Vivo Optogenetic proteinlerin ipek/AAV filmleri kullanarak hedeflenen ifade

Bu yöntem, sistem nörolojisi alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Nöronal toplulukların aktivitesi beyinde duyusal ve bilişsel işleme nasıl desteklenir gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, ayrı bir virüs enjeksiyon prosedürü gerektirmeden, ilgi beyin bölgelerine Chan rodopsin ve GCaMP gibi optogenetik proteinlerin doğru hedefleme kolaylaştırır olmasıdır.

Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir, çünkü küçük optik implantlara ipek ve virüs birikimi tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için bazı pratikler gerektirebilir. İlk olarak, mix çözülmüş AAV ve 5-7 nokta beş yüzde sulu ipek fibroin bir oran bir-bir oranında 200 mikrolitre PCR tüp. Yavaşça pipet çözeltisi birkaç kez iyice AAV ve fibroin karıştırmak için.

İpek/AAV'yi yatırmak için, yapılan fiber implant sayısı için gerekli çözelti miktarı yla bir enjeksiyon pipeti yükleyin, ayrıca pipet tıkanması nedeniyle oluşan kayıpları karşılamak için yaklaşık yüzde 30 ekstra. Daha sonra, bir mikroenjektör ile donatılmış stereotaksik bir cihaz içine bir ferrule tutucu monte. Ferrule tutucuyu mikroenjektörün üzerine yerleştirin ve aşağıdaki ipek/AAV karışımını uygulayın.

Enjeksiyon pipeti optik fiber yüzeyin merkezine dokunana veya neredeyse dokunana kadar manevra yapın ve 10 ila 20 nanolitre ipek/AAV çözeltisi fırlatın. Sonra pipeti geri çekin. Daha sonra, yaklaşık bir dakika içinde düz bir filme kuruyan sıvı bir kubbe olarak görünen düz yüzeyde ipek/AAV bolus gözlemleyin.

İstenilen miktarda ipek/AAV yatırılınakadar önceki adımları tekrarlayın. Birden fazla implant hazırlarken, ilk implanta dönmeden önce ipek/AAV solüsyonu bir implanta uygulayın ve diğer implantları kaplamaya geçin. Bir saat kuruduktan sonra, tüm ferrule tutucuyu bir vakum odasına yerleştirin ve vakum bir gecede yaklaşık 125 torr ve dört santigrat derece de kurutun.

Ertesi gün, yüksek güçlü bir mikroskop altında ortaya çıkan ipek filmin şeklini ve konumunu değerlendirin. Filmlerin optik fiber yüzeyin ucuyla sınırlı olduğundan, nispeten ince ve simetrik olduğundan emin olun. Konik optik lifleri kaplamak için, ipi/AAV enjeksiyon pipetini konik lerin başındaki optik fiberin yan tarafına yerleştirin ve pipetin optik fibere dokunduğundan emin olun.

Kaplama işlemini başlatmak için 20 nanolitre ipek/AAV çıkar, damlacıkoptik fibere yapışır ve fiber ve pipet in arabiriminde kalmasını sağlar. İpek/AAV kururken damlacıkları lif ucunun ucuna doğru hafifçe yakınlayın ve pipet ucunu tıkamamak için enjeksiyon pipetini kurutma damlacığıyla temas halinde tutun. İlk bolus neredeyse tamamen kuruduğunda, başka bir 20 nanolitre atmak ve konik boyunca damlacık wicking devam edin.

Bir önceki adımı, az miktarda ipek/AAV çıkararak ve çözeltiyi yavaş yavaş konik tarafına kurutarak tekrarlayın. Kurutunca, ortaya çıkan ipek filmin in şeklini ve konumunu yüksek güçlü bir mikroskop altında değerlendirin. GRIN lens implantlarının kapaması için, ipek/AAV'yi bir GRIN lens implantına tek bir enjeksiyonda yatırın.

Kurutunca, filmin lens yüzeyini kapladığından emin olmak için yüksek güçlü bir mikroskop altında elde edilen ipek filmin şeklini ve konumunu değerlendirin. Cam kranial pencereleri kaplamak için, damlacık tüm cam yüzeyi kapsayacak şekilde yayılır, böylece üç milimetrelik yuvarlak kapak kayma yüzeyine ipek / AAV beş mikrolitrelik damlacık el pipet. Kuruduktan sonra, ipek/AAV kaplı optik lifleri, cihazları yerleştirmeden önce 125 torr ve dört santigrat derecede soğutulmuş vakum kurutucusunda saklayın.

Florofor etiketli optogenetik proteinlerin floresan görüntüleri, ipek/AAV filmlerinin ifade derecesinin bir ölçüsünü sağlar ve tipik optik lifler 200 nanolitre ipek/AAV'yi kolayca barındırabilir. Uygulama ile, deneyciler implante liflerin ucu etrafında son derece güvenilir ifade elde edebilirsiniz. Kaplamalı kafatası pencereleri ile ilgili iki olası sorun yetersiz ifade ve çözülemeyen ve görüş alanını gizleyen ipek filmlerdir.

İfadeyi artırmak için, pencerenin implante edilmesinden ve/veya filmdeki virüs miktarının artırılmasından önce durektomi yapılabilir. En iyi ifade, sırasıyla ipek ve stok-titre AAV bir-dört karışımı kullanılarak elde edildi. Kaplamalı pencerelerdeki ipek miktarı fiber implantlara göre 10 ila 100 kat daha fazladır ve film dokuya daha az gömülüdür ve bu nedenle ipek filmlerini eritebilecek aynı proteolitik aktivite seviyelerine maruz kalmayabilir.

Ancak, bazı ipek varlığı pencerelerin altında ifade elde etmek için gereklidir, büyük olasılıkla tek başına virüs ten yapılmış bir film ameliyat sırasında interstisyel sıvı tarafından yıkanır çünkü. Bu prosedürü uygularken, ipek kaplı implantları tarif ettiğimiz şekilde hazırlamak ve saklamak önemlidir. Yanlış depolama ipek filmlerin özelliklerini değiştirebilir veya viral ifade vektörlerinin etkinliğini azaltabilir.

Bu teknik, sinirsel aktivite fareler, sıçanlar, hatta insan olmayan primatlar gibi memelilerin beyinlerinde duyusal ve bilişsel işleme sürücüler keşfetmek için sistem nöroloji alanında araştırmacılar için büyük yarar olabilir. Viral ekspresyon vektörleri ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve eldivenler, gözlükler ve laboratuvar önlükleri gibi kişisel koruyucu ekipmanlar olabileceğini unutmayın, Adeno ile ilişkili virüsle çalışırken her zaman giyilmelidir.