Name: CRISPR-Cas9-tabanlı rekabet deneyleri kullanarak genetik bağımlılıkları incelenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Keşfedin, CRISPR-Cas9 ve akış sitometrisine dayalı rekabetçi büyüme analizi kullanarak AML hücrelerinde çoklu gen bağımlılıklarını paralel olarak incelemeyi. Bu hızlı ve ölçeklenebilir yöntem, kanser hücre hatlarında gen fonksiyonlarını değerlendirmek için uygulanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PCW-Cas9 plazmid Eric Lander & David Sabatini (Addgene plazmid # 50661) ve pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - hediyesiydi W plazmid Yusa laboratuarından (Addgene plazmid #67974. Akış Sitometresi çekirdek SBP tıbbi Discovery Enstitüsü'nde akışı analizi ve sıralama ile zamanında yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bayan Tata Anıtı Vakfı A.D. için destek kabul etmek istiyoruz Ayrıca aşağıdaki finansman kaynakları destek kabul etmek istiyoruz: NIH/ncı P30 CA030199 Kanser Merkezi Grant sponsorluğunda, V-Vakfı ve San Diego ncı kanser merkezleri (C3) #PTC2017to A.J.D.

1. üreten AML hücre satırı klonlar istikrarlı ve etkin Cas9 yüksek ifadesi ile
<ol><li>Cas9 lentivirus imalatı
	<ol>
<li>0. gün: 10 mL (BSL2) DMEM % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve penisilin ve L-glutamin bir 10 cm doku kültürü tabak içinde bir Biyogüvenlik seviye 2 ile plaka 4 x 106 293T hücrelerde hücre kültür hood sertifikalı. Çanak 37 ° C kuluçka makinesine koyun.</li>
		<li>1. gün: Kaplama 293T hücreleri % 70 – 80 birleşmesi 1 gün olmalıdır. Öğleden sonra aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak transfection gerçekleştirin.</li>
		<li>Transfection orta, Kültür Medya ve transfection reaktif için oda sıcaklığında ısıtın. Transfection için tüm gerekli plazmid çözülme.</li>
		<li>PsPAX2, pMD2.G, 0.9 µg ve pLenti-Cas9 plazmid 9 µg transfection orta 5 mL tüp içinde 500 µL ile mix 9 µg.</li>
		<li>14 ml Yuvarlak alt tüp transfection orta 1.7 mL ekleyin. Transfection reaktif 57 µL doğrudan tüp duvarına dokunmaktan kaçının için tüp transfection ortamda içine ekleyin.</li>
		<li>Yavaşça tüm plazmid mix transfection reaktif ekleyin ve hafifçe yan tüp dokunarak karıştırın. 20-30 dakika oda sıcaklığında karışımı kuluçkaya. Bu arada, orta numaralı seribaşı 293T plaka değiştirin.</li>
		<li>Transfection karıştırmak dropwise plaka ekleyin ve hafifçe etkili karıştırma için yan plaka rock. Plaka 37 ° C kuluçka makinesine koyun.</li>
		<li>2. gün: hücreleri değil rahatsız veya plaka yerinden süpernatant transfection plaka yavaşça Aspire edin. Süpernatant atmak. 10 mL taze % 10 DMEM orta aşağı yavaşça hücreleri kekii önlemek için plaka taraftan kaydırarak ekleyin.</li>
		<li>3. gün: transfection plaka süpernatant yavaş yavaş içeren 10 cm steril enjektör çizerek virüs toplamak. Süpernatant şırınga toplandıktan sonra steril 0,45 µM filtre şırıngaya takın ve şırınga ve filtre bir taze, steril 15 mL polipropilen konik tüp üzerinde tutun. Yavaşça süpernatant 0,45 µM filtreden 15 mL polipropilen konik tüp içine içeren virüs filtre uygulamak için şırınga Dalma.</li>
		<li>Viral şartına orta aliquots 2 ml her birinin 2 mL cryovials-80 ° C'de depolayın</li>
	</ol></li>
	<li>AML hücresi satırlarının iletim
	<ol>
<li>Gün -1: 1 mg/mL rekombinant insan fibronektin parçası stok 10 µg/ml steril fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile sulandırmak. Kat sigara doku kültürü onaylı BSL2 hücre kültür mahallede 6 iyi plaka 2 mL 10 µg/mL rekombinant insan fibronektin parça çalışma çözeltisi ile tedavi. Plaka gecede buharlaşma ve mağaza oda sıcaklığında kaybını önlemek için sarılmak şal şal.</li>
		<li>0. gün: Cas9 içeren viral süpernatant çözülme. Rekombinant insan fibronektin parçası çözüm tamamen kaplı kalenin hemen önce spinfection Aspire edin. Cas9 ile viral şartına Orta 2 mL plaka ekleyin ve 1.300 x g 35 ° C'de 90 dk için de spin Bu viral parçacıkların spinfected iyi eklemek yardımcı olur.</li>
		<li>Bu arada, transduced için hücreleri saymak ve 2 x 106 hücre 15 mL polipropilen konik tüp içinde aşağı spin. Süpernatant Aspire edin ve Pelet 2 mL taze kültür ortamının resuspend.</li>
		<li>Spinfection sonra tüm viral süpernatant spinfected de kaldırmak ve atın. Retroviral parçacıkları süpernatant de spinfected altına eklenir. Bu, yukarıdaki adımı ortamından 2 ml resuspended 2 x 106 hücre ekle.</li>
		<li>Plaka 1.300 x g çok kısa bir süre (1-2 dk) hücreleri altındaki yerleşmek izin vermek yeterli, tekrar çevir. Plaka da kuluçka yerleştirin ve gece kuyuya bağlı spinfected viral parçacıkların ile iletim için bırakın.</li>
		<li>1. gün: hücre yoğunluğu bağlı olarak aşırı büyüme önlemek için transduced hücrelere daha fazla orta ekleme.</li>
		<li>2. gün: pLenti-Cas9 plazmid Blasticidin direnç işaretçisi olduğundan, 10 µg/mL doz (kontrol) MOLM13 transduced ve untransduced adlı Blasticidin veya fare MLL AF9 lösemi hücreleri hücre ifade Cas9 seçimi için ekleyin. Not: Ne zaman tüm untransduced kontrol hücreleri ortadan Cas9 transduced MOLM13 veya MLL AF9 lösemi hücreleri Blasticidin yelpazesi tam olarak kabul edilir. Böylece optimal bir doz istihdam MOLM13 ve MLL AF9 lösemi dışında hücre hatlarında bir doz yanıt eğrisi bu deneme önce gerçekleştirilmelidir. Titrasyon, viral süpernatant da düşük iletim hızları durumunda gerçekleştirilebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Yüksek-Cas9 ifade hücrelerin seçimini klon. Not: Biz bazı AML hücre hatlarında klon seçimi gerekli olmayabilir fark etmişsinizdir: toplu Cas9-Blasticidin seçili nüfus zaten yüksek verim genom düzenleme vardır. Bu durumda, adım 1.3 atlamak ve western Blot tarafından Cas9 ifade toplu Cas9-blasticidin AML hücrelerinde değerlendirmek için adım 1.4 için devam etmek mümkündür. Hala gen düzenleme verimliliği rekabet deneyleri için devam etmeden önce bu toplu Cas9-AML hücrelerdeki (adım 1.5) değerlendirmek önemli olacaktır. Tek yüksek-Cas9 klonlar yelpazesi farklı tek Kılavuzu RNA'ların (sgRNAs) bir dizi test ederken özellikle önemlidir genom düzenleme değişkenliği azaltır tahmin.<ol>
<li>Tek hücreli bir nevi Cas9 Blasticidin adı bundan böyle MOLM13-Cas9 ve MLL-AF9-Cas9 hücreleri, sırasıyla, MOLM13 ve MLL AF9 lösemi hücreleri onaylı BSL2 mahallede bulunan bir FACS sıralayıcısı kullanarak seçili gerçekleştirin. Sıralama 5 – 10 yuvarlak alt doku kültürü tedavi 96 iyi kalıplara gerçekleştirilebilir.</li>
		<li>Bir kez MOLM13-Cas9 tek ve MLL-AF9-Cas9 klon seçilmiş ve tek tek adında, 10-20 klonlar 10 µg/mL Blasticidin kültür Cas9 ifade bakım sağlamak için medya ile genişletin.</li>
	</ol></li>
	<li>İfade istikrarlı Cas9 protein immunoblotting tarafından kontrol edin.
	<ol>
<li>MOLM13 ve MLL AF9 lösemi nükleer ekstraksiyon kiti başı olarak üreticinin iletişim kuralını kullanan tüm seçili Blasticidin klonların nükleer özleri olun. Cas9 protein ifade Anti-bayrak m2 antikor pLenti-Cas9 plazmid Cas9 beri bir N-terminal bayrak epitope bağlı kullanarak kontrol edin.</li>
		<li>Toplam protein 50 µg her nükleer özü Bis-Tris jel ve üst grup de ayrılır kadar 120 V jel çalıştırmak % 10 üzerine yükleyin.</li>
		<li>Membran TBST arabellek için 1s içinde %5 süt çözelti ile engelleyin.</li>
		<li>Membran ile Anti-bayrak M2 antikor gecede 4 ° C'de 1 µg/mL nihai bir konsantrasyon, 1:1,000 seyreltme kuluçkaya.</li>
		<li>Ertesi gün, membran TBST arabellek ile yıkama ve 1:5,000 (son konsantrasyon 0,16 µg/mL) 1 h için oda sıcaklığında bir seyreltme, HRP konjuge anti-fare ikincil antikor ile kuluçkaya.</li>
		<li>Membran TBST ile iyice yıkayın ve ECL substrat kullanarak leke geliştirmek.</li>
		<li>3-4 klon Cas9 yüksek protein ifadesi ile daha fazla fonksiyonel analiz (Şekil 1) Western blot tarafından görüldüğü gibi seç.</li>
	</ol></li>
	<li>Seçili klonlar yüksek Cas9 etkinliğinde sağlanması
	<ol>
<li>Lentiviral süpernatant bir sgRNA kodlama vektöründen insan hedefleme sgRNAs ile hazırlamak veya adım 1. 1'açıklandığı gibi AAVS1 safe Harbor anlaşmasının locus fare.</li>
		<li>Üst Cas9 ifade MOLM13 transduce veya yukarıda açıklanan spinfection yöntemini kullanarak anti-AAVS1 sgRNA lentiviral süpernatant ile MLL AF9 lösemi klonlar. 2,5 µg/mL ile puromisindir 4 gün için seçin.</li>
		<li>Genomik DNA ekstraksiyon kiti üretici yönergelerine göre kullanarak kendi vahşi tipi denetim ile birlikte puromisindir seçimden sonra genomik DNA ' MOLM13-Cas9 veya MLL-AF9-Cas9 lösemi klonlar arındırmak. 2 x Taq polimeraz ve Tablo 1' de listelenen PCR programı ana karışımı kullanarak bir PCR ile AAVS1_test_primers gerçekleştirmek için bir şablon olarak DNA'ın kullanım 50 ng.</li>
		<li>PCR ürünü üzerinde % 2 özel jel çalıştırmak ve jel-268 baz çifti grubun bir jel ekstraksiyon kiti başı olarak üreticinin iletişim kuralı kullanarak arındırmak. Sanger sıra jel AAVS1_target-frag_F astar kullanarak PCR ürünü saf.</li>
		<li>Düzenleme verimliliği tarafından düzenlenmiş AAVS1 karşılaştırılması ve wildtype dizileri online web tabanlı araçlar (Şekil 2) kullanarak değerlendirmek.</li>
	</ol></li>
</ol>2. klonlama ve AML-Cas9 hücrelerdeki sgRNAs iletim
<ol><li>
Orta-den geçerek sgRNAs klonlama
	<ol>
<li>4-6 sgRNAs gene bir örümcek ağı-esaslı CRISPR tasarım yazılımı kullanarak ilgi için tasarım. Orada bir dizi CRISPR tasarım aracı kullanılabilir online sgRNA dizileri oluşturmak http://crispr.mit.edu/ bir giriş DNA sıralamasına dayanan gibi vardır.<ol>
<li>Yıldız işareti ile alanlara uygun bilgileri doldurun. Hedef genom sgRNA tasarım için tıklayın. Hedef sıra sıra kutusuna yapıştırın ve tıkırtı üstünde boyun eğmek düğme.</li>
		</ol>
</li>
		<li>PKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - klonlama için W sgRNA ifade plazmid, nükleotit "CACC" anlamda oligo ve ters çıkarılan antianlamlı oligo için "AAAC" siparişi vermeden önce önüne ekleyin. Premix sipariş anlam ve anti-anlamda oligos bir 96-şey plaka Oligo-Mix bir oligonükleotid sentez şirketten etiketli. Not: Biz yaptık pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - kullanımı sgRNA klonlama için BbsI kısıtlama sitenin W plazmid. -Dibi takdirde diğer sgRNA ifade plazmid kullanılır, sgRNA oligonucleotides için kullanılan çıkıntılar buna göre değiştirilmesi gerekebilir.</li>
		<li>Ayrı U alt 96-şey kalıp Tavlama plakaetiketli al. 1 µL ana bir karışımını yapmak T4 PNK, 10 T4 DNA ligasyonu arabellek x 1 µL ve reaksiyon tavlama başına su 6 µL.</li>
		<li>Ana karışımı 8 µL tavlama plaka her şey için ekleyin. 100 µM 1 µL, mantıklı ve antianlamlı oligo (veya karışık anlamda-anti-sense oligos 2 µL) ana karışıma ekleyin. 2-3 kez pipet yavaşça karıştırın için kısaca kuyu dibine karışımları almak için plaka spin.</li>
		<li>PCR makinede aşağıdaki tavlama programı kullanmak: 37 ° c, 2 dk 30 sn 95 ° C'de 30 dk takip tarafından yavaş soğutma-0,1 oranında 22 ° c ° C/s. Tavlama sonra Seyreltilmiş OligoMixetiketli taze bir 96-şey plaka almak. Bu plaka bir çok kanallı pipet kullanarak yukarıdaki tepki su (1: 200) ile gelen fosforile ve tavlanmış oligos sulandırmak.</li>
		<li>PKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - Özeti 5 µg BbsI Restriksiyon enzimi (10.000 adet/mL) 1,5 µL ile W vektör uygun bir arabellek 37 ° C'de 2 h için daha sonra ligasyonu linearize kullanarak.</li>
		<li>Tüp ligasyonu plaka etiketli bir taze 96 iyi tabak alıp 20 BbsI ng sindirilmiş pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W vektör istenen sgRNA tüp ligasyonu başına bir şey için. Bu, Seyreltilmiş OligoMix plaka fosforile, tavlanmış oligos 2 µL Ekle.</li>
		<li>10 x T4 ligaz arabelleği 1 µL ve T4 DNA ligaz enzim 1 µL ekleyin. Yavaşça ile çok kanallı pipet pipet ve ligasyonu mix 2 h için oda sıcaklığında kuluçkaya. Not: Tüp ligasyonu karışımları daha sonra dönüştürme adımı için-20 ° C'de muhafaza edilebilir.</li>
		<li>Bu arada, kimyasal olarak yetkili E. coli tezcan 90 µL buz ligasyonu adım sonundan önce 10 dk hücreleri.</li>
		<li>Bir çok kanallı pipet kullanarak, yetkili hücre 10 µL aliquots ayrı 96 iyi kalıp her kuyuya olun.</li>
		<li>De yetkili hücreleri, pipet yukarı ve aşağı yavaşça içeren içine adım 2.1.8 ligasyonu karışımı ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.</li>
		<li>Pipet 5 µL doğrudan bir 6 içine yukarıdaki reaksiyon gelen bakteri DNA Mix de plaka LB-agar 100 µg/mL ile ampisilin içeren. Her dönüşüm reaksiyonlar için yineleyin.</li>
		<li>Her dönüşüm reaksiyonu ayrı olarak etiketli içine de bir 6-şey plaka plaka. Yaklaşık 5-8 cam boncuk her şey ve bütün 6-şey plaka 8-10 kez dairesel hareketlerle salla ekleyin.</li>
		<li>Her şey bir steril 20 µL pipet ucu ile 1-2 tek kolonileri seçim ve LB agar ve 100 mg/mL ampisilin ile steril 10 cm Petri kabına üzerinde dikkatle etiketli bir nokta haline çizgi. LB plaka çizgiler sonra sadece alt tüp yuvarlak 14 mL içeren ortamda karşılık gelen bakteriyel klon numarası ile işaretlenmiş 3 mL LB-ampisilin clone çizgiler için kullanılan ucu dışarı atmak.</li>
		<li>Bakteriyel plaka doğrudan Sanger için göndermek insan U6 organizatörü ileri astar ile sıralama.</li>
		<li>Klonlanmış sgRNAs sıra onay sonra üreticinin yönergelerine göre Mini hazırlık seti kullanarak karşılık gelen 14 mL tüp DNA'dan arındırmak.</li>
		<li>Spektrofotometre ile konsantrasyon ve her biri mini preps kalitesini ölçmek. Her mini hazırlık'a 15 ng/µL ve pipet konsantrasyon sgRNA klonlar plakaetiketli bir 96 iyi tabak içine normalleştirmek. Not: Bu plaka-20 ° C'de depolanan veya doğrudan virüs hazırlık için kullanılan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SgRNA yapıları ve iletim viral imalatı
	<ol>
<li>96-iyi biçimde sgRNA lentiviral parçacıklar üretimi için izleyin "shRNA/sgRNA/ORF yüksek üretilen iş Viral üretim (96 iyi)" Broad Enstitüsü genetik pertürbasyon platformu (GPP web Portal) iletişim kuralından (URL: https:// Portals.broadinstitute.org/GPP/public/Resources/Protocols).</li>
		<li>Steril tüpler, viral süpernatant 200 µL aktarmak ve hemen-80 ° C'de dondurmak.</li>
		<li>Gün -1: bir düz dipli sigara-doku kültürü tedavi 96 iyi plaka ile 10 µg/mL BSL2 hücre kültür başlıklı bir konsantrasyon, rekombinant insan fibronektin parçasının 100 µL kat. Buharlaşma kaybı önlemek ve tezgah gece bırakın sarılmak wrap kullanarak plaka sarın.</li>
		<li>0. gün: rekombinant insan fibronektin parçası her kuyudan çıkarın. Her sgRNA oda sıcaklığında viral süpernatant çözülme. Viral süpernatant ile 50 µL her tüp her iyi ve iletim levha kaplı ekleyin. İletim plaka 1.300 x g 35 ° C'de 90 dk için de spin</li>
		<li>Spinfection sonuna doğru kültür şişeye hücrelerden MOLM13-Cas9 (klon B3) saymak. Kuyuda 100 µL birim başına 10.000 hücreler kullanın. Ölü cilt göz önünde bulundurarak tüm iletim kuyuları için hücreleri saymak.</li>
		<li>90 dk spinfection sonra 50 µL yavaş yavaş plaka eğerek ayarlanmış bir çok kanallı pipet kullanarak kuyulardan süpernatant kaldırın. MOLM13-Cas9 klon B3 hücre kültürünün 100 µL her şey yavaş yavaş aşağı belgili tanımlık kenar kayan için ekleyin.</li>
		<li>1.300 x g 2 dk 35 ° C'de hücreler alt yerleşmek izin vermek için de plaka Döndür. Plaka da 37 ° C doku kültürü sınıf kuluçka aktarın.</li>
		<li>1. gün: 100 µL taze orta de içeren her sgRNA için Cas9-MOLM13 transduced veya son Orta hacim 200 µL öyle ki Cas9-MLL-AF9 lösemi hücreleri ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. rekabetçi büyüme tahlil
<ol><li>Gün 3: 72 saat (3 gün) iletim sonrası, akış sitometresi (FACS) tarafından her şey BFP pozitif hücreleri içeren sgRNA yüzdesini kontrol edin. Bir hücre canlılığı boya işaretlemek ve ölü hücreleri çözümleme dışı bırakmak için kullanın.</li>
	<li>Hücrelerin bir kısmı yeni kuyu taze orta ile aşırı büyüme sırasında tahlil önlemek için her FACS analiz sonra yeniden kaplama devam edin.</li>
	<li>
FACS analiz 2-3 günde BFP pozitif (BFP + ve) hücreleri BFP negatif (BFP-ve) meslektaşları (Şekil 3) karşılaştırıldığında göreli oranı kontrol etmek için yineleyin. BFP pozitif hücrelerinin (FlowJo veya benzer FACS analiz yazılımı kullanarak) her zaman için yüzdesi analiz.
	<ol>
<li>FCS dosyaları her örnek için FlowJo yazılım için sürükleyin. Çift tıkırtı üstünde herhangi bir örnek eğe ve yan dağılım (SSC) FSC ile X ekseni ve SSC Y ekseninde vs ileri dağılım (FSC), bir nokta Leke arsa. Tüm hücreleri kapı.</li>
		<li>Geçitli hücreler üzerinde çift tıklayın ve onları canlılığı leke (Y ekseni) FSC yüksekliği (H) veya alan (A) nokta leke vs üzerinde arsa. Kapı canlılığı olumsuz (canlı) hücreleri leke.</li>
		<li>Çift Kapılı canlı hücreleri üzerinde tıklayın ve BFP (Y ekseni üzerinde) FSC (A) vs eksen çizmek. Kapı BFP + ve hücreleri. Bu kapılardan grubu sekmesi altında Tüm örnekleri için seçilen örnek sürükleyerek tüm örnekleri için geçerlidir.</li>
		<li>Tüm örneklerin Analizi tablo oluşturmak için Tablo Düzenleyicisi üzerinde tıklatın. BFP + ve sayısı bir örnek tabloya sürükleyin ve Bordro dökümü tüm örneklerinin BFP + ve hücreleri yüzdesini gösteren bir tablo oluşturmak için Tablo Düzenleyicisi'ni görüntüle düğmesini tıklayın. Tabloyu bir xls kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Orantılı artış hesaplamak veya % BFP pozitif hücreler zamanla canlı hücre nüfus içinde düşüş gösteren ve bu oran kontrol sgRNAs (örneğin, luciferase, şifreli veya GFP sgRNA) BFP pozitif hücrelerinin oranı karşılaştırın.</li>
	<li>3. gün taban çizgisi olarak kullanarak denetimlerin yanı sıra, faiz, gene(s) de dahil olmak üzere farklı sgRNAs için BFP pozitif hücrelerinin oranını arsa.</li>
</ol>

<ol><li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Method%22%5BJournal%5D)">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096(2014).</li>
<li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+Genome+Editing+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).</li>
<li>Kuhn, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Chromatin+Regulators+Inhibits+Leukemogenic+Gene+Expression+in+NPM1+Mutant+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).</li>
<li>Erb, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+control+by+the+ENL+YEATS+domain+in+acute+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia.</a> Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantification+of+template-directed+CRISPR%2FCas9+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 58(2018).</li>
<li>Nguyen, A. T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+functions+of+Dot1+and+H3K79+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation.</a> Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).</li>
<li>Vlaming, H., van Leeuwen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+upstreams+and+downstreams+of+H3K79+methylation+by+DOT1L%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L.</a> Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).</li>
<li>Bernt, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLL-rearranged+leukemia+is+dependent+on+aberrant+H3K79+methylation+by+DOT1L%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L.</a> Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).</li>
<li>Daigle, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+killing+of+mixed+lineage+leukemia+cells+by+a+potent+small-molecule+DOT1L+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor.</a> Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).</li>
<li>Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+Dot1l+in+murine+postnatal+hematopoiesis+and+leukemogenesis+by+MLL+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation.</a> Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).</li>
<li>Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOT1L%2C+the+H3K79+methyltransferase%2C+is+required+for+MLL-AF9-mediated+leukemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis.</a> Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).</li>
<li>Zuber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toolkit+for+evaluating+genes+required+for+proliferation+and+survival+using+tetracycline-regulated+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li>
<li>Li, M. J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+transduction+of+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Lentivirus transduction of hematopoietic cells.</a> CSH Protocols. 2007, pdb prot4755 (2007).</li>
</ol>

A.J.D A2A ilaç (New Jersey) ve Salgomed tedavi (San Diego) için bir danışmandır. Diğer yazarların herhangi bir çakışma olmadığını bildirmek için vardır.

Bu makale, biz aday genler akış sitometresi insan/antikorundan AML hücrelerinde (Şekil 5) kullanarak AML hücre hatlarında rolünü araştırmak için bir CRISPR-Cas9-tabanlı rekabet büyüme tahlil yürütmek için detaylı bir protokol tanımlamak. Testin amacı iki ya da üç hafta boyunca bir orta-den geçerek ölçekte bakım gen silinmesiyle AML hücre çoğalması etkisini belirlemektir. Bazı kritik adımlar dikkatle açıklanan protokolünden yükseltme kolaylaştırmak için izlenmesi gereken. Cas9 lentivirus üret...

Son birkaç on yıl çok sayıda araştırma çabalarının anahtar moleküler yolları akut miyeloid lösemi (AML) patogenezinde katkısı belirlenmesi üzerinde duruldu gördüm. Geleneksel olarak, gen-bozulma AML hücrelerdeki koşullu nakavt fareler veya kısa saç tokası RNA (shRNA) kullanılarak yapılmıştır. Nakavt fareler gen-silme spatio-temporal kontrolü için gelişmiş bir sistem sunarken, gen nakavt fareler üreten emek, zaman alıcı ve pahalı. Ayrıca, gen-knockouts rekombinasyon stratejileri kullanarak kolayca ölçeklenebilir; değildir Bu stratejileri kendilerini de paralel olarak çeşitli genler sorgulama için borç yoktur. RNA müdahale yöntemleri için küçük müdahale RNA (siRNA) veya shRNA kullanarak knock-down endojen mRNA'ların keşfi sonra birçok grup AML belirli genlerin rolünü araştırmak için RNA müdahale teknikleri kullanmaya başladı. Fare ve insan AML hücreleri geleneksel transfection lipid tabanlı yöntemleri kullanarak transfect Rootkitler zor olduğundan, çoğu gen işlevi AML hücrelerinde çalışmak için lentivirally istihdam veya retrovirally kodlanmış shRNA çalışmalar. Son keşfi düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) kümelenmiş ve ilişkili Cas enzimler (CRISPR-Cas9) teknolojileri1,2,3gen hedefleme devrim. CRISPR-Cas9 kullanarak, belirli genler ve genomik bölgeler silinmiş, düzenlenemez veya verimliliği ve kolaylığı ile etiketlenmiş. CRISPR-Cas9-esaslı gen-düzenleme şimdi genotip fenotip ilişkileri farklı hücre tipleri basitlik, etkinlik ve bu tekniğin geniş uygulanabilirliği nedeniyle soruşturma için seçtiğiniz yöntemi olarak ortaya çıkıyor. CRISPR-Cas9-tabanlı yöntemleri da yönteminin seçimi AML, sadece bireysel genler sorguluyor, ama birden çok gen dizilmiş veya havuza alınan genetik ekranlarda hedef için bir yol amaçlı olarak da paralel potansiyel olarak birkaç genleri araştıran hale geliyor AML-bağımlılıkları4,5,6.
Bu makale, gen-bozulma istikrarlı CRISPR-Cas9-aracılı gen-yüksek üretilen iş akış sitometresi tarafından takip düzenleme temel alan AML hücrelerinin büyümesini üzerinde etkisini ölçmek için bir basit rekabetçi büyüme tahlil açıklar. Bu yöntem basit, verimli ve ölçeklenebilir paralel AML hücrelerinde birkaç genlerin rolünün araştırılması için orta-den geçerek deneyler için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>BAYRAK-M2 Antikor</td><td>sigma-aldrich</td><td>F3165, lot # SLBS3530V</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare Antikoru</td><td>Invitrogen</td><td>31446, lot # TA2514341</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Maksimum Hassasiyet Substratı</td><td>Thermo Fisher</td><td>34095</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Görüntüleme Sistemi</td><td>BIO RAD</td><td>17001401</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT santrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>R21001</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Kırmızı</td><td>Termo Balıkçı</td><td>S34859</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Termo Balıkçı</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Termo Balıkçı</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Termo Balıkçı</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Termo Balıkçı</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>SAFC</td><td>12303C</td><td></td></tr><tr><td>tek gRNA vektörü</td><td>Addgene #67974</td><td>pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W</td><td></td></tr><tr><td>CelLytic Nükleer ekstraksiyon kiti</td><td>sigma-alorich</td><td>NXTRACT</td><td></td></tr><tr><td>XtremeGENE 9</td><td>sigma-alorich</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>Takara</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometresi</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEBioLabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasyon tamponu</td><td>NEBioLabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz enzimi</td><td>NEBioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Fisher bilimsel</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Fisher scientific</td><td>BP9724-500</td><td></td></tr><tr><td>LB Et suyu</td><td>Fisher scientific</td><td>BP9731-500</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen mini hazırlık kiti</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Spektrofotometre</td><td>Thermo Fisher</td><td>NanoDrop Bir</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Murin IL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Murin IL-6</td><td>Peprotech</td><td>216-16</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Murin M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>Kararlı yetkin hücreler</td><td>NEBiolabs</td><td>C3040I</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Doku Kültürü kapları</td><td>Fisher Scientific</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Hücre lizis çözeltisi</td><td>Qiagen</td><td>158906</td><td></td></tr><tr><td>Protein çökeltme çözeltisi</td><td>Qiagen</td><td>158910</td><td></td></tr><tr><td>DNA hidrasyon çözeltisi</td><td>Qiagen</td><td>158914</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>BbSI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0539S</td><td></td></tr><tr><td>APEX 2.0x Taq Kırmızı Master Karışım</td><td>Kiti Genessee Scientific</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Fisher scientific</td><td>BP2956100</td><td></td></tr><tr><td>50 mL polipropilen konik tüpler</td><td>Fisher scientific</td><td>1495949A</td><td></td></tr><tr><td>15 mL polipropilen konik borular</td><td>Fisher scientific</td><td>1495970C</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr-cas9-tabanlı rekabet deneyleri kullanarak genetik bağımlılıkları incelenmesi

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Gene pertürbasyon çalışmalar yoğun bireysel gen AML patogenezinde rol araştırmak için kullanılmaktadır. Tam gene bozulma ulaşmak için birçok bu çalışmalar yapmış karmaşık gen nakavt modelleri kullanın. Bu çalışmalar nakavt fareler ile genotip fenotip ilişkileri araştıran bir zarif ve zaman test sistemi sunarken, aday genler değerlendirmek için hızlı ve ölçeklenebilir bir yöntem bu AML hücre çoğalması bir rol veya AML modelleri hayatta kalma oynamak paralel sorgu birden fazla aday gen hızlandırmak yardımcı olacaktır. Genom düzenleme teknolojileri son gelişmeler önemli ölçüde bizim yeteneği benzeri görülmemiş ölçekte bir genetik tedirginlikler gerçekleştirmek için gelişmiş var. Genom düzenleme bir tür hedef hücre genom hızlı ve etkili değişiklik yapma için kullanılan yöntemi CRISPR Cas9 göre sistemidir. Kolaylık ve CRISPR/Cas9-aracılı gen-silme ölçeklenebilirliğini yapar çok sayıda gen sorgulama için en cazip tekniklerden birini fenotipik deneyleri. Burada, nükleer silahların yayılmasına karşı önemli bir rol oynayabilir genlerin rolünün veya insan yaşama araştırmak için CRISPR/Cas9 aracılı gen-kesinti yüksek üretilen iş akış sitometresi-tabanlı rekabet deneyleri ile kombine kullanarak basit bir tahlil mevcut ve fare AML hücre hatları.

Bizim çalışmada, ilk MLL-AF9 translocation Cas9-blasticidin lentiviral plazmid kodlama yüksek titresi virüs taşıyan MOLM13 insan AML hücre kültürünü transduced. Elimizde, sıralanmamış MOLM13-Cas9 hücreleri yüksek düzey Cas9 ifade Western blot tarafından göstermedi ve aynı zamanda ne zaman de verimli gen için düzenleme yöntemi kullanılarak denenecektir gerçekleştirmedi toplu7daha önce açıklanan. Bu nedenle, tek hücre klonlar kurmak ve Western blot (<strong class="xf...

Bu el yazması için basit ve ivedi soruşturma akut miyeloid lösemi (AML) hücre çoğalması içinde birden çok aday genlerin rolünün bir kümelenmiş düzenli olarak Interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) CRISPR-Cas9-tabanlı yöntemi açıklar paralel. Bu teknik ölçeklenebilir ve de diğer kanser hücre hatlarında uygulanabilir.

CRISPR-Cas9-tabanlı rekabet deneyleri kullanarak genetik bağımlılıkları incelenmesi

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Bu video paralel olarak AML birden fazla aday genleri araştırmak için basit bir yöntem gösterecektir, akış sitometri dayalı rekabetçi büyüme tsay ile birlikte Crisper-Cas9 sistemi kullanarak. Bu tekniğin en büyük avantajı hızlı ve ölçeklenebilir olmasıdır. Prosedürü gösteren Bo Rui Chen, laboratuarımızdan bir post doc olacaktır.Bir web tabanlı CRISPR tasarım yazılımı ilgi geni için dört ila altı tek kılavuz RNA tasarlamak için kullanılır. Başlamak için, alanlardaki uygun bilgileri yıldız işaretleriyle doldurun. Daha sonra tek kılavuz RNA tasarımı için hedef genomu seçin.Hedef sırasını sıra kutusuna yapıştırın ve gönder düğmesine tıklayın. İstenilen tek kılavuz RNA ekspresyonu plazmid klonlama için, ters ücretsiz antisense oligonükleotid anlamda oglionükleotid ve AAAC nükleotid CACC prepend. Premix anlamda ve antisense oligonükleotidler sonra bir şirketten sipariş edilir 96 iyi plaka, Oligo Mix etiketli.Ayrı bir U-Bottom 96 kuyu plakası, Annealing Plaka etiketli ayarlayın. T4 polinükleotid kizaz bir mikrolitre ana karışımını hazırlayın, 10x T4 DNA ligasyon tampon bir mikrolitre, ve annealing reaksiyon başına su altı mikrolitre. Annealing Plaka her kuyuya ana karışımı 8 mikrolitre ekleyin, premix anlamda ve antisense oligonükleotid2 mikrolitre takip.Pipet iki ila üç kez yavaşça iyice karıştırın ve sonra kuyuların dibine karışımları almak için kısa bir süre plaka spin. Bir PCR makinesinde aşağıdaki annealing programını kullanın. 30 dakika boyunca 37 santigrat derece, iki dakika ve 30 saniye boyunca 95 santigrat derece, saniyede 0.1 santigrat derece hızında 22 santigrat derece yavaş soğutma izledi.Annealing tamamlandığında, su ile 200 annealing reaksiyon1-200 fosforlu ve annealed oligonükleotidseyrelterek, Seyreltilmiş Oligo Mix etiketli taze bir 96 kuyu plaka sıyrık. Tek kılavuz RNA ekspresyon vektörü, 1,5 mikrolitre BBS1 restriksiyon enzimi ile vektörün beş mikrogramını sindirerek, 37 santigrat derecede iki saat boyunca uygun bir tampon kullanarak doğrusallaştırın. Sonra, yeni bir almak 96 iyi plaka Ligation Plaka etiketli, ve BBS1 sindirilmiş tek kılavuz RNA ifade vektörü 20 nanogram eklemek bir iyi her istenilen tek kılavuz RNA ligasyon.Buna seyreltilmiş Oligo Mix plakasından 2 mikrolitre fosforilasyonlu annealize oligonükleotid ekleyin. Her kuyuya, bir mikrolitre 10X T4 ligaz tamponu ve bir mikrolitre T4 ligaz enzimi ekleyin ve yavaşça pipet karıştırın. Tabağı oda sıcaklığında iki saat kuluçkaya yatırın.Ligasyon reaksiyonu bitmeden yaklaşık 10 dakika önce, 90 mikrolitre kimyasal olarak yetkin E.coli hücrelerini buz üzerinde doldurun. Ayrı bir 96 kuyu plakasının her bir kuyuya yetkili hücrelerin 10 mikrolitre aliquots aktarın. Yetkili hücreleri içeren kuyulara ligasyon karışımı ekleyin.Pipet yavaşça yukarı ve aşağı, ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka. Pipet bakteri DNA karışımı her dönüşüm reaksiyondoğrudan bir kuyu içine 6 kuyu plaka, ampisilin mililitre başına 100 miligram lb agar içeren. Her kuyuya yaklaşık 5-8 cam boncuk ekleyin ve dairesel bir hareketle 6 kuyu plakasını 8-10 kez sallayın.Plakaları bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, steril 20 mikrolitre lik pipet ucu ile her kuyudan bir ila iki tek koloni seçin ve steril 10 santimetre petri kabında etiketli bir noktaya çizgi, LB agar ve mililitre başına 100 miligram ampisilin ile LB plakaüzerine streaking sonra, 14 mililitre yuvarlak alt tüp içinde ampicillin orta üç mililitre içine ucu çıkarmak , ilgili bakteriyel klon numarası ile işaretlenir. Bakteriyel plaka daha sonra doğrudan Sanger sıralama için gönderilir.Klonlanmış tek kılavuz RNA'ların sıralı bir teyidinden sonra, üreticinin talimatlarına uygun bir miniprep kiti kullanarak, ilgili 14 mililitrelik tüpten DNA'yı arındırın. Tek kılavuz RNA lentiviral parçacıklar metin protokolünde açıklandığı gibi, 96 iyi formatta üretilmektedir. Ve viral süpernatant hemen eksi 80 derecede dondurulur.AML Cas9 hücrelerinde tek kılavuz RNA'ların transdüksiyonundan bir gün önce, mililitrede 10 mikrogram konsantrasyonda 100 mililitre rekombinant insan fibronektin parçası ile düz bir alt doku dışı kültür 96 iyi plaka tedavi edilir. Buharlaşma kaybını önlemek için plakayı sargı sargı ile sarın ve bir gece boyunca bankta bırakın. Ertesi gün, 96 kuyu plaka her kuyudan rekombinant insan fibronektin parçası çıkarın.Oda sıcaklığında her bir kılavuz RNA viral supernatant çözülme. Transdüksiyon plakasının her kaplanmış kuyusu için her tüpten 50 mikrolitre viral süpernatant ekleyin. Santrifüj sırasında olası kirlenmeyi önlemek için plakayı yapışkan sargı ile sarın.90 dakika boyunca 35 santigrat derece de 1, 300 kez g plaka spin. Spenfeksiyon sonuna doğru, kültür şişesinden klon B3 hücrelerini ifade eden yüksek Cas9'u sayın. Saydıktan sonra, gerekli sayıda hücreaşağı spin ve taze ortamda resuspend.90 dakikalık spinfection'ten sonra, plakayı yavaşça yatırarak süpernatantı tüm kuyulardan çıkarmak için 50 mikrolitreye ayarlanmış çok kanallı bir pipet kullanın. Her iyi yavaş yavaş, jant aşağı kayan, klon B3 hücrelerinin kültürünün 100 mikrolitre ekleyin. Hücreleri dibe yerleşmek için iki dakika boyunca 35 santigrat derece de 1, 300 kez g plaka spin.Plakayı 37 santigrat derece doku kültürü sınıfı kuluçka makinesine aktarın. Ertesi gün, tek kılavuz Lure transduced hücreleri içeren her kuyuya 100 mikrolitre taze ortam ekleyin, böylece son orta hacmi 200 mikrolitredir. Tabağı kuvöze geri ver.Transdüksiyondan 72 saat sonra, akış sitometrisi ile her kuyuda BFP pozitif hücreler içeren tek kılavuz RNA yüzdesini kontrol edin. Ölü hücreleri analizden işaretlemek ve dışlamak için hücre canlılığı boyası kullanın. Tahlil sırasında aşırı büyümeyi önlemek için her olgu analizinden sonra hücrelerin bir kısmını taze ortamla yeni kuyulara yeniden kaplamaya devam edin.Her iki ila üç günde bir, BFP pozitif hücrelerin bfp negatif karşıtlarına göre göre göreli oranını kontrol etmek için gerçekler analizini tekrarlayın. Olgu analizi yazılımını kullanarak her zaman noktası için BFP pozitif hücrelerinin yüzdesini analiz edin. Rekabetçi çoğalma tsay başarısının anahtarı nihai canlı hücre numaraları doğru olduğundan emin olmak için uygun gating teknikleri kullanmaktır.Her örnek için FCS dosyalarını yazılıma sürükleyin. Herhangi bir örnek dosyaya çift tıklayın ve x ekseninde ileri dağılım ve y ekseninde yan dağılım ile ileri dağılım ayarı çizin. Tüm hücreleri kapıla.Kapılı hücrelere çift tıklayın ve y ekseninde canlılık lekesini öne doğru dağılım yüksekliğine veya alan nokta çizimine göre çizin. Canlılık lekesi negatif hücreleri kapa. Geçitli canlı hücrelere çift tıklayın ve x ekseninde y ekseninde ve ileri dağılıma karşı BFP'yi çizin.BFP pozitif hücreleri açın. Seçili örneği grup sekmesi altındaki tüm örneklere sürükleyerek tüm bu kapıları tüm örneklere uygulayın. Tüm örneklerin analiz tablosunu yapmak için tablo düzenleyicisine tıklayın.BFP pozitif sayısını bir örnekten tabloya sürükleyin ve tablo düzenleyicisi'ndeki ekran düğmesini tıklatarak tüm örneklerin toplu raporunu oluşturun ve tablo BFP pozitif hücrelerin yüzdesini görüntüler. Tabloyu excel dosyası olarak kaydedin. Bu sistem, insan ve murine AML hücre hatlarının yayılmasında veya hayatta kalmasında rol oynayabilecek genlerin rolünü araştırmak için kullanılmıştır.AAVS1 güvenli liman lokusunun iki ayrı tek kılavuz lu RNA'ların insan MOM13 Cas9 hücrelerinin çoğalması üzerinde hiçbir etkisi olmadığı, buna karşılık, DNA replikasyonu ile ilişkili gen RPA3 hedeflendiğinde, BFP pozitif hücrelerinin yüzdesinde BFP negatif untransduced muadillerine göre ilerleyici ve anlamlı bir düşüş gözlenmiştir. Benzer şekilde, bir epigenetik regülatör olan Dot1l'i ve göz pigmentasyon geni Rodopsin'i hedefleyen tek kılavuz RNA'ların etkileri fare MLL-AF9 Cas9 hücrelerinde test edildi. Dot1l hedefleyen tek kılavuz RNA'lar, Rodopsin'i hedefleyen tek kılavuz RNA'ların aksine rekabetçi çoğalmada dramatik ve ilerici bir düşüş göstermiştir.Bu sonuçlar, daha önce yayınlanmış sonuçları doğrulayan, Dot1l tükenmesine kitle lösemi hücrelerini ifade eden MLL-AF9'un savunmasızlığını göstermektedir. Gen başına dört ila altı kılavuz RNA varsayarsak, bu yöntem de paralel olarak en az 16-24 gentest için kullanılmak üzere uygundur, ve aynı zamanda herhangi bir kanser hücresi hattında gen bağımlılıkları test etmek için uygulanabilir. AML hücrelerinde test edilmesi gereken moleküler yol gibi daha fazla sayıda gen olması durumunda, CRISPR-Cas9 tabanlı ekranlar daha yararlı olacaktır.

investigation-genetic-dependencies-using-crispr-cas9-based

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Floresan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) jel elektroforezi kılcal çiftler burada tarif edilen genotipleme tekniği, nükleaz aracılı nakavt klonları yüksek verimli genotipleme için izin verir. Diğer Genotipleme teknikleri karşılaştığı sınırlamaları ortadan ve dizileme yöntemleri maliyet açısından daha etkilidir.

CRISPR genotipine bir Floresan PCR kılcal jel elektroforezi Tekniği / yüksek verimli bir Format Nakavt Mutants Cas9 aracılı

Bu iletişim kuralı iş akışı sistemi onarıma memeli hücrelerinde noktası mutasyonların düzenleme CRISPR/Cas9-tabanlı bir gen özetliyor. Burada, gen Indel oluşumu hedef sitesindeki ölçmek için detaylı bir follow-on deneysel stratejisi ile düzenleme bir Kombinatorik yaklaşım kullanın — özünde, yerinde mutagenesis analiz.

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Burada, CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ve homoloji bağımlı onarım şablonları kullanarak C. elegans genom mühendisi bir yöntem mevcut.

Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

CRISPR-Cas9 teknolojisi, memeli lerin genomunu herhangi bir hücre tipinde tam olarak dizmek için etkili bir yöntem sağlar ve genom çapında genetik ekranlar gerçekleştirmek için yeni bir araç tır. Havuzlu genom genişliğindeCRISPR-Cas9 ekranlarının başarılı bir şekilde performans alabildikleri adımları tartışan ayrıntılı bir protokol burada verilmiştir.

Memeli Hücrelerinde Havuzlu CRISPR Tabanlı Genetik Ekranlar

Önceden monte edilmiş Cas9/guide RNA ribonükleoprotein komplekslerinin doğrudan teslimi hematopoetik hücrelerde genom düzenleme için hızlı ve etkili bir araçtır. Burada, bir RUNX1 intronic susturucu silmek ve OCI-AML3 lökemik hücrelerde transkripsiyonel yanıtları incelemek için bu yaklaşımı kullanır.

Akut Miyeloid Lösemi Hücrelerinde CRISPR/Cas9 Ribonükleoprotein ile RUNX1 Intronic Susturucunun Transkripsiyonel Rolünün İncelendirin

Burada, shield-1 adlı küçük molekül altında düzenli olarak kümelenmiş kısa palindromik tekrar- (CRISPR-) ilişkili protein 9'un (Cas9) zamansal ve koşullu stabilizasyonuna dayanan bir genom düzenleme aracı tarif ediyoruz. Yöntem kültürlü hücreler ve hayvan modelleri için kullanılabilir.

Koşullu Cas9 Stabilizasyonunu Kullanarak Gen fonksiyonlarını değerlendirmek için Yeni Bir Araç Seti

Bu el yazması, hücre dışı reseptör-ligand etkileşimlerini tanımlamak için genom ölçeğinde hücre tabanlı tarama yaklaşımını açıklamaktadır.

Genom ÖlçeğiCRISPR/Cas9 Genetik Ekranlar Kullanılarak Hücre Yüzey Reseptör Tanımlama

Bu protokolün amacı, C. elegans genomunun monte edilmiş ribonikleoprotein kompleksleri ve tarama için dpy-10 co-CRISPR işaretleyicisi kullanılarak sorunsuz CRISPR/Cas9 düzenlemesini sağlamaktır. Bu protokol, C. elegans'ta eklemeler, silmeler, gen değiştirmeleri ve kodon ikameleri de dahil olmak üzere çeşitli genetik değişiklikler yapmak için kullanılabilir.

CRISPR/Cas9 C. elegans rbm-3.2 Geninin dpy-10 Co-CRISPR Tarama İşaretçisi ve Monte Edilmiş Ribonikleoprotein Kompleksleri kullanılarak düzenlenmesi.

Erken gelişim, maternal kalıtsal ürünlere bağlıdır ve bu ürünlerin çoğunun rolü şu anda bilinmemektedir. Burada, tek bir nesilde anne-etki fenotiplerini tanımlamak için CRISPR-Cas9 kullanan bir protokol tanımladık.

Maternal Crispantlarla Erken Gelişimde Annelik İfade Edilen Genlerin Rolünün Belirlenmesi

CRISPR gibi teknolojilerin önündeki önemli bir engel, hayati genleri bozabilecek hedef dışı olaylardır. 'Dizileme ile Bölünme Etkilerinin İn Vitro Raporlaması için Döngüselleştirme' (CIRCLE-seq), istenmeyen bölünme bölgelerini belirlemek için tasarlanmış bir tekniktir. Bu yöntem, CRISPR-Cas9'un genom çapındaki aktivitesini yüksek hassasiyetle ve önyargısız olarak haritalandırır.

Hedef Dışı Gen Düzenlemenin Sorgulanması için CIRCLE-Seq

Genom çapında bir CRISPR / Cas9 tarama yönteminin uygulanması yoluyla dirençli ve hassas radyasyon genlerini seçmek için titiz ve yapılandırılmış bir yaklaşım verilmiştir. Bu protokol aynı zamanda klinik olarak uygulanan kimyasal ilaçlara direnç mekanizmalarını araştıran diğer araştırma çabaları için çok yönlü bir çerçeve olarak hizmet etme potansiyeline sahiptir.

Radyosensitif ve radyodirençli genleri ortaya çıkarmak için genom çapında CRISPR ekranı

Keşfedin, CRISPR-Cas9 ve akış sitometrisine dayalı rekabetçi büyüme analizi kullanarak AML hücrelerinde çoklu gen bağımlılıklarını paralel olarak incelemeyi. Bu hızlı ve ölçeklenebilir yöntem, kanser hücre hatlarında gen fonksiyonlarını değerlendirmek için uygulanabilir.

CRISPR-Cas9-tabanlı rekabet deneyleri kullanarak genetik bağımlılıkları incelenmesi

Daha fazla video keşfet