Name: Neuroscience bölümlerinde TEM örnekleme tarafsız bir yaklaşım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Öğrenin, beyin dokusunda nöronal özelliklerin tarafsız analizi için otomatik elektron mikroskobu yöntemini. Bu teknik, sinaps yoğunluğu ölçümünü kolaylaştırarak sinirbilim araştırmalarında verimliliği artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Avusturyalı Bilim Fonu, FWF, proje numarası P 29370 B27 tarafından finanse

Tüm deneyler Federal Bakanlığı bilim ve araştırma (BMWF-80.104/2-BrGT/2007 ve BMWF-66.010/0037-II/3b/2013) Avusturya Cumhuriyeti ya da etik Komisyonu tıbbi Graz Üniversitesi, sayı 28-549 eski bir etik kurul tarafından kabul edildi 15/16 ve 24 Kasım 1986 (86/609/EEC) Avrupa Toplulukları Konseyi yönergesi ve yönergesi sayılı Avrupa Parlamentosu ve Konseyi 22 September2010 göre yürütülen (2010/63/AB). Hayvan deneyleri tasarlanmış ve kullanılan hayvan sayısını en aza şekilde yapılır.
1. diseksiyon ve doku fiksasyonu
<ol><li>Fareler ötenazi (21 hafta yaşlı, kadın C57BL/6J fare ve C57BL/6N fareler; erkek WT ve NPY KO fareler üzerinde karışık bir C57BL / 6:129 / SvJ (1:1) arka plan sırasıyla) 150 mg/kg Fentobarbital intraperitoneally enjekte edilerek.</li>
	<li>Beyni kafatasından kaldırmak ve hemen onları (sola doğru yarımküreden ayıran) - bir neşter kullanarak yarıya.</li>
	<li>Hemen yarıya % 2 formaldehit ile cam kaplar içine yerleştirin ve 0.1 M cacodylate %2,5 oxazolidin (CH3)2AsO2Na·3H2O, pH 7.4 ile 1 M için ayarlanmış tampon NaCl), pH 7.4 4 ° C'de Dikkat: Fiksajlar zehirlidir ve büyük bir dikkatle ele alınmalıdır. Sadece koruyucu eldiven ve duman başlık altında kullanın.</li>
	<li>2 gün 4 ° C ve durulama için beyin yarısı aynı arabellek en az 24 h, ayrıca 4 ° C'de için fix Arabellek hacmi hakkında on kat numune birim olmalıdır.</li>
</ol>2. belirlemek ilgi içinde beyin bölgesinin Vibratome bölümleri başvuru ile karşılaştırarak fare bölümlerden beyin Atlas10
<ol><li>Beyin örnek bir vibratome üzerine yerleştirin. Beyin yönünü doğru olduğundan emin olun (Bu durumda, koronal bir yönelim Hipokampus için seçildi).</li>
	<li>Faiz (ROI) beyin bölgesinin ulaşılana kadar kırpın. Büyük bir kalınlık bölümleri kesme (e.g., 100 µm) kadar beyin bölümü bölgenin ilgi ile ulaştı ve her bölüm at.</li>
	<li>Vibratome bölümleri ile 20 µm kalınlık yatırım Getirisi ile beyin bölümünün başında kesip vibratome bölümleri bir cam slayt üzerinde yer başlatın. Onları (Nisl leke) bölümleri % 0.05 thionine asetat sodyum asetat tampon pH 4.2 için 1 dk (şekil 1AI) içine yerleştirerek leke.</li>
	<li>Lekeli bölümleri hafif bir mikroskop kullanarak fare beyin atlas ile karşılaştırmak ve kesme ve istenen beyin koordinatları ulaşana kadar boyama devam edin.</li>
</ol>3. bir örnek bölge gömmek için elde etme
<ol><li>En kısa zamanda doğru alan tanımlanır, kesme bir bölüm 150 µm kalınlık, vibratome ile başlayın.</li>
	<li>Microdissect bu vibratome bölüm stereo mikroskop altında bir tıraş bıçağı ile. ROI çevresinde parçalar kesip. Bölüm transmisyon elektron mikroskobu (TEM) (1 x 1 mm2' den büyük olmayan) aşağıdaki hazırlık adımlarını için uygun bir boyutu olması gerekir.</li>
</ol>4. TEM hazırlık - gömme, ultra-ince kesit ve boyama
<ol><li>Katıştırma<ol>
<li>2 h %2 Osmiyum tetroxide oda sıcaklığında-(RT) için sonrası düzeltme. En az 10 kez numune hacmi ile örnek kapsar, ancak gereksiz zehirli atık önlemek için aşırı sabitleştirici kullanmaktan kaçının için bir birim kullanırsanız. Dikkat: Osmiyum tetroxide çok zehirli ve büyük bir dikkatle ele alınmalıdır. Sadece koruyucu eldiven ve duman başlık altında kullanın.</li>
		<li><li> </li><li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li></li></ol></li><li> </li></ol><ol><li><li><ol><li></li><li><li></li><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li></ol></li></ol><ol><li></li><li></li><li></li><li><ol><li></li><li></li><li><li><li></ol></li></ol><ol><li><li> </li><li> </li><li></li><li></li><li></li><li><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58745/58745eq1.jpg"></li><li></li></ol><ol><li><ol><li><li></li><li></li><li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li><li><li></li><li><ol><li></li><li>&amp; </li></ol></li><li></li><li></li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li> </li><li></li><li><li><li></li><li> </li><li></li><li><li><li><li></ol></li></ol>

<ol><li>Howard, V., Reed, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoward%2C+V+%22Unbiased+Stereology%3A+Three-Dimensional+Measurement+in+Microscopy%22">Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy</a>. , BIOS Scientific Publishers. Oxford. (1998).</li>
<li>Nakamura, H., Kobayashi, S., Ohashi, Y., Ando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-changes+of+brain+synapses+and+synaptic+plasticity+in+response+to+an+enriched+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Age-changes of brain synapses and synaptic plasticity in response to an enriched environment.</a> Journal of Neuroscience Research. 56 (3), 307-315 (1999).</li>
<li>Landers, M. S., Knott, G. W., Lipp, H. P., Poletaeva, I., Welker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+formation+in+adult+barrel+cortex+following+naturalistic+environmental+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synapse formation in adult barrel cortex following naturalistic environmental enrichment.</a> Neuroscience. 199, 143-152 (2011).</li>
<li>Reichmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+unbiased+counting+method+for+the+quantification+of+synapses+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel unbiased counting method for the quantification of synapses in the mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 240, 13-21 (2015).</li>
<li>Reichmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+induces+behavioural+disturbances+in+neuropeptide+Y+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Report%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment induces behavioural disturbances in neuropeptide Y knockout mice.</a> Scientific Report. 6, 28182(2016).</li>
<li>Mayhew, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+Tissue+Samples+from+the+Placenta%3A+An+Illustration+of+Principles+and+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Taking Tissue Samples from the Placenta: An Illustration of Principles and Strategies.</a> Placenta. 29, 1-14 (2008).</li>
<li>Ferguson, S., Steyer, A. M., Mayhew, T. M., Schwab, Y., Lucocq, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Golgi+structure+using+EM%3A+combing+volume-SEM+and+stereology+for+higher+throughput%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying Golgi structure using EM: combing volume-SEM and stereology for higher throughput.</a> Histochemistry and Cell Biology. 147, 653-669 (2017).</li>
<li>Sterio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unbiased+estimation+of+number+and+sizes+of+arbitrary+particles+using+the+disector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector.</a> Journal of Microscopy. 134 (2), 127-136 (1984).</li>
<li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+stereological+tools%3A+disector%2C+fractionator%2C+nucleator+and+point+sampled+intercepts+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96 (10), 857-881 (1988).</li>
<li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+KBJ+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Elsevier/Academic Press. (2008).</li>
<li>Lewis, P. R., Knight, D. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLewis%2C+PR+%22Staining+Methods+for+Sectioned+Material%22">Staining Methods for Sectioned Material</a>. , Elsevier/North-Holland Biomedical Press. (1988).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J Struct Biol. 152 (1), can be downloaded from http://bio3d.colorado.edu/SerialEM 36-51 (2005).</li>
<li>Rampon, C., Tang, Y. P., Goodhouse, J., Shimizu, E., Kyin, M., Tsien, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+induces+structural+changes+and+recovery+from+nonspatial+memory+deficits+in+CA1+NMDAR1-knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enrichment induces structural changes and recovery from nonspatial memory deficits in CA1 NMDAR1-knockout mice.</a> Nature Neuroscience. 3 (3), 238-244 (2000).</li>
<li>Xu, X., Ye, L., Ruan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+induces+synaptic+structural+modification+after+transient+focal+cerebral+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment induces synaptic structural modification after transient focal cerebral ischemia in rats.</a> Experimental Biology and Medicine. 234 (3), 296-305 (2009).</li>
<li>Lonetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+environmental+enrichment+moderates+the+behavioral+and+synaptic+phenotype+of+MeCP2+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Early environmental enrichment moderates the behavioral and synaptic phenotype of MeCP2 null mice.</a> Biological Psychiatry. 67 (7), 657-665 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada sunulan iş akışı araştırmacı tarafsız bir biçimde ultrastructural özellikleri üzerinde veri almak sağlar. Bu çok daha az zaman alıcı birim soruşturma seri bölümlerden daha var. Bu hedefe ulaşmak için birkaç farklı uygulamaları kullanılır. (Kullanılabilirlik, lütfen iletişim için karşılık gelen yazar) ilk başta bir rasgele sahne-örnekleme alanı koordinatları seçmek için üst karakter tanıtmak için ısmarlama RPS yazılımımız kullanılır. Bu yatırım Getirisi sistematik bir üniforma rastgele örnekleme sağlar. Daha sonra belirli yapıları sayımlarda biz nerede 2 ardışık bölümlerde bilinen mesafe ile karşılaştırılır, biz kullanılan önceki çalışmalar13,14,15 ' e göre yeni bir yol disector yöntemi adapte bizim özel yapım RPS yazılım sistematik Tekdüzen rastgele örnekleme için. Bu 3D yeniden inşa seri bölümler tüm birimlerden karşılaştırıldığında zaman kazandırır. Özel yapım RPS yazılım özellikle mikroskop iş akışı çoğaltılması için kısıtlayıcı bir faktör olan bir tür için geliştirilmiştir. Bu özel yazılım bir alternatif komut dosyalarına izin veren ve diğer mikroskop modelleri ile uyumlu bir uygulama olacaktır.
Biz başarıyla kullanılan bu yaklaşım için bizim karşılaştırmalı çalışmalar4,5. Ultra-ince kesitler nöronal doku, ilgi alanı özetlenen ve görüntüleri bu alanda sistematik Tekdüzen rastgele örnekleme tarafından alındı. Bu ilgi, dentat gyrus polimorf tabakası alanı olan yaklaşımımız için yararlı olabilir araştırmak için oldukça küçük bir alan olduğunu belirtmek zorunda. Rastgele yerleştirilmiş bir disector içinde DCV sayısı değerlendirildi ve birkaç ultrastructural şekil-in yetişkin fareler DGpl sinapslar SE ve EE yanı sıra yetişkin WT yetişkin NPY nakavt fareler ve fareler yer alır. Yaklaşımımız, toplanan veri değişiklikleri incelenen parametrelerden bazıları gösterdi. Bu bulgular Juvenil hayvanlar2benzer diğer çalışmalarda olanlardan doğruladı.
Bir dezavantajı bu iş akışının deneysel kullanım kullanıcılar (bizim durumumuzda, kullanıcı arabirimi, TEM seri bölüm farklı arayüzü ile rahat olsun gerek bu multi-application-yaklaşım kullanım kolaylığı açısından ideal olmadığını olabilir RPS yazılım ve SerialEM yazılım). Tüm uygulamaları verimli bir şekilde işlemek öğrenme zaman alıcıdır ve dikkate alınmalıdır. Ancak, bu iş akışıyla kullanmak öğrenme zaman yatırım hala seri bölümü TEM ile tüm birimleri çözümlemek için gereken zaman içinde açıkça olumlu. Güvenilir veri1 bölüm/birim yüksek miktarda araştırmak gerek kalmadan sunmak için yeterli ilgi alanında sistematik Tekdüzen rastgele örnekleme tarafından yerleştirilen bir disector kullanma yöntemidir.
Doku ve yapıların korunması sadece ilgi alanı belirsizliğe yer bırakmadan tanımlayan için de yapısal özelliklerini değerlendirmek için çok önemli değil gibi çalışmalarımız sonucu en üst düzeye çıkarmak için numune hazırlama sırasında kendine iyi bak hayati oldu. Çok önemli bir faktör ve bu yöntemin belki başka bir dezavantajı olduğunu kaliteli Ultra-ince kesitler çiftlerinin gereklidir: hiçbir delik veya birini kullanarak bölümleri soruşturma altında alanı kapsayacak kırışıklıkları olmalıdır ve bölüm kalınlığı olmalıdır homojen yapılmaktadır. Araştırmacı ultramicrotomy, iyi eğitilmiş olmalı. Bakımı da bu bölümleri elektron ışını zarar duyarlıdır ve kolayca altını üstüne gibi TEM bölümlerde Imaging gerçekleştirilecek var. Ayrıca, doğru numarayı örnekleme alanların yatırım Getirisini seçmek önemlidir. Bağlı olarak deneysel amacı, dikkatli bir şekilde ayarlanması büyütme oranını elektron filmler var. Bizim deneyler için özel olarak, merkezi sinir sistemindeki sinapslar sayma 20 bir bölümünde ilgi 30,25 µm2 alana sahip en iyi bölgeleridir. Bu su kuyusu içinde güvenilir sonuçlar elde etmek için (bizim durumda sinapslarda, sinaptik özellikleri ve DCV) söz konusu özellikleri tanıma personel yetiştirmek için tavsiye edilir. Sinapsların tanımlamak için sinaptik veziküller tanımlanabilir olmalıdır ve bu en az 10 çözümlenmesini gerektiren nm. Bunun için 5000 X büyütme en uygun olan ama büyütmeyi kamera konumunu ve türü gibi donanım parametreleri bağlıdır ve diğer mikroskop ve/veya fotoğraf makinesi türleri için adapte etmesi gerekir belirtmek gerekiyor. Ayrıca protokol uygulamaları özel bir TEM için kullanır ve kullanıcıların diğer modelleri ile Kur farklılıkları göz önünde bulundurmanız gerekir kaydetti vardır.
Biz (bir TEM yüksek çözünürlüklü gerektiğinde) araştırma soru sistematik bir üniforma talepleri bizim iş akışı sadece nörolojik ama biyolojik bilim ve malzeme bilimi geniş bir alanda pek çok diğer uygulamalar için adapte edilebilir inanıyorum rastgele örnekleme ve muayene için örnekler miktarını sorar zamanı bir verimli şekilde analiz için. Örneğin, biz şu anda demir depoları insan beyninin yerelleştirme ilgilendi. Bunun için biz son zamanlarda bizim iş akışı, ultra-ince bölümlerinde rasgele seçilmiş bölgelerde elementel analiz etkinleştirmek için adapte edilmiştir. İş akışı için gerekli olan uygulama sayısını en aza indirmek için rasgele bir biçimde seçilebilir noktaları önceden belirtmek üzere sahne alanı taşımak için programlanabilir çünkü yalnızca, SerialEM yazılımı kullanarak geçerli amaçladık. Biz iş akışını tamamen automatizing amacı ile TEM denetlemek için özel komut dosyaları oluşturdu. Bu tatmin edici sonuçlar vermemiştir filtre uygulanmış görüntüleme modunda autofocusing dışında mümkün olmuştur. Böylece DM yazılım odaklanarak ve enerji filtre görüntüleri elde etmek için kullanılır.
Özetle, biz elektron Filmler tarafsız bir şekilde elde etmek yardımcı yazılım çözümleri sunuyoruz.

Elektron mikroskobu, bölümler içindeki temsilcisi bölgeleri örnek için zordur. Biz, bir gözlemci olarak, sık sık belirli bölgeler dikkatimizi örnek, göze çarpan özellikleri tarafından çizilmiş bakmak için de dağıtılmış, yansız örnekleme önleme önyargılı vardır. Bölgenin ilgi bir her parçası bir elektron test1' bitiş yukarıya aynı şansı olursa önyargı örnekleme yalnızca önlenebilir. Örneğin, bir yazılım çözümü önyargısız örnekleme mikroskop trackball el ile sahne durur her yerde örnekleme bölgeleri seçin için belgili tanımlık imge vasıl bakmadan iterek önlemek mümkündür. Ama net olarak söylemek gerekirse, bu rasgele bir yordam, çünkü, bilinçli ya da bilinçsizce, kullanıcı hareket sahne alanı üzerinde bir etkisi olabilir ve ayrıca, örnekleme bölgeleri seçme sofistike bir yolu bu değil, değil. Rastgele örnekleme çiftleri bölümlerden kesitler, bilinen mesafe çiftlerini gerektiren stereology1için belirli birimlerdeki, örneğin, yapılarının sayısını değerlendirmek için kullandıysanız özellikle önem kazanmaktadır. Ayrıca yalnızca tek bir bölümüne bakın ve belirli yapılara2sayısını tahmin etmek mümkün olurdu, ama çok küçük yapılardır sürece bu yaklaşım ile müfettişler sayısal yoğunluğu büyük yapıların abartma eğilimindedir karşılaştırma bölümü kalınlığında. Alternatif yaklaşımlar seri bölümlerden doku birimleri yeniden ve böylece3istenen verileri almak üzeresiniz. Ama bu çok zaman alıcı ve (daha büyük) karşılaştırmalı çalışmalar için uygun bir yaklaşım değil.
Bu sorunların üstesinden gelmek için araştırmacı örnekleri elektron Filmler, ultra-ince kesitler içinde normal aralığı elde etmek için otomatik olarak seçmesine olanak sağlayan bir iş akışı geliştirdik. Elektron Filmler rasgele, yansız örnekleme izin konumudur. Uygun yaklaşımdır yapıları (örneğin, sinapslarda içinde bir belirli neuropil cilt4,5) sayısal yoğunluğu ve yapısal özellikleri (örneğin, genişliğini sinaptik yarık boyutlarının belirlenmesi için her ikisi de veya çap postsinaptik yoğunluğu4,5)
İş akışı özel yapım bir rasgele noktası otomatik olarak önceden tanımlanmış bir bölgesi içinde kılavuz pozisyonların Ultra-ince bir bölümü ilgi hesaplar (RPS) yazılımı (bizim mikroskopla sağlanan komut dosyası oluşturma yazılımını kullanarak Java komut dosyasında yazılmıştır) örnekleme kullanır. Böylece bir elektron test her noktada yapılan RPS yazılım elektron mikroskobu aşaması önceden tanımlanmış bu noktalara taşır. İlk olarak, kullanıcı ilgi ince bölümünde bir bölge tanımlar. Daha sonra RPS yazılım bu bölge içerisinde kılavuz pozisyonlar hesaplar. X / ilk konumda y koordinatlarını rasgele oluşturulur ve kalan pozisyonlar açısından ilk pozisyonu normal kılavuz aralıklarla yerleştirilir. Bölgenin ilgi bir her parçası muayene ediliyor aynı şansı olduğundan, bu en düşük düzeyde veri toplama sağlar. Bu yaklaşım örnekleme da sistematik Tekdüzen rastgele örnekleme denir (bkz: başvuran6,7 daha fazla ayrıntı için).
Sayısal yoğunluğu yapıları belirlemek için bilinen uzaklıkta mı bölümleri çiftiyle çalışıyoruz. Bir elektron test önceden belirlenmiş pozisyonların birinde ilk bölümünden elde ettikten sonra TEM seri bölümü yazılım (bizim elektron mikroskobu ile sağlanan yazılım paketinin bir parçası) ikinci bölümünde, karşılık gelen nokta için taşır bir elektron test karşılık gelen konum elde etmek. Bu önceden belirlenmiş kılavuzunda her konum için tekrarlanır. Bizim yaklaşım, bir disector elektron Filmler8,9her çifti parçacıkları saymak için kullanılır. Bir disector bir çift sayma kare, her bölüm8,9için oluşur. Nesneleri sayısal yoğunluğu yalnızca nesneleri görünür sayılarak belirlenir ilk bölüm (veya başvuru bölümü) ama ikinci bölüm (veya arama bölümüne) üzerinde. Bu nesnelerin bir hızlı ve verimli bir şekilde8,9sayısal yoğunluğu tahmin etmek için sağlar. Ayrıca tek bölümlerde iki boyutlu yapısal özellikleri ölçülebilir.
Başarıyla hipokampüs synapse sayılarda enriched çevre (EE) koşulları koşulları4,5konut standart ortamına (SE) göre konut maruz farelerin farklılıkları değerlendirmek için bu iş akışını uygulamış olan, ve aynı zamanda vahşi türü (WT) fareler ve peptit Y (NPY) KO fareler ultrastructural farklılıkları değerlendirmek için SE ve EE5altında tuttu. Hedefimiz nöronların, sayısal sinaptik yoğunluğu gibi yapısal özellikleri itibariyle özellikle kesit aktif bölgesinde ve postsinaptik yoğunluğu, sinaptik yarık ve sinaptik veziküller sayısı genişliğini uzunlukları aramak oldu, nöronal bağlantısı ve etkinleştirme farklı deneysel koşullar arasında değişiklikleri değerlendirme için. Buna ek olarak, nöronlar belirli bir beyin alanda saklı nöropeptitler miktarını belirlemek için yoğun çekirdekli veziküller (DCV) sayısal yoğunluğu içinde ilgilenmişlerdir.
Bizim yaklaşım yukarıda bizim sonraki adımda açıklanan Etütler başarısı göre insan beyni örnekleri içinde tarafsız elemental analizler için alanlar seçmek için bizim iş akışı adapte olması. Bu nöronlar ve gliyal hücreler ferritin molekülleri depolanan görüntü demir için yapılmıştır. Bunun için biz bize bir rasgele tarama süreci işlemlerinde tanımlanmış bir alanı beyin bölümlerinin çoğunu otomatikleştirmek izin verilen bir komut dosyası derlenmiş.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital</td><td>SigmaAldrich</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Merck</td><td>1040051000</td><td>1kg</td></tr><tr><td>Glutardialdehit</td><td>Bilim Hizmetleri</td><td>E 16210</td><td>%25; 100ml; EM sınıfı</td></tr><tr><td>kakodilat tamponu</td><td>Merck</td><td>C4945</td><td>250g; Dimetilarsinik asit sodyum trihidrat</td></tr><tr><td>Tiyonin asetat/Ceristain</td><td>Merck</td><td>861340</td><td></td></tr><tr><td>asetik asit</td><td>Merck</td><td></td><td>1000631000 1 L</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Merck</td><td>1064951000</td><td>1 kg, peletler</td></tr><tr><td>osmiyum tetraoksit</td><td>Bilim Hizmetleri</td><td>E 19110</td><td>10x1g</td></tr><tr><td>TAAB gömme reçine</td><td>Bilim Hizmetleri</td><td>TAT001</td><td>500g</td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>Bilim Hizmetleri</td><td>TAD024</td><td>100g</td></tr><tr><td>DDSA</td><td>Bilim Hizmetleri</td><td>TAD025</td><td>500g</td></tr><tr><td>Uranil asetat dihidrat</td><td>Plano GmbH</td><td>19481</td><td>tükenmiş, 25g</td></tr><tr><td>Ultrastain 2</td><td>Leica</td><td>16707235</td><td>Kurşun sitrat</td></tr><tr><td>Toluidin mavisi çözeltisi</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1727</td><td>10g</td></tr><tr><td>Pioloform</td><td>Plano GmbH</td><td>R1275</td><td>10g Toz</td></tr><tr><td>Proylenoxide</td><td>SigmaAldrich</td><td>82320-1L</td><td>1L</td></tr><tr><td>DPX gömme ortamı</td><td>Plano GmbH</td><td>R1320</td><td>cam slayt üzerine yarı ince kesitler için gömme ortamı, 50 ml</td></tr><tr><td>Vibratom, Leica VT 1000</td><td>Leica Microsystems, Viyana, Avusturya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Ultracut UCT, ultramicrotom</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai G2 20</td><td>FEI, Eindhoven, Hollanda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Megaview geniş açılı kamera</td><td>Olympus Soft Imaging Solution, M&uuml; nster, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABD 1000 dijital kamera</td><td>Gatan, Pleasanton, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM Görüntüleme Analiz Yazılımı</td><td>FEI, Eindhoven, Hollanda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FEI Seri Bölüm Yazılımı</td><td>FEI, Eindhoven, Hollanda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji, ImageJ 1.52e</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüsü, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPSS 20.0 SPSS</td><td>Inc., Chicago, IL, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SerialEM</td><td>Colorado Üniversitesi</td><td></td><td></td>Regents</tr><tr><td>RPS (rastgele nokta örnekleme) yazılımı 0.9a</td><td>ısmarlama</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disector v1.0.2 (ImageJ makro)</td><td>ısmarlama</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EFTEMSerialEM (SerialEM komut dosyası)</td><td>ısmarlama</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

neuroscience bölümlerinde tem örnekleme tarafsız bir yaklaşım

An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience

Araştırmalar neurons ve onların sinapslarda ultrastructural özelliklerinden sadece elektron mikroskobu ile mümkündür. Özellikle yoğunlukları değişiklikleri karşılaştırmalı çalışmalar ve dağılımları gibi özelliklerin, yansız örnekleme iletişim kuralı için güvenilir sonuçlar önemlidir. Burada, beyin örnekleri resim alma için iş akışı mevcut. İş akışı tanımlı beyin bölgesi içinde sistematik Tekdüzen rastgele örnekleme sağlar ve görüntüleri bir disector kullanılarak analiz edilebilir. Bu teknik çok seri bölümler kapsamlı sınav hızlıdır ancak hala yoğunlukları ve ultrastructure özellikleri dağılımları tahmin etmek için uygun bir yaklaşım sunuyor. Katıştırma önce lekeli vibratome bölümleri, soruşturma, hangi yardım hız yukarıya genel numune hazırlama süreci altında beyin bölgesi tanımlamak için bir referans olarak kullanılmıştır. Bu yaklaşım bir zenginleştirilmiş-konut çevre ultrastructural parametrelerinde birkaç fare beyin etkisini araştıran karşılaştırmalı çalışmalar için kullanıldı. İş akışı başarılı kullan seçeneğine göre biz beyin örnekleri elementel analiz amacıyla uyarlanmış. İletişim kuralı kullanıcı etkileşimi zaman açısından en iyi duruma getirilmiş. Açık kaynak yazılım SerialEM için bir komut dosyası derleme tarafından zaman alıcı adımlar otomatikleştirme kullanıcı temel haritalar edinme ana çalışmalarına odaklanmaya yardımcı olur. Orijinal iş akışı olduğu gibi biz güvenilir sonuçlar güvence altına almak için yansız örnekleme yaklaşım dikkat.

Burada, alanları TEM için otomatik ve tarafsız bir şekilde seçmek için iş akışını açıklar. Kullanıcı TEM Ultra-ince bir bölümünde içinde ilgi alanı seçer ve alanı içinde 20 örnekleme alanlarına koordinatlarını otomatik olarak hesapladığı RPS yazılım da dahil olmak üzere iş akışı için birkaç yazılım çözümleri kullanır faiz. O zaman, TEM sahne fotoğraf için her örnekleme alanına taşınır. Bu tek bölümleri analiz etmek için ve kesitler, araştırmacı önyargı olmadan görüntüleme için alanları seçerek sağlar, bilinen bir mesafe çift analiz etmek için mümkündür.
Bu iş akışının ne zaman fare beyin bölümleri4,5' ultrastructural özellikleri belgeleyen değerli olduğunu kanıtladı. Bu çalışmalarda dentat gyrus (DGpl) polimorf hücre tabakası bir ilgi alanı incelenmiştir. Bizim yöntem dorsal DG (Bregma −1.3) Koronal bir bölümünü Ultra-ince bir bölüme uyuyor ve onun ana hatlarıyla kolayca düşük büyütme oranında tanınır çünkü DG incelenmesi için uygun olduğunu kanıtladı. Diğer beyin bölgeleri incelenmesine olsaydı, onların büyüklük ve deneyler planlamadan önce özellikleri ayırt kontrol etmek önemli olacaktır.
Burada açıklanan iş akışı uygulayarak EE konut önemli ölçüde DGpl4' deki standart konut koşullarını açısından sinaptik yarık genişliği artar gösterdi. Ayrıca, yoğun çekirdek veziküller sayısı önemli ölçüde nöropeptitler ev değişiklikleri gösteren hayvanlar EE yer alan4, azalmış. WT ve NPY nakavt fareler EE koşullar altında tutulur DCV yoğunluğu açısından SE-konut5azalmıştır nöronlar/µm³ DGpl içinde sayısı artarken. Buna ek olarak, yedek havuzuna (yerleşik olmayan sinaptik veziküller) koşulları5konut bağımsız sinaptik veziküller önemli bir artış NPY nakavt sonuçlandı. EE etkisi sinaptik yarık genişliği EE yer alan WT ve NPY KO fareler5arasında anlamlı bir fark sonuçlanan NPY KO grubunda ters. WT ve NPY davranış çalışmaları ile birlikte alınan nakavt hayvanlar bu NPY çok önemli bir rol EE5nörobiyolojik etkileri için gösterir konut koşullarını, her iki tür altında düzenlenen.
İnsan beyninin içinde depolanan demir görüntülenmesi için bir komut dosyası için rasgele bir bütün ultrathin bölümünde Alım noktaları bir enerji elde etme amacı ile elektron test bu noktaların her filtre seçmek SerialEM yazılım derlendi . Elektron mikroskobu bölümü yükledikten sonra komut dosyası bölümü istikrar gerçekleştirilen (i.e., 'numune-yemek' rutin) bir gecede. Komut dosyası daha sonra puan bu şekil 3' te bir ızgara işaretli kullanıcı tarafından önceden tanımlanmış bir dizi rasgele seçilmiş. Bir testi test üreten ve onun gri düzeylerini denetleyerek, komut dosyası seçilen noktaları ızgara çubukları üzerinde indi Puan reddetme bölümünde, görünür bir parçası üzerinde bulunan Eğer kontrol ettim. Çoğu iş akışının en az kullanıcı etkileşimi ile komut dosyası tarafından yapılır. Ancak, orada olduğu gibi çok az ışık SerialEM otofokus rutin için otomatik filtre enerji Filmler (Bu Kur) ile kaydetmek mümkün olmadı. Bu nedenle, biz en kısa zamanda komut dosyası sahne her noktasına taşındı odak el ile ayarlanabilir ve demir EFTEM görüntüsünü yapılan DM yazılım için açık. Öldükten sonra insan beyninin bir EFTEM demir resim için bir örnek şekil 4' te gösterilmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig1.jpg"> Şekil 1. İllüstrasyon iş akışının. (A) (ok yönünde) numune hazırlama ana adımları gösterilir: vibratome bölümler (ı), kesme yarı ince ve ultra-ince kesitler (III) ve alıcı Ultra-ince bakır Izgaralar (IV) bölümlerinde çift embedding(ii). (B) kayıt siteleri belirlemek örnekleme alanı koordinatları oluşturmak için kullanımı hem mikroskop tedarikçinin yazılım ve özel yapım RPS yazılım. Köşe noktaları bölümlerin mikroskobu yazılımında depolanır ve ROI (yarı ince kesitler yardımı ile tanımlanır) vurgulanana (ı); alanları örnekleme bir kılavuz yatırım Getirisi üzerinde oluşturulur, rasgele ÜSTKRKT (kırmızı ok) x tanıtıldı ve y. Böylece hiçbir vardiyalar, siyah kareler yerine rasgele kaydırılacağı, mavi kareler kayıt siteleri (II); belirlemek için kullanılır (siyah oklar), örnekleme alanlar arasındaki mesafe daha küçük değişikliğidir sadece örnekleme (siyah ve mavi kareler olarak çizilen) YG sınırları içinde kayıt için kullanıldı. Filmler yapılan başvuru bölümünde (siyah kareler) ve ilgili yerlerde arama bölümünde (mavi kareler) (III). (C) bir test yeterli büyütme her örnekleme alanda yapılır; birkaç birleştirilmiş görüntülerini oluşan bir montaj (Bu durumda, 2 x 2 görüntüleri birlikte birleştirilmiş) gerekirse yapılır (ı); bir sayım çerçeve oluşturulur ve görüntüde bir kaplama olarak gösterilen, yapıları zarfında belgili tanımlık çerçevelemek vekabul çizgiler'(kesik çizgili çerçeve çizgileri)-var sayılır, ama değilyasak çizgiler'(kalın Çerçeve çizgileri) (II). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig2.jpg"> Resim 2 . Ultra-ince bölümleri tarafsız bir sayım çerçeve ile bir çift ölçüm ultrastructural parametreleri. (A) ImageJ windows sayma ve hücresel yapılar analiz etmek için kullanılan genel bakış. Sol tarafta elektron test sayım çerçeve ile bir bindirme olarak gösterir. Sağ tarafta: damla-aşağı yemek listesi (üst) ve (aşağıda); araç ile ImageJ kullanıcı arayüzü (mavi dikdörtgen) ObjectJ Nesne Düzenleyicisi'ni (yeşil dikdörtgen); ölçme araçları nerede seçilebilir ObjectJ araçları penceresi (turuncu dikdörtgen) ve nerede tüm ölçümler belgelenen ObjectJ sonuçları penceresi (siyah dikdörtgen). (B) işaretli sinapslarda üzerinde elektron test (sinapslarda üzerinde her iki bölümde - oklar; yalnızca arama bölümü-ok başları üzerinde sinaps) görüntülenmesini ayrıntı. Bu çok noktaya aracını kullanarak işaretlenir (kırmızı daire) ImageJ araç çubuğundan. (C) adları ve sinaptik özellikler ölçüm parametreleri ObjectJ araçlarıkullanılarak tanımlanır. Marker-araç ve özellik ilgi seçilir ve resimde sol fare tıklama yapısı boyunca tarafından çizilmiş anahat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig3.jpg"> Şekil 3. Alanlar bir yatırım Getirisi için filtre enerji iletim elektron mikroskobu içinde elemental eşleme için örnekleme seçilmesi. SerialEM ilgi bir bölge seçmek için ve örnekleme alanlarda normal aralığı (A ve B görüntülerde pembe haç), yüksek bir dizi önermek için kullanılır. Bir komut dosyası sonra rastgele örnekleme alanlarından (önceden tanımlanmış Bu koordinatlar) edinme için seçer. Zavallı aydınlatma ile örnekleme alanlarda 20 de ışıklı örnekleme alanları içinde ROI seçmiş olduğunuz sürede ızgara çubukları ve komut dosyası durur önlemek için reddedilir. (A) mümkün örnekleme alanlarda yüksek bir dizi ile bir çokgen tarafından özetlenen ilgi tüm alanı genel bakış (B) detay örnekleme alanları rasgele seçimden önce gösterilen A X. işaretlenmiş. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig4.jpg"> Şekil 4. Elemental Haritası (EFTEM) edinme örneği. (A) parlak alan TEM test alanı satın alma noktası etrafında. Rasgele seçilen bir alan bir temel harita elde etmek için kullanılan ve siyah bir dikdörtgen tarafından işaretlenir. (B) EFTEM ön pencere resim rastgele seçilen alanda yapılan kenar. (C) EFTEM sonrası aynı bölgede yapılan pencere resim kenar. (D) Elemental demir aynı çevrenin (M-kenar) haritası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Biz beyin dokusunun elektron mikroskobu araştırmalar için yeni iş akışı tanıtmak. Yöntemi tarafsız bir biçimde nöronal özelliklerini incelemek kullanıcı sağlar. Elementel analiz için Ayrıca randomize örnekleme için iş akışı çoğu automatizes bir script mevcut.

Neuroscience bölümlerinde TEM örnekleme tarafsız bir yaklaşım

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative ...

Elektron mikroskobu için tarafsız örnekleme protokolü hayati önem taşımaktadır. Belirli bir beyin bölgesindeki sinapsların veya diğer yapıların sayısal yoğunluğu üzerinde ölçmek isterseniz, tekniğimizin en büyük avantajı tarafsız olması ve en az kullanıcı müdahalesi ile otomatik olarak elektron mikrografları üretmesini sağlamasıdır. Bu teknik aynı zamanda nöroloji gibi diğer araştırma alanlarında da değerlidir, bir sinir ağının gücünü değerlendirmede kullanılabilir nerede.Protokolümüzü uygulamak için, örnek hazırlama ve geçiş elektron mikroskobu gibi elektron mikroskobik tekniklerinde deneyim sahibi olmak gerekir. Prosedürümüzdr. Bu protokol, elektron mikroskobu için beyin örneklerinin hazırlanmasından, ince kesitlerin kesilmesinden oluşmaktadır.Daha sonra, otomatik olarak ilgi bir alanda elektron mikrograflar tanımlı sayıda üretmek için nasıl açıklayacağız. Daha sonra, yapısal özelliklerin sayısal yoğunluğunu değerlendirmek için bir sayma çerçevesi kullanır. Başlamak, incelemek, düzeltmek, düzeltmek ve reçineler katıştırma içine ilgi örnekleri gömmek için eşlik eden metin protokolü ile birlikte takip etmek.Daha sonra, bir ultramicrotome üzerine örnek yerleştirin ve 55 nanometre ultra ince seri bölümleri üretmek. Piola formu ile kaplanmış, iki milimetre bir milimetre boyutları ile bir yuva ızgara üzerinde bölümleri yerleştirin. Daha sonra yuva ızgaralarında %2 uranyl asetat kullanarak ultra ince bölümleri 30 dakika boyunca lekeleyin ve ardından oda sıcaklığında 30 saniye kurşun sitrat elde edin.Şebekeyi TEM'e yerleştirin ve bölümlerin kalitesini değerlendirmek için düşük büyütme kullanarak TEM ile ızgara üzerindeki bölümleri inceleyin. Daha sonra, TEM Seri Bölümü yazılımını başlatın, Bölüm'ü seçin ve başvuru ve arama bölümü için köşe noktalarını eklemek için Ekle'yi seçin. Açılır pencerenin yönergelerini izleyin.Başvuru bölümüyle başlayın ve ardından arama bölümüyle devam edin. Bir ve iki noktaları girilirken, bölümün kenarlarının bir sonraki bölüme paralel olduğundan emin olun. Sonraki ilgi bölgesini tanımlamak için düşük büyütme altında referans bölümünü görselleştirin.Referans bölümündeki TEM görüntü analizini kullanarak mikroskop aşamasını Yatırım Getirisi'nin anahatlarını oluşturmak için Yatırım Getirisi'nin birden çok köşe noktalarına taşıyın. Rasgele Nokta Örnekleme yazılımını kullanarak ortaya çıkan çokgenin koordinatlarını kaydedin. Bunun için, bölümdeki YG'yi anahatize etmek için gereken çokgenin her noktasında Rastgele Nokta Örnekleme yazılımının iletişim kutusunda koordinatları ekle'ye basın.Sonraki tanımlayın ve Rasgele Nokta Örnekleme yazılımıiçine alanlar arasındaki örnekleme alanları ve mesafeler için uygun bir boyut girin. Daha sonra, mikrografın çokgen içindeki konumları için sistematik, tek düze, rastgele bir şekilde koordinatlar oluşturmak için Raster'ı Hesapla tuşuna basın. Rastgele Nokta Örnekleme yazılımı ve TEM Seri Bölümü yazılımını kullanarak, örnekleme noktalarını referans ve arama bölümlerinde saklayın.Bunlar daha sonra kaydedilen montajların koordinatlarıdır. Rasgele Nokta Örnekleme yazılımında, mikroskop aşamasını referans bölümündeki her örnekleme alanının x, y-koordinatlarına taşımak için bir sonraki konuma gidin. Ardından, Konum'u seçin ve başvuru bölümündeki TEM Seri Bölümü yazılımında bu koordinatları almak için Ekle'yi seçin.Tüm koordinatlar için bunu tekrarlayın. Başvuru bölümündeki koordinatları arama bölümüne yansıtmak için Bölüm'ün ve Bölüme Git'i seçin. İletişim penceresine arama bölümünün numarasını girin.Montajların kaydı için, daha önce açıklandığı gibi başvuru ve arama bölümü arasında geçiş yapmak ve referans bölümündeki konumu konumla birlikte değiştirin ve numaraya gidin. İletişim penceresindeki bir sonraki koordinatı seçin. SerialEM montajları için, her örnekleme koordinatında Dosya'ya gidin ve açılan menüden Yeni Montaj'ı seçin.İletişim penceresinde doğru kutucuk sayısını ve çakışma yüzdesini seçin. Bu çalışma için, 5000 büyütme çalışmada sinaptik özellikleri tanımak için yeterlidir. Ancak CCD kameranın sınırlı görüş alanı iki görüntü ile iki montaj yapılması nı gerektiriyordu.Montajlar SerialEM'e yapılır. Her montajı kaydetmeden önce, odağı yeniden yeniden gözden geçirir veya kayıt yazılımındaki otomatik odaklama seçeneğini etkinleştirin. Montaj dosyasını kaydetmek için klasörü seçin ve SerialEM'in sol tarafındaki montaj alt menüsünden Başlat tuşuna basarak montaj Kaydını başlatın.Mikrodissektörüne başlayın ve sayım çerçevesinin boyutunu ve gerektiğinde segment sayısını tanımlayın. Dissector makroyu kullanarak sinaps yoğunluğunu say. Araç çubuğunda bulunan çok noktalı aracı kullanarak, dissector'un iki yasak çizgisiyle kesişen sinapsları sınırlayın, ancak karşıt kabul satırlarında sinapsları sayın.Başvuru bölümünde görünen, ancak arama bölümünde görünmeyen sayma çerçevesi içindeki her sinapsı oval bir seçimle işaretleyin. Sinaps parametrelerini ölçmek için, yalnızca başvuru kesitinde bulunan sinaptik yarıklı sinapsları seçin. Bu, dissector için kullanılan aynı görüntü çerçeveleri içinde olmalıdır.Ardından, Eklentiler'e gidin ve ardından Çözümle'ye gidin ve açılan menüden eklenti ObjectJ'i başlatın. ObjectJ açılır iletişim kutusundan yeni bir proje açın ve bu da kullanıcının işaretaracıyla yapıları anahatlamasına ve işaretlemesine olanak tanıyan bir pencere açabilir. İlk olarak, yapı boyunca bir çizgi çizerek pre-sinaptik membran ve post-sinaptik yoğunluk uzunluğu uzunluğunu ölçmek için marker aracını kullanın.Daha sonra, hem öncesi hem de sonrası sinaptik membranı kapsayan bir poligon çizerek sinaptik yarık ortalama genişliğini elde edin. Kenetlenmiş vezikül sayısını belirlemek için, bir vezikül çapı veya daha az pre-sinaptik membran maksimum mesafe ye sahip tüm veziküller saymak. Daha sonra, aynı sinapsta bir vezikül çapı maksimum mesafe ile veziküller sayarak undocked veziküllerin sayısını belirleyin.Protokolün uyarlanmış bir sürümü ultra ince bölüm içinde tarafsız elde edilen yerlerde elementanalizleri sağlar. Bunun için TEM görüntüleme modunda SerialEM'i başlatın ve yeni bir proje açın. Ardından, Navigator'ı açın ve kamera ve komut dosyası kontrollerinde kamera nın ayarlarını kontrol edin ve görüntülemeyi kaydedin ve başlatın.Ultra ince bölümün köşe haritasını yapmak için Gezgin penceresinde Puan Ekle'yi seçin. Ardından, köşe noktalarını ultra ince bir bölümün kenarlarına ayarlayın. Sağ fare tuşunu basılı tutarak sahneyi bir köşe noktasına taşıyın.Bölümün bir köşesine ulaşıldığında, sol fare tıklamasıyla bir köşe noktası ekleyin. Üç köşe noktası daha eklemek için yordamı tekrarlayın. Navigator penceresinde, köşe noktaları için C kutusunun depolanan noktalar için işaretlendiğinden emin olun.Köşe montajını başlatmak için SerialEM menü çubuğundaki Navigator'a gidin ve açılan menüden Montaj Izgaraları ve Kurulum Köşesi Montajı'nı seçin. Gezgin penceresinde Çokgen Ekle'yi seçin ve birden çok sağ fare tıklamasıyla ilgi çekici bölgenin anahatlarını belirleyin. Ardından, Gezgin açılır menüsünde Puan Izgara ekle'yi seçin ve noktalar arasındaki mesafeyi tanımlayın.EFTEMSerialEM komut dosyasını başlatın, komut komutlarını izleyin, Navigator'da gösterildiği gibi ızgara noktası sayısını girin ve edinme noktalarının sayısını girin. Ardından, komut dosyasının ızgara çubuklarından kaçınabilmesi için aydınlatma eşiğini ayarlayın. Komut dosyası komutlarını izleyin ve kılavuz çubuğunun dörtte biri kadar görüş alanını kapsayacak şekilde sahneyi el ile taşıyın.Görüntülenen değere göre, görüntülenen değerden daha yüksek bir eşik aydınlatma değeri girin. Satın alma noktaları seçilene ve pişirme rutininin bitmesine kadar bekleyin. Bu uzun zaman alır ve bir gecede yapılabilir.Enerji filtreli TEM element analizi için kurulum yaptıktan sonra, elemana özel ayarlara sahip bir temel harita edinin. Tarafsız örnekleme yaklaşımı, belirli beyin bölgelerindeki sinaptik özellikleri saymak ve analiz etmek için yararlıdır. Ayrıca, SerialEM yazılımı için EFTEMSerialEM komut dosyası, bu noktaların her birinde enerji filtreli elektron mikrografı elde etmek amacıyla, bir bütün ultra ince bölüm içinde edinme noktalarını rastgele seçmenize olanak tanır.Komut dosyası rasgele bir dereceleme ile işaretlenmiş olanlardan kullanıcı tarafından önceden tanımlanmış bir dizi nokta seçti. Bir test mikrografı üreterek ve sınıf düzeylerini kontrol ederek, seçilen noktaların bölümün görünür bir bölümünde bulunup bulunmadığı kontrol edilerek, ızgara çubuklarına inen noktaları reddedilmiştir. İş akışının çoğu, kullanıcının en az etkileşimi ile komut dosyası tarafından işlendi.Ancak, burada gösterilen örnek ile, SerialEM otomatik odaklama rutin için çok az ışık vardı. Bu nedenle, komut dosyası sahneyi her noktaya hareket ettirmez, odak ayarlandı ve bir temel harita demirden yapıldı. İlgi alanını dikkatle seçmek ve aynı sayıda örnekleme noktasının her ilgi alanına girmesini sağlamak önemlidir.Numune hazırlamada kullanılan kimyasalların çoğunun zehirli olduğunu unutmayın. Bu yüzden bir laboratuvar önlüğü ve koruyucu eldiven giymek ve bir duman kapağı altında çalışmak.

an-unbiased-approach-of-sampling-tem-sections-in-neuroscience

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Beyin bankacılık ve biyolojik materyalin sistematik örnekleme tarafsız stereology temelini sağlar ve olası veri her numune elde edilen en üst düzeye çıkarır.

Beyin Bankacılık: Araştırma Örneklerinin En iyi şekilde

Primat beynin anatomik organizasyonu, insanlarda normal ve patolojik durumları önemli bilgiler sağlayabilir. Hakkında tarafsız stereology, doğru ve etkin bir biçimde, belirli bir referans alanı toplam nöron numarası (veya başka bir hücre tipi) tahmin etmek için bir...

Sigara insan Primate Beyin | Stereology: sayar ne bilmek

Ayrık fare beyin bölgelerinin RNA ekspresyon profillemesi, hassas ve tekrarlanabilir bir doku toplama stratejisi gerektirir. Burada, hem koronal beyin kesitlenmesi hem de doku orajörü yardımıyla mikrodissection kullanan bir protokol açıklanmaktadır. Elde edilen örneklerden sağlanan toplam RNA'nın verimi ve kalitesi, özetlenen yöntemin kullanışlılığını doğrulamaktadır.

Toplam RNA İzolasyonu ve Alt Nesil Sıralama ve Kaynak gösterilmeden kullanılamaz Ayrık Fare Beyin Bölgeler Mikrodisseksiyon Sigara Lazer Yakalama Mikroskopi Yaklaşım

Biz manyetik rezonans görüntüleme (MRG) tarafından yakalanır anatomik bilgi ile kombine manyeto ve elektroensefalografi (MEG / EEG), işitsel dikkat ile ilişkili kortikal ağ dinamikleri eşlemek için kullanabilirsiniz.

Eşzamanlı MEG / EEG ve Anatomik-kısıtlı Minimum norm Tahminleri Kullanarak Eşleme Kortikal Dinamiği: Bir İşitsel Dikkat Örneği

Bu protokol değiştirilmiş kuduz virüsü floresan işaretlerini ifade ve bağımsız, tarafsız küme farklı nöronal alt sınıfları arasında morfolojik metrik kapsamlı karakterizasyonu olanak analizleri ile retrograd enfeksiyonu takiben etiketli seçici nöronal popülasyonlarının büyük ölçekli rekonstrüksiyon açıklar.

Morfolojik Ölçümler dayanarak büyük ölçekli yeniden düzenlemesi ve Bağımsız, Unbiased Kümelenme Seçici Populasyonlarında Nöronlar Sınıflandıran

Burada, elektrokonvülsif uyarımı takiben sıçan hipokampusunda, yeni nöronların oluşumunu ve canlılığını ölçmek için kullanılan bir optik fraktatör olan stereolojik bir yöntemi sunuyoruz. Doğru şekilde uygulandığında, stereolojik yöntemlerin duyarlılığı ve verimliliği, sabit ve önceden belirlenmiş bir hassaslıkla doğru tahminler sağlar.

Elektrokonvülsif Terapi Sıçan Modelinde Hücre Sayılarını Tahmin Etmek İçin Optik Fraksiyonlama Tekniği

Bu makalede küçük hayvan beyin mikro-CT görüntüleme, hangi lezyonlar sayılabilir ve tüm beyin bağlamında yüksek hassasiyetle yer alan elektrotlar hazırlamak için basit bir yöntem.

Lezyonlar karakterize ve küçük hayvan beyinlerinde elektrot bulmak için bir mikro-CT-esaslı Yöntem

Konu Görüntülerinin Permütasyonu (SDM-PSI) ile Tohum bazlı d Haritalama kullanarak voksel bazlı nörogörüntüleme çalışmalarının meta-analizini nasıl yapacağımızı ayrıntılı olarak anlatıyoruz.

Konu Görüntülerinin Permütasyonu ile Tohum Bazlı d Haritalama Kullanılarak Voxel Tabanlı Nörogörüntüleme Çalışmalarının Meta-analizi (SDM-PSI)

Burada açıklanan, açılı bir koronal yaklaşım kullanarak zorlu ve ulaşılması zor beyin bölgelerini (mekansal sınırlamalar nedeniyle) hedef alabilen stereotaktik bir prosedürdür. Bu protokol hem fare hem de sıçan modellerine uyarlanabilir ve kanül implantasyonu ve viral yapıların mikroenjectionları da dahil olmak üzere çeşitli nörobilimsel uygulamalara uygulanabilir.

Çok Yönlü Nörobilim Teknikleri için Uyarlanabilir Açılı Stereotaktik Yaklaşım

Fare beyninin çıkarılması ve taze beyin dokusundan ayrı bölgelerin diseksiyonu için uygulamalı, adım adım, hızlı bir protokol sunuyoruz. Moleküler analiz için beyin bölgelerinin elde edilmesi birçok sinirbilim laboratuvarında rutin hale gelmiştir. Bu beyin bölgeleri, sistem seviyesi analizi için yüksek kaliteli transkriptomik veriler elde etmek için hemen dondurulur.

Fare Beyninin İşlevsel ve Anatomik Olarak Farklı Bölgelere Mikrodiseksiyonu

Protokol, sürekli video-elektroensefalogram (EEG) monitörizasyonuna paralel olarak gerçekleştirilen epileptik sıçanlardan tekrarlanan beyin omurilik sıvısı ve kan alımlarını gösterir. Bunlar, çeşitli vücut sıvısı moleküllerindeki değişiklikler ile nöbet aktivitesi arasındaki olası bağlantıları araştırmak için etkilidir.

EEG Kayıtları Sırasında Sıçanlarda Lateral Kuyruk Veninden Beyin Omurilik Sıvısı ve Kan Örneği Alınması

Öğrenin, beyin dokusunda nöronal özelliklerin tarafsız analizi için otomatik elektron mikroskobu yöntemini. Bu teknik, sinaps yoğunluğu ölçümünü kolaylaştırarak sinirbilim araştırmalarında verimliliği artırır.

Neuroscience bölümlerinde TEM örnekleme tarafsız bir yaklaşım

Daha fazla video keşfet