Ligand bağlayıcı etki Dimerization etkinliği östrojen reseptör Alfa memeli iki-hibrid tahlil kullanarak algılama

Yani bu yöntem östrojenik ligands yeteneği hakkında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir östrojen reseptör alfa ve seçici östrojen reseptör modülatörleri mekanizmaları düzenlemek için. Bu tekniğin en büyük avantajı basit bir yöntem olmasıdır. Bu hücrelerde ligand bağımlı östrojen reseptör alfa ligand bağlayıcı etki dimerizasyon aktivitesi gösterir.

Prosedürü gösteren Tanner Jefferson, grubumuzdan bir doktora öğrencisi olacak. Bu yöntem, hücrelerde östrojen reseptör ligand bağlayıcı etki dimerizasyon aktivitesini tespit etmek için üç farklı plazmid kullanır. pG5-Luc dimerizasyon aktivitesinin etkinliğini tespit etmek için luciferase muhabiri plazmid olduğunu.

pBIND fare östrojen reseptörü alfa EF bir galaktoz duyarlı transkripsiyon faktörü GAL4 DNA bir ana erimiş fare östrojen alfa ligand bağlayıcı etki alanı ifade plazmid bağlayıcı pG5-Luc muhabiri GAL4 duyarlı eleman bağlanır. pACT fare östrojen reseptörü alfa EF segment protein VP16 aktivasyon etki alanı doğrudan pG5-Luc muhabiri ne bağlamaz fare östrojen reseptör alfa ligand bağlayıcı etki alanı ekspresyonu plazmid erimiş segment protein iaktive bir herpes simpleks virüs transaktivolduğunu. Uygun ligand mevcut olduğunda, pBIND fare östrojen reseptörü alfa EF ve pACT fare östrojen reseptörü alfa EF plazmidler türetilen proteinler östrojen reseptörü alfa ligand bağlayıcı etki alanı ile bağlanır.

Dimerizasyon verimliliği luciferase aktivitesi tarafından belirlenir. En önemli adım pBIND fare östrojen reseptörü alfa EF türetilmiş protein aktivitesini kontrol etmektir. PACT östrojen reseptörü alfa EF plazmid olmadan her ligand pBIND türetilmiş östrojen reseptör alfa ligand bağlama etki alanı aktivitesi ligand bağımlı östrojen reseptör ligand bağlayıcı etki dimerizasyon aktivitesi analiz etmeden önce değerlendirilmelidir.

Kombinasyon başına iki 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpler içine uygun plazmid kombinasyonları ekleyerek başlayın. DNA karışımının iki kombinasyonunu hazırlayın. İlk tüp pG5-Luc içerir, pBIND-östrojen reseptör-alfa EF, ve boş pACT plazmidler.

İkinci tüp pG5-Luc içerir, pBIND-östrojen reseptör-alfa EF, ve pACT-östrojen reseptör-alfa EF plazmidler. DNA'yı çökertmek için, her tüpteki DNA karışımına üç molar sodyum asetat ve %100 etanol 20X üç molar sodyum asetat hacminin 1/9'u dna karışımı hacmini ekleyin ve tüpleri girdaplayın. Ertesi sabah maksimum hızda santrifüj önce 20 derece santigrat gecede karışımları saklayın.

Süpernatantları atın ve tüp başına %75 etanolün 120 mikrolitresinde görünmez peletleri yeniden askıya alın ve tüplerin içlerine yapışmış DNA'ları durulayın. Aynı koşullar altında ikinci bir santrifüj sonra, supernatants atın ve 30 dakika boyunca bir vakum konsantratörü DNA kuru. Transfeksiyon için, hazırlanan insan hepatosellüler karsinom hücrelerini her yıkama başına 0,5 mililitre oda sıcaklığında PBS ile iki kez yıkayın ve hücreleri 0,5 mililitre taze 37 derece fenol kırmızısız MEM ile besleyin ve %10 kömürlü ısı yalıtımlı fetal sığır serumu ve iki milimolar L-glutamin ile besleyin.

Daha sonra, bireysel 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerde kuyu sayısı başına DMEM uygun hacimde kurutulmuş plazmid DNA karışımı ve transfeksiyon reaktifaskıya. Her DMEM askıda plazmid DNA karışımı tüpe eşit hacimli transfeksiyon reaktifi ortamı ekleyin. Oda sıcaklığında beş ila 10 dakikalık bir kuluçkadan sonra, hücre kültürü kuluçka makinesinde altı saatlik bir transfeksiyon için 24 kuyulu insan hepatosellüler karsinom hücre kültür plakasının uygun deneysel kuyularına 25 mikrolitre DNA karışımı ekleyin.

Ve kuluçka sonunda, taze 37 derece fenol kırmızı-free MEM 0.5 mililitre ile transfeksiyon orta değiştirin 10% kömür-soyulmuş ısı inaktive FBS ile takviye, iki milimolar L-glutamin, 1% penisilin streptomisin, ve ligand başına iyi ve başka bir hücre kültürü kuvöz hücreleri dönmek 16-18 saat. Ertesi sabah, iyi başına PBS bir mililitre hücreleri yıkayın ve iyi başına pasif lysis tampon 100 mikrolitre ve bir girdap karıştırıcı ile güçlü sallayarak her kuyudan hücreleri takın. Sonra sıvı nitrojen içinde hücre lysates dondurun.

Çift luciferase tsay gününde, plaka oda sıcaklığına ulaşana kadar bir çalkalayıcı üzerinde lysates sallamak ve 96-iyi beyaz plastik plaka bireysel kuyulara lysate 10 mikrolitre aktarın. Daha sonra bir mikroplaka okuyucu üzerinde her hücre lysate örnek luciferase aktivitesini okuyun. PBIND fare östrojen reseptörü alfa EF ve pACT plazmidlerinin tedavisi 10 nanomolar estradiol ile transfected hücreleri uyarır östrojen reseptör alfa ligand bağlayıcı etki ligand bağımlı transaktivasyon fonksiyonel etki alanı içerir, AF-2.

Bir ve 10-nanomolar konsantrasyonları ancak, pBIND ve pACT fare östrojen reseptörü alfa EF plazmids kombinasyonu ile transfected hücrelerde luciferase aktivitesi neden, östrojen reseptör alfa ligand bağlama etki dimerizasyon aktivitesini değerlendirmek için bu prosedürün fizibilite düşündüren estradiol tedavi nin bir nanomolar kadar. 4-hidroksi-tamoksifen ile tedavi pBIND fare östrojen reseptörü alfa EF ve pACT plazmid transfected hücrelerde luciferase aktivitesi ortaya çıkarmak değildir, östrojen reseptör alfa AF-2 fonksiyonu bu ligand tarafından aktive olmadığını düşündürmektedir. 10 nanomolar konsantrasyonları ancak, pBIND ve pACT fare östrojen reseptörü alfa EF plazmids kombinasyonu ile transfected hücrelerde luciferase aktivitesi niyarışlar, bu prosedür östrojen reseptör alfa ligand bağlayıcı etki dimerizasyon aktivitesini değerlendirmek için mümkün olduğunu düşündüren 10 nanooksi-tamoksifen tedavisi nanomolar.

4-hidroksi-tamoksifen ile pBIND ve pACT fare östrojen reseptör alfa ligand bağlayıcı etki alanı ekspresyonu plazmidlerin kombinasyonundan aktivite pBIND ve pACT insan östrojen reseptör alfa ligand bağlayıcı etki alanı ekspresyonu plazmidleri kombinasyonundan önemli ölçüde daha yüksektir. Bu fare östrojen reseptör alfa ligand bağlayıcı etki alanının 4-hidroksi-tamoksifen bağımlı homodimerizasyon aktivitesi daha insan östrojen reseptörü alfa ligand bağlayıcı etki daha güçlü olduğunu gösterir. Ayrıca, fare östrojen reseptör alfa ligand bir insan F etki alanı içeren bağlama etki alanının 4-hidroksi-tamoksifen bağımlı homodimerizasyon aktivitesi önemli ölçüde vahşi tip fare östrojen reseptör alfa ligand bağlama etki alanı daha düşüktür.

Buna karşılık, bir fare F etki alanı içeren insan östrojen reseptörü alfa ligand bağlayıcı etki alanının 4-hidroksi-tamoksifen bağımlı homodimerizasyon aktivitesi önemli ölçüde yabani tip insan östrojen reseptör üvel alfa ligand bağlayıcı etki alanı daha yüksektir. Bu F etki alanı türlere özgü 4-hidroksi-tamoksifen bağımlı östrojen reseptör alfa ligand bağlayıcı etki homodimerizasyon aktivitesi üzerinde bir etkisi olduğunu göstermektedir. Bu prosedürü çalışırken, GAL4 DNA bağlayıcı etki alanının bazal aktivitesini test etmek için hatırlamak önemlidir östrojen reseptör üle alfa ligand ligand ligand bağlama etki alanı aktivitesi ligand ile erimiş.

Bu aktivite araç tedavisi yle aynı olmalıdır.