Mezenkimal kök hücre izolasyon hamuru doku ve kanser hücreleri ile ortak kültür ilişkileri incelemek için

Bu yöntem, kök hücre davranışının düzenlenmesinde yetişkin kök hücrelerinrolü hakkında kök hücre alanında anahtar soruların cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, canlı organizmalar kullanılmadan kanser hücresi ve kök hücre etkileşimlerinin in vitro olarak değerlendirilmesine olanak sağlamasıdır. Bu teknik, kemik gibi sert dokulara kanser metastazında yetişkin kök hücrelerinin teşvik edici rolünü modelleyen kanser metastazı potansiyeline sahiptir.

Prosedürün gösterimi, laboratuvarımda doktora sonrası hüseyin Apdik tarafından yapılacaktır. 17-20 yaş arası genç yetişkinlerden elde edilen yirmilik dişlerin merkezinden posa dokusunu çıkarmak için steril ekstraksiyon forsepsleri kullanarak başlayın. 10 santimetrelik doku kültürü yemekleri soğuk tam DMEM doku yerleştirin ve iki ila üç milimetrelik parçalar halinde örnekleri kıyma için bir neşter kullanın.

Her çanak tan parçaları bir doku kültürü altı iyi plaka tedavi bireysel kuyulara aktarın ve tam DMEM 200 mikrolitre ile her kuyuda dokuları kapsayacak. Dokuların nemli, 37 derece santigrat ve %5 CO2 hücre kültürü kuluçka makinesinde en az iki saatlik kuluçka ile kuyu diplerine bağlanmasına izin verin. Kuluçka sonunda, taze tam orta ve kültür iki ila 2,5 mililitre ile dokuları beslemek ek bir sekiz ila dokuz gün hücreleri.

Kültür %80 birleştiğinde, her kuyuyu iki mililitre PBS ile yıkayın ve ardından 37 santigrat derecede iki mililitre tripsin ile hücrelerin ayrılması nı takip edin. İki dakika sonra, kuyu başına tam DMEM iki mililitre ile reaksiyonu durdurmak ve santrifüj ile hücreleri toplamak. Daha sonra, hücrelerin iki kuyu başına taze tam orta 15 mililitre pelet resuspend ve sonraki kültür için T75 şişeleri içine hücreleri geçiş.

En az sekiz pasajdan sonra, ışık mikroskobu ile hücreleri görselleştirin. Diş hamuru kök hücreleri kültür yemekleri bağlı olmalı ve bir mil benzeri hücre morfolojisi gösterilmelidir. Yüzey marker analizi için, tripsinizasyon yapıldıktan sonra, 1.5 mililitrelik tüplerde oda sıcaklığında 20 dakika boyunca %4 paraformaldehit ile hücreleri düzeltin ve ardından yıkama başına 500 mikrolitre PBS'de üç yıkama yapın.

Son yıkamadan sonra, dört santigrat derece bir saat boyunca tüp başına PBS 100 mikrolitre ilgi uygun antikorlar ile hücreleri etiket. Kuluçka sonunda, hücreleri pbs'de gösterildiği gibi üç kez yıkayın ve hücreleri tüp başına 100 mikrolitre PBS'de uygun ikincil antikorlarla etiketleyin. Daha sonra pbs üç kez örnekleri yıkayın ve standart protokollere göre akış sitometri ile hücreleri analiz.

Diş posası kök hücrelerinin farklılaşması için, hücre kültürü kuluçka makinesinde 24 saatlik kuluçka için 500 mikrolitre tam DMEM'de 24 kuyulu plakaların tek tek kuyularına dört hücreye 10 kez tohum at. Ertesi gün, her kuyudaki ortayı uygun farklılaştırma ortamıyla değiştirin ve hücreleri iki hafta boyunca haftada iki kez yenilenerek kuvöze geri dönün. Farklılaşma, standart protokollere göre von Kossa ve Alcian mavi boyama ile doğrulanabilir.

İki ila dört pasajdan sonra, kültürler %80 biraraya geldiğinde, kültürdeki diş hamuru kök hücrelerinden koşullanmış orta süpernatantları toplayın. Daha sonra, herhangi bir atık doku malzeme ve hücre enkaz kaldırmak ve kullanıma kadar negatif 20 santigrat derece orta saklamak için toplanan orta santrifüj. Kanser hücresi tedavisi için, tohum bir kez 10 beş tümör hücrelerine bir gecede kuluçka için 12-iyi plaka bireysel kuyular içine 37 santigrat derece ve% 5 CO2.

Ertesi sabah, steril bir 200 mikrolitre ucu her kuyuda bir çizik yaralanması yapmak ve hemen klimalı orta çeşitli konsantrasyonlarda içeren taze orta ile her kuyuda supernatant değiştirin. Daha sonra, ters bir mikroskop altında çizikler gözlemlemek ve düzenli zaman aralıklarında yaralı kültürlerin görüntüleri elde. Analizin sonunda, ImageJ'de çizilme kapatmayı zaman içinde ölçün.

Diş hamuru kök hücre göçünü değerlendirmek için, ilk tohum üç kez 10 dört diş hamuru kök hücreleri üzerine bireysel 24-well plaka ekler üzerine 0.4 mikron gözenekler ile 250 mikrolitre DMEM ve 37 santigrat derece bir gecede ekler kuluçka. Sonra, tohum beş kez 10 37 santigrat derece gecede kuluçka için DMEM 500 mikrolitre 24-iyi plaka bireysel kuyulara dört tümör hücreleri. Ertesi sabah, tümör hücrelerini olduğu gibi kaşıyın.

Supernatants taze DMEM 500 mikrolitre ile değiştirin ve her iyi taze orta ile beslenen içine bir diş hamuru kök hücre tohumlu yerleştirin. Sonra hemen ters mikroskop hücreleri gözlemlemek ve düzenli aralıklarla diş hamuru kök hücre göçünü değerlendirmek için hücreleri görüntü. Diş posası kök hücrelerinin kanser hücreleriyle doğrudan etkileşimini değerlendirmek için, tek hücreli süspansiyonlar elde etmek ve ayrıştırılan hücreleri santrifüj ile toplamak için etiketli her kültürü deneyin.

Dilüent C tamponu içinde hazırlanan, üreticinin talimatlarına göre verilen farklı hücre bağlayıcı boya çözeltilerinde peletleri yeniden askıya alın ve hücreleri 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Fetal sığır serum100 mikrolitre ile boyama reaksiyonu sonve santrifüj ile hücreleri toplamak. Sonra tam orta iki mililitre bir oran altı iyi plaka başına dört diş hamuru kök hücre ve tümör hücreleri beş kez 10 kaplama önce tam büyüme ortamı ile hücreleri santrifüj.

Santrifüj ile 24 veya 48 saatlik kuluçkadan sonra hücreleri toplayın ve ardından PBS'de yıkanır. Daha sonra, standart akış sitometrik analiz protokollerine göre hücreleri analiz etmeden önce herhangi bir hücre agregasını dağıtmak için beş mililitrelik yuvarlak dip akış sitometri tüpleri ve girdap floresan aktive hücre sıralama tampon 300 mikrolitre hücreleri yeniden askıya. Diş posası kök hücreleri, hematopoetik hücre belirteçlerini kaplamave ekspres mezenkimal kök hücre yüzey istemlerinden sonra fibroblast benzeri hücre morfolojisi sergilerler.

Uygun farklılaşma kokteyli uygulamasını takiben diş posası kök hücre kültürlerinde osteo, kondro ve adipojenik farklılaşmaile ilgili morfolojik ve moleküler düzeyde değişiklikler de gözlenmektedir. Sıfırdan yaralanan tümör hücre kültürlerinin %10 ve %20 konsantrasyonları ile koşullu ortam ların tedavisi, kontrol orta-tedavi edilen tümör hücre kültürlerine göre çizilme kapanmasını önemli ölçüde artırır. Diş posası kök hücre insert co-kültürlerden salgılanan moleküller de kontrol hücre co-kültürleri ile karşılaştırıldığında yaralı tümör hücrelerinde çizik kapatma arttı.

İn vitro hücre kültürü içinde diş posası sapı ve tümör hücresi etkileşimlerinin floresan mikroskop analizi, tümör hücrelerinin 48 saat sonra hızla çoğaldığı iyi organize edilmiş bir yapının yaratılmasını ortaya koymaktadır. Bu prosedürü denerken, iki doku örneğini soğuk ortamda tutmayı ve hücre ölümünü en aza indirmek için numuneleri hemen laboratuvara taşımayı unutmamak önemlidir. Bu teknik, gelişiminden sonra, insanlarda yetişkin kök hücre kanseri etkileşimlerini keşfetmek kök hücre alanlarında araştırmacılar için yol açtı.

Bu prosedürü takiben, çeşitli kök hücre ve kanser türlerinin diferansiyel etiketli hücreler için bağışıklık hücresi izleme gibi diğer yöntemler yetişkin kök hücrelerin kanser hücreleri ile etkileşim ve kontrol kanser metastazı hakkında ek soruya cevap için yapılabilir. İnsan örnekleri ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bulaşıcı hastalıklar için hasta örneklerinin analiz edilmesi ve yazılı hasta onayı alınması gibi önlemlerin her zaman bu işlemi gerçekleştirirken uygulanması gerektiğini unutmayın.