Name: Ligand bağlayıcı etki Dimerization etkinliği östrojen reseptör Alfa memeli iki-hibrid tahlil kullanarak algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Öğrenin, memeli iki-hibrid tahlil kullanarak östrojen reseptörü alfa ligand bağlayıcı etki dimerizasyon aktivitesini nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, seçici östrojen reseptör modülatörlerinin mekanizmalarını anlamak için basit ve etkili bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Drs. Sueyoshi ve Wang, Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü (NIEHS) için el yazması ve Tanner Jefferson okuma kritik videoda yordamları gerçekleştirmek için teşekkür ederiz. Bu eser (adı için) Ulusal Sağlık Enstitüleri Grant 1ZIAES070065 NIEHS, Intramural araştırma bölümü tarafından desteklenmiştir.

1. hazırlanması plazmid memeli iki-hibrid tahlil için
<ol><li>Aşağıdaki plazmid kullanın: pG5-Luc, pBIND-ERαEF ve Paktı-ERαEF. Not: Plazmid yazarlardan istek üzerine mevcuttur ve filtre kağıdı gönderilir. pG5-Luc duyarlı öğeleri luciferase ifade birimi (Şekil 1A) ile erimiş GAL4 beş tekrarlar içeren muhabir plazmid var. pBIND-ERαEF protein ifade plazmid ERα yakın GAL4DBD erimiş proteinler için var. pBIND-ERαEF bir Renilla luciferase ifade transfection verim (Şekil 1B) normalleştirme için içerir. Paktı-ERαEF protein ifade plazmid ERα yakın VP16AD erimiş proteinler (Şekil 1C) için olduğunu. Plazmid ifade protein yapısından diyagramı Şekil 2' de gösterilmiştir.</li>
	<li>Plazmid DNA'lar hazırlayın.<ol>
<li>Temiz makas kullanarak kağıt plazmid yüklü alanından dışarı ve 1,5 mL tüp içine koydu. Eldiven giymek ve temiz cımbız plazmid yüklü gazeteyi almak için kullanın. 100 µL Tris-EDTA (TE) arabelleği (pH 8.0) ve girdap de ekleyin.</li>
		<li>1 µL eklemek plazmid DNA çözüm adım yetkili Escherichia coli 1.2.1 hücreleri ( Tablo malzemelerigörmek) ve tüp buz 15 dakika tutun.</li>
		<li>Isı şok plazmid eklendi yetkili hücreleri; tüpler için 30 42 ° C su banyosunda kuluçkaya s ve sonra buz 2 min için saklayın.</li>
		<li>Tüpler ve kültür için 30 dk 37 ° C'de sallayarak ile 250 µL catabolite baskı (SOC) Orta (Oda sıcaklığında) ile süper en iyi suyu ekleyin.</li>
		<li>Kültürlü E. coli prewarmed Luria suyu (LB) plaka üzerine 100 µL gecede 100 µg/mL ampisilin (10 cm çapında çanak) ve 37 ° C'de kültürü ile plaka.</li>
		<li>Bir koloni plaka almak ve müthiş suyu (TB) 100 µg/mL ampisilin ile 2 mL içeren bir 14 mL tüp içine ekleyin. Orta hafif bulutlu 's kadar 37 ° C'de sallayarak ile kültür.</li>
		<li>Kültürlü orta 1 mL 1.2.6 adımından TB 50 mL 100 µg/mL ampisilin ile içeren bir autoclaved 250 mL Cam şişe ekleyin. 20-24 h 37 ° C'de sallayarak ile kültür.</li>
		<li>Kültürlü E. coli 50 mL konik tüp ve 30 dk salıncak-kova rotor kullanarak 3.450 x g oda sıcaklığında, santrifüj aktarın. Orta atın. E. coli Pelet-80 ° C'de kaydetmek</li>
		<li>Hücre resuspension çözümü 3 mL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) E. coli için cips ve tamamen askıya alma. Hücre lizis çözümü 3 mL ekleyin (bakınız Tablo malzemeler), karışımı yavaşça bu ters çevirme tarafından tüp 10 x ve 5 min için buz tutmak (zamanında almak belgili tanımlık zaman). Nötralizasyon çözüm 6 mL ekleyin (bkz. Tablo reçetesi) tüp giderek dokunarak ile karıştırın ve daha sonra 10 min için buz üzerinde tutmak.</li>
		<li>30 dk salıncak-kova rotor kullanarak için 4 ˚C'de 3.450 x g , tüp santrifüj kapasitesi. DNA içeren çözüm yeni bir 50 mL konik tüp aktarmak ve DNA arıtma reçine 10 mL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek). Reçine yavaşça askıya alma.</li>
		<li>625 x g 1dk salıncak-kova rotor kullanarak için de tüp santrifüj kapasitesi. Çözüm atın ve reçine altındaki koruyun.</li>
		<li>15 mL sütun yıkama çözeltisi ekleyin (80 mM potasyum asetat, 8.5 mM Tris-HCl [pH 7,5], 40 µM EDTA ve % 55 etanol) 50 mL konik tüp ve yavaşça reçine askıya almak için salla. 1.2.11 arasındaki adımları yineleyin. Not: Sütun yıkama çözüm dietil pyrocarbonate (DEPC) kullanılarak hazırlanması gerekir-tedavi su veya su nükleaz ücretsiz.</li>
		<li>5 mL sütun yıkama çözeltisi 50 mL konik tüp ekleyin ve reçine ile 5 mL damlalıklı askıya alma. Reçine sütununa uygulamak vakum manifold üzerinde ayarlanmış ( Tablo malzemelerigörmek) bu. Reçine kuru kadar sütun vakum. 6 mL sütun yıkama çözeltisi sütun ve vakum için ekleyin.</li>
		<li>Görsel olarak reçine kurur sonra havzanın sütundan ayırmak. Sütun (reçine) alt bölümünde 1,5 mL tüp aktarın. Sütun 2 min bir microcentrifuge reçine kurumasını kullanmak için maksimum hızda santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Sütun (reçine) alt bölümünde yeni bir 1,5 mL tüp aktarın. Nükleaz ücretsiz su 300 µL sütununu ekleyin ve bütün reçine sırılsıklam olana kadar bekleyin.</li>
		<li>Plazmid DNA içeren çözüm (200-250 µL) toplamak 1 dk için maksimum hızda sütun santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Fenol-kloroform (1:1), sonra kloroform ile DNA içeren çözümle aşağıdaki gibi davran.<ol>
<li>Iyice çalkalayınız ve 2 min bir microcentrifuge kullanarak için maksimum hızda santrifüj kapasitesi fenol kloroform (1:1) aynı hacmi DNA içeren çözüm (200-250 µL) ekleyin. Üst katmanı (DNA içeren çözüm) toplamak ve yeni bir 1,5 mL tüp ekleyin. 1 x bu adımı yineleyin.</li>
			<li>Kloroform aynı hacmi DNA içeren (200-250 µL) ekleyin, sallamak iyi ve 1 dk. maksimum hızda santrifüj üst katmanı (DNA içeren çözüm) toplamak ve bir 1,5 mL tüp ekleyin. Not: Bazı hücreler hücresel sinyal endotoksin (lipopolysaccharide) neden olmaktadır. Böyle gizemli bir etkisi önlemek için adım 1.2.17, hangi-ebilmek azaltmak endotoksin kirlenme önerilir.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Plazmid DNA gibi etanol yağış tekniği kullanarak çökelti.<ol>
<li>1/9 3 M sodyum asetat (pH 5.5) DNA karışımı hacminin ekleyin ve 20 x 3M sodyum asetat hacminin % 100 etanol DNA içeren çözüm için. Örneğin, 3 M sodyum asetat 27,8 µL ve 278 µL % 100 etanol (son 555.8 µL birimdir) DNA çözüm 250 µL için ekleyin.</li>
			<li>Çözüm için 20 dk-80 ° C'de en az tutun. 20 dk 4 ˚C az için maksimum hızda santrifüj kapasitesi. Çözüm atın ve Pelet koruyun. 200 µL % 75 etanol ekleyin ve tüp içine durulayın. 4 ° C'de 20 dk santrifüj kapasitesi, çözüm atın ve Pelet koruyun. Vakum yoğunlaştırıcı kullanarak DNA Pelet kuru.</li>
			<li>100-250 µL TE arabelleği (pH 8.0) tüp ekleyin. DNA Pelet dağıtılması ve dalga boyu 260 bir spektrofotometre kullanarak DNA toplama kontrol nm. DNA konsantrasyonu 0.5 mg/mL etrafında tutmak.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. memeli iki-hibrid tahlil
<ol><li>Hücreleri korumak.<ol>
<li>İnsan hepatosellüler karsinom HepG2 hücrelerde 750 mL, 175 cm2 doku kültürü şişesi ile fenol red ücretsiz minimum temel medya (MEM) % 10 fetal Sığır serum ile desteklenmiş Kültür (FBS; ısı inaktive), 2 mM L-glutamin ve % 1 penisilin-streptomisin çözüm (antibiyotik) hücreleri korumak için.</li>
		<li>%5 CO2hücrelerinde kültür-hücreleri yaklaşık % 90 birleşmesi olana desteklenmiştir, 37 ° C kuluçka makinesi. Not: östrojenik arka plan etkinliğini azaltmak için orta fenol red-ücretsiz tüm M2H deneyler için kullanılmalıdır. Bu adım bir temiz tezgah/biyolojik güvenlik kabin içinde gerçekleştirilmelidir. Hücreleri genel memeli hücre kültür protokol7takip sağlanmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücreleri transfection için hazır olun. Not: Aşağıdaki yordam adımları kabine temiz tezgah/biyolojik güvenlik içinde gerçekleştirilmelidir. Hücreler kültürlü/inkübe bir % 5 CO2'-Bu adımda her zaman desteklenmiştir, 37 ° C kuluçka makinesi.<ol>
<li>24-şey plakaları % 90 konfluent hücrelere replate; hücreleri 1 durulama x fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile.</li>
		<li>Kültür şişeye 7 mL % 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 1-2 min için hücreleri kültür balonun içinde temiz bir Bank oda sıcaklığında tutarken ıslatın. Tripsin-EDTA çözümünün bir parçası kaldırmak ve 1-2 mL çözüm kültür şişeye bırakın. 1-2 min için kuluçka kültür şişeye kuluçkaya.</li>
		<li>Hücreleri ayırmak ve mikroskop altında hücreleri denetleyin şişeye alt şaplak at. Not: hücreleri için şişesi hala iliştirilmişse, başka bir 1-2 min için kuluçkaya ve, sonra 2.2.3 arasındaki adımları yineleyin.</li>
		<li>% 10 ile desteklenmiş fenol red ücretsiz MEM hücrelerde askıya alma (ısı-inaktive) kömür elimden FBS, 2 mM L-glutamin ve % 1 penisilin-streptomisin çözüm. Not: Kömür elimden FBS serum kaynaklı endojen östrojen etkisini azaltmak için kullanılmalıdır.</li>
		<li>Hücre sayısı ve yoğunluğu 1.2 x 105 hücreleri/iyi bir 24-şey plaka hücrelerde tohum. Üç kuyular (onaylatılacak) her veri noktası için atayın.</li>
		<li>Hücreleri gecede kültür. 2.4.1 adıma devam edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Bir DNA karışımı transfection için hazır olun. Not: Aşağıdaki plazmid DNA'lar transfected bir kuyuda: 100 pG5-Luc muhabir plazmid, 50 ng ng GAL4DBD füzyon protein (pBIND) için ifade plazmid ve 50 ifade plazmid VP16AD füzyon protein (anlaşma) için ng.<ol>
<li>Ligand-bağımlı ERα yakın dimerization etkinliğini çözümlemeye, aşağıdaki kombinasyonları (Şekil 3) hazırlayın. Kombinasyon (ı): pG5-Luc pBIND-hERαEF + Paktı ve pG5-Luc + pBIND-mERαEF + Paktı. Kombinasyon (II): pG5-Luc + pBIND-hERαEF + Paktı-hERαEF ve pG5-Luc + Paktı-mERαEF pBIND-mERαEF. Kombinasyon (III): pG5-Luc + pBIND + Paktı-hERαEF ve pG5-Luc + pBIND + Paktı-mERαEF. Not: Kombinasyon (i) insan ERα yakın ve fare ERα yakın, bazal deneysel düzeyde sırasıyla temsil eder. Sonuç ligand ile son derece yüksek bir düzeyde yalnız gösteriyorsa, bu olanaksız bu ligand (Örneğin, dietilstilbestrol [DES]) ile kullanmak için bir yöntemdir. Kombinasyon (II) dimerized insan ERα yakın ve dimerized fare ERα yakın, düzeyleri sırasıyla temsil eder. Kombinasyon (III) negatif denetimlerinizi temsil eden; sadece deneme sistemi arka plan düzeyini değerlendirmek ilk kez gerçekleştirildiğinde bu seti kullanın.</li>
		<li>Karıştırma önce toplam hesaplamak transfection için kuyu sayısı dayalı gerekli DNA miktarı. Triplicates ve beş veri noktalarında yapılan deneylerde, iki 1,5 µL tüpler kombinasyonları (i) ve (II) için aşağıdaki plazmid DNA'lar karıştırmak: pG5-Luc, 5 (veri noktaları) 3 (kuyu) x 100 ng x 1500 = ng (15 µL); pBIND-mERαEF, 5 (veri noktaları) 3 (kuyu) x 50 ng x 750 = ng (7,5 µL); Paktı (kombinasyon i) veya Paktı-mERαEF (için kombinasyon II), 5 (veri noktaları) 3 (kuyu) x 50 ng x 750 = ng (7,5 µL). Not: Her plazmid DNA çözüm 0.1 µg/µL bölgedir.</li>
		<li>Etanol yağış tekniği kullanarak DNA karışımı çökelti. 1/9 3 M sodyum asetat (pH 5.5) DNA karışımı hacminin ekleyin ve 20 x 3M sodyum asetat hacminin % 100 etanol DNA karışımı için. O zaman, girdap tüp. Not: Örneğin, 3 M sodyum asetat 3.4 µL ve 34 µL % 100 etanol 30 µL adım 2.3.2 örneği plazmid DNA karışımı ekleyin. Bu adım bir değişmez transfection durumu tutmaya yardımcı olur ve biyolojik emanet dolabı bu adımı gerçekleştirmek gerekli değildir.</li>
		<li>Karışımı bir gecede-20 ° C'de tutmak 4 ° C'de 20 dk için maksimum hızda santrifüj kapasitesi (Pelet görünmez) çözüm atın. 120 µL % 75 etanol tüp ekleyin; o zaman, tüp içine durulayın. 4 ° C'de 20 dk santrifüj Çözüm atmak ve vakum yoğunlaştırıcı için 30 dk kullanarak DNA karışımı kurumasını bekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfection gerçekleştirin. Not: Aşağıdaki adımları temiz bir Bank ya da biyolojik Emanet kabine içinde gerçekleştirilmelidir.<ol>
<li>Ertesi sabah, bir 24-şey plaka (Kimden adım 2.2.6) numaralı seribaşı hücreleri durulama 2 x 0.5 mL PBS (Oda sıcaklığında) ile.</li>
		<li>Taze fenol red ücretsiz MEM % 10 ile desteklenmiş sıcak (37 ° C) kömür-(ısı-inaktive) FBS ve her şey (0.5 mL orta/de) antibiyotiklere olmadan 2 mM L-glutamin elimden ekleyin. Hücreleri bir % 5 CO2' deki tutmak-desteklenmiştir, 37 ° C kuluçka makinesi.</li>
		<li>Kurutulmuş plazmid DNA karışımı (Kimden adım 2.3.4) Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal Orta (DMEM) (hiçbir serum, fenol red içermeyen, glutamin; 13 µL/iyi) askıya alma. DMEM kuyu transfection için dizi tutarlarını hesaplamak. Not: 15 wells (i) x 13 µL birleşimi için 195 µL ve (ii) x 13 µL birleşimi için 15 wells = 195 µL =.</li>
		<li>Transfection reaktif askıya alma ( Tablo reçetesi; görmek 1,5 µL/iyi) DMEM içinde (12.5 µL/de) başka bir 1,5 mL tüp içinde. Transfection reaktif ve kuyular için transfection dizi DMEM miktarlarını hesaplamak. Not: 30 [kombinasyon için 15 wells] (i) ve 15 kuyular için kombinasyon (II) transfection reaktif 1,5 µL + 30 x 12.5 µL DMEM, x 420 µL =.</li>
		<li>Her tüp (Kimden adım 2.4.3) transfection reaktif ortamına (Kimden adım 2.4.4) eşit miktarda ekleyin. Tüpler, oda sıcaklığında 5-10 dk için kuluçkaya. Not: 200 µL transfection reaktif orta + 195 µL birleşimi (i) DNA karışımı 395 µL ve 200 µL transfection reaktif orta + 195 µL birleşimi (II) DNA karışımı = 395 µL =. Bu kombinasyon (i) ve (ii) tüpler transfection reaktif orta eşit bir birim eklemek önemlidir. Bu adımda orta kullanmak gerekli değildir.</li>
		<li>Her kuyudan (25 µL/de) 24-şey plaka (adım 2.4.2) kombine karışıma (Kimden adım 2.4.5) ekleyin ve %5 CO26 h için hücreleri kuluçkaya-desteklenmiştir, 37 ° C kuluçka makinesi.</li>
		<li>Transfection orta 24-şey plaka kaldırın. Taze fenol red ücretsiz MEM takıma % 10 ile sıcak (37 ° C) kömür-mahrum (ısı-inaktive) FBS, 2 mM L-glutamin, % 1 penisilin-streptomisin çözüm ve ligand (etanol askıya) ekleyin (0.5 mL orta/de). 16-18 h % 5 CO2için hücreleri kültür-desteklenmiştir, 37 ° C kuluçka makinesi.</li>
	</ol></li>
	<li>Örnekleri hasat.<ol>
<li>PBS 1 mL hücrelerle durulama ve daha sonra 1 pasif lizis arabellek x 100 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
		<li>Şiddetle 24-şey plakaları hücreleri ayırmak için bir girdap mikser ile çalkalanır.</li>
		<li>Tabak (hücre lysates) dondurma analiz önce-80 ° C'de 1 x sıvı azot veya kaydedin. Oda sıcaklığında onlar kadar tahlil hemen önce tabakları bir shaker şiddetle çalkalanır. Not: Bu işlem düzensiz luciferase aktivitesinin anormal değerler görünmesini engeller.</li>
	</ol></li>
	<li>Bir çift-luciferase tahlil gerçekleştirin.<ol>
<li>Reaktifler çift-luciferase tahlil sistemi için hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek).<ol>
<li>Luciferase tahlil substrat (LAS) tampon yapmak için tüm luciferase tahlil arabellek cam kahverengi şişede olan luciferase tahlil substrat içine ekleyin. -20 ° C'de LAS arabelleğe kaydetme Not: Kullanmadan önce oda sıcaklığına LAS arabellek ısınma.</li>
			<li>Renilla luciferase substrat (RLS) tampon yapmak için Renilla luciferase substrat ve 1:50 oranında Renilla luciferase arabellek karıştırın. Taze HBS her tahlil için tampon ve siyah bir tüp veya folyo tarafından gölgeli bir tüp kullanmak olun. Taze bir arabellek yapma HBS arabellek miktarını hesaplamak. Not: HBS arabellek için oda sıcaklığında kullanmadan önce ısınma.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Reaktifleri Mikroplaka Okuyucu ayarlayın.<ol>
<li>Yıkama enjeksiyon % 70 etanol ile 2 x hatlarını; sonra yıkama hatları 2 x su ile. Not: Bu tahlil sonuçları rahatsız edici önlemek önemlidir.</li>
			<li>LAS P-enjektör için arabellek kümesi satır (ilk enjeksiyon) ve HBS arabellek M-Enjektör hattı (ikinci enjeksiyon). Bu arabellekleri birlikte kullanmayın. HBS arabellek luciferase etkinliği engeller.</li>
		</ol>
</li>
		<li>96-şey beyaz plastik levha (Kimden adım 2.5.3) hasat örnekleri 10 µL uygulanır.</li>
		<li>Aşağıdaki ayarları Mikroplaka Okuyucu için geçerlidir. P-enjektör için 50 µL, bir gecikme 2 hacmi kullanın s ve 50 µL/s hızında. M-enjektör için 50 µL, bir gecikme 2 hacmi kullanın s ve 50 µL/s hızında 15 s. kümesinin bir entegrasyon zaman sıcaklık 25 ° C'ye ayarla.</li>
		<li>Mikroplaka Okuyucu çalıştırın.</li>
		<li>Luciferase aktivitesi (IPValue) değerleri ve veri satın alma programı kullanarak Renilla luciferase etkinliğini (IMValue) değerlerini kaydedin (bkz. Tablo malzeme).</li>
		<li>Veri toplama sonra enjeksiyon hatları yıkama (bkz. Adım 2.6.2.1).</li>
	</ol></li>
	<li>Veri çözümlemesi gerçekleştirin.<ol>
<li>Normalleştirilmiş değerleri (IPValue/IMValue) veri analizi için kullanın.</li>
		<li>Araç (0 nM ligand) ile birlikte (i) [pG5-Luc + pBIND-ERαEF + Paktı] normalleştirilmiş değerini düzeyi bazal düzeyi ve ERα yakın homodimerized hesaplanması için 1 olarak ayarlayın. Düzeyleri "Göreceli etkinlik" olarak gösterilir.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+F+domain+of+estrogen+receptor+%CE%B1+is+involved+in+species-specific%2C+tamoxifen-mediated+transactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).</li>
<li>Brzozowski, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+agonism+and+antagonism+in+the+oestrogen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor.</a> Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).</li>
<li>Shiau, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+estrogen+receptor%2Fcoactivator+recognition+and+the+antagonism+of+this+interaction+by+tamoxifen%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen.</a> Cell. 95 (7), 927-937 (1998).</li>
<li>Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+F-domain+of+estrogen+receptor-alpha+inhibits+ligand+induced+receptor+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).</li>
<li>Montano, M. M., Müller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carboxy-terminal+F+domain+of+the+human+estrogen+receptor%3A+role+in+the+transcriptional+activity+of+the+receptor+and+the+effectiveness+of+antiestrogens+as+estrogen+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 9 (7), Baltimore, MD. 814-825 (1995).</li>
<li>Koide, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Regions+within+the+F+Domain+of+the+Human+Estrogen+Receptor+%CE%B1+that+Are+Important+for+Modulating+Transactivation+and+Protein-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor α that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions.</a> Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).</li>
<li>Mitry, R. R., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMitry%2C+RR+%22Human+Cell+Culture+Protocols%22">Human Cell Culture Protocols</a>. , Humana Press. (2011).</li>
<li>Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transactivation+Function-2+of+Estrogen+Receptor+%CE%B1+Contains+Transactivation+Function-1-regulating+Element%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor α Contains Transactivation Function-1-regulating Element.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).</li>
<li>Huang, H. -J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+negative+regulatory+surface+within+estrogen+receptor+alpha+provides+evidence+in+support+of+a+role+for+corepressors+in+regulating+cellular+responses+to+agonists+and+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 16 (8), Baltimore, MD. 1778-1792 (2002).</li>
<li>Chang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+LXXLL+nuclear+receptor-coactivator+interaction+motif+using+combinatorial+peptide+libraries%3A+discovery+of+peptide+antagonists+of+estrogen+receptors+alpha+and+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta.</a> Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).</li>
<li>Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+%CE%B1+L543A%2C+L544A+mutation+changes+antagonists+to+agonists%2C+correlating+with+the+ligand+binding+domain+dimerization+associated+with+DNA+binding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor α L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar bildirmek için bir şey yok.

Burada, ERα yakın homodimerization aktivite örnek olarak algılamak için tahlil koşullar odaklanan M2H tahlil için protokol açıkladığımız. Genel olarak, M2H tahlil ligand-bağımlı ERα yakın dimerization etkinlik değerlendirmesi için popüler değil. Bu ERα bir transkripsiyon etkinleştirme işlev sahip yakın nedeniyle. Hangi etkinlik rahatsız ediyor, bazı durumlarda, M2H tahlil sonuçları. Biz burada göstermek gibi ancak, M2H tahlil yakın (Örneğin, 4OHT, SERMs) AF-2 transactivation işlevi etkinleştirmezseniz belirli ma...

Östrojen reseptör Alfa (ERα) östrojenik ligand-bağımlı transkripsiyonu düzenleyicisidir. Amino asit sequenceof ERα türler arasında son derece korunmuş. İnsan arasında daha yüksek Homoloji nedeniyle ve ERα fare, bu reseptörleri işlevini, aynı düşünce ve östrojenik maddeler (Örneğin, Tamoksifen) bu türlerin farklı etkinlik türün farklılıkları nedeniyle oluşur kimyasal metabolizmaları ERα yapısal farklılıklar tarafından değil. ERα son derece A F etki alanlarına belirlenmiş nükleer reseptör (NR) üst aile arasında yaygın etki alanı yapılarına korunmuş. E veya ligand bağlayıcı etki alanı (yakın)-ligand taşıması cep ve transkripsiyon aktivasyon fonksiyonu 2, içerir AF-2 adlı. F etki alanı hemen E etki alanına bitişik yerelleştirilmiştir ve NRs arasında en değişken etki alanıdır. Hatta insan arasında ve ERα fare, Homoloji F etki alanının önemli ölçüde diğer etki alanları1daha düşüktür. ERα ligand bağlı yakın (ERα klasik eylem) ligand-bağımlı Gen transkripsiyonu düzenleyen için doğrudan belirli östrojen duyarlı DNA öğeyi bağlamak için ERα protein homodimerization artırır. Helix 12 (AF-2 çekirdek etki alanı) ile estradiol (E2) - ya da 4-hidroksi-tamoxifen (4OHT) - Diferansiyel konumlandırma bağlı yakın dimer2,3Crystallographic çalışmalar ortaya koymuştur. ERα F etki alanı (45 amino asitler) helix 12 doğrudan bağlayın. Ancak, ERα yakın dimerization bu eklentinin helix 12 üzerinden 45 amino asitlerin (F etki alanı) etkisi ile ilgili hiçbir bilgi yoktur. Bu çalışmada, bir memeli iki-hibrid (M2H) tahlil kullanarak species-specific 4OHT bağlı ERα yakın homodimerization F etki alanına katkısını göstermek.
M2H tahlil üç farklı plazmid DNA'lar tanıtımı memeli hücrelerinde protein-protein etkileşimlerini göstermek için bir yöntemdir: GAL4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı (DBD) füzyon ERα yakın ve VP16AD füzyon ERα yakın hızlı, iki protein ifade plazmid ve bir GAL4RE erimiş luciferase ifade muhabir plazmid. Ne zaman GAL4DBD füzyon ERα yakın ve VP16AD füzyon ERα yakın etkileşim (yapmak bir dimer) hücrelerde bu protein kompleksi için GAL4RE bağlar ve, sonra luciferase gen ekspresyonu VP16AD bağlı transactivation işlevi aracılığıyla etkinleştirir. YAKIN homodimerization düzeyini luciferase aktivite değerlendirilebilir.
Maya iki-hibrid (Y2H) tahlil Maya ana bilgisayar ortamı olarak kullanır aynı ilkeye göre alternatif bir yöntemdir. Y2H sistemi kullanarak önceki raporları F-etki alanı-kesme insan ERα yakın E2 bağımlı coactivator işe alım, F etki alanı E2-aracılı transkripsiyon4engeller sonuç artar gösterdi. Bu sonuç hangi insan ERα memeli hücreleri5,6F-etki alanı-kesme zayıflatılmış transkripsiyon faaliyet gösterdiği diğer Özet Tablo raporları ile tutarsız. Son zamanlarda, bizim çalışma M2H sistemiyle, insan ERα yakın E2 bağımlı coactivator işe alım etkinliği tarafından F etki alanı kesme memeli hücrelerinde azalma ve transkripsiyon etkinlik1ile tutarlıdır gösterdi. Bu gözlemler protein-protein etkileşim fizyolojik rolü bir hücre türüne özgü şekilde ve içeriği farklıdır öneririm. M2H tahlil protein-protein etkileşim Etkinlik transkripsiyon etkinliğini belirlemek için kullanılan aynı hücresel bağlamında kanıtlamanın. Bu Y2H ya da diğer vitro protein-protein etkileşim analizleri ile karşılaştırıldığında M2H testin bir avantaj sağlar.
Seçici östrojen reseptör modülatörleri (SERMs) (Örneğin, 4OHT) ERα-aracılı transkripsiyonu düzenleyen kısmi agonist etkinliğinin moleküler mekanizmaları ile ilgili sorular kalır. M2H deneyleri ERα yakın tabanlı kısmi agonist aktivitesinde SERMs çeşitli memeli hücre türleri mekanizması çalışmaya uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>pG5-Luc</td><td>Promega</td><td>E249A</td><td>CheckMate Memeli İki Hibrit Sistemin Bileşeni</td></tr><tr><td>pBIND</td><td>Promega</td><td>E245A</td><td>CheckMate Memeli İki Hibrit Sistemin Bileşeni</td></tr><tr><td>pACT</td><td>Promega</td><td>E246A</td><td>CheckMate Memeli İki Hibrit Sistemin Bileşeni</td></tr><tr><td>Tek Atış TOP10 Kimyasal Olarak Yetkin E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj Rotoru</td><td>SORVALL</td><td>75006445</td><td></td></tr><tr><td>Döner Kovalar</td><td>SORVALL</td><td>75006441</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Yeniden Süspansiyon Çözeltisi (CRA)</td><td>Promega</td><td>A7112</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Lizis Çözeltisi (CLA)</td><td>Promega</td><td>A7122</td><td></td></tr><tr><td>Nötralizasyon Çözeltisi (NSA)</td><td>Promega</td><td>A7131</td><td></td></tr><tr><td>Kolon Yıkama Çözeltisi (CWB)</td><td>Promega</td><td>A8102</td><td></td></tr><tr><td>Sihirbaz Midipreps DNA Saflaştırma Reçinesi</td><td>Promega</td><td>A7701</td><td></td></tr><tr><td>Sihirbaz Midicolumns</td><td>Promega</td><td>A7651</td><td></td></tr><tr><td>MEM, glutamin yok, fenol kırmızısı yok</td><td>Gibco</td><td>51200038</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td></td></tr><tr><td>%0.5 Tripsin-EDTA (10x)</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (100x)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>Gemini-Bio</td><td>100-106</td><td>Isı ile etkisiz hale getirilmiş</td></tr><tr><td>Kömür: dekstran sıyırma fetal sığır serumu</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-119</td><td>Isı ile etkisiz hale getirilmiş</td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz, glutamin yok, fenol yok</td><td>Transfeksiyon için</td><td>kırmızı Gibco</td><td>31053028</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>Pasif Lizis 5X Tampon</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td></td></tr><tr><td>Çift Lusiferaz Raportör Test Sistemi</td><td>Promega</td><td>E1980</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax L mikroplaka okuyucu</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro Yazılımı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ligand bağlayıcı etki dimerization etkinliği östrojen reseptör alfa memeli iki-hibrid tahlil kullanarak algılama

Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay

Östrojen reseptör Alfa (ERα) östrojenik ligand-bağımlı transkripsiyonu düzenleyicisidir. ERα protein dizi türleri arasında son derece korunmuş. İnsan işlevinin ve fare ERαs aynı olduğunu düşündüm. Fare ve insan ERα ligand bağlayıcı etki (yakın) dimerization etkinliği memeli iki-hibrid (M2H) tahlil kullanarak fark 4-hidroksi-tamoxifen (4OHT) etkisi göstermektedir. M2H tahlil kullanan iki protein ifade plazmid (GAL4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı [DBD] füzyon yakın ve VP16 transactivation etki alanı [VP16AD] füzyon yakın) transfection yakın homodimerization aktivite memeli hücrelerinde verimliliğini kanıtlamanın ve bir GAL4 duyarlı öğesi (GAL4RE) luciferase muhabir plazmid erimiş. GAL4DBD fusion yakın ve VP16AD füzyon yakın bir dimer hücrelerde yaptığınızda, bu protein kompleksi için GAL4RE bağlar ve sonra bir luciferase gen ekspresyonu VP16AD bağımlı transkripsiyonu faaliyetleri ile hiçbir devreye giriyor. 4OHT-aracılı luciferase harekete geçirmek fare ERα yakın füzyon protein ifade plazmid insan hücrelerinde ERα yakın füzyon protein ifade transfected plazmid ile transfected HepG2 hücreleri yüksektir. Bu sonuç 4OHT bağımlı fare ERα yakın homodimerization faaliyet etkinliği insan ERα yakın yüksek olduğunu göstermektedir. Genel olarak, M2H tahlil kullanımı agonistik ligandlar yakın etkinlik bazal düzeyini arttırmak ve bu yakın dimerization aktivite tespiti engellemektedir Çünkü nükleer reseptör yakın dimerization etkinlik, değerlendirme için ideal değildir. Bulduğumuz o 4OHT ERα yakın bazal etkinlik geliştirmez. Bu belirlemek ve M2H tahlil başarıyla kullanmak için 4OHT bağlı yakın dimerization aktivite tespit edememek için önemli bir faktördür. M2H deneyleri ERα yakın tabanlı kısmi agonist etkinliği seçici östrojen reseptör modülatörleri (Örneğin, 4OHT) ile çalışmaya çeşitli memeli hücre tiplerinde uygulanabilir.

Şekil 3 olası yanıtları düzeni kombinasyonu (i) ve kombinasyon (II) plazmid transfected hücreleri görüntüler. Deneysel sonuçları Şekil 4' te gösterilmiştir. Kombinasyon (i) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + Paktı) faaliyet stimülasyon 10 tarafından gösteren nM E2 (Şekil 4A), ERα yakın ligand-bağımlı transactivation işlev etki alanı, AF-2 içerdiğinden. ERα yakın bağlar (Örneğin, E2) ...

Biz memeli iki-hibrid tahlil kullanarak 4-hidroksi-tamoxifen-bağımlı östrojen reseptör Alfa ligand bağlayıcı etki alanı dimerization etkinliğini analiz etmek için bir yöntem mevcut.

Ligand bağlayıcı etki Dimerization etkinliği östrojen reseptör Alfa memeli iki-hibrid tahlil kullanarak algılama

Estrogen receptor alpha (ER&#945;) is an estrogenic ligand-dependent transcription regulator. The sequence of ER&#945; protein is highly conserved among ...

Yani bu yöntem östrojenik ligands yeteneği hakkında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir östrojen reseptör alfa ve seçici östrojen reseptör modülatörleri mekanizmaları düzenlemek için. Bu tekniğin en büyük avantajı basit bir yöntem olmasıdır. Bu hücrelerde ligand bağımlı östrojen reseptör alfa ligand bağlayıcı etki dimerizasyon aktivitesi gösterir.Prosedürü gösteren Tanner Jefferson, grubumuzdan bir doktora öğrencisi olacak. Bu yöntem, hücrelerde östrojen reseptör ligand bağlayıcı etki dimerizasyon aktivitesini tespit etmek için üç farklı plazmid kullanır. pG5-Luc dimerizasyon aktivitesinin etkinliğini tespit etmek için luciferase muhabiri plazmid olduğunu.pBIND fare östrojen reseptörü alfa EF bir galaktoz duyarlı transkripsiyon faktörü GAL4 DNA bir ana erimiş fare östrojen alfa ligand bağlayıcı etki alanı ifade plazmid bağlayıcı pG5-Luc muhabiri GAL4 duyarlı eleman bağlanır. pACT fare östrojen reseptörü alfa EF segment protein VP16 aktivasyon etki alanı doğrudan pG5-Luc muhabiri ne bağlamaz fare östrojen reseptör alfa ligand bağlayıcı etki alanı ekspresyonu plazmid erimiş segment protein iaktive bir herpes simpleks virüs transaktivolduğunu. Uygun ligand mevcut olduğunda, pBIND fare östrojen reseptörü alfa EF ve pACT fare östrojen reseptörü alfa EF plazmidler türetilen proteinler östrojen reseptörü alfa ligand bağlayıcı etki alanı ile bağlanır.Dimerizasyon verimliliği luciferase aktivitesi tarafından belirlenir. En önemli adım pBIND fare östrojen reseptörü alfa EF türetilmiş protein aktivitesini kontrol etmektir. PACT östrojen reseptörü alfa EF plazmid olmadan her ligand pBIND türetilmiş östrojen reseptör alfa ligand bağlama etki alanı aktivitesi ligand bağımlı östrojen reseptör ligand bağlayıcı etki dimerizasyon aktivitesi analiz etmeden önce değerlendirilmelidir.Kombinasyon başına iki 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpler içine uygun plazmid kombinasyonları ekleyerek başlayın. DNA karışımının iki kombinasyonunu hazırlayın. İlk tüp pG5-Luc içerir, pBIND-östrojen reseptör-alfa EF, ve boş pACT plazmidler.İkinci tüp pG5-Luc içerir, pBIND-östrojen reseptör-alfa EF, ve pACT-östrojen reseptör-alfa EF plazmidler. DNA'yı çökertmek için, her tüpteki DNA karışımına üç molar sodyum asetat ve %100 etanol 20X üç molar sodyum asetat hacminin 1/9'u dna karışımı hacmini ekleyin ve tüpleri girdaplayın. Ertesi sabah maksimum hızda santrifüj önce 20 derece santigrat gecede karışımları saklayın.Süpernatantları atın ve tüp başına %75 etanolün 120 mikrolitresinde görünmez peletleri yeniden askıya alın ve tüplerin içlerine yapışmış DNA'ları durulayın. Aynı koşullar altında ikinci bir santrifüj sonra, supernatants atın ve 30 dakika boyunca bir vakum konsantratörü DNA kuru. Transfeksiyon için, hazırlanan insan hepatosellüler karsinom hücrelerini her yıkama başına 0,5 mililitre oda sıcaklığında PBS ile iki kez yıkayın ve hücreleri 0,5 mililitre taze 37 derece fenol kırmızısız MEM ile besleyin ve %10 kömürlü ısı yalıtımlı fetal sığır serumu ve iki milimolar L-glutamin ile besleyin.Daha sonra, bireysel 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerde kuyu sayısı başına DMEM uygun hacimde kurutulmuş plazmid DNA karışımı ve transfeksiyon reaktifaskıya. Her DMEM askıda plazmid DNA karışımı tüpe eşit hacimli transfeksiyon reaktifi ortamı ekleyin. Oda sıcaklığında beş ila 10 dakikalık bir kuluçkadan sonra, hücre kültürü kuluçka makinesinde altı saatlik bir transfeksiyon için 24 kuyulu insan hepatosellüler karsinom hücre kültür plakasının uygun deneysel kuyularına 25 mikrolitre DNA karışımı ekleyin.Ve kuluçka sonunda, taze 37 derece fenol kırmızı-free MEM 0.5 mililitre ile transfeksiyon orta değiştirin 10% kömür-soyulmuş ısı inaktive FBS ile takviye, iki milimolar L-glutamin, 1% penisilin streptomisin, ve ligand başına iyi ve başka bir hücre kültürü kuvöz hücreleri dönmek 16-18 saat. Ertesi sabah, iyi başına PBS bir mililitre hücreleri yıkayın ve iyi başına pasif lysis tampon 100 mikrolitre ve bir girdap karıştırıcı ile güçlü sallayarak her kuyudan hücreleri takın. Sonra sıvı nitrojen içinde hücre lysates dondurun.Çift luciferase tsay gününde, plaka oda sıcaklığına ulaşana kadar bir çalkalayıcı üzerinde lysates sallamak ve 96-iyi beyaz plastik plaka bireysel kuyulara lysate 10 mikrolitre aktarın. Daha sonra bir mikroplaka okuyucu üzerinde her hücre lysate örnek luciferase aktivitesini okuyun. PBIND fare östrojen reseptörü alfa EF ve pACT plazmidlerinin tedavisi 10 nanomolar estradiol ile transfected hücreleri uyarır östrojen reseptör alfa ligand bağlayıcı etki ligand bağımlı transaktivasyon fonksiyonel etki alanı içerir, AF-2.Bir ve 10-nanomolar konsantrasyonları ancak, pBIND ve pACT fare östrojen reseptörü alfa EF plazmids kombinasyonu ile transfected hücrelerde luciferase aktivitesi neden, östrojen reseptör alfa ligand bağlama etki dimerizasyon aktivitesini değerlendirmek için bu prosedürün fizibilite düşündüren estradiol tedavi nin bir nanomolar kadar. 4-hidroksi-tamoksifen ile tedavi pBIND fare östrojen reseptörü alfa EF ve pACT plazmid transfected hücrelerde luciferase aktivitesi ortaya çıkarmak değildir, östrojen reseptör alfa AF-2 fonksiyonu bu ligand tarafından aktive olmadığını düşündürmektedir. 10 nanomolar konsantrasyonları ancak, pBIND ve pACT fare östrojen reseptörü alfa EF plazmids kombinasyonu ile transfected hücrelerde luciferase aktivitesi niyarışlar, bu prosedür östrojen reseptör alfa ligand bağlayıcı etki dimerizasyon aktivitesini değerlendirmek için mümkün olduğunu düşündüren 10 nanooksi-tamoksifen tedavisi nanomolar.4-hidroksi-tamoksifen ile pBIND ve pACT fare östrojen reseptör alfa ligand bağlayıcı etki alanı ekspresyonu plazmidlerin kombinasyonundan aktivite pBIND ve pACT insan östrojen reseptör alfa ligand bağlayıcı etki alanı ekspresyonu plazmidleri kombinasyonundan önemli ölçüde daha yüksektir. Bu fare östrojen reseptör alfa ligand bağlayıcı etki alanının 4-hidroksi-tamoksifen bağımlı homodimerizasyon aktivitesi daha insan östrojen reseptörü alfa ligand bağlayıcı etki daha güçlü olduğunu gösterir. Ayrıca, fare östrojen reseptör alfa ligand bir insan F etki alanı içeren bağlama etki alanının 4-hidroksi-tamoksifen bağımlı homodimerizasyon aktivitesi önemli ölçüde vahşi tip fare östrojen reseptör alfa ligand bağlama etki alanı daha düşüktür.Buna karşılık, bir fare F etki alanı içeren insan östrojen reseptörü alfa ligand bağlayıcı etki alanının 4-hidroksi-tamoksifen bağımlı homodimerizasyon aktivitesi önemli ölçüde yabani tip insan östrojen reseptör üvel alfa ligand bağlayıcı etki alanı daha yüksektir. Bu F etki alanı türlere özgü 4-hidroksi-tamoksifen bağımlı östrojen reseptör alfa ligand bağlayıcı etki homodimerizasyon aktivitesi üzerinde bir etkisi olduğunu göstermektedir. Bu prosedürü çalışırken, GAL4 DNA bağlayıcı etki alanının bazal aktivitesini test etmek için hatırlamak önemlidir östrojen reseptör üle alfa ligand ligand ligand bağlama etki alanı aktivitesi ligand ile erimiş.Bu aktivite araç tedavisi yle aynı olmalıdır.

detecting-ligand-binding-domain-dimerization-activity-estrogen

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu videoda, bitki türevli bileşiklerin östrojenik aktivitesini belirlemek için hücre bazlı bir raportör testi açıklanmaktadır. Östrojen benzeri aktiviteye sahip bir bileşik, östrojen reseptörlerine bağlanmasını taklit eder ve aşağı akış raportör enzim gen transkripsiyonunu yönlendirir. Raportör enzim, bileşiğin östrojenik aktivitesini gösteren bir reaksiyonda biyolüminesans üretir.

Fitoöstrojen Östrojenik Aktiviteyi Taramak için Östrojen Reseptör-Raportör Aktivite Testi

Ketokonazol, Pregnane X Reseptörü (PXR) aktivasyonuna bağlanır ve antagonize eder. PXR mutantlarının maya yüksek verimli ekranları, ketokonazol bağlanması için benzersiz bir bölge tanımlar. Bu maya bazlı genetik yöntem, yüzey bağlanma bölgeleriyle ilişkili ligandlarla yeni nükleer reseptör etkileşimlerini keşfeder.

Memeli Nükleer Reseptör kalıntıları tespit Maya İki melez Sistemi ters olduğunu Ligandlannın ve / veya antagonistleri ile Etkileşim

Östrojen ve mikroRNA'lar hem aracılığıyla sinyal Moleküler meme kanseri gelişiminde ve büyümesinde önemli olan. Östrojen transkripsiyon faktörleri olan östrojen reseptörleri aktive eder. Pek çok transkripsiyon faktörleri microRNA ekspresyonunu düzenleyen ve estrojen ile düzenlenen microRNA farklı büyük ölçekli teknikler kullanılarak profilli olabilir.

Meme Kanseri Hücrelerinde östrojen düzenlenmiş microRNA profil

Bu protokol, COS7 fibroblast hücreleri üzerindeki epidermal büyüme faktörü reseptörünün (EGFR) etiketlenmesini ve ardından hidratlı durumdaki tüm hücrelerin korelasyon ışık ve elektron mikroskobunu açıklar. Etiket, floresan kuantum noktaları içeriyordu. Protokol, EGFR'nin stokiyometrisini tek molekül seviyesinde incelemek için kullanılabilir.

Korelatif Mikroskopisi kullanılarak sağlam hücrelerde Epidermal Büyüme Faktörü Alıcısının stokiyometrisinden incelenmesi

Bu madde miktarının ligandlar kişisel bakım ürünlerinde (PCPs) östrojen reseptörleri alfa (ERα) ve/veya beta (ERβ) bağlamak için bir en iyi duruma getirilmiş Maya östrojen ekran sunar. Yöntem iki Renkölçer substrat seçenekleri, bir altı gün buzdolabında kuluçka kullanılmak üzere lisans dersleri ve veri analizi için istatistiksel araçlar içerir.

Kişisel bakım ürünleri için lisans öğretim laboratuvar bir maya östrojen ekran optimize kullanarak östrojenik ligandlar saptamak

İşte, bir yakınlık ligasyonu tahlil (PLA) ile yüksek hassasiyet MST1/MST2 heterodimerization sabit hücrelerdeki görselleştirmek için nasıl kullanılacağını göstermektedir.

Heterodimerization in Situ yakınlık ligasyonu tahlil kullanarak Protein izoformlarının tespiti

Herhangi bir küçük molekül ligand için istenilen yakınlık ve özgüllük ile kimyasal kaynaklı protein dimerizasyon sistemleri oluşturma birçok biyolojik algılama ve harekete uygulama olacaktır. Burada, faj la görüntülenen tek etki alanı antikor kütüphanesinin adım adım seçimi yoluyla kimyasal olarak indüklenen dimerizasyon sistemlerinin de novo mühendisliği için etkili, genelleştirilebilir bir yöntemi tanımlıyoruz.

Bir Kombinatoryal Tek Etki Alanı Antikor Kütüphanesi adım wise Faj Seçimi ile Son Derece Spesifik Kimyasal Kaynaklı Protein Dimerization Sistemleri Oluşturma

Ticari olarak mevcut bir östrojen reseptörü β muhabir testlerini, insan ve insan dışı primat gıdaları östrojenik aktivite için taramak için optimize ettik. Bilinen östrojenik insan gıda soyasının yüksek olduğunu, diğer gıdaların ise hiçbir aktivite göstermediğini göstererek bu tahlilini doğruladık.

Hücre Tabanlı Östrojen Reseptörü Kullanarak Fitoöstrojen taraması β Reporter Assay

Tek moleküllü RNA floresan in situ hibridizasyon (smFISH), belirli RNA'ların seviyelerini ve lokalizasyonunu tek hücre düzeyinde doğru bir şekilde ölçmek için bir yöntemdir. Burada, belirli RNA'ların tek hücreli nicelleştirilmesi için ıslak tezgah işleme, görüntüleme ve görüntü analizi için onaylanmış laboratuvar protokollerimizi rapor ediyoruz.

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Yeni anti-HER2 monoklonal antikorlar kullanılarak valide edilmiş bir sandviç ELISA testi sunuyoruz. Bu test, in vitro kültürlenmiş hücrelerden ve kan ve dokular dahil olmak üzere diğer örneklerden hücreye bağlı ve salınan HER2 proteininin hassas bir şekilde ölçülmesini sağlar.

Hücrelerden Salınan ve Hücrelere Bağlanan İnsan Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörü 2'nin Kapsamlı Belirlenmesi için Doğrulanmış İmmünokimyasal Test

Öğrenin, memeli iki-hibrid tahlil kullanarak östrojen reseptörü alfa ligand bağlayıcı etki dimerizasyon aktivitesini nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, seçici östrojen reseptör modülatörlerinin mekanizmalarını anlamak için basit ve etkili bir yaklaşım sunar.

Ligand bağlayıcı etki Dimerization etkinliği östrojen reseptör Alfa memeli iki-hibrid tahlil kullanarak algılama

Daha fazla video keşfet