Name: Düzenleyici T hücre alt kümeleri içinde fare timus, lenf nodu ve dalak akışı sitometresi kullanarak drene pankreas belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Öğrenin fare timusu, lenf nodu ve dalağından tek hücre süspansiyonu hazırlama ve akış sitometrisiyle düzenleyici T hücre alt kümelerini analiz etme yöntemini. Bu manuel protokol maliyet etkindir ve bağışıklık hücrelerinin sağlık ve hastalık bağlamındaki rollerini araştırmaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu da çalışmanın maddi İsveçli Araştırma Konseyi, EXODIAB, İsveç diyabet Vakfı, İsveçli çocuk diyabet Fonu, SEB Diabetesfonden ve O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse tarafından desteklenmiştir. Yazarlar ayrıca onların destekler ve tartışmalar için teşekkürler Ola başı Carlsson ve Stellan Sandler ister misiniz.

Yerel hayvan Etik Komitesi, Uppsala Üniversitesi hayvan deneyleri onaylanmış.
1. hayvanlardan organ hasat
<ol><li>Fareler tarafından servikal çıkığı kurban.</li>
	<li>Timik bezleri yerleştirin ve dalağı 20 mL mercek tüpleri veya 15 mL konik tüpler Hanks´ 5 mL ile dolu dengeli tuz solüsyonu (HBSS). 1.5 mL mikro tüpler RPMI 1640 1 mL ile dolu yer PDLNs. Bütün timus ve dalak ve bütün PDLNs kullanın. Not: Organları prosedürü boyunca buzda tutulmalıdır ve araştırmacı timik bağışıklık hücreleri hızlı bir şekilde yüksek sıcaklıklarda düşebilir beri timik doku özellikle işlerken tek hücre süspansiyonlar, hazırlarken hızlı olmaya çalışmalısınız.</li>
</ol>2. tek hücre izolasyon timus ve dalak
<ol><li>İyice timus ve dalak bağışıklık hücreleri serbest bırakmak için cımbız bir çift ile sıkmak. Kalan timik ve dalak kapsülü atmak.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 15 mL konik tüp ve 4 ° C'de bir Pelet oluşturmak için 5 min için 433 x g , santrifüj aktarın. Süpernatant atmak.</li>
	<li>Kırmızı kan hücreleri parçalayıcı için hücre süspansiyon 5 mL 0,2 M NH4Cl resuspend ve 10 dk. ters çevirmek için tüpler baş aşağı yavaşça her 2 dk. eklemek 5 mL HBSS kuluçka sonundaki lizis durdurmak için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>433 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.</li>
	<li>Hücre Pelet HBSS yaklaşık 5 mL resuspend. Tüpler HBSS ile doldurun.</li>
	<li>433 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.</li>
	<li>Hücre Pelet HBSS yaklaşık 5 mL resuspend. Tüpler HBSS ile doldurun.</li>
	<li>433 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.</li>
	<li>Hücre Pelet timus için HBSS 5 mL ve dalak için 10 mL resuspend.</li>
	<li>Transfer 1 mL timik hücre süspansiyon ve dalak hücre süspansiyon 5 ml, 500 µL alt tüpleri hücre süzgeç kapaklar ile yuvarlak. Hücre süspansiyon hücre süzgeç kapaklar için geçerlidir. Not: 35 µm naylon mesh cap dahil edilmiştir. Yaklaşık 5-10 milyon hücre her tüpün içinde toplanmıştır.</li>
</ol>3. tek hücre izolasyon PDLN
<ol><li>Steril 250 µm metal kafes 15 mL konik tüp bir rafa yerleştirin. Mesh RPMI 1 mL ile yıkayın.</li>
	<li>Lenf düğümleri için metal kafes aktarım ve bir çift cımbız kullanarak ağ eziyet. RPMI 1 mL tüp içine hücreleri temizlemek için metal mesh uygulayın. 3 kez daha yineleyin ve mesh kaldırın.</li>
	<li>433 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.</li>
	<li>Hücre Pelet RPMI yaklaşık 5 mL resuspend. Tüpler RPMI ile doldurun.</li>
	<li>433 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.</li>
	<li>Hücre Pelet RPMI yaklaşık 5 mL resuspend. Tüpler RPMI ile doldurun.</li>
	<li>433 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.</li>
	<li>Hücre Pelet 2 mL RPMI resuspend. Transfer hücre süspansiyon 2 mL 5 ml yuvarlak alt tüpleri hücre süzgeç kapakları. Hücre süspansiyon hücre süzgeç kapaklar için geçerlidir.</li>
</ol>4. Akış Sitometresi
<ol><li>Hücre süspansiyonlar timus, PDLN ve dalak vasıl 433 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.</li>
	<li>Akış Sitometresi arabellek (FACS arabellek) Boyama 100 µL aşağıdaki yüzey antikor hücrelerle leke: 0,75 µg/100 µL FITC Birleşik CD4 antikor, 0.60 µg/100 µL APC-H7-Birleşik CD8 antikor, 0,30 µg/100 µL PE Birleşik CD25 antikor, 5 µL (1:20) APC Birleşik Nrp1 antikor. Tüpler 40 min için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>200 µL FACS arabelleği her tüp için ekleyin. 433 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak. Bir kez daha yineleyin.</li>
	<li>Fix ve hücreleri hücre Pelet 500 µL Permeabilization fiksasyon arabellek (PFB) içinde resuspending tarafından permeabilize. Not: PFB fiksasyon/Permeabilization konsantre fiksasyon/Permeabilization seyreltici, 3 parça ile 1 kısım karıştırılarak hazırlanır.</li>
	<li>Tüpler gecede 4 ° C'de buzdolabında tutun. Not: 1 h kuluçka da çalışır.</li>
	<li>433 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.</li>
	<li>Hücre Pelet 500 µL Permeabilization yıkama arabellek (PWB), içinde resuspend. 433 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak. Not: PWB Permeabilization sulandrarak hazırlanan tampon (10 x) 1:10 için distile suda.</li>
	<li>PWB 100 µL aşağıdaki hücre içi antikor hücrelerle leke: 0,30 µg/100 µL PE-Cy7-Birleşik Foxp3 antikor, 4 µL (1:25) PacificBlue Birleşik Helios antikor. Tüpler 1 h için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>PWB 500 µL her tüp için ekleyin. 433 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.</li>
	<li>Hücre Pelet PWB 500 µL içinde resuspend. 433 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.</li>
	<li>Hücre Pelet FACS arabellek 300 µL içinde resuspend.</li>
	<li>Akış Sitometresi hücrelerdeyse analiz.</li>
	<li>Tek hücreleri yan dağılım alanı, yükseklik ve genişliği ve ileri dağılım alanı, yükseklik ve genişlik alarak kapı. Bir milyon olayları analiz için çalıştırın.</li>
	<li>FCS verdiğinizde deneyler ve Akış Sitometresi analyzer yazılımı kullanarak bunları analiz.</li>
</ol>

<ol><li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li>
<li>Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+Scurfin+in+CD4%2BCD25%2B+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).</li>
<li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li>
<li>Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+self-tolerance+maintained+by+activated+T+cells+expressing+IL-2+receptor+alpha-chains+%28CD25%29.+Breakdown+of+a+single+mechanism+of+self-tolerance+causes+various+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.</a> The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).</li>
<li>Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+regulatory+T+cells+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">How regulatory T cells work.</a> Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).</li>
<li>Thornton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Helios%2C+an+Ikaros+transcription+factor+family+member%2C+differentiates+thymic-derived+from+peripherally+induced+Foxp3%2B+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells.</a> The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).</li>
<li>Weiss, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin+1+is+expressed+on+thymus-derived+natural+regulatory+T+cells%2C+but+not+mucosa-generated+induced+Foxp3%2B+T+reg+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).</li>
<li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin-1+distinguishes+natural+and+inducible+regulatory+T+cells+among+regulatory+T+cell+subsets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).</li>
<li>Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+analysis+of+Helios+and+Neuropilin-1+as+a+marker+to+detect+thymic+derived+regulatory+T+cells+in+naive+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice.</a> Scientific Reports. 5, 7767(2015).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+spleen+with+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-35+administration+counteracts+established+murine+type+1+diabetes--possible+involvement+of+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells.</a> Scientific Reports. 5, 12633(2015).</li>
<li>Digre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+heparanase+enhances+T+lymphocyte+activities+and+intensifies+the+inflammatory+response+in+a+model+of+murine+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis.</a> Scientific Reports. 7, 46229(2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-tumoral+immune+cell+alterations+in+wild+type+and+Shb-deficient+mice+in+response+to+4T1+breast+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas.</a> Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu çalışmada izole timik bezleri, PDLNs ve dalağı NOD farelerin tek hücreleri ve Helios ve CD4 Nrp1 ifadesi soruşturma+CD8-CD25+Foxp3+ Treg hücreler Akış Sitometresi kullanarak. Bu da çalışmanın, NOD fareler, hangi tip 1 diyabet fare bir modeldir kullanıldı. Bir önceki çalışmada, biz vahşi türü fare suşları CD-1 ve C57BL/6 fareler Helios veya Nrp1 tTreg hücre pTreg hücrelerden ayırt için daha iyi bir işaret olduğunu araştırmak için kullandık. Bu çalışmada, biz benzer Treg hücre...

Düzenleyici T (Treg) hücreleri bağışıklık sistemi homeostazı için kritik öneme sahiptir. Treg hücreler ifade yüzey antijenleri CD4 ve CD25 ve transkripsiyon faktörü forkhead kutusunu P3 (Foxp3)1,2,3tarafından tanımlanır. Sakaguchi vd. ilk CD25 yapısal T bastırıcı hücrelerde fareler4insan Treg hücreler tanımlaması için öncü bir gözlem sağlanan, ifade edilir gösterdi. Treg hücreler mekanizmaları, Apoptozis, sitokin tüketimi ve inhibisyon sitotoksik ifade yoluyla ikna etmek için granzymes salgısı ile cytolysis dahil olmak üzere çeşitli yoluyla baskılayıcı bir yetenek uygulamakla tarafından bağışıklık hoşgörü merkezi bir rol oynamak T-lenfosit antijeni 45. Ayrıca, dönüştürme büyüme faktörü beta (TGF-β), İnterlökin-10 (IL-10) ve IL-355gibi inhibitör sitokinler salgılarlar. Treg hücreler doğal olarak timus bu durumda timik türetilmiş Treg (tTreg) hücreleri atanan elde edilebilir veya periferik indüklenen (pTreg) Treg hücreler durumda denir o onlar periferik organlarda bağlı olmak.
Helios, Ikaros transkripsiyon faktörü ailesinin üyesi olan tTreg hücreler arasında ayrım için bir işaret olduğu bildirildi ve pTreg6hücreler. Daha sonra diğer iki grup Neuropilin 1 (Nrp1), semaphorin III reseptör tTreg hücreleri belirli koşullar7,8altında yüzey avans olarak hizmet verebilir rapor. Yine de, Singh ve ark. Helios bu bağlamda naif fareler9daha iyi bir işaret olduğunu göstermiştir.
Treg hücreler kümelerine homeostazı bağışıklık sisteminin bakım ve otoimmünite ve enfeksiyona karşı koruma önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, numaraları ve lenfoid ve sigara-lenfoid doku bu nüfus oranlarını belirlemek önemlidir. Bunu başarmak için bir tek hücre kullanılamaz hale gelen bu organların hazırlamak zorunda. Bir dizi Protokolü açıklanan veya önceki çalışmalarda kullanılır. Esas olarak, otomatik dissociators daha önce yayımlanmış raporları10,11' kullanılmıştır. Otomatik dissociators kullanmak kullanışlıdır ve zaman tasarrufu, ancak bu pahalı bir işlemdir. Bu nedenle, normoglycemic obez olmayan diyabetik (NOD) fareler ve bu organların izole tek hücreleri tek hücre süspansiyonlar fare timik bezleri, pankreatik drenaj lenf düğümleri (PDLNs) ve dalağı hazırlamak için bir el ile yöntemi kullandık. Bu yöntem bizim önceki çalışmalarda kullanılan ve tek hücre süspansiyon hazırlamak için elle yapılan yöntem otomatik dissociator yöntemi9,12olarak,13,14verimli olduğunu bulduk. Ayrıca, biz Akış Sitometresi CD4 oranlarını belirlemek için kullanılan+CD8-CD25+Foxp3+ Treg hücreler ve Treg kümelerine hücreleri tTreg ve pTreg hücreleri. TTreg ve pTreg hücreleri Helios ve Nrp1 tTreg hücre için işaretleyici olarak kullanarak ayırt edildi. Böylece, bizim sonuçları tek hücreleri hazırlanması için elle yapılan yöntem verimli çalışır ve hazırlanan tek hücre süspansiyonlar daha fazla Akış Sitometresi kullanarak çalışmaları için kullanılabilir gösterir.

<table><tbody><tr><td>NOD fareler</td><td></td><td></td><td>Kurum içi ekmek</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Statens veterin&auml; rmedicinska anstalt</td><td>991750</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>EMD Millipore</td><td>1011450500</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3 / Transkripsiyon Faktörü Boyama Tampon Seti</td><td>ThermoFisher</td><td>00-5523-00</td><td>Fiksasyon/Geçirgenleştirme Konsantresi, Fiksasyon/Geçirgenleştirme Seyreltici ve Geçirgenleştirme Tamponu (10x) İçerir</td></tr><tr><td>eBioscience Akış Sitometrisi Boyama Tamponu</td><td>ThermoFisher</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Monoklonal Antikor (RM4-5), FITC, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0042-85</td><td></td></tr><tr><td>CD25 Monoklonal Antikor (PC61.5), PE, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>12-0251-83</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen&nbsp; APC-H7 Sıçan anti-Fare CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>560182</td><td></td></tr><tr><td>Fare Nöropilin-1 APC konjuge Antikor</td><td>R& D Sistemleri</td><td>FAB5994A</td><td></td></tr><tr><td>FOXP3 Monoklonal Antikor (FJK-16s), PE-Siyanin7, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>25-5773-82</td><td></td></tr><tr><td>Pasifik Mavisi anti-fare/insan Helios Antikoru</td><td>BioLegend</td><td>137220</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Yuvarlak Tabanlı Polistiren Test Tüpü, Hücre Süzgeci Geçmeli Kapaklı</td><td>CORNING</td><td>352235</td><td>A 35 &mikro; m naylon ağ, çift konumlu geçmeli kapağa dahil edilmiştir</td></tr><tr><td>Tüp 15 mL, 120 mm x17 mm, PP</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Mikro tüp 1.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık sintilasyon şişeleri</td><td>WHEATON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometrisi</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometrisi analiz yazılımı</td><td>Inivai</td><td>Technologies Flowlogic</td><td></td></tr></tbody></table>

düzenleyici t hücre alt kümeleri içinde fare timus, lenf nodu ve dalak akışı sitometresi kullanarak drene pankreas belirlenmesi

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Bizim bağışıklık sistemi bir numarası ve bağışıklık hücreleri düzenleyici T hücreleri (Treg) hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli oluşur. Treg hücreler iki alt kümeleri, timik türetilmiş Treg (tTreg) hücreleri ve periferik indüklenen Treg (pTreg) hücre bölünmüş olabilir. Vücudumuzun farklı organlarda varsa ve Helios ve Neuropilin 1 gibi özel işaretler tarafından seçkin. Bu tTreg hücreler pTreg hücreleri işlevsel olarak daha baskılayıcı bildirilmiştir. Bu nedenle, türdeş olmayan hücre popülasyonlarının soruşturma ne zaman tTreg ve pTreg hücre oranı belirlemek önemlidir. Burada, biz timik bezleri, pankreatik drenaj lenf düğümleri ve dalağı normoglycemic obez olmayan diyabetik farelerin tTreg hücreleri Akış Sitometresi kullanarak pTreg hücrelerden ayırt etmek için toplanan. El ile tek hücre kullanılamaz hale gelen bu organların hazırladık. Fluorochrome Birleşik yüzey CD4, CD8, CD25 ve Neuropilin 1 antikorlar hücreleri leke için kullanılmıştır. Onlar gece buzdolabında tutuldu. Ertesi gün, hücreleri Birleşik fluorochrome hücre içi Foxp3 ve Helios antikorlar ile lekeli. Bu işaretleri Treg hücreler iki alt kümeleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bu iletişim kuralı tek fare timus, dalak ve lenf nodu drene pankreas hücrelerden hazırlamak ve sonraki akış sitometrik çözümlemesi için kullanma a sade ama pratik yol gösterir.

Nrp1 ve tTreg ve pTreg hücreleri üzerinde Helios ifadesi araştırmak için tek hücreleri timik bezleri, PDLNs ve normoglycemic NOD farelerin dalağı hazırlanan ve onları için akış sitometrik Treg hücre işaretli CD4, CD25, Foxp3, Helios ve Nrp1 lekeli analiz. Sonuçları stratejileri (şekil 1) çoğunluğuna temsilcisi gösterildiği gibi analiz edildi. Helios+ hücreler arasında CD4 oranı bulduk+CD8-CD25+Foxp3+ Treg...

Burada, biz tek fare timus, lenf nodu ve dalak ileri çalışmalar için Akış Sitometresi kullanarak bu hücreler drene pankreas hücrelerden hazırlamak için bir iletişim kuralı mevcut. Ayrıca, bu iletişim kuralını kullanarak Akış Sitometresi düzenleyici T hücreleri kümelerine belirlemek için kullanıldı.

Düzenleyici T hücre alt kümeleri içinde fare timus, lenf nodu ve dalak akışı sitometresi kullanarak drene pankreas belirlenmesi

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

Bu protokol, bağışıklık hücrelerinin sağlık ve patolojide özellikle organlardaki rolünün araştırılmasına yardımcı olur. Bu tekniğin en büyük avantajı, manuel bir teknik olduğu için bunun uygun maliyetli bir teknik olmasıdır. Prosedürü gösteren Zhengkang Luo, benim laboratuvarımdan doktora öğrencisi olacak.Başlamak için, daha önce ötenazi olmuş farelerden gelen timik bezleri ve dalakları Hank'in dengeli tuz çözeltisinin 5 ml'si ile doldurulmuş 20 ml sintillasyon phials veya 15 ml konik tüplere yerleştirin. 1 ML RPMI-1640 ml dolu 1,5 ml mikro tüpler içine pankreas drenaj lenf düğümleri yerleştirin. Tüm timus ve dalak ve tüm PDLNs kullandığınızdan emin olun.Tüm işlem boyunca organları buzda tutun. Makas bir çift kullanarak, iyice bağışıklık hücrelerini serbest bırakmak için timus ve dalak sıkmak. Kalan timik ve dalak kapsülleri atın.Hücre süspansiyonuna 15 ml konik bir tüp aktarın. Santrifüj 433 kez g ve 4 derece santigrat beş dakika için, ve supernatant atın. Kırmızı kan hücrelerini eşitlemek için hücre süspansiyonunu 0,2 Molar amonyum klorür 5 ml'de yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında on dakika kuluçkaya yatırın.Tüpleri her iki dakikada bir hafifçe ters çevirin. Kuluçka sonunda, lysis durdurmak için HBSS 5 ml ekleyin. Tüpleri 433 kez g ve 4 derece santigrat derecede beş dakika santrifüj edin.Supernatant atın ve HBSS yaklaşık 5 ml hücreleri yeniden askıya. Sonra tüpleri HBSS ile doldurun. Numunelerin santrifüjünden tüpün HBSS ile doldurulmasına kadar bu işlemi bir kez tekrarlayın.Tüpleri bir kez daha 433 kez g ve dört derece santigrat beş dakika santrifüj. Supernatant atın ve HBSS pelet yeniden askıya. Hücre süzgeci kapaklı 5 ml yuvarlak alt tüpler elde edin.Süspansiyonu hücre süzgeci kapaklarına uygulayarak 1 ml timik hücre süspansiyonu ve 500 mikrolitre dalak hücre süspansiyonunun tüplere aktarılması. İlk olarak, bir raf içine 15 ml konik tüp yerleştirin. Tüpün üzerine steril 250 mikrometrelik metal bir ağ yerleştirin.1 ml RPMI ile örgü durula. Sonra, metal örgü lenf düğümleri transfer ve örgü onları ezmek için cımbız bir çift kullanın. Hücreleri tüpe yıkamak için kafese 1 ml RPMI uygulayın.Her örnek için lenf düğümlerini üç kez aktarma ve taşlama bu işlemi tekrarlayın ve sonra örgü kaldırın. Tüpleri 433 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve RPMI yaklaşık 5 ml hücreleri yeniden askıya.Sonra tüpleri RPMI ile doldurun. Numunelerin santrifüjünden tüpün RPMI ile doldurulmasına kadar bu işlemi bir kez tekrarlayın. Tüpleri tekrar 433 kez g ve dört derece santigrat beş dakika santrifüj.Supernatant atın ve RPMI 2 ml hücre pelet yeniden askıya. Hücre süspansiyonunun 2 ml'sini hücre süzgeç kapaklı 5 ml yuvarlak alt tüplere aktarın. İlk olarak, timus, dalak ve PDLN örneklerinden hücre süspansiyonuna 433 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin.Supernatant atın. Hücreleri metin protokolünde belirtildiği gibi yüzey antikorlarıyla lekeleyin ve tüpleri 40 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Ardından, her tüpe 200 mikrolitre FACS arabelleği ekleyin.Santrifüj 433 kez g ve dört derece santigrat beş dakika için, ve supernatant atın. Arabelleği ekleyerek, santrifüj ekleyerek ve süpernatant'ı bir kez atarak bu işlemi yineleyin. Hücreleri düzeltmek ve permeabilize etmek için 500 mikrolitre permeabilizasyon fiksasyon tamponhücre pelet yeniden askıya.Tüpleri bir gecede 4 derece santigrat derecede bir buzdolabına aktarın. Ertesi gün tüpleri 433 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve permeabilizasyon yıkama tampon 500 mikrolitre hücre pelet yeniden askıya.Hücreleri tekrar 433 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin ve süpernatant atın. Metin protokolünde belirtildiği gibi hücreleri hücre içi antikorlarla lekeleyin. Tüpleri 1 saat boyunca buzda kuluçkaya yatırın.Bundan sonra, her tüp için permeabilizasyon yıkama tampon 500 mikrolitre ekleyin. Santrifüj 433 kez g ve dört derece santigrat beş dakika. Supernatant atın ve permeabilizasyon yıkama tampon 500 mikrolitre pelet yeniden askıya.Santrifüj bir kez daha 433 kez g ve dört derece santigrat beş dakika. Supernatant atın ve FACS tampon 300 mikrolitre hücre pelet yeniden askıya. Ardından, metin protokolünde belirtildiği gibi, akış sitometresi üzerindeki hücreleri analiz edin.Bu çalışmada, tek hücreler normal glisemik NOD farelerin timik bezleri, PDLN'ler ve dalaklardan izole edilmiştir ve akış sitometrik analizi için Treg hücre belirteçleri, CD4, CD25, Foxp3, Helios ve nöropilin-1 ile boyanmıştır. Sonuçlar analiz edilir ve burada temsili gating stratejileri olarak gösterilir. CD4-pozitif, CD8-negatif, CD25-pozitif, Foxp3-pozitif Treg hücreleri arasındaki Helios-pozitif hücrelerin oranı nın her üç organdaki Nrp1-pozitif hücrelerden daha yüksek olduğu görülmektedir.Timusdaki Treg hücrelerinin %80'inden fazlasının PDLN'den daha yüksek olan Helios ve dalak ifade ettiği görülmektedir. Helios-pozitif Treg hücreleri arasında NrP1-pozitif hücrelerin oranı timus veya dalak olanlara göre PDLN daha yüksek olduğu görülmektedir. Nrp1-pozitif Treg hücrelerinin çoğunluğu da Helios ifade, ve Nrp1 pozitif Treg hücreleri arasında Helios-pozitif hücrelerin oranı pdln daha timus ve dalak daha yüksek olduğu görülmektedir.Birlikte, bu sonuçlar Helios Nrp1. Lenf düğümleri daha T Treg hücreleri tespit etmek için daha iyi bir belirteç olduğunu göstermektedir, ancak bazı hücre içi belirteçleri akış sitometri iyi bir sinyal vermek için hücrelerin çok sayıda gerektirir. Hücreler zaten lekeli ve ölü olduğundan, bu işlemden sonra başka yöntemler yapılamaz.Ama hayvanın dört hücre belirteci diğer bağışıklık hücrelerini incelemek için değiştirilebilir.

determination-regulatory-t-cell-subsets-murine-thymus-pancreatic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu myeloid türevi bastırıcı hücreler (MDSC) işaretleyicidir ve Gr-1 zenginleştirmek için hızlı ve kapsamlı bir...

Akım Sitometri ve Otomatik Manyetik Aktif Hücre Sıralama (AutoMACS) kullanarak Naive ve Pankreas Tümör taşıyan fareler ile myeloid türevi bastırıcı hücreler (MDSC) hazırlanması

Biz T hücre gelişimini incelemek üzere bir akım sitometri tabanlı bir yöntem...

Akım Sitometri tarafından Timik Pozitif ve Negatif Seçim incelenmesi

Bu videoda, murin pankreas drenaj lenf düğümlerinden (PDLN'ler) tek hücreleri izole etmek için bir protokolü ve akış sitometrisi kullanarak tek hücreli popülasyondan düzenleyici T hücrelerinin (Treg'ler) karakterizasyonunu açıklıyoruz. Treg'ler, hücre yüzeyi belirteçleri CD4, CD25 ve Nrp1'in pozitif ekspresyonuna ve nükleer transkripsiyon faktörleri Foxp3 ve Helios'a dayanarak tanımlanır.

Murin Pankreatik Drenaj Lenf Nodlarından Düzenleyici T Hücresi Alt Kümelerinin Belirlenmesi

Diğer T hücresi alt kümelerinin farklı efektör işlevleri ile, Th17 hücreleri merkezi inflamatuar otoimmün implike edilmiştir. Bu in vitro Th17 farklılaşma protokolü naif CD4 + T lenfositleri Th17 hücrelerine ayırt edebilir, ve daha fazla otoimmün ve konak cevabı rollerini incelemek belirlemek için bir araç sağlar.

İzolasyon ve naif CD4 T Lenfositler Th17 Farklılaşma

Naif CD4+ T hücreleri, aktivasyon sırasındaki ortama bağlı olarak çeşitli alt kümelere polarize olur.  Naif CD4 + T hücrelerinin çeşitli efektör alt kümelerine farklılaşması, T hücresi reseptör uyaranlarının ve spesifik sitokin sinyallerinin eklenmesiyle in vitro olarak elde edilebilir.

Fare Naif CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Hücre İzolasyonu ve<em&gt; In vitro</em&gt; T hücre alt içine Farklılaşma

Bu makalede, sitometrisi spektral, fluorochromes ayırt emisyon spektrumları şekilleri kullanan akış sitometrisi yeni bir yaklaşım tarif edilmektedir. Bir algoritma, tazminat değiştirir ve bağımsız bir parametre olarak otomatik floresan tedavi edebilir. Bu yeni yaklaşım, katı organ izole edilmiş hücre uygun analizi sağlar.

Spektral Sitometrisi ile Katı Dokular İzole Hücre Cezalar Analizi

Bu makalede mitokondri veya canlı hücrelerde organellerin ölçmek için güçlü bir yöntem gösterilmektedir. Primer hücre kullanarak doku örnekleri, hasat gibi karma hücre nüfus bu organelleri miktar lysosome veya mitokondri özel boyalar yüzey işaretleyicileri karşı fluorescently konjuge antikorlar ile kombinasyonu sağlar çok renkli akış sitometresi.

Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

Burada, CD4 tanımlamak için bir akış sitometrik protokol mevcut+ ve CD8+ T hücreleri, γδ T hücreleri, B hücreler, NK hücreleri ve monosit yedi yerine sadece iki fluorochromes kullanarak insan periferik kan içinde. Bu yaklaşım ile beş ek işaretleri çoğu akışı cytometers üzerinde kaydedilir.

İki-fluorochrome tarafından yedi bağışıklık hücre alt kümeleri ayrımcılık Akış Sitometresi

Burada, murine dalak, kemik iliği, lenf düğümleri ve sinovyal doku içinde hem ekstra hem de hücre içi boyama tahlilleri kullanarak monosit/makrofaj ve T hücrealt kümelerini tanımlamak için ayrıntılı ve tekrarlanabilir akış sitometri protokolünü tanımladık ve murine osteoartritin yerleşik bir cerrahi modelini kullanıyoruz.

Bir Osteoartrit Modelinde Minör Dalak, Kemik İliği, Lenf Düğümleri ve Sinovyal DokuDaki İmmün Hücre Alt Kümelerinin Akış Sitometri Analizi

Burada periton, dalak ve kemik iliği dokularındaki murin immün B hücre bölmesinin akış sitometrisine göre heterojenliğinin basit bir analizinde açıklanmaktadır. Protokol diğer fare dokularına uyarlanabilir ve genişletilebilir.

Murine B Hücre Gelişiminin Akış Sitometrik Karakterizasyonu

Bu protokol, düzenleyici T hücrelerinin efektör T hücre çoğalması ve farklılaşması üzerindeki etkilerini araştırmak için in vitro bir ortak kültür stratejisi sunar.

In Vitro Düzenleyici T Hücrelerinin Fonksiyonel Analizi: Proliferasyon ve Farklılaşmaya Odaklanma

Öğrenin fare timusu, lenf nodu ve dalağından tek hücre süspansiyonu hazırlama ve akış sitometrisiyle düzenleyici T hücre alt kümelerini analiz etme yöntemini. Bu manuel protokol maliyet etkindir ve bağışıklık hücrelerinin sağlık ve hastalık bağlamındaki rollerini araştırmaya yardımcı olur.

Düzenleyici T hücre alt kümeleri içinde fare timus, lenf nodu ve dalak akışı sitometresi kullanarak drene pankreas belirlenmesi

Daha fazla video keşfet