Name: Fare ve insan antikoru kapsayacağını tarafından yeni nesil sıralama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Öğrenin fare ve insan antikoru kapsayıcılarını yeni nesil sıralama ile analiz etmeyi. Bu yöntem B hücresi repertuarlarını görselleştirir ve aşı etkinliği ile hastalık patogenezine dair bilgi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser AMED Grant numarası JP18fk0108011 altında bir hibe tarafından desteklenmiştir (KO ve sı) ve JP18fm0208002 (TS, KO ve YO) ve Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve Teknoloji (15K 15159) dan Grant-in-Aid KO için. Sayuri Yamaguchi ve Satoko Sasaki değerli teknik yardım için teşekkür ederiz. Editage (www.editage.jp) İngilizce dil düzenleme için teşekkür etmek istiyorum.

Tüm hayvan deneyleri kurumsal esaslarına göre ve Ulusal Enstitüsü bulaşıcı hastalıklar hayvan bakımı ve kullanımı kurulu onayı ile yapıldı. PBMCs örnekleme temsilcisi sonucu bu raporda Etik Komitesi, Ulusal Enstitüsü, bulaşıcı hastalıklar, Tokyo, Japonya, onayı ile gerçekleştirilen ve aydınlatılmış onam yazılı olarak kullanılan sağlıklı yetişkin gönüllülerden elde edildi Her katılımcıdan bir Etik Komitesi tarafından onaylanan form kullanarak.
1. primer tasarım
<ol><li>CDNA immünglobulin yükseltmek için bir evrensel ileri astar tasarım mRNA olarak 5'-yarış11,12 ve akıllı-PCR13 teknikleri kullanılan PCR astar, önyargı olmadan.</li>
	<li>İmmünglobulin VH gene amplifikasyon için ters astar8,14 olarak (şekil 1A) immünglobulin sınıf özel sıraları sabit bölgede tasarlayın. Not: Herhangi bir kütüphane molekülleri farklı örnek kaynaklardan etiketlemek için bu astar Multiplex etiketi dizileri eklenebilir. İç içe geçmiş PCR dizileri de, kullanılan seti15rehberine göre eklenebilir.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Evrensel ileri astar</td>
			<td>5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Fare immünoglobulinler (Ref.8) için ters astar</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgM_CH1:</td>
			<td>5'-CACCAGATTCTTATCAGACAGGGGGCTCTC-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG1_CH1:</td>
			<td>5'-CATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGG-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG2c_CH1:</td>
			<td>5'-GTACCTCCACACACAGGGGCCAGTGGATAG-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG3_CH1:</td>
			<td>5'-ATGTGTCACTGCAGCCAGGGACCAAGGGA-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgA_CH1:</td>
			<td>5'-GAATCAGGCAGCCGATTATCACGGGATCAC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igκ_CH1:</td>
			<td>5'-GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igλ_CH1:</td>
			<td>5'-CTBGAGCTCYTCAGRGGAAGGTGGAAACA-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">İnsan immünoglobulinler (Ref.14) için ters astar</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgM_CH1:</td>
			<td>5'-GGGAATTCTCACAGGAGACG-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG_CH1:</td>
			<td>5'-AAGACCGATGGGCCCTTG-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgD_CH1:</td>
			<td>5'-GGGTGTCTGCACCCTGATA-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgA_CH1:</td>
			<td>5'-GAAGACCTTGGGGCTGGT-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgE1_CH1:</td>
			<td>5'-GAAGACGGATGGGCTCTGT-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgE2_CH1:</td>
			<td>5'-TTGCAGCAGCGGGTCAAGGG-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igκ_CH1:</td>
			<td>5'-TGCTCATCAGATGGCGGGAAGAT-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igλ_CH1:</td>
			<td>5'-AGAGGAGGGCGGGAACAGAGTGA-3 '</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Astar dizileri PCR-immünglobulin amplifikasyon
2. nükleik asit izolasyon bağışıklık hücreleri ve doku
Not: aşağıda verilen fare dalak nükleik asitler ayıklamak için bir yöntemdir. Ancak, diğer bağışıklık doku ve lenf bezleri gibi insan hücreleri veya periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) (şekil 1B) için geçerlidir.
<ol><li>Teşrih doku, örneğin, bir 8 haftalık C57BL/6 fareden dalak ve dağınık hücreleri elde etmek için PBS arabelleğinin 2 mL ile paslanmaz çelik kafes (200-400 µm) geçer. Hücre süspansiyon 2.0 mL microcentrifuge tüp ve santrifüj 600 × g ve 4 ˚C 5 min için transfer. Süpernatant atmak.</li>
	<li>ACK lysing arabelleği (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7.2) 800 µL için Pelet ekleyin ve buz kırmızı kan hücreleri doku koşullar için 2 dakika için üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>PBS 3 2 mL ile doku hücreleri yıkama x 600 × g ve 4 ˚C 5 min için Santrifüjü ardından,.</li>
	<li>Fenol/guanidin isothiocyanate reaktif 800 µL Pelet için eklemek girdap iyice ve 5 min için yaklaşık 25 ˚C, kuluçkaya.</li>
	<li>Kloroform (200 µL) eklemek, el sallamak için 15 s ve yaklaşık 25 ˚C 2 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Santrifüjü 12.000 × g ve 25 ˚C 15 dakika tarafından fazlar ayrı ve üst sulu faz için taze bir tüp aktarın.</li>
	<li>% 70 etanol, girdap kısaca bir birim eklemek ve silis spin sütun için geçerlidir.</li>
	<li>RNA 30-100 µL su ile elute.</li>
	<li>Bir yer (Tablo reçetesi) kullanarak ilk RNA konsantrasyon quantitate.</li>
	<li>-80 ˚C, saflaştırılmış RNA saklayın.</li>
</ol>3. cDNA sentezi ve PCR güçlendirme
Not: aşağıda açıklanan yöntem 5'-yarış11,12 ve akıllı-PCR teknikleri13üzerinde temel alır. Ayrıntılar ve optimizasyon reaksiyon seti 15kılavuzunda açıklanmıştır. Başlangıç için fare immünglobulin 2.10. adımdaki örnek malzemelerdir. Başlangıç için insan immünoglobulin 2.3-2,10 adımlarda açıklandığı gibi tedavi örnek insan dokular, ex. PBMC, malzemelerdir.
<ol><li>2 ilk iplikçikli cDNA 5'-yarış CD astar (oligo-dT-içeren) ve akıllı-PCR Oligonükleotid (Tablo reçetesi) üreticinin yönergeleri15göre kullanarak toplam RNA şablonunun 10 µg için sentez.<ol>
<li>Fare immünglobulin için yüksek sadakat DNA polimeraz evrensel ileri astar ve immünglobulin sınıfa özgü ters astar (Tablo 1) kullanarak ile cDNA PCR yükseltmek. Olarak termal bisiklet koşullarını ayarla: 94 ˚C 2 dk sonra 40 94 ˚C devredir 30 için s, 30 59 ˚C s ve 30 72 ˚C s, 5 min için 72 ˚C son uzantısı adımda izledi. Not: Saf, bağımlı Th1 ve Th2 bağımlı B hücreleri (şekil 3) bakmak için IgM, Igg1, IgG2c, Igk ve Igl immünglobulin sınıfları tipik deneyler yükseltmek.</li>
		<li>İnsan immünoglobulin için 1st PCR evrensel ileri astar ve immünglobulin sınıfa özgü ters astar (Tablo 1) etiket sıralarıyla kullanarak gerçekleştirin. 2nd tarafından PCR her örnek için dizin serilerini içeren dizin sırası primerler kullanılarak. Aşağıdaki PCR koşulları ve Taq polimeraz kullanma: 94 ˚C 2 dk, 21 döngüsü (1st PCR) veya 32 döngüsü (2nd PCR) 94 ˚C sırasında 30 s, 30 59 ˚C s, 30 72 ˚C s. Not: Tipik deneyler yükseltmek IgM, IgD, IgG (Igg1, Igg2, Igg3 ve Igg4), Iga (Iga1 ve Iga2), IgE, Igk ve Igl immünglobulin sınıflar tüm B hücre popülasyonlarının (şekil 4) bakmak için.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir özel jel PCR ürünlerde electrophorese ve 600-800 bp parçaları bir silika membran spin-sütun kullanarak arındırmak.<ol>
<li>3.2.1 veya %3.2.2 2 özel jel üzerinde örnek electrophorese.</li>
		<li>UV-transilluminator DNA bands görselleştirmek ve 600-800 arasında geniş bant içeren jel-dilim tüketim bp.</li>
		<li>Membran bağlama çözüm 10 mg jel dilim başına 10 mL ekleyin. Mix ve jel dilim tamamen eriyene kadar 50-65 ° C kuluçkaya.</li>
		<li>Jel çözüm silis membran spin-sütun aktarın. Bir kez arabellek yıkama ile yıkama ve DNA nükleaz ücretsiz su (Malzemeler tablo) ile 50 mL elute.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NGS sıralama için eşit miktarda her immünglobulin sınıftan bir yer ve havuzu amplicons ile saf amplicons ölçmek. Not: Genellikle, her immünglobulin sınıf için 2-10 mg amplicon DNA'sı bulundu. Her örnek çözümü tutardaki yükselişi 50 mL solüsyon içeren 10-20 ng DNA/mL vermek aynı derecede DNA karıştırın.</li>
	<li>Boyutu ve konsantrasyon kütüphanelerin bir mikro-kılcal tabanlı Elektroforez DNA boyutlandırma küçük parça (Malzemeler tablo) ile kullanarak belirler. -20 ° C'de kitaplık depolamak</li>
</ol>4. NGS sıralama kütüphanelerin
<ol><li>Bir SampleSheet.cvs sıralama çalışma belirten örnek adı, dizin bilgilerini oluşturmak ve yalnızca .fastq dosyaları edinmek için talimat.</li>
	<li>Reaktif kartuşu (Malzemeler tablo) ve kütüphaneler çözülme.</li>
	<li>0.2 N NaOH yapmak ve istenen molar konsantrasyonu elde etmek için kitaplıklarına oranında seyreltin.</li>
	<li>Durulayın ve kuru akışı hücre. Seyreltilmiş ve denatüre Kütüphane çözüm 600 mL reaktif kartuşu kuyunun içine ekleyin.</li>
	<li>Sıralama Çalıştır başlatın.</li>
</ol>5. kalite kontrol NGS veri
<ol><li>"FASTX-Toolkit"16ile FASTQ veri kalite kontrolünü gerçekleştirin. Not: Kullanılan parametre ayarları temel bir örneği aşağıdaki gibidir: fastq_quality_trimmer - v -t 20 - l 200 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq] fastq_quality_filter - v - s 20 - p 80 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq] fastx_reverse_complement - v -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]</li>
	<li>"Fasta nükleik asit (.fna)" için çıkış dosyalarının aşağıdaki komutu tarafından Biçimlendir: fastq_to_fasta - v - n -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fna]</li>
</ol>6. çıkarma ve immünglobulin dizileri .fna veri analizi
Not: Örnek programlar bir UNIX ortamında uygulamaya edildi. Lütfen performans işletim sistemi ve donanım ortamı bağlı olabilir çünkü bir örnek başvuran olarak kullanmak. Yazarlar için hata veya eksiklikler herhangi bir sorumluluk kabul etmiyoruz. Programlama dilleri, Perl17, R18ve gerekli modülleri atıf Web siteleri talimatlara göre yüklü olması gerekmektedir. IgBLAST programın uygun Web sitesi19,20talimatlara göre yüklenmesi gerekir.
<ol><li>Kurum içi programlar repertuar analizleri için aşağıdaki örnekleri https://github.com/KzPipeLine/KzPipeLine download: 03_PipeLine_Mouse.zip; Bir dizi örnek program fare antikor sıralarının analizleri için. 05_PipeLine_Human.zip; Bir dizi örnek program insan antikoru sıralarının analizleri için.</li>
	<li>Antikor okur sıra verilerde özü: imza dizileri her immünglobulin sabit bölgede (Tablo 2) arama bir Perl programı tarafından veri (.fna) her IG-sınıf immünglobulin (Ig) dizileri ayıklamak.<ol>
<li>Fare immünglobulin ağır zincir (IgH) genler için aşağıdaki komutu tarafından okuma çıkarımı: $ perl 01_KzMFTIgCmgggaNtdVer3_Kz160607.pl [giriş dosya adı] [Çıkış dosya adı (sonek)]</li>
		<li>Fare immünglobulin hafif zinciri için (IgL) genler tarafından aşağıdaki komutu okur çıkarımı: $ perl 01_KzMFTCkltNtdVer1_170810.pl [giriş dosya adı] [Çıkış dosya adı (sonek)]</li>
		<li>İnsan immünoglobulin ağır zincir (IgH) gen için aşağıdaki komutu tarafından okuma çıkarımı: $ perl 01_KzMfHuIgHCmgadeNtdVer1_Kz180312.pl [giriş dosya adı] [Çıkış dosya adı (sonek)]</li>
		<li>İnsan immünoglobulin hafif zincir (IgL) gen için aşağıdaki komutu tarafından okuma çıkarımı: $ perl 01_KzMfHuIgCkltNtd_180316.pl [giriş dosya adı] [Çıkış dosya adı (sonek)]</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ek açıklama eklemek ve V (D) J gen rekombinasyon verimliliğini kontrol edin: Not: tek başına IgBLAST19 V (D) J gen segmentlerinin sıradaki eklenti için aşağıda açıklanan yöntemi kullanır. V (D) J genler için veritabanı ve IgBLAST parametre ayarlarını açıklanan20ayarlayın.<ol>
<li>Fare immünglobulin ağır zincir (IgH) genleri aşağıdaki komutu tarafından Açıklama: $ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-organizma fare - domain_system imgt-sorgu. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/mouse_gl.Aux-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName</li>
		<li>Fare immünglobulin hafif zincir (IgL) genleri aşağıdaki komutu tarafından Açıklama: $ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-organizma fare - domain_system imgt-sorgu. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/mouse_gl.Aux-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName</li>
		<li>İnsan immünoglobulin ağır zincir (IgH) genleri aşağıdaki komutu tarafından Açıklama: $ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-organizma insan - domain_system imgt-sorgu. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/Human_gl.aux-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName</li>
		<li>İnsan immünoglobulin hafif zincir (IgL) genleri aşağıdaki komutu tarafından Açıklama: $ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-organizma insan - domain_system imgt-sorgu. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/human_gl.Aux-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir antikor repertuar genel özelliği görselleştirin.<ol>
<li>Fare IgH repertuarı aşağıdaki komutu tarafından görselleştirin: $ . 00a1_3DView_MoIgH_Kz180406.sh Not: Giriş dosyası filename.fna (sıralı veri), tercihen olduğunu 6.2.1 çıkış dosyasından. Bu dosyanın "dosya adı" adlı bir alt dizinde (klasör) yerleştirilmesi gerekir. Kabuk komut satırını 50, Para_4 için bir "dosya adı" atayın.</li>
		<li>İnsan IgH repertuarı aşağıdaki komutu tarafından görselleştirin: $ . 00a1_3DView_HuIgH_Kz180411.sh Not: Giriş dosyası filename.fna sıra, tercihen 6.2.3 çıktı dosyası veridir. Bu dosyanın yerleştirilmesi gerekir "dosya adı" alt dizininde (klasör) o adıdır. Kabuk komut satırını 46, Para_4 için bir "dosya adı" atayın.</li>
		<li>Fare IgL repertuar aşağıdaki komutu tarafından görselleştirin: $ . 00_2DViewS_MoIgL_Kz180406.sh Not: Bu boru hattı ile Igk ve Igl kullanılazlar işlenir. Giriş dosyası filename.fna (sıralı veri), tercihen olduğunu 6.2.2 çıkış dosyasından. Bu dosyanın "dosya adı" adlı alt dizinde (klasör) yerleştirilmesi gerekir. Kabuk komut satırını 53, Para_4 için bir "dosya adı" atayın. Çıkış dosya adının, "_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt" ile biten iki boyutlu bir çubuk grafik (şekil 3, IgL) koordinatlarını verir.</li>
		<li>İnsan IgL repertuar aşağıdaki komutu tarafından görselleştirin: $ . 00_2DView_HuIgL_Kz180319.sh Not: Bu boru hattı ile Igk ve Igl kullanılazlar işlenir. Giriş dosyası filename.fna sıra, tercihen 6.2.4 çıktı dosyası veridir. Bu dosyanın "dosya adı" adlı bir alt dizinde (klasör) yerleştirilmesi gerekir. Kabuk komut satırını 53, "dosya adı" Para_4 için atayın. "_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt" ile biten çıktı dosyası adı (şekil 4, IgL) iki boyutlu bir çubuk grafiği koordinatlarını verir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Schroeder, H. W. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarity+and+divergence+in+the+development+and+expression+of+the+mouse+and+human+antibody+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+%26+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">Similarity and divergence in the development and expression of the mouse and human antibody repertoires.</a> Developmental & Comparative Immunology. 30 (1-2), 119-135 (2006).</li>
<li>Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+generation+of+antibody+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic generation of antibody diversity.</a> Nature. 302 (5909), 575-581 (1983).</li>
<li>Georgiou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+and+challenge+of+high-throughput+sequencing+of+the+antibody+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The promise and challenge of high-throughput sequencing of the antibody repertoire.</a> Nature Biotechnology. 32 (2), 158-168 (2014).</li>
<li>Lees, W. D., Shepherd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+Antibody+Repertoires+with+Next-Generation+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Studying Antibody Repertoires with Next-Generation Sequencing.</a> Methods in Molecular Biology. 1526, 257-270 (2017).</li>
<li>Weinstein, J. A., Jiang, N., White, R. A. 3rd, Fisher, D. S., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+sequencing+of+the+zebrafish+antibody+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-throughput sequencing of the zebrafish antibody repertoire.</a> Science. 324 (5928), 807-810 (2009).</li>
<li>Arnaout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+description+of+antibody+heavy-chain+repertoires+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-resolution description of antibody heavy-chain repertoires in humans.</a> PLoS One. 6 (8), e22365(2011).</li>
<li>Boyd, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+variation+in+the+germline+Ig+gene+repertoire+inferred+from+variable+region+gene+rearrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Individual variation in the germline Ig gene repertoire inferred from variable region gene rearrangements.</a> Journal of Immunology. 184 (12), 6986-6992 (2010).</li>
<li>Kono, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+antigen-responding+antibody+repertoires+by+using+next-generation+sequencing+and+confirming+them+through+antibody-gene+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Deciphering antigen-responding antibody repertoires by using next-generation sequencing and confirming them through antibody-gene synthesis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 487 (2), 300-306 (2017).</li>
<li>Jiang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinism+and+stochasticity+during+maturation+of+the+zebrafish+antibody+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Determinism and stochasticity during maturation of the zebrafish antibody repertoire.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (13), 5348-5353 (2011).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distorted+antibody+repertoire+developed+in+the+absence+of+pre-B+cell+receptor+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Distorted antibody repertoire developed in the absence of pre-B cell receptor formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 1411-1417 (2018).</li>
<li>Olivarius, S., Plessy, C., Carninci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+verification+of+transcriptional+starting+sites+by+Deep-RACE%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">High-throughput verification of transcriptional starting sites by Deep-RACE.</a> Biotechniques. 46 (2), 130-132 (2009).</li>
<li>Yeku, O., Frohman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+amplification+of+cDNA+ends+%28RACE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid amplification of cDNA ends (RACE).</a> Methods in Molecular Biology. 703, 107-122 (2011).</li>
<li>Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcriptase+template+switching%3A+a+SMART+approach+for+full-length+cDNA+library+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction.</a> Biotechniques. 30 (4), 892-897 (2001).</li>
<li>Vollmers, C., Sit, R. V., Weinstein, J. A., Dekker, C. L., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+measurement+of+memory+B-cell+recall+using+antibody+repertoire+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic measurement of memory B-cell recall using antibody repertoire sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13463-13468 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SMARTer+RACE+5%E2%80%99%2F3%E2%80%99+Kit+User+Manual+%28634858%2C+634859%29%22">SMARTer RACE 5’/3’ Kit User Manual (634858, 634859)</a>. , (2018).</li>
<li>FASTX-Toolkit. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> (2018).</li>
<li>Perl. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://perldoc.perl.org/">https://perldoc.perl.org/</a> (2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+language+and+environment+for+statistical+computing%22">R: A language and environment for statistical computing</a>. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2016).</li>
<li>Ye, J., Ma, N., Madden, T. L., Ostell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgBLAST%3A+an+immunoglobulin+variable+domain+sequence+analysis+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">IgBLAST: an immunoglobulin variable domain sequence analysis tool.</a> Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W34-W40 (2013).</li>
<li>IgBLAST. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/faq.html">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/faq.html</a> (2018).</li>
<li>Prabakaran, P., Streaker, E., Chen, W., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((454+antibody+sequencing+-+error+characterization+and+correction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">454 antibody sequencing - error characterization and correction.</a> BMC Research Notes. 4, 404(2011).</li>
<li>Lefranc, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IMGT%2C+the+international+ImMunoGeneTics+information+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">IMGT, the international ImMunoGeneTics information system.</a> Nucleic Acids Research. 37 (Database issue), D1006-D1012 (2009).</li>
<li>Alamyar, E., Duroux, P., Lefranc, M. P., Giudicelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IMGT%28%28R%29%29+tools+for+the+nucleotide+analysis+of+immunoglobulin+%28IG%29+and+T+cell+receptor+%28TR%29+V-%28D%29-J+repertoires%2C+polymorphisms%2C+and+IG+mutations%3A+IMGT%2FV-QUEST+and+IMGT%2FHighV-QUEST+for+NGS%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">IMGT((R)) tools for the nucleotide analysis of immunoglobulin (IG) and T cell receptor (TR) V-(D)-J repertoires, polymorphisms, and IG mutations: IMGT/V-QUEST and IMGT/HighV-QUEST for NGS.</a> Methods in Molecular Biology. 882, 569-604 (2012).</li>
<li>IMGT/HighV-QUEST. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.imgt.org/HighV-QUEST/login.action">http://www.imgt.org/HighV-QUEST/login.action</a> (2018).</li>
<li>Glanville, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+determination+of+the+diversity+of+a+combinatorial+antibody+library+gives+insight+into+the+human+immunoglobulin+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Precise determination of the diversity of a combinatorial antibody library gives insight into the human immunoglobulin repertoire.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (48), 20216-20221 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22rgl%3A+3D+Visualization+Using+OpenGL%22">rgl: 3D Visualization Using OpenGL</a>. , R package version 0.95.1247 (2015).</li>
<li>Hardy, R. R., Wei, C. J., Hayakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+during+development+of+VH11%2B+B+cells%3A+a+model+for+natural+autoantibody-producing+CD5%2B+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Selection during development of VH11+ B cells: a model for natural autoantibody-producing CD5+ B cells.</a> Immunological Reviews. , 60-74 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Burada açıklanan yöntemi NGS 5'-yarış yöntemi kullanılarak güçlendirilmiş antikor RNA için kullanır. Dejenere 5'-VH gen astar yöntemler aksine mRNA her antikor sınıfın eşit olarak evrensel ileri primerler kullanılarak güçlendirilmiş. Buna ek olarak, repertuar belirli immünglobulin sınıfları profil oluşturma sabit bölge 1 (CH1) antikor gen antianlamlı astar belirli kullanımını etkinleştirir. Bu sınıfa özgü antikor yanıtı dissekan için hem de saf ve aşılı kapsayacağını8,9karşılaştırmak için çok faydalıdır.
Yöntemin en olası bir hatadır güçlendirilmiş immünglobulin iletileri bir yetersizliği var. Bu iletişim kuralı tarafından büyük ölçüde elde edilen antikor repertuar derinliği 3.1 ve 3.2 adımlarda açıklanan PCR güçlendirme bağlıdır. Repertuar derinlik düzgün elde değil ettiyseniz, şablon cDNA ve astar adımda 3.2.1 veya 3.2.2 oranları değişen kesinlikle önerilir.
NGS tarafından üretilen antikor okuma yaklaşık % 20'si belirsiz dizileri21genellikle. Hatta ile kurulan "düzeltme yöntemleri", % 5-10 kalır belirsiz3. Biz, bu nedenle, sıra analiz ve ham okuma immünglobulin sürekli bölgelere (CμH1, Cγ1H1, Cγ2cH1, vb) karşılık gelen imza dizileri içeren filtre. Bu nedenle somatik hiper mutasyonlar analizi dikkatli muayene ihtiyacı var.
Bu yöntem sınırlamaları biri o immünglobulin ağır ve hafif zincir çifti anlaşılmaktadır değiştiremiyor. Bu nedenle bu yöntemle elde edilen repertuar görünüm bütünsel değil. Ancak, üst düzey ikili veri10tarafından istatistiksel tahmin etmek mümkündür. Ayrıca, bir roman yöntemi immünglobulin çiftleri oldu diziye son3,4rapor.
Çıkış .fna veri immünglobulin serilerinde immünglobulin gen imza dizileri varlığı dayalı elde. V (D) J düzenlemeler verimliliğini ve segmentleri sonra açıklamalı V, D ve J gen değerlendirildi. Tamamlayıcılık belirleyen bölge 3 (CDR3) dizileri de açıklamalı. İmmünglobulin dizileri sistematik bu sınavlar .fna veri yararlı IMGT/HighV-QUEST server22,23,24tarafından temin edilmiştir. Ancak, bir otomatik işleme boru hattı inşa büyük deneysel verileri çözümlemek için hak vardır. Her amaç için özelleştirilmiş boru hattı tek başına IgBLAST protokolü19kullanarak kurmak mümkündür. Bu yaklaşımın temel programlama okuma-yazma ihtiyacı ama immünglobulin sistem detaylı analizler için çok yararlıdır. Açıklanan boru hatları özelleştirilmiş Protokolü (Şekil 2) örnekleridir.
Antikor sayısını orantılı antikor RNA'ların antikor sisteminin antikor bileşenlerinin yansıtan örnek miktarı zaman Puan5,8,25verilen okur. Burada açıklanan yöntemi bir kuş bakışı R programları8,18,26kullanarak bir antikor repertuarı V (D) J Anayasanın verir.
IgM antikor kapsayacağını bireysel saf farelerin genel görünümünü son derece korunmuş VDJ profil ile karşılaştırıldığında bu Igg1 veya IgG2c8saptandı. Bu olgunlaşmamış Zebra balığı VDJ kombinasyonları çok basmakalıp9olduğunu bildirildi. Buna ek olarak, insan VDJ kombinasyonları son derece çarpık6olduğu bildirilmiştir. Naif B hücreleri son derece korunmuş deterministic VDJ-profilleri otomatik-antijenler vücutta sunulan ile muhtemelen de çarpık VDJ-düzenlemeler tarafından oluşturulan veya negatif seçim vardır. Örneğin, IGHV11-2 tercihen fetal IgM repertuar27 ifade edilir ve bu ağırlığı IGHV11-2 autoreactivity senescent eritrositler27karşı atfedilir. İlginçtir, IGHV11-2 de saf IgM8daha önce yayımlanmış bizim analiz en yaygın büyük repertuarında oldu.
Burada anlatılan yöntem ikisi bireysel organları anahtar antikor kapsayacağını8yanlışlıkla ihmal kaçınarak, üretilen antikor-repertuar uzay analiz ederek antijen-duyarlı antikor kapsayacağını deşifre için yararlıdır, 10. Bu yöntem aynı zamanda kolaylaştırmak detaylı antikor ağ dinamizm incelenmesi hızlandırılmış yeni ortaya çıkan karşı koruyucu antikorlar keşfi sağlar patojenler.

Antikor sistemi Edinsel bağışıklık sisteminin temelleri biridir. Patojenler geniş çeşitliliği, iyi Antijen tanıma özgüllük ve antijen spesifik B hücreleri klonal genişlemesi nedeniyle işgal karşı son derece güçlü. B hücreleri antikor üreten repertuar 10'dan fazla olduğu tahmin edilmektedir15 tek tek tek1. Bu büyük çeşitlilik VDJ gen rekombinasyon immünglobulin genetik loci2yardımıyla oluşturulur. Tüm B hücre kapsayacağını ve yanıt antijen-aşılama için dinamik değişiklikleri açıklaması bu nedenle zorlu ama patojenler istila karşı antikor yanıt tam bir anlayış için gerekli.
Astronomik onların çeşitlilik nedeniyle, B hücre repertuarında bir kara kutu kabul edilmiştir; Ancak, NGS teknolojisi gelişine devrimler onların karmaşıklığı3,4gelişmiş bir anlayış için sağlamıştır. Bütün antikor kapsayacağını başarıyla, öncelikle Zebra balığı5, sonra fare6ve insanlar6,7analiz edilmiştir. NGS şimdi edinilmiş bağışıklık yanıtının çalışmada güçlü bir araç haline gelmiştir rağmen ortak ve antikor kapsayacağını bireysel hayvanlar arasında farklılıklar temel analizleri eksik vardır.
Farelerde, Igg1 ve IgG2c bireyler8arasında önemli ölçüde farklıdır, ancak IgM kapsayacağını bireyler arasında hemen hemen aynı olduğunu bildirildi. V-gen kullanım profili ek olarak gözlenen VDJ-saf periferik B hücreleri profilinde bireyler8arasında son derece benzer sıklığıdır. VDJ bölge amino asit dizisi analizi de-daha önce düşünce8' den çok daha sık farklı fareler aynı bileske dizileri oluşumunu gösterdi. Bu sonuçlar antikor repertuar oluşumu için mekanizmalar Stokastik yerine belirli5,8,9olabilir gösterir. Farelerde antikor repertuar geliştirme sürecinin başarıyla NGS daha fazla ayrıntı10antikor bağışıklık sisteminde ortaya çıkarmak için NGS potansiyelini vurgulamak için kullanılarak da analiz.
Bu raporda, görselleştirmek ve bir antikor repertuar, genel bir düzeyde analiz etmek için basit ve etkili bir yöntem açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>0.2 mL Şerit Tüpler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0452</td><td>120 şerit</td></tr><tr><td>100 bp DNA Merdiveni</td><td>TOYOBO</td><td>DNA-035</td><td>0.5 mL</td></tr><tr><td>2100 Biyoanalizör Sistemleri</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939BA /2100</td><td></td></tr><tr><td>Asetik Asit</td><td>Wako</td><td>017-00256</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Agaroz, NuSieve GTG</td><td>Lonza</td><td>50084</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Klorür</td><td>Wako</td><td>017-02995</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Wako</td><td>038-02606</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun PBS'si (-)" Nissui"</td><td>NISSUI&nbsp;</td><td>08192</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamin-N, N, N ', N'-tetraasetik Asit Disodyum Tuzu Dihidrat (2NA)</td> <td>Wako</td><td>345-01865</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Falcon 40 & mikro; m Hücre Süzgeci</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>50/Kasa</td></tr><tr><td>ling kilit tüpü 1.7 mL BM</td><td>EKİPMANI</td><td>BM-15</td><td></td></tr><tr><td>ling kilit tüpü 2.0 mL</td><td>BM EKIPMANI</td><td>BM-20</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reaktif Kiti v2</td><td>illumina</td><td>MS-102-2003</td><td>500 döngü</td></tr><tr><td>MiSeq Sistemi</td><td>illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c Spektrofotometre&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Hidrojen Karbonat</td><td>Wako</td><td>166-03275</td><td>500 g</td></tr><tr><td>PureLink RNA Mini Kit</td><td>yaşam teknolojileri</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Florometre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Test Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td>500 tahlil</td></tr><tr><td>AKILLI YARIŞ 5'/3' Takımı&nbsp;</td><td>Clontech&nbsp;</td><td></td><td></td>634858</tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq Sıcak Başlangıç Sürümü&nbsp;</td><td>Takara Biyo A.Ş. & nbsp;</td><td>RR006A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizma baz</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>TRIzol Reaktif</td><td>AmbionThermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Ultra Şeffaf qPCR Kapakları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0866</td><td>120 şerit</td></tr><tr><td>UltraPure Etidyum Bromür</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Jel ve PCR Temizleme Sistemi&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>A9282</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

fare ve insan antikoru kapsayacağını tarafından yeni nesil sıralama

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

Antijen tanıma antikorlar tarafından büyük uyum Edinsel bağışıklık sisteminin temelidir. Anlayışımızı geniş repertuar antikor üretimini Edinsel bağışıklık sistemleri tarafından temel moleküler mekanizmaları rağmen bu henüz tam antikor repertuar küresel bir bakışta gelmesi mümkün olmamıştır. Özellikle, B hücre kapsayacağını antikor klonlar astronomik onların sayısı nedeniyle bir kara kutu kabul edilmiştir. Ancak, yeni nesil sıralama teknolojileri B hücre repertuar bilgimizi artırmak devrimler etkinleştiriyorsanız. Bu raporda, görselleştirmek ve tüm bireysel fare ve insan antikoru kapsayacağını çözümlemek için basit ve etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Bağışıklık organ, dinlerinden farelerde dalak ve periferik kan mononükleer hücrelerin insanlarda, toplam RNA transkripsiyonu ve 5'-yarış yöntemi kullanılarak güçlendirilmiş hazırlanmış, geriye doğru. Evrensel bir ileri astar ve antianlamlı astar antikor sınıfa özgü sürekli etki alanları için kullanarak, antikor mRNA'ların düzgün frekansları antikor nüfus yansıtan oranlarda güçlendirilmiş. Amplicons tarafından 10'dan fazla5 antikor dizileri immünolojik örnek başına verimli yeni nesil sıralama (NGS), sıralı. Antikor sıra analizleri V (D) J-gen-segment ek açıklama, kuşbakışı antikor repertuar ve bizim hesaplama yöntemleri de dahil olmak üzere iletişim kuralları açıklar.

Antikor kapsayacağını fare
Hücreleri veya doku dalak, kemik iliği, lenf nodu veya kan gibi bir fare antikor repertuar bir bütün olarak bir bakış elde edilebilir. Şekil 3 hafif zincir (IgL) kapsayacağını saf fare dalak üzerinden IgM, Igg1, IgG2c ve immünglobulin temsilcisi sonuçlarını gösterir. Okuma numaraları özetini Tablo 3' te gösterilmiştir. Örneğin, 166,175/475,144 okuma IgM özgü imza sırası (Tablo 2) yer alan ve 133,371/166,175 okuma VDJ üretken IgBLAST19tarafından ima edildi.
Şekil 3 VDJ düzenlenmesi 3D-VDJ-arsa, her topu büyüklüğünde okuma göreli sayısı temsil eden tarafından bir repertuar profili gösterir; başka bir deyişle, tüm B hücreleri antikor mRNA'ların sayısı. 110 IGHV, 12 IGHD ve 4 IGHJ, kromozom üzerinde onların sipariş yansıtacak şekilde uyumlu 3-b kafes oluşur. Buna ek olarak, belirsizce IgBLAST tarafından atanan genler ayrı ayrı cuboid 7,215 düğümlerin sebebiyet veren her IGHV, IGHD ve IGHJ satır için son olarak toplanmıştır.
Aynı zamanda, şekil 3 ' te VJ-düzenlenmesi profilinde IgL repertuar bir 2D-VJ-arsa gösterilen gösterilmiştir. Bu arsa üzerinde her çubuğunun uzunluğu okuma göreli sayısı temsil eder. X ekseni 101 IGLVκ ve 3 IGLVλ genler ve 4 IGLJκ ve 3 IGLJλ gen y ekseni temsil eder. Unannotated V - ile J-gen değil sınırda temsil edilir.
Tamamlayıcılık belirleyen bölge 3 (CDR3) antijen bağlayıcı özgüllük çoğunluğu ortaya çıkmasına, bu verimli okuma dizisi verilen IgBLAST çıkışlarını içinde. Dizileri istatistiksel analiz edilebilir CDR3, çoğaltır, biyolojik ya da teknik olarak dahil olmak üzere8,10daha önce açıklanan.
İnsan antikoru kapsayacağını
Bir insan antikoru repertuar bir bütün olarak bir bakış çeşitli periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) de dahil olmak üzere dokularda veya patolojik dokuları analiz edilebilir. Şekil 4 temsilcisi IgM, sonuçlarını gösterir IgA (Iga1 ve Iga2), IgD, IgE ve IgL toplam, toplam IgG (Igg1, Igg2, Igg3 ve Igg4) kapsayacağını normal PBMCs üzerinden. Bir özetini okumak numaraları Tablo 3' te gösterilmiştir. Örneğin, 90,238/1,582,754 okuma IgM özgü imza sırası bulunan ve 67,896/90,238 okuma VDJ verimli olduğunu.
VDJ düzenlenmesi repertuar profil bir 3D-VDJ-her topu büyüklüğünde okuma göreli sayısı temsil eden arsa üzerinde gösterilir; başka bir deyişle, tüm PBMCs (şekil 4) üzerinden antikor mRNA'ların sayısı. 56 IGHV, 27 IGHD ve 6 IGHJ, kromozom üzerinde göründükleri sıraya uyumlu 3-b kafes oluşur. Buna ek olarak, belirsizce IgBLAST tarafından atanan genler ayrı ayrı 11,172 düğümlerin cuboid sebebiyet veren her IGHV, IGHD ve IGHJ satır için son olarak temsil edilir.
VJ-düzenlenmesi profilinde IgL repertuar bir 2D-VJ-her çubuğun uzunluğu okuma (şekil 4) göreli sayısı temsil eden komplo tasvir edilir. X ekseni 41 IGLVκ ve 32 IGLVλ genler ve 5 IGLJκ ve 5 IGLJλ gen y ekseni temsil eder. Un açıklamalı V - ile J-gen değil sınırda temsil edilir.
İnsan CDR3 sıraları IgBLAST içinde verilen veriyor ve8,10daha önce açıklandığı gibi istatistiksel analiz edilebilir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>İmmünglobulin sınıfı</td>
			<td>Anlamda</td>
			<td>Antisens</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Fare immünglobulin ağır zincir (C57BL/6)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>IgM</td>
			<td>AGTCAGTCCTTCCCAAATGTC</td>
			<td>GACATTTGGGAAGGACTGACT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igg1</td>
			<td>AAAACGACACCCCCATCTGTC</td>
			<td>GACAGATGGGGGTGTCGTTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Igg1 varyant)</td>
			<td>AAAACAACACCCCCATCAGTC</td>
			<td>GACTGATGGGGGTGTTGTTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG2c</td>
			<td>AAAACAACAGCCCCATCGGTC</td>
			<td>GACCGATGGGGCTGTTGTTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igg3</td>
			<td>GTGATCCCGTGATAATCGGCT</td>
			<td>AGCCGATTATCACGGGATCAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Iga</td>
			<td>TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG</td>
			<td>TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Fare immünglobulin hafif zincirleri (C57BL/6)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Igκ</td>
			<td>CTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGC</td>
			<td>GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igλ1</td>
			<td>TGTTTCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAG</td>
			<td>CTCGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGAAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igλ2</td>
			<td>TGTTTCCACCTTCCTCTGAGGAGCTCAAG</td>
			<td>CTTGAGCTCCTCAGAGGAAGGTGGAAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igλ3</td>
			<td>TGTTTCCACCTTCCCCTGAGGAGCTCCAG</td>
			<td>CTGGAGCTCCTCAGGGGAAGGTGGAAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igλ4</td>
			<td>TGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAG</td>
			<td>CTTGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGGAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">İnsan immünoglobulin ağır zincir</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>IgM</td>
			<td>GGGAGTGCATCCGCCCCAAC</td>
			<td>GTTGGGGCGGATGCACTCCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG</td>
			<td>GCTTCCACCAAGGGCCCATC</td>
			<td>GATGGGCCCTTGGTGGAAGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Iga</td>
			<td>GCATCCCCGACCAGCCCCAA</td>
			<td>GACCGATGGGGCTGTTGTTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgD</td>
			<td>GCACCCACCAAGGCTCCGGA</td>
			<td>TCCGGAGCCTTGGTGGGTGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgE</td>
			<td>GCCTCCACACAGAGCCCATC</td>
			<td>GATGGGCTCTGTGTGGAGGC</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">İnsan immünoglobulin hafif zincirleri</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Igκ</td>
			<td>ACTGTGGCTGCACCATCTGC</td>
			<td>GCAGATGGTGCAGCCACAGT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igλ1, 2, 6</td>
			<td>GTCACTCTGTTCCCGCCCTC</td>
			<td>GAGGGCGGGAACAGAGTGAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Igλ3, 7</td>
			<td>GTCACTCTGTTCCCACCCTC</td>
			<td>GAGGGTGGGAACAGAGTGAC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Özet immünglobulin imza dizileri

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Fare IgH</td>
			<td>Toplam okuma</td>
			<td>IgM</td>
			<td>Igg1</td>
			<td>IgG2c</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Giriş</td>
			<td>475,144</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>IGC içeren</td>
			<td></td>
			<td>166,175</td>
			<td>229,671</td>
			<td>36,628</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>VDJ verimli</td>
			<td></td>
			<td>133,371</td>
			<td>196,583</td>
			<td>31,446</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Fare IgL</td>
			<td>Toplam okuma</td>
			<td>IgKappa</td>
			<td>IgLambda</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Giriş</td>
			<td>527,668</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>IGC içeren</td>
			<td></td>
			<td>178,948</td>
			<td>21,446</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>VJ verimli</td>
			<td></td>
			<td>160,924</td>
			<td>16,988</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>İnsan IgH</td>
			<td>Toplam okuma</td>
			<td>IgM</td>
			<td>IgG</td>
			<td>Iga</td>
			<td>IgD</td>
			<td>IgE</td>
		</tr>
<tr>
<td>Giriş</td>
			<td>1,582,754</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>IGC içeren</td>
			<td></td>
			<td>90,238</td>
			<td>5,298</td>
			<td>94,061</td>
			<td>75,549</td>
			<td>2,932</td>
		</tr>
<tr>
<td>VDJ verimli</td>
			<td></td>
			<td>67,896</td>
			<td>2,775</td>
			<td>78,203</td>
			<td>56,495</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>İnsan IgL</td>
			<td>Toplam okuma</td>
			<td>IgKappa</td>
			<td>IgLambda</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Giriş</td>
			<td>1,582,754</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>IGC içeren</td>
			<td></td>
			<td>120,316</td>
			<td>64,148</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>VJ verimli</td>
			<td></td>
			<td>97,169</td>
			<td>52,324</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: Özet deneylerde okuma sayıların
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58804/58804fig1.jpg"> Şekil 1: antikor kapsayacağını bireysel farelerde analiz etmek için sıralama stratejisinin şematik gösterim. (A) ters transkripsiyonu ve PCR-güçlendirilmiş evrensel ileri astar kullanarak bağışıklık hücreleri veya doku toplam RNA ve immünglobulin sınıfa özgü ters astar. Her immünglobulin sınıftan amplicons havuza alınmış ve yeni nesil sıralama için işlenir. (B) dalağı C57BL/6 fare üzerinden aşağıdaki gibi tedavi edildi gibi biyolojik çoğaltır: Toplam RNA'ların dalak örnekleri saflaştırılmış ve cDNAs 5'-evrensel astar ve antikor sınıfa özgü astar kullanarak yarış tarafından güçlendirilmiş. Onlar o zaman bireysel fareler için astar etiketleme ile yeni nesil sıralama için render. Şekil8 izinle adapte parçasıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58804/58804fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58804/58804fig2.jpg"> Şekil 2: antikor kapsayacağını bireysel farelerde analiz etmek için veri işleme akış çizelgesinin şematik. Yeni nesil sıralama sonra elde edilen Amplicon okuma aşağıdaki gibi işlenen: (1) okuma dizileri antikor sınıfa özgü imza dizileri; varlığı için kontrol (2) dizileri için V, D, incelenmiş ve IMGT/HighV-macera ve/veya IgBLAST kullanarak J gen parçalarının; (3) üretken VDJ kavşak içeren dizileri toplanmıştır; ve (4) bu dizilere kullanılan genel repertuar özellikleri, CDR3, analiz için vb <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58804/58804fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58804/58804fig3.jpg"> Şekil 3: küresel veri görselleştirme için fare antikor kapsayacağını. Her antikor sınıfın genel repertuar profilleri 3D-VDJ-arsa tarafından görüntülenmiştir. X ekseni 110 IGHV genlerin kromozom gibi sipariş temsil eder. Y ve z - ekseni 12 IGHD ve 4 IGHJ genler, sırasıyla temsil eder. Her düğümde küre hacmi okuma sayısı temsil eder. Kırmızı Küre: un açıklamalı V, D ile J gen. IgL dağıtımları bir 2D-VJ-her çubuğun uzunluğu okuma göreli sayısı temsil eden arsa üzerinde gösterilir okuyun. X ekseni 101 IGLVκ ve 3 x IGLVλ genler x ve y ekseni 4 x IGLJκ ve 3 x IGLJλ genler temsil eder. Un açıklamalı V ile J gen değil sınırda temsil edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58804/58804fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58804/58804fig4.jpg"> Şekil 4: küresel veri görselleştirme için insan antikoru kapsayacağını. Her antikor sınıfın genel repertuar profilleri 3D-VDJ-arsa tarafından görüntülenmiştir. X ekseni 56 IGHV genlerin kromozom gibi sipariş temsil eder. Y ve z - ekseni 27 IGHD ve 6 IGHJ genler, sırasıyla temsil eder. Her düğümde küre hacmi okuma sayısı temsil eder. Kırmızı Küre: un açıklamalı V, D ile J gen. IgL okuma 2D-VJ-her çubuğun uzunluğu okuma göreli sayısı temsil eden arsa üzerinde serilir. X ekseni 41 IGLVκ ve 32 x IGLVλ genler x ve y ekseni 5 x IGLJκ ve 5 x IGLJλ genler temsil eder. Un açıklamalı V - ile J-gen değil sınırda temsil edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58804/58804fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Burada, analiz ve görselleştirme yapısı ve bütün antikor kapsayacağını Anayasası için iletişim kuralları açıklar. Bu büyük yeni nesil sıralama kullanarak antikor RNA dizisi edinimi içerir.

Fare ve insan antikoru kapsayacağını tarafından yeni nesil sıralama

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

Bu videoda, küresel düzeyde bir antikor repertifini görselleştirmek ve analiz etmek için basit ve etkili bir yöntem açıklıyoruz. Bu bireylerde tüm B hücre repertisi ve bağışıklık stimülasyonu yanıt olarak dinamik değişiklikleri tanımlamak mümkündür. Bu yöntem, ortaya çıkan viral enfeksiyonların hastalarından alınan patolojik örnekleri analiz etmek ve enfeksiyonun patogenezine dair eşi görülmemiş bir içgörüyle verileri elde etmek için uygulanabilir.Uygulama için en heyecan verici alanlardan biri aşı kontrolüdür. Aşı etkinliği, aşı uygulanan bireylerde küresel antikor repertifinin dinamikleri analiz edilerek değerlendirilebilir. Antikor gen amplifikasyonunun verimliliği başlangıç malzemelerinin türlerine bağlı olduğundan, bireyin bu yöntemde yeni olduğu PCR koşullarını optimize etmesi gerekebilir.Fla-cher immünglobulin amplicons belirlenmesi için. Bu eylemleri görsel olarak göstermek önemlidir. Prosedürü gösteren bayan Sayuri Yamaguchi ve Bay Hanbing Xue, benim laboratuvarımdan bir teknisyen ve yüksek lisans öğrencisi olacak.Bu prosedüre başlamak için, sekiz haftalık C57 siyah altı faredoku incelemek ve dağınık hücreleri elde etmek için PBS iki mililitre ile paslanmaz çelik örgü geçmek. Hücre süspansiyonuna iki mililitrelik mikrosantrifüj tüpü ve santrifüjiçin 600 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika aktarın. Supernatant atın ve pelet için ACK lysing tampon 800 mikrolitre ekleyin.Dokudaki kırmızı kan hücrelerini lyse için iki dakika buz üzerinde kuluçka. Daha sonra, her yıkama için pbs üç mililitre kullanarak doku hücrelerini üç kez yıkayın. Santrifüj tekrar 600 kez g ve dört derece santigrat beş dakika için.Supernatant atın ve iyice pelet ve girdap fenol / guanidin izotiyoyanat reaktif 800 mikrolitre ekleyin. 25 derecede beş dakika kuluçkaya yat. Sonra, kloroform 200 mikrolitre ekleyin ve 15 saniye boyunca elle çalkalayın.25 derecede iki dakika kuluçkaya yat. 12, 000 kez g ve 25 santigrat derecede fazları ayırmak için santrifüj. Üst sulu fazı taze bir tüpe aktarın.% 70 etanol bir hacim ekleyin. Girdap kısaca ve silika spin sütununa bu karışımı uygulayın. 30 ila 100 mikrolitre su ile RNA'yı eute.Bundan sonra, ilk RNA konsantrasyonu quantitate için bir florometre kullanın. Saflaştırılmış RNA'yı eksi 80 derecede saklayın. İlk olarak, üreticinin talimatlarına göre 5'RACE CDS astar ve SMART-PCR oligonükleotid kullanarak toplam RNA şablonunun iki ila 10 mikrogram ilk iplikçik cDNA sentezleyin.Fare immünglobulin için, PCR yüksek sadakat DNA polimeraz ile cDNA yükseltmek, evrensel ileri astar ve immünglobulin sınıfa özgü ters astarkullanarak, metin protokolünde belirtildiği gibi. İnsan immünglobulin için, etiket dizileri ile evrensel ileri astar ve immünglobulin sınıfa özgü ters astarkullanarak ilk PCR gerçekleştirin. Dizin dizilimi astarlarını kullanarak ikinci PCR'ye göre her örnek için dizin dizilerini ekleyin.Daha sonra, %2 agarose jel üzerinde PCR ürünlerinden herhangi birini elektrofore edin. UV transilluminator'daki DNA bantlarını görselleştirin ve 600 ile 800 baz çifti arasındaki geniş bandı içeren jel dilimini çıkarın. Jel dilimi 10 miligram başına membran bağlayıcı çözelti 10 mikrolitre ekleyin.Jel dilimleri tamamen eriyene kadar 50 ila 65 santigrat derecede karıştırın ve kuluçkaya yatırın. Daha sonra jel çözeltisini silika membran spin sütununa aktarın. Kolonu bir kez yıkama tamponu ile yıkayın ve 50 mikrolitre nükleaz içermeyen su ile DNA'yı aşındırın.Bir florometre kullanarak, saflaştırılmış amplikonrları ölçün ve her immünglobulin sınıfındaki amplikonları NGS dizilimi için eşit miktarlarda bir araya koyun. Bundan sonra, kütüphanelerin boyutunu ve konsantrasyonlarını belirlemek için DNA boyutlandırma çipi ile mikrokapiller bazlı elektroforez kullanın. Kütüphaneleri eksi 20 derecede saklayın.İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi sıralama çalışmasının örnek bir elektronik tablosu oluşturun. Ardından, bir reaktif kartuşunu ve kitaplıkları eritin. Sodyum hidroksit 0.2 normal bir çözüm yapmak ve istenilen azı konsantrasyonları elde etmek için kütüphaneler seyreltmek.Daha sonra, akış hücresini durulayın ve kurulayın ve reaktif kartuşu kuyusuna seyreltilmiş ve denatüre kütüphane çözeltisinin 600 mikrolitresini ekleyin ve sıralama çalışmasını başlatın. Bir bütün olarak bir mürin antikor repertuarı bir bakış açısı hücre veya dalak gibi dokulardan elde edilebilir, kemik iliği, lenf düğümü, veya kan. IgM, IgG1, IgG2c ve naif bir fare dalak gelen immünglobulin hafif zincir repertuarlarının temsilsonuçları burada gösterilmiştir.V(D)J 3D V(D)J çizimi ile yeniden düzenlenmesinde, her topun boyutu göreli okuma sayısını temsil eder. Başka bir deyişle, tüm B hücrelerindeki antikor mRNA'larının sayısını temsil eder. 3D mesh 110 immünglobulin ağır zincir V genleri oluşur, 12 immünglobulin ağır zincir D genleri, ve dört immünglobulin ağır zincir J genleri, kromozom kendi sırasını yansıtacak şekilde hizalanmış.2D VJ arsa IGL repertisi VJ yeniden düzenleme profilini gösterir. Her çubuğun uzunluğu, göreli okuma sayısını temsil eder. X ekseni temsil 101 immünglobulin ışık zinciri V-kappa genleri, ve üç immünglobulin ışık zinciri V-lambda genleri, ve Y-ekseni dört immünglobulin ışık zinciri J-kappa genleri temsil eder, ve üç immünglobulin ışık zinciri J-lambda genleri.Bir bütün olarak bir insan antikor repertuarı bir bakış periferik kan mononükleer hücreleri veya patolojik dokular da dahil olmak üzere çeşitli dokulardan analiz edilebilir. IgM, total IgG, total IgA, IgD, IgE ve IgL repertoirelerinin normal periferik kan mononükleer hücrelerinden elde edilen temsili sonuçları burada gösterilmiştir. Murine modelinde olduğu gibi, V(D)J yeniden düzenlemesinin repertoire profili, her topun boyutunun göreceli okuma sayısını temsil ettiği 3D V(D)J çiziminde gösterilir.3D mesh 56 immünglobulin ağır zincir V genleri oluşur, 27 immünglobulin ağır zincir D genleri, ve altı immünglobulin ağır zincir J genleri, kromozom üzerinde görünür sırasına göre hizalanmış. IgL reperton'daki VJ yeniden düzenleme profili, her çubuğun uzunluğunun okumaların göreli sayısını temsil ettiği 2D VJ çiziminde gösterilmiştir. X ekseni 41 immünglobulin ışık zinciri V-kappa genlerini, 32 immünglobulin ışık zinciri V-lambda genini, Y ekseni ise beş immünglobulin ışık zinciri J-kappa genini ve beş immünglobulin ışık zinciri J-lambda genini temsil eder.Bu protokolün çalışma materyalinde, patolojik örneklerin akış sitometrisine ve hatta kriyokesilerine göre az sayıda sıralanmış hücre kullanılabilir. Ancak, PCR koşullarının dikkatli optimizasyonu gerekli olacaktır. Bu protokolün çıktı bilgileri çok büyük olduğu için, biyoinformatik okuryazarlığı antikor ağının yapısını bulmaya yardımcı olacaktır.Bu bağışıklık sisteminin derin anlaşılmasına daha önce hiç öncülük eder.

identification-mouse-human-antibody-repertoires-next-generation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu çalışmada, özel proteinlerin glikozilasyon profil kullanılabilir lektin saptama yöntemi ile çoklanır yüksek verim antikoru mikroarray için geliştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, yeni, güvenilir reaktif özellikleri ve önemli ölçüde daha önceki prosedüre göre zaman, maliyet ve laboratuar ekipmanları gereksinimlerini azaltır.

Kompleks Örnekleri spesifik protein Glikozilasyon arasında Multiplexed Yüksek verim Profilleme için Kimyasal-bloke Antikor Mikroarray

Burada, insanlardan ve farelerden serum IgG ve IgM otoantikorlarının aynı anda tespiti için kullanılabilecek özelleştirilebilir antijen mikrodizileri oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu diziler, ilgilenilen herhangi bir antijene veya epitopa karşı antikorların yüksek verimli ve kantitatif tespitine izin verir.

IgG ve IgM Antikorlarının Eşzamanlı Algılama için İki Renkli Antijen Mikroarray&#39;ler Üretimi

Hidoma teknolojisine dayalı monoklonal antikorların üretilmesi için optimize edilmiş bir protokol sunulmuştur. Fareler bir immünokonjugat ile aşılandı. Dalak hücreleri, PEG ve ölümsüz miyelom hücreleri ile bir elektrik darbesi ile kaynaştırıldı. Antikor üreten hibridoma hücreleri HAT ve antijene özgü ELISA taraması ile seçildi.

Hibridoma teknolojisi ile murin monoklonal antikorlar üretilmesi

Epigenetik faktörler gen ekspresyonu modüle ve B hücre işlevi düzenleyen genetik programlarla etkileşim kurabilirsiniz. İçinde vitro B hücreli stimülasyon, qRT-PCR ve yüksek-den geçerek mikroRNA-sıra ve mRNA-sıra yaklaşımlar birleştirerek, B hücreleri miRNA ve gen ifadesinde epigenetik modülasyon analiz edebiliriz.

Genom çapında modülasyon mikroRNA ve mRNA'ların B hücreleri indüklenen geçirmek sınıf--düğme DNA rekombinasyon ve Plazma hücre farklılaşması içinde analiz HDAC inhibitörü-aracılı

Biz insan kanında dolaşan nadir B hücreleri başlayarak insan antikorlar faiz, bir antijen için belirli üretim için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu doğal antikorlar nesil verimli ve hızlı ve elde edilen antikor arasında son derece ilgili antijenleri ayırt edebilirsiniz.

Kanda dolaşan nadir antijen spesifik B hücreleri Discriminative insan monoklonal antikorların üretimi

Bu yazıda, biz T-bağımlı ve T-bağımsız immünglobulin (Ig) izotip yanıt ELISA kullanarak farelerde karakterize için bir protokol tanımlamak. Bu yöntem tek başına veya kullanılabilir akış ile birlikte sitometresi araştırmacılar T-bağımlı ve bağımsız T antijen bağışıklama takip farelerde B hücre-aracılı Ig izotip yanıtlarında farkları belirlemek için izin verir.

Timus bağlı ve timus bağımsız immünglobulin izotip yanıt Immunosorbent Assay enzim bağlı kullanarak farelerde karakterizasyonu

Gelecekteki hastalığı modelleme uygulamaları olan kimyasal olarak tanımlanan koşullarda, burada İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre farklılaşma içine her somite türev (myotome, sclerotome, dermatome ve syndetome) için bir iletişim kuralı mevcut ve Ortopedik cerrahi hücre tabanlı terapiler.

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

BSelex yöntemi tanımlamak ve insan periferik kan mononükleer hücrelerden bireysel antijen özgü antikorlar kurtarmak için tek hücreli PCR ve klonlama ile akış sitometri birleştirir.

Zenginleştirilmiş İnsan Hafızası B Hücre Popülasyonlarından İstenilen Özgülliklerle Antikorların Seçimi ve Geri Kazanımı İçin Tek Hücreli Tarama Yöntemi

Burada fare embriyonik dokularında gen ekspresyonunu profillemek için çok katlı tek hücreli mRNA dizileme yöntemi ni sunduk. Damlacık tabanlı tek hücreli mRNA dizileme (scRNA-Seq) yöntem çoklama stratejileri ile birlikte aynı anda birden fazla örnekten tek hücre profili olabilir, hangi önemli ölçüde reaktif maliyetlerini azaltır ve deneysel toplu etkileri en aza indirir.

Fare Embriyonik Hücrelerinin Çok katlı Tek Hücreli mRNA Sıralama Analizi

Mevcut protokol, kan örnekleri ve bağırsak biyopsilerinden DNA izolasyonu, yeni nesil sıralama için TCRβ ve IGH PCR kütüphanelerinin üretimi, bir NGS çalışmasının performansı ve temel veri analizi için bir yöntem tanımlamaktadır.

Yeni Nesil Dizileme Kullanılarak T ve B Hücre Reseptörü İmmün Repertuar Analizi

Burada, MHC sınıf I ve sınıf II peptit komplekslerinin yüksek kaliteli immünopeptidomik veriler sağlayan fare ve insan hücre çizgilerinden arındırılması için bir protokol sunuyoruz. Protokol, piyasada bulunan antikorları kullanarak numune hazırlamaya odaklanır.

İmmünopeptidomik: Kütle Spektrometresi Analizi için Fare ve İnsan MHC Sınıfı I ve II İlişkili Peptitlerin İzolasyonu

Öğrenin fare ve insan antikoru kapsayıcılarını yeni nesil sıralama ile analiz etmeyi. Bu yöntem B hücresi repertuarlarını görselleştirir ve aşı etkinliği ile hastalık patogenezine dair bilgi sağlar.

Fare ve insan antikoru kapsayacağını tarafından yeni nesil sıralama

Daha fazla video keşfet