Name: Bir küresel öldürme tahlil araba T hücreleri tarafından (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Öğrenin, CAR T hücrelerinin 3D tümör spheroidlerine karşı sitotoksisitesini gerçek zamanlı görüntüleme teknolojisi ve hassas immünolojik analiz kullanarak değerlendirmeyi. Bu yöntem, immünoterapi geliştirmede bağışıklık yanıtlarını dinamik olarak izlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser hibe #244388, #254817 ve #284983 altında Norveç Araştırma Konseyi tarafından desteklenen; Norveç Kanser Derneği (#6829007); Norveç Sağlık bölge Güney Doğu Grant #17/00264-6 ve #2016006.

1. nesil pulcuklarının kolorektal kanser hücre satırından
<ol><li>Yıkama HCT 116 (farklılaşma 19 küme (CD19) ve yeşil floresans Protein (GFP) ifade etmek için stabil transduced) hücre monolayers fosfat ile arabelleğe alınmış serum (PBS; 25 cm2 veya bir 75 cm2 şişesi için 10 mL 5 mL). Tripsin (0.5 mL 25 cm2 veya bir 75 cm2 şişesi için 1 mL) ekleyin ve 5 min için 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
	<li>Hücre dekolmanı mikroskop altında kontrol ve hücre ayrılma enzim tam Roswell Park Memorial Enstitüsü 160 Orta (RPMI 1640) ile nötralize (RPMI 1640 + %10 FCS + viomisin; 10 mL 25 cm2 veya bir 75 cm2 şişesi için 20 mL).</li>
	<li>Santrifüj hücre süspansiyon 500 x g 5 dakika süreyle de süpernatant pipet bir kullanarak kaldırın ve yukarı ve aşağı birkaç kez 5 mL ile tam RPM1 1640 orta pipetting tarafından resuspend.</li>
	<li>Uyumlu cep tezgahta Trypan mavi dışlama kullanarak hücreleri saymak.</li>
	<li>Santrifüj hücre süspansiyon 500 x g 5 dakika süreyle de süpernatant pipet bir kullanarak kaldırın ve 5 x 103 hücre/mL elde etmek için RPMI ortamda resuspend.</li>
	<li>Hücre süspansiyon için steril bir rezervuar aktarmak ve bir çok kanallı pipet kullanarak alt tabaklar yuvarlak bir 96 kuyuya 200 µL/iyi dağıtmak.</li>
	<li>Plaka otomatik görüntüleme cihazları bir kuluçka (37 ° C, % 5 CO2, % 95 nem) içeri aktarın.</li>
	<li>Oturum alma yazılımı içine, Zamanlama için alması seçin | Başlat Ekle gemi | Zamanlamaya göre tarama | Gemi oluşturun: yeni.</li>
	<li>
Tarama türü seçin: küresel. Faiz kanalları seçin: faz + (pulcuklarının büyüme takip için) aydınlık alan, (tümör sinyal takip etmek, satın alma zaman 300 ms) yeşil ve kırmızı (apoptosis izleyin, satın alma vakti 400 ms).
	<ol>
<li>İstediğiniz büyütme seçin: 10 x.</li>
		<li>Plaka modeli ve çekmeceyi konumunu seçin. Wells görüntü konumunu seçin. Deneme açıklamasını girin: adı, tipi hücre, hücre sayısı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analiz kurulum için Erteleme analiz kadar daha sonraseçin. Zaman çizelgesi üzerinde sağ tıklatın ve Grup aralığı tarama ayarla seçili seçeneği seçin ve ayarla eklemek inceden inceye gözden geçirmek her 4 h ve için toplam 24 h için ayarlamak istediğiniz başlangıç saatini (en az 1 h otomatik görüntüleme cihazları kuluçka sonra).</li>
	<li>
2 günde pulcuklarının büyümesi için logging içine görüntüleme yazılımı ile kontrol edin.
	<ol>
<li>Görünüm son tarar seçeneği seçin ve istenen deney üzerinde çift tıklatın. Aydınlık alan görüntü Kanallar panelinde seçin ve ardından pulcuklarının çapını ölçmek için Ölçü resim özellikleri aracını kullanabilirsiniz. İstediğiniz boyuta ulaşmak bir küresel 6 gün sürer: 0,5 mm çapında. Tam RPMI orta iyi başına 50 µL orta buharlaşma etkisi sınırlamak için 4 gün ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. nesil CD19 araba T hücreleri
<ol><li>
Genişleme CD19 araba T hücreleri Not: CD19 araba T hücrelerinin istikrarlı ifade yukarıda açıklanan16olarak sağlıklı donör PBMCs toplu retroviral iletim tarafından satın alınmıştır. Retroviral yapı CD19 araba için kodlama ikinci nesil bir araba ve fmc63 scFv zincir, CD8 menteşe ve transmembran etki alanı, bir 4-1BB co-stimulatory ve bir CD3ζ etki alanı sonunda oluşur.<ol>
<li>Genişletmek için kültür transduced T anti-CD3/28 manyetik boncuklar huzurunda bir hücre boncuk oranı 1:1 ile 10-11 gün boyunca hücreleri. Genişleme sırasında tam ortamda hücrelerdir (X-VIVO 15, %5 Serum değiştirme ve 100 U/mL rekombinant insan IL-2). Not: İdeal verimli bir genişleme için 1-2 x 106 hücre/mL yoğunluğudur. Bağlı olarak ilk sayı, hücre hücre kültür kuluçka (37 ° C, % 5 CO2, % 95 nem) şişeler (25 cm2 şişe 20 ml, 75 cm2 şişe toplam hacminin 40 ml) genişletilebilir.</li>
		<li>Aşağıdaki deneyleri için negatif kontrol grubu, Sigara transduced PBMCs CD19 araba T hücrelere paralel genişletme Protokolü (sahte anılacaktır) içerir.</li>
		<li>3. gün tarih ve ileriye doğru her gün taze orta eklemek ve gerekirse daha fazla kültür şişeler hücreleri bölmek.</li>
		<li>Günde 10-11, 500 x g 5 dakika süreyle santrifüj hücreleri süpernatant kaldırmak ve bir 50 mL tüp içine tüm hücreleri birleştirmek ve ~ 30 mL taze tam medya hücrelerde resuspend.</li>
		<li>Manyetik boncuklar kültür ortamından ayırmak için manyetik bir stand resuspended hücreleri içeren 50 mL tüp yerleştirin.</li>
		<li>2-3 dk tarafında tüp toplamak boncuk için bekleyin.</li>
		<li>Bir pipet ve yeni bir tüp transferi ile kültür orta manyetik boncuk toplama bölgelere dokunmadan kaldırın.</li>
		<li>Bir kez daha son kültür ortamı boncuklar sınırlamak için boncuk kaldırma (2.1.5–2.1.7) ile ilgili adımları yineleyin.</li>
		<li>Resuspend ve hücreleri saymak, yoğunluğu 2 x 106 hücre/ml tam orta 1'e ayarlayın.</li>
		<li>Hücrelerin en az 4 gece kadar s için tuttuğunuz. Sonra doğrudan bunları-80 ° C'de dondurmak ve uzun süreli depolama için ertesi gün bir sıvı azot tankı şişeleri aktarın. Alternatif olarak, bir dinlenme ilâ gecede acil kullanım için uzatmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CD19 araba ifade denetimde birincil T hücreleri
	<ol>
<li>Sayıları biraz donma/çözülme orta veya gecede kültür sonra farklı olabilir gibi genişletilmiş T hücreleri sayar.</li>
		<li>5 x 105 hücreleri her iki CD19 araba ve akış sitometresi tüpler ayırmak için sahte birincil T hücreleri aktarın.</li>
		<li>Hücreler akışı arabelleğe 200 μL ile yıkayın (%2 PBS FBS) ve santrifüj tüpleri 500 x g 5 dakika süreyle de kültür medyum tarafından neden olduğu herhangi bir eserler kurtulmak için çamaşır adımları yineleyin.</li>
		<li>Birincil antikor (Biotin keçi Anti-fare IgG, F(ab') ₂ parça belirli) akış arabellek 1: 200 seyreltme gerçekleştirerek hazırlayın.</li>
		<li>Antikor Mix tüp başına 100 μL hücrelerde resuspend ve 15 dk. tekrarlamak için iki kez aşırı antikor kaldırmak için önceki çamaşır adım buz üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>1: 400 seyreltme arabelleği akış olarak ikincil antikor (Streptavidin-PE) hazırlayın.</li>
		<li>Antikor Mix tüp başına 100 μL hücrelerde resuspend ve 15 dk. tekrarlamak için iki kez aşırı antikor kurtulmak için önceki çamaşır adım buz üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>Akış arabellek 200 μL tüp başına hücrelerde resuspend ve bir akış sitometresi çözümleyebilirsiniz.</li>
		<li>Negatif ve pozitif geçidi ayarla ve CD19 araba çözümlemek için kullanım alay T hücreleri T hücreleri buna göre transduced.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 3D tümör küresel öldürme tahlil
<ol><li>
6 gün sonra veya bir kez pulcuklarının istediğiniz boyuta ulaşmak, plaka kuluçka makinesi kaldırın. Bir çok kanallı pipet kullanarak, küresel plakalar 100 µL/iyi tam RMPI 1640 orta yavaşça çıkarın.
	<ol>
<li>Bu adımda, ipuçları içine doğru açı duvar pulcuklarının rahatsızlık en aza indirmek için kuyunun ile temas kaçınarak 96-wells plaka. Birim kalan yaklaşık 100 µL olmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>V kırmızı Annexin 1: 200 çözeltisi 50 µL v kırmızı Annexin tam RPMI 1640 orta 9.95 mL ile karıştırarak hazırlayın.</li>
	<li>V kırmızı Annexin çözüm 1: 200, 100 µL/iyi ekleyin.</li>
	<li>Plaka 15dk için bir kuluçka makinesi (37 ° C, % 5 CO2, % 95 nem) aktarın.</li>
	<li>15 mL tüp ve onlara 500 x g 5 dakika süreyle bir pipet kullanarak süpernatant kaldırın ve yukarı ve aşağı birkaç kez 2 mL ile tam RPM1 1640 orta pipetting tarafından resuspend santrifüj transduced araba CD19 T hücrelerinde hasat.</li>
	<li>Uyumlu cep tezgahta Trypan mavi dışlama kullanarak hücreleri saymak.</li>
	<li>Santrifüj hücre süspansiyon 500 x g 5 dakika süreyle de süpernatant pipet bir kullanarak kaldırın ve 2 x 105 hücre/mL elde etmek için RPMI ortamda resuspend.</li>
	<li>Hücre süspansiyon için steril bir rezervuar aktarmak ve bir çok kanallı pipet kullanarak alt küresel plaka yuvarlak bir 96 kuyuya 100 µL/iyi dağıtmak.</li>
	<li>Plaka geri otomatik görüntüleme cihazları bir kuluçka (37 ° C, % 5 CO2, % 95 nem) içeri aktarın.</li>
	<li>
Satın alma yazılımı içine oturum, için zamanlama alması seçin.
	<ol>
<li>İnceden inceye gözden geçirmek zaman çizelgesini sağ tıklatıp Zaman çizelgesi düzenlemek. Tarama grubu sağ tıklatın ve silin. Zaman çizelgesi üzerinde sağ tıklatın ve Grup aralığı tarama ayarla seçili seçeneği seçin ve ayarla eklemek inceden inceye gözden geçirmek her 1,5 saat ve Toplam için 24 h için.</li>
		<li>İstenen başlangıç saatini (en az 1 h otomatik görüntüleme cihazları kuluçka sonra) ayarlayın. Zamanlama taramalarıseçin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. otomatik görüntü analizi
<ol><li>Edinme oturum, Görünümü son tarar seçeneği seçin ve Analiz Başlat seçeneğini belirleyin. Yeni analiz tanımı oluşturmak seçin | Analiz türü: küresel. (Faz + aydınlık alan, yeşil ve kırmızı) çözümlemek için resmin kanallarını kene.</li>
	<li>En az 10 temsili resim seçin: genellikle, koşul ve en az 3 saat puan (başlangıç, orta ve satın alma) başına 1.</li>
	<li>Önizleme varsayılan yordam tüm görüntü yığını üzerinde analiz.</li>
	<li>Aydınlık alan maskesi parametrelerini değiştirin. Tipik parametreler şunlardır: duyarlılık 10, delik Dolgu 1000 µm2, min alan 1000 µm2. Resmin tamamını yığında önizleme ve seçilen parametrelere pulcuklarının doğru algılamak kontrol edin.</li>
	<li>Yeşil maske (GFP) parametrelerini değiştirin. Tipik parametreler şunlardır: silindir şapkalı bölümleme RADIUS 200 µm ve eşik 3 delik doldurmak 5000 µm2, ayar boyutu -2 piksel, alanı en az 3.000 µm2, kenar GCU, bölünmüş kapalı. Resmin tamamını yığında önizleme ve seçilen parametrelere pulcuklarının doğru algılamak kontrol edin.</li>
	<li>Kırmızı maske (Annexin V) parametrelerini değiştirin. Tipik parametreler şunlardır: silindir şapkalı bölümleme RADIUS 150 µm ve eşik 2 delik doldurmak 5000 µm2, ayar boyutu 0 piksel, alan dk 1000 µm2, kenar GCU, bölünmüş kapalı. Resmin tamamını yığında önizleme ve seçilen parametrelere pulcuklarının doğru algılamak kontrol edin.</li>
	<li>
Analyzer'ı Başlat.
	<ol>
<li>Analizi yapıldıktan sonra faiz ölçümü ayıklayın. Parçalanmış dosya ve sonra Grafik ölçülerini seçeneği seçin. Faiz, tarama ve iyi ölçümleri seçin. Tipik olarak, aydınlık alan sınırları içinde toplam kırmızı ve yeşil yoğunluğu aydınlık alan maskesi (Şekil 3) kullanılarak belirlenen pulcuklarının sınırlarına floresans sinyalinin kısıtlayarak en doğru ölçümler vermek. Birkaç dosya biçiminde seçilen ölçümleri "Veriüzerinde" tıklatarak ayıklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resim ve film ayıklama analiz dosya seçerek devam edin ve görüntüleri dışa aktar ve film seçeneği seçin. İki seçenek kullanılabilir ya da "olarak düşsel bilgisayar yazılımı (genellikle bileşik görüntüler), her iki"olarak üçüncü bölümü yazılım aracılığıyla dış analiz için ham veri almak için depolanan"görülen"al resim ve film için olarak görüntülenir.</li>
</ol>

<ol><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+B-lineage+cells+and+regression+of+lymphoma+in+a+patient+treated+with+autologous+T+cells+genetically+engineered+to+recognize+CD19%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19.</a> Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).</li>
<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138(2013).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>D'Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cells%3A+the+long+and+winding+road+to+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors.</a> Cell Death & Disease. 9 (3), 282(2018).</li>
<li>Amann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+innovative+3D+cell+culture+system+to+study+tumour--stroma+interactions+in+non-small+cell+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells.</a> PLoS One. 9 (3), e92511(2014).</li>
<li>Enzerink, A., Salmenpera, P., Kankuri, E., Vaheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+of+fibroblasts+induces+proinflammatory+chemokine+secretion+promoting+leukocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Clustering of fibroblasts induces proinflammatory chemokine secretion promoting leukocyte migration.</a> Molecular Immunology. 46 (8-9), 1787-1795 (2009).</li>
<li>Birgersdotter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culturing+of+the+Hodgkin+lymphoma+cell-line+L1236+induces+a+HL+tissue-like+gene+expression+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culturing of the Hodgkin lymphoma cell-line L1236 induces a HL tissue-like gene expression pattern.</a> Leukemia & Lymphoma. 48 (10), 2042-2053 (2007).</li>
<li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li>
<li>Galateanu, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.spandidos-publications.com/10.3892/ijo.2016.3467?text=abstract">Impact of multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model on anticancer drug response.</a> International Journal of Oncology. 48 (6), 2295-2302 (2016).</li>
<li>Shaheen, S., Ahmed, M., Lorenzi, F., Nateri, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-Formation+%28Colonosphere%29+Assay+for+in+Vitro+Assessment+and+Expansion+of+Stem+Cells+in+Colon+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Spheroid-Formation (Colonosphere) Assay for in Vitro Assessment and Expansion of Stem Cells in Colon Cancer.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 12 (4), 492-499 (2016).</li>
<li>Izraely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Metastatic+Microenvironment%3A+Melanoma-Microglia+Cross-Talk+Promotes+the+Malignant+Phenotype+of+Melanoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">The Metastatic Microenvironment: Melanoma-Microglia Cross-Talk Promotes the Malignant Phenotype of Melanoma Cells.</a> International Journal of Cancer. , (2018).</li>
<li>Khawar, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+Dimensional+Mixed-Cell+Spheroids+Mimic+Stroma-Mediated+Chemoresistance+and+Invasive+Migration+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Three Dimensional Mixed-Cell Spheroids Mimic Stroma-Mediated Chemoresistance and Invasive Migration in hepatocellular carcinoma.</a> Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).</li>
<li>Merker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+ErbB2-CAR-engineered+cytokine-induced+killer+cells+for+the+treatment+of+high-risk+soft+tissue+sarcoma+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of ErbB2-CAR-engineered cytokine-induced killer cells for the treatment of high-risk soft tissue sarcoma in children.</a> Oncotarget. 8 (39), 66137-66153 (2017).</li>
<li>Mittler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Content+Monitoring+of+Drug+Effects+in+a+3D+Spheroid+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncolology%22%5BJournal%5D)">High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model.</a> Frontiers in Oncolology. 7, 293(2017).</li>
<li>X Tadesse, F. G., Mensali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpredicted+phenotypes+of+two+mutants+of+the+TcR+DMF5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Unpredicted phenotypes of two mutants of the TcR DMF5.</a> Journal of Immunological Methods. 425, 37-44 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Gelecekteki kanser tedavisi doğrulamak için yenilikçi bir araç olarak pulcuklarının kullanımı son yıllarda giderek artan ilgi alanı haline gelmiştir. Pulcuklarının klasik 2D tüp bebek analiz ve içinde vivo değerlendirme arasında bir ara adım temsil eder. Yöntemi daha fazla söz7profil oluşturma gen yanı sıra mikro-çevre tümörü taklit eden açısından onların potens ile ilgili bir çok tutar. Bu yayında sunulan Protokolü Saheen adapte vd.11 ' e Incucyte S3 ve 3D tümör p...

Evlat edinen hücre aktarımı (ACT) yeni nesil kanser muamele temsil eder. Efektör hücreler (T - veya NK-hücreleri) enjeksiyon bir hasta dayanmaktadır. Bu hücrelerin genetik olarak onlara onların hedefe, tümör, rehberlik ve onu yok bir reseptör ile değiştirilebilir. Son zamanlarda bu yaklaşım B-hücre işaretçisi CD19 karşı yönetmen Chimeric antijen reseptör (araba) hasta T hücreleri seçtiğin bu kullanıcı kanser1öldürmeye tanıttığında mümkün olduğu gösterilmiştir. Yapay bir reseptör olan araba söz konusu olduğunda tasarım spesifik antikor parçaları bir varlık belirlenmiş tek zincir değişken parçası (scFv), azaltılmış etki alanı bağlama antijen oluşur T-hücre sinyal etki alanlarına bağlı. Çeşitli tasarımlar olmakla birlikte, ikinci nesil araba tasarımları TCR sinyal için CD3z ve co-stimulatory etki alanı oluşur anılacaktır en çok kullanılan sürümleri (CD28, 4-1BB, OX40, vs.) 1 , 2. ne zaman CD19 araba-T hücreleri efficaciously B hücre maligniteler3,4ile çok sayıda hasta tedavi immünoterapi alan Yasası'nın bu yeni form dikkatini çoğunu yönetmen. Bu başarının, araştırmacılar diğer epitopları için sınırlı başarı ile solid tümör hedefleyerek benzer tasarımlar yararlanmaya çalıştı. Ne yazık ki, tümör belirli antijenleri ve araba T işlenen sert tümör microenvironments kıtlığı daha az etkili solid tümör5doğru hücreleri.
Şu anda, en sık kullanılan vitro doğrulama stratejileri yalnızca bir parçası zaten belirtilen solid tümör zorlukların adres iki boyutlu (2D) sistemleri üzerinde güveniyor. Klasik, 2D vitro sistemleri bu efektör hücreler özgüllük ve işlevlerinin değerlendirmek için monolayers araba T hücreleri ve hedef kanser hücre satırlarını içerir. Bu stratejileri önemli ve hayati parçaları çalışmaların olmakla birlikte, onlar karmaşık Morfoloji ve kanser hücreleri6üç boyutlu (3D) yapısını göz önünde değil. 3D sistemleri pulcuklarının anılacaktır, kültürlü kanser hücrelerinin yeni fenotipik özellikleri tanıma yeniden yönlendirilen efektör hücreleri tarafından etkisi gen ifade profil7, hangi değişiklikleri yoluyla elde. Birgersdotter ve arkadaşları bir Hodgkin Lenfoma (HL) hücre satırı yalnızca bir 3D kültür modelinde yetiştirilen birincil tümör örnekleri8' e benzer bir gen ifade profil tutar gösterdi. Bu nedenle, pulcuklarının veya benzer 3D metodolojileri teklif Standart 2D sistemleri karşı in vitro modellerinde daha alakalı kültür. Bu tür sistemlere de verilen bir araba doğrulama sürecindeki son adım olarak görülen içinde vivo çalışmalar benzer. 2D sistemleri kanser kümeleri morfolojisi taklit etmek başarısız göz önüne alındığında, pulcuklarının araba T hücreleri önce işlevselliğini değerlendirmek için benzer oluşumlar teklif içinde vivo modelleri. Bir çalışmada, Pickl vd. tanımlanan insan epidermal büyüme faktörü reseptörü (HER2) kanser hücrelerinin overexpressing bir küresel model benzer sinyal profilleri içinde vivo modelleri9gösterdi. Bunu daha fazla pulcuklarının araba T hücrelerinin daha alakalı ve Kapat ve içinde vivo değerlendirme teklif destekler. Ayrıca, araba T-hücre doğrulama pulcuklarının karşı daha eleştirel onların etkinliğini değerlendirmek ve bazı tasarımlar içinde vivo çalışmalar için erken hareket etmesini önlemek yardımcı olabilir10; Böylece, etik ilgili araştırma için daha az sayıda hayvan kurban ederek katkıda. Ayrıca, pulcuklarının kullanarak iletişim kuralları klasik 2D sistemleri daha ve çok daha hızlı klasik içinde vivo çalışmalar ile karşılaştırıldığında daha pahalı değildir. Birlikte ele alındığında, tüp bebek ve içinde vivo çalışmalar bağlamak için standart bir uygulama haline yakında küresel çalışmalar dahil kimse tahmin edebilirsiniz.
Burada, kolon kanseri hücre satırından HCT 116 pulcuklarının hazırlanması mevcut. Bu hücre kültürünü insan CD19 molekül CD19 araba T hücreleri hassas işlemek için ve klinik olarak doğrulanmış bir araba inşa kullanarak öldürme net bir değerlendirme sağlamak için hızlı şekilde değiştirilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu</td><td>Su SIGMA-ALDRICH</td><td>D8537-500ML</td> < <td>güçlü > Lot Numarası: < / güçlü> RNBG7037</td></tr><tr><td>75 cm ve sup2; büyüme alanı şişeleri</td><td>VWR</td><td>430639 <</td> <td>güçlü > Lot Numarası: < / güçlü> 2218002</td></tr><tr><td>75 cm ve sup2; büyüme alanı şişeleri</td><td>VWR</td><td>734-2705</td><td><güçlü>Lot Numarası: < / güçlü> 3718006</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>SIGM-ALDRICH</td><td>T3924-100ml</td> <td><güçlü > Lot Numarası: < / güçlü> SLBTO777</td></tr><tr><td>RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL</td><td>Yaşam Teknolojisi (Gibco)</td><td>21875-091</td><td>Lot Numarası: 1926384</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td> Lot Numarası: 08Q3066K</td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Thermo Fischer</td><td>15750060</td><td>Lot Numarası: 1904924A</td></tr><tr><td>Tripan Mavisi Çözeltisi, %0.4</td> <td>Thermo Fischer</td><td>15250061</td><td><güçlü>Lot Numarası: < / güçlü> 1886513</td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka, yuvarlak tabanlı</td><td>VWR</td><td>734-1797</td> <td>< güçlü > Lot Numarası: < / güçlü> 33117036</td></tr><tr><td>Dynabeads İnsan T-Aktivatör CD3 / CD28</td><td>Thermo Fischer</td><td>11132D-X-VIVO</td><td></td></tr> <tr><td>15, Gentamisin L-Gln, Fenol Kırmızısı, 1 L</td><td>BioNordika ile</td><td>BE02-060Q</td><td>Lot Numarası: 8MB036</td></tr><tr><td>CTS Bağışıklık Hücresi Serumu Değiştirme</td><td>Thermo Fischer</td><td>A2596102</td><td>Lot Numarası: 1939319</td></tr><tr><td>IL-2 Proleukin</td><td>Novartis</td><td></td><td>Lot Numarası: 505938M</td></tr><tr><td>IncuCyte Annexin V Kırmızı Reaktif</td><td>Essen Bioscience</td><td>4641</td><td>Lot Numarası: 17A1025-122117</td></tr><tr><td>Reaktif Rezervuarı</td><td>VWR</td><td>89094-672</td><td><güçlü>Lot Numarası: < / güçlü> 89094-672</td></tr><tr><td>15 mL tüpler</td><td>VWR</td><td>734-1867</td> <td>< güçlü > Lot Numarası: < / güçlü> 19317044</td></tr><tr><td>anti-insan CD19-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555413</td><td><güçlü>Lot Numarası: < / güçlü > 4016990 <güçlü >RRID: < / güçlü> AB_395813</td></tr><tr><td>Biotin-SP (uzun aralayıcı) AffiniPure F (ab ') 2 Parça Keçi Anti-Fare IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-066-072</td> <td>< güçlü > Lot Numarası: < / güçlü > 129474: < güçlü >RRID: < / güçlü > AB_2338583</td></tr><tr><td>Streptavidin-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td><güçlü > Lot Numarası: < / güçlü > 5191579 < güçlü>RRID: </güçlü> AB_10053328</td></tr><tr><td>HCT 116 Kolorektal Karsinom Hattı</td><td>ATCC</td><td>CCL-247-Incucyte</td><td></td></tr> <tr><td>S3</td><td>Essen Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bir küresel öldürme tahlil araba t hücreleri tarafından

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

İmmünoterapi Aksi takdirde tedavi edilemez kansere karşı mücadele büyüyen ilgi alanı haline gelmiştir. Tüm immunotherapeutic Yöntemler arasında en çarpıcı sonuçlar, özellikle Pediatrik B akut lenfoblastik lösemi (B-ALL) ile elde edilen T hücreleri chimeric antijen reseptör (araba) yönlendirildi. Klasik doğrulama yöntemleri araba T hücrelerinin özgüllük kullanımı ve işlevselliği deneyleri hedef hücrelere süspansiyon ve xenograft modelleri karşı araba T hücrelerinin güveniyor. Ne yazık ki, tüp bebek yapılan gözlemleri kez vivo içinde elde edilen sonuçlar üzerinden decoupled ve çok çaba ve hayvanların bir adım daha ekleyerek bağışladı: 3D kültür kullanımı. Onlar hayvan modeli engrafted yükleyen tümör hücreleri 3D yapısını taklit potansiyel hedef hücrelere pulcuklarının üretim ideal bir alternatif temsil eder. Burada, evlat edinen hücre tedavisi (burada CD19 araba T hücreleri tarafından örneği) için bir doğrulama aracı olarak bir transduced kolorektal hücre satırından pulcuklarının üretmek için uygun fiyatlı, güvenilir ve kolay bir yöntem raporu. Bu yöntem küresel büyüme takip edebilirsiniz bir Gelişmiş canlı görüntüleme sistemi ile birleştiğinde, sitotoksisite ve tümör hücre apoptosis efektör hücreleri.

Şekil 1' de görüldüğü gibi bu akış sitometresi tarafından ifade CD19 arabanın T hücreleri (Şekil 1A) ve CD19 düzeyde HCT116 tümör hücre hatları (Şekil 1B) kontrol etmek önemlidir. Şekil 2 bir tipik küresel denemenin sonucu örneğidir. Otomatik görüntüleme cihazları dört farklı kanalları fotoğraf çeker: parlak alan, faz, yeşil ve kırmızı Floresans. Faz kanal pulcuklarının ...

Bu iletişim kuralı immunotherapeutic yeniden yönlendirilen T-hücre (araba T-hücreli) sitotoksisite karşı 3D yapılandırılmış kanserli hücreleri (pulcuklarının) gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için tasarlanmıştır.

Bir küresel öldürme tahlil araba T hücreleri tarafından

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Bu yöntem 3D yapı tümör hücrelerine karşı immün hücre sitotoksisite değerlendirilmesi hakkında immünoterapi alanında anahtar soruya cevap yardımcı olabilir. Bu yöntemin başlıca avantajları, basit olması ve ileri görüntüleme teknolojisi ve hassas bir immünolojik tsede biraraya vardır. PBS beş mililitre ile ilgi kolorektal kanser hücre hattı yıkama ve 37 santigrat derecede beş dakika için 0.5 mililitre tripsin ile şişe alt hücreleri kaldırarak başlayın.Bir mikroskop altında müfreze doğruladıktan sonra, tam orta 10 mililitre ile hücre dissosyasyon enzimi nötralize ve santrifüj ile hücreleri toplamak. Sayma için beş mililitre taze tam ortamda pelet resuspend ve mililitre konsantrasyonu başına üçüncü hücrelere 1,5 kez 10 hücreleri yeniden askıya. Daha sonra 96-iyi yuvarlak alt plaka her kuyuiçine hücrelerin 200 mikrolitre tohum ve 5% CO2 ve% 95 nem ile 37 derece Santigrat kuvöz içinde otomatik bir görüntüleme cihazı içinde plaka yerleştirin.Aygıtın satın alma yazılımına giriş yapın ve Satın Almak için Zamanlama'yı seçin, Gemi Ekle, Programda Taraya ve Yeni Gemi Oluştur'u başlatın. Ardından, scan türü Spheroid'i seçin ve uygun parlak alan ve floresan kanallarını seçin. Büyütmeyi 10 kata ayarlayın ve plaka modelini ve görüntüleme cihazı çekmecesindeki konumunu seçin.Görüntülenecek kuyuların konumunu seçin ve hücre adı, hücre türü ve hücre sayısını içeren deneyin açıklamasını girin. Analiz kurulumu için, Daha Sonrasına Kadar Analiz'i ertele'yi seçin, zaman çizelgesine sağ tıklayın ve Seçili Tarama Grubu Aralığını Ayarla'yı seçin ve Her dört saat ve Toplam 24 saat için Tarama Ekle'yi ayarlayın. Daha sonra otomatik görüntüleme cihazında kuluçkadan sonra başlangıç saatini en az bir saat olarak ayarlayın.Küresel büyüme ilerlemesini kontrol etmek için, her iki günde bir görüntüleme yazılımına giriş yapın ve Son Taramaları Görüntüle'yi seçin. İlgi alanı deneyine çift tıklayın ve Görüntü Kanalları panelinde Brightfield'ı seçin. Daha sonra, herhangi bir orta buharlaşma efektini sınırlamak için dört gün boyunca her kuyuda 50 mikrolitre tam ortam ekleyerek küresel lerin çapını ölçmek için Ölçü Görüntü Özellikleri aracını kullanın.Küresel ler uygun deneysel boyuta ulaştıklarında, plakayı dikkatlice açılayın ve her kuyudan 150 mikrolitrelik tam ortamı, küresel leri rahatsız etmeden nazikçe çıkarmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Daha sonra, atılan orta yı Annexin V Red'in 1 ila 200 çözeltisinin 50 mikrolitresiyle değiştirin ve plakayı 15 dakika boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. Santrifüj 15 mililitrelik konik tüp içinde CAR CD19 T hücreleri transduced ve tam orta iki mililitre pelet resuspend.Saydıktan sonra, tam orta konsantrasyon mililitre başına beşinci hücrelere iki kez 10 hücreleri seyreltin. Daha sonra her küresel içeren kuyuya 100 mikrolitre CAR CD19 T hücresi ekleyin ve plakayı otomatik görüntüleme cihazına geri döndürün. Satınalma yazılımında, Kazanılması Gereken Zamanla'yı seçin ve tarama zaman çizelgesine sağ tıklayın.Zaman Çizelgesidüzenle'yi seçin ve silmek için silmek için scan grubuna sağ tıklayın. Zaman çizelgesine tekrar sağ tıklayın ve Seçili Tarama Grubu Aralığını Ayarla'yı seçin ve Her 1,5 saat ve Toplam 24 saat için Tarama Ekle'yi ayarlayın. Ardından, otomatik görüntüleme aygıtında kuluçka ya da program taramalarını kaydet seçeneğini belirleyin.Otomatik görüntü analizi için tarama yazılımında Son Taramaları Görüntüle ve Başlatma Analizi'ni seçin. Yeni Analiz Tanımı oluştur ve analiz türü Spheroid'i seçin ve görüntü kanallarını analiz edilecek şekilde ayarlayın. En az 10 temsili resim seçin ve tüm görüntü yığınındaki varsayılan analiz yordamını önizleyin.Parlak alan maskesi parametrelerini değiştirin ve seçilen parametrelerin küresel leri doğru şekilde algıladığını onaylayarak görüntü yığınını önizleyin. Seçili parametrelerin küresel leri doğru bir şekilde algıladığını doğrulamak için yeşil maske parametrelerini değiştirin ve görüntü yığınını önizleyin. Seçilen parametrelerin küresel leri doğru şekilde algıladığını doğrulamak için kırmızı maske parametrelerini değiştirin ve görüntü yığınını önizleyin.Her zaman noktasında her olayı yakalamak için izin verecek parametreleri bulmak mümkün olmayacaktır akılda tutarak, gürültü ve duyarlılık üzerinde en iyi sinyali elde etmek için dikkat edin. Sonra analizörü başlatın. Çözümleme tamamlandığında, ilgi ölçüsünü ayıklayın ve analiz edilen dosyayı ve grafik ölçümleri seçeneğini seçin.İlgi ölçümlerini, tarama ve kuyuyu seçin. Seçili ölçümleri çeşitli dosya biçimlerinde ayıklamak için Verileri Dışa Aktar'ı tıklatın. Ardından, görüntüleri ayıklamak için çözümlenen dosyayı seçin ve Görüntüleri ve Filmleri Dışa Aktar'ı seçin.Transektasyont t hücreleri cd19 CAR ekspresyonu ve transduced kolorektal kanser hücrelerinde CD19 ekspresyonu akış sitometrisi ile doğrulanabilir. Burada, tipik bir küresel deneyin sonucu gözlemlenebilir. Sahte T hücrelerinin aksine, CD19 CAR T hücreleri özellikle kolorektal kanser hücre hattı kaynaklı sferoidler öldürmek edebiliyoruz, büyük ölçüde canlı tümör hücrelerinin sayısını azaltarak.Zaman içinde küresel sınırlar içinde toplam yeşil ve kırmızı sinyallerin evriminin izlenmesi, CD19 CAR T hücre enjeksiyonundan kısa bir süre sonra, apoptoz sinyali hızla arttıkça küreseloidlerin boyutunun hızla küçüldüğünü ortaya koymaktadır. Bu prosedürü takiben, ilaç taraması, T hücre hareketliliği veya küresel formasyon ile ilgili ek soruları yanıtlamak için toksisite tahlilleri, hücre göçü tahlilleri veya küresel yapı ölçümleri gibi diğer yöntemler de yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Spheroids, 2B hücre kültürü tek katmanlı modellere kıyasla bir hücrenin ortamını daha doğru bir şekilde temsil etmek için kullanılan bir tür 3B hücre kültürü modelidir. Örnek protokolde, bilim adamlarının bir kolorektal kanser hücre hattından sferoidler ürettiğini ve sferoidlerin büyümesini izlemek için canlı hücre görüntüleme uyguladığını göreceğiz.

Hücre Hatlarından Küresel Üretim: Üç Boyutlu (3D) Bir Hücre Kültürü Yöntemi

Bu videoda, yüksek tümör hücresi yükleri sırasında CAR T hücrelerinin tekrarlayan tümör öldürme potansiyelini değerlendirmek için tekrarlayan tümör zorluğu testini gösteriyoruz. Ayrıca, CAR T hücreleri, numunedeki CAR T hücrelerinin farklı alt popülasyonlarını belirlemek için akış sitometrisi kullanılarak analiz edilebilir.

Tekrarlayan Tümör Zorluk Testi: Tekrarlayan Tümör Öldürme Potansiyeli için Kimerik Antijen Reseptörü (CAR) T Hücrelerini Değerlendirmek İçin Bir İn Vitro Kültür Testi

Bu video, gerçek zamanlı elektriksel empedans ölçümleri aracılığıyla kanser hücrelerine karşı CAR T hücresi aktivitesini izlemek için bir yöntemi göstermektedir. İmpedanstaki değişikliklerin izlenmesi, CAR T hücrelerinin kanser hücresi sitolizini indüklemedeki etkinliğini değerlendirir ve sitotoksik yetenekleri hakkında bilgi sağlar.

CAR T Hücrelerinin Gücünü Değerlendirmek için Gerçek Zamanlı İn Vitro Sitoliz Testi

Bu video, CAR T hücrelerinin floresan proteinleri eksprese eden 3D tümör sferoidleri üzerindeki sitotoksik etkilerini değerlendiren bir in vitro testi göstermektedir. Bu değerlendirme, CAR T hücreleri ile etkileşimlerden sonra apoptotik kanser hücrelerinin dış broşüründeki açıkta kalan fosfatidilserin kalıntılarına bağlanan Annexin V kırmızı floresan probunu kullanır. Prob tarafından yayılan kırmızı floresan, bu hücreleri yeşil floresan yayan sağlıklı hücrelerden ayırt etmeye yardımcı olur.

Tümör Sferoidlerine Karşı CAR T Hücresi Sitotoksisitesini Değerlendirmek için İn Vitro Test

Bu video, kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücresi aktivitesini doğrulamak için bir in vitro testi göstermektedir. CD19 antijeni ve sitoplazmik lusiferaz eksprese eden B hücreli lenfoma hücreleri, CD19'a özgü CAR T hücreleri ile birlikte kültürlenir. Bir tümör üzerinde CD19'a CAR bağlanması, CAR T hücrelerinin tümör hücresi sitotoksisitesine neden olan sitokinleri ve toksinleri serbest bırakmasına neden olur. CAR T hücresi aktivitesi, tümör hücrelerinde salınan sitokin ve azalmış lusiferaz...

Tümöre Özgü CAR T Hücrelerinin Anti-Tümör Aktivitesini Değerlendirmek için İn Vitro Test

Bu tümör hedef hücreleri ile inkübe zaman T hücrelerinin sitotoksisiteye ölçmek için bir tek hücreli yüksek verim tahlil açıklanmaktadır. Bu yöntem, mekansal olarak tanımlanan oranlarda T hücreler ve hedef hücrelerin sınırlandırmak için alt nanolitre kuyular (~ 100.000 kuyu / dizi) ve bir yoğun, elastomerik dizisi kullanır ve efektör-hedef konjugasyon ve daha sonra apoptoz izlemek için flüoresan mikroskop ile birleştirilmiştir.

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Terapi değerlendirilmesi amaçlayan deneysel tedavi rejimleri hücre hatları, baş ve boyun Skuamöz hücreli karsinom için geçerli standart test etmemizi sağlayan bir küresel tabanlı, üç boyutlu vitro modeli evrimi tarif duyarlılık ve direnci Primer hücre insan örnekler üzerinden üzerinde içinde belgili tanımlık gelecek.

Baş ve boyun Skuamöz hücreli karsinom için bir küresel tabanlı 3D hücre kültür modelinde test terapi

Sıvı ve katı tümör hücrelerini hedefleyen kimerik antijen reseptör T hücrelerinin gücünü değerlendirmek için kantitatif gerçek zamanlı in vitro sitoz ispat sistemini tanımlıyoruz. Bu protokol diğer bağışıklık etki hücreleri değerlendirmek için uzatılabilir, yanı sıra kombinasyon tedavileri.

Katı ve Hematolojik Kanser Hücrelerini Hedefleyen İmhimik Antijen Reseptör T Hücreleri Için Gerçek Zamanlı Potens Tsay

Burada, antitümör antikorların önemli bir kanser hücresi öldürme mekanizması olan ADCC mekanizmasını modüle eden bileşikleri tanımlamak için bir yöntem sunuyoruz. NK hücrelerinin sitotoksik etkisi, Trastuzumab varlığında meme kanseri hücre sferoidlerinde ölçülür. Görüntü analizi, sferoidlerdeki canlı ve ölü öldürücü ve hedef hücreleri tanımlar.

Bir Tümör Sferoid Modelinde Antikora Bağımlı Hücresel Sitotoksisitenin Ölçülmesi: İlaç Keşfi Uygulaması

Burada, tek hücre düzeyinde hücre öldürmeyi incelemek için bir T hücresini ve bir kanser hedef hücresini kapsülleyen çift emülsiyon damlacıkları oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, büyük bir T hücresi popülasyonu içinde hem sitotoksik moleküllerin hem de hedef hücre apoptozunun ikili miktar tayinine izin verir.

Kimerik Antijen Reseptörü T hücrelerini Tek Hücre Düzeyinde Değerlendirmek için Damlacık Bazlı Sitotoksisite Testi

Öğrenin, CAR T hücrelerinin 3D tümör spheroidlerine karşı sitotoksisitesini gerçek zamanlı görüntüleme teknolojisi ve hassas immünolojik analiz kullanarak değerlendirmeyi. Bu yöntem, immünoterapi geliştirmede bağışıklık yanıtlarını dinamik olarak izlemeye yardımcı olur.

Bir küresel öldürme tahlil araba T hücreleri tarafından

Daha fazla video keşfet