birkaç basit yöntem sunuyoruz. Bu nedenle, küroid modeli, kanser ilaç etkinliğinin değerlendirilmesi için gelişmiş çeviri ile in vivo koşullara izin verir.

Hücre viability ve ölüm kanser hücrelerinin 3D Küroid kültürlerde değerlendirilmesi

Protokol, genetik olmayan kusurlu transkripsiyon uzaması için in vitro murine karsinom modelini ayrıntılarıyla anlatır. Burada, CDK9 kronik inhibisyonu taklit etmek ve klinik olarak aşırı TEkesinlikle fenomen çalışma pro-inflamatuar yanıt genleri boyunca RNA Pol II üretken uzama bastırmak için kullanılır, tüm kanser türlerinin yaklaşık% 20 mevcut.

Kanserlerde Yaygın Genetik Olmayan TranskripsiyonEl Uzaması Defektlerini (TEkesinlikle)Incelemek için Kronik CDK9 İnhibisyonu Bir Murine Hücre Hattı Tabanlı Modeli

Burada immünohistokimya için formalin-sabit, parafin-gömülü hücre pelet kontrolleri oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır.

Formalin-Sabit, Parafin-Gömülü Hücre Pelet İmmünohistokimya Kontrolleri için Standartlaştırılmış İşleme

Burada, antitümör antikorların önemli bir kanser hücresi öldürme mekanizması olan ADCC mekanizmasını modüle eden bileşikleri tanımlamak için bir yöntem sunuyoruz. NK hücrelerinin sitotoksik etkisi, Trastuzumab varlığında meme kanseri hücre sferoidlerinde ölçülür. Görüntü analizi, sferoidlerdeki canlı ve ölü öldürücü ve hedef hücreleri tanımlar.

Bir Tümör Sferoid Modelinde Antikora Bağımlı Hücresel Sitotoksisitenin Ölçülmesi: İlaç Keşfi Uygulaması

Öğrenin, retroviral enfeksiyonla DR3 aşırı ekspresyonlu stabil hücre hatları oluşturmayı ve antimitotiklerle apoptozu incelemeyi. Bu yöntem, gen fonksiyonu araştırmaları için güvenilir araçlar sunar.

Anti-mitotik Therapeutics apoptotik yanıtı değerlendirmek için DR3 Overexpressing hücre satırları oluşturma

Daha fazla video keşfet