Yalıtım ve insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücre erken Doğum ve terim bebekler karakterizasyonu

Bu yöntem, hücre terapisi için USMSC'nin en iyi kaynağı gibi UCMSC'nin görüşülmesinde anahtar soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, ucmsc'nin pre-term ve dönem öncesi bebeklerden tutarlı izolasyon ve güçlü çoğalmasını sağlamasıdır. Bu tekniğin etkileri inatçı hastalıkların tedavisine kadar uzanır.

Bu yöntem UCMSC müzakere içine fikir sağlayabilir rağmen, aynı zamanda diğer MSC kaynaklarına uygulanabilir, yağ dokusu gibi, sinovyum, cilt, diş hamuru, ve benzeri. Göbek diseksiyonu ve mezenkimal kök hücre izolasyonu adımlarında çok varyasyon olduğu için genellikle, bu yönteme yeni bir birey mücadele edecek. Bu adımların öğrenilmesi zor olduğundan, gözden kaçırılmaya yatkın birkaç nokta olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir.

Göbek kordonu diseksiyon başlamak için, ilk bir metal tepsi, steril makas ve forceps, on mililitre pipetler, 25 mililitrelik pipetler ve iki 60 milimetre doku kültürü yemekleri hazırlamak. Oda sıcaklığına kadar 500 mililitre azaltılmış serum orta ve kültür ortamı olan PBS saflaştırılmış enzim karışımlarını ısıtın. Alfa MEM'deki 50 mililitrelik bir tüpten daha önce izole edilmiş göbek kordonu çıkarın ve plastik tepsiye yerleştirin.

Göbek kordonu tartın ve sonra kordon beş gram incelemek için sterilmak kullanın. Göbek kordonu sterilize etmek için, üzerine yüzde 70 etanol on mililitre dökmek için on mililitre pipet kullanın. Daha sonra on mililitrelik pipetle on mililitre PBS ekleyerek kabloyu iki kez yıkayın.

Sterilize 60 milimetre doku kültür çanak yıkanmış göbek kordonu yerleştirin ve on mililitre azaltılmış serum orta ve 0.5 mililitre saflaştırılmış enzim karışımları ekleyin. 2-3 milimetrelik parçalar halinde kordon kesmek için steril makas ve forceps kullanın. Çanak%5 karbondioksit inkübatörve 37 santigrat derece 30 dakika kuluçka yerleştirin.

Sonra kısmen sindirilmiş parçaları küçük parçalara ayırın ve homojen kıvamlı olana kadar %5 karbondioksit kuvözde 37 derecede kuluçkaya yatırın. Son olarak, homojen in 25 mililitrelik pipet ile kolayca akmasını sağlamak. İlk kültür orta 500 mililitrelik şişe dört, 50 mililitreplastik tüpler hazırlamak.

Göbek kordonu homojen iki, 50 mililitreplastik tüpler her tüp yaklaşık 7,5 mililitre ile bölmek için 25 mililitrelik pipet kullanın. Sonra her tüp içine kültür orta 20 mililitre ekleyin ve iyice karıştırın. Her homojen25 mililitrelik pipet ile toplayın ve yeni bir 50 mililitrelik toplama tüpü üzerine yerleştirilen 100 mikrometre hücresüz ile filtre.

Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1000g filtrasyonlu iki tüp santrifüj. Santrifüj bittikten sonra, dikkatle supernatant aspire ve atın. Her tüpe beş mililitre kültür ortamı ekleyin ve hücre peletlerini yeniden askıya alın.

Hücre süspansiyonunu 60 milimetrelik yeni bir plakaya ve kültüre 37 derecede yüzde beş karbondioksit kuvözle aktarın. UCMSC's kültür için, Sıcak PBS, trippsin EDTA, ve kültür orta, oda sıcaklığına. Hücreler tabağa bağlandığında, ortayı çıkarın ve enkaz ve kırmızı kan hücrelerini temizlemek için beş mililitre PBS ile iki kez yıkayın.

Kültür ortamını ekleyin ve %5 karbondioksit kuvözde 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Haftada iki kez ortamı değiştirin ve hücreleri yüzde 90-100 biraraya gelene kadar kültürlendirin. Daha sonra hücreleri beş mililitre PBS ile iki kez yıkayın, 0.5 mililitre tripsin EDTA ekleyin ve 5-10 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.

Hücreler yuvarlanmış ve ayrılmış hale geldiğinde, kültür orta dokuz mililitre ekleyin ve trypsin inaktive etmek için iyi karıştırın. Hücre süspansiyonuna 100 milimetrelik yeni bir plaka ekleyin. Hücreleri %5 karbondioksit kuvözde 37 derecede büyütün.

Tripsinizasyon ve onuncu ayete kadar iki yeni plakaya bölme tekrarlayın. UCMSC'nin yüzey işaretleyici ifadesi, karakterizasyonu için ölçüt olarak kullanılmıştır. Uygun antikorlar ile inkübe edildiğinde ve akış sitometrisi ile analiz edildiğinde, MSC'nin imza belirteçleri için pozitif, ancak monosit makrofaj için negatif, hematapoietic kök hücre ve eftilyal hücre için negatif, B hücresi için negatif, pan lökositler için negatif ve majör histokompatibilite kompleksleri için negatif bulundu.

USCMSC'nin preterm ve dönem bebeklerinden trilineage farklılaşma kapasitesini değerlendirmek için hücreler adipositler, osteositler ve kondrositler olarak ayırt edildi. UCMSC, farklılaşma kapasitelerini doğrulayan üç mezodermal hücre türüne de başarıyla ayrılmıştır. Bu yordamı çalışırken, dört kritik adım olduğunu hatırlamak önemlidir.

Kabloyu iki ila üç santimetrelik parçalara ayırın, daha küçük parçalara bölünür, homojenin 25 mililitrelik pipetten kolayca akmasını sağlar ve homojeni 100 mikrometrelik bir süzgeçten filtreler.