Ritmik aktif hazırlanması Vitro yenidoğan kemirgen beyin-omurilik ve ince dilim

Bu yöntem, Mirian Medüller Solunum Ağı'nın ele geçirilen analizi için kemirgen beyin saplarının tekrarlanabilir diseksiyonu ve dilimlemesi kolaylaştırıyor. Bu teknik, büyük deneysel esneklik sunarak, in-vitro unblock veya kayıt için bir dilim hazırlamayı mümkün kılar. Bu yöntem, solunum ritimleri üreten nöral kontrol devresini araştırmak ve genetiği değiştirilmiş kemirgenlerde solunumun patolojisini ve düzensizliğini anlamak için elektrofizyoloji deneyleri için kullanılabilir.

Nöraksidi'nin diseksiyonu yapıldıktan sonra, hayvanın izole gövdesini bir diseksiyon mikroskobu altında havalandırılmış bir diseksiyon odasına hızlı bir şekilde aktarın ve rostral ucu odanın önüne bakacak şekilde doku dorsal tarafını yukarı yerleştirin. Omuzlarda doku pin ve omurilik en kaudal sonunda ve korteks ve kafatası altında yatan beyin sapı zarar önlemek için parietal sütür aşağıdaki kafatası ile bir midsagital kesi yapmak. Sagittal dikişbaş ve yanal çalışma başlayarak, yansıyabilir ve demirlemek ve kafatasının rostral kısmını stabilize etmek için sabitlenmiş kemik flepoluşturmak için kafatasının oksipital dikişleri snip.

Her iki kafatası flepleri yansıttıktan sonra, serebral korteksin geri kalanı çıkarmak, bir dorsal laminektomi gerçekleştirmek için nispeten bozulmamış beyincik kaudal kısmını bırakarak. Kafatası ve vertebral sütun çevreleyen kas kaldırmak için mikro yay makas ve forceps kullanın. Göğüs kafesi dorsal tarafı boyunca doku çıkarın, kaburga bozulmadan bırakarak ve dikkatle vertebral lamina lateral süreçleri uzak snip.

Pons ve medulla, vermis, beyincik, pons ve omurilik başlangıcı örten herhangi bir doku kestikten sonra, açıkça görülebilir olacaktır. Ventral laminektomi yapmak için, doku dorsal tarafı aşağı yerleştirin ve göğüs kafesi ve omurganın en kaudal ucunda pin. Dokunun rostral tarafını sabitlemek ve göğüs kafesinin ventral yarısını çıkarmak için kafatası fleplerini kullanın, göğüs kafesi ve tüm karın organları dahil.

Kaburga ve omurilik maruz bırakmak ve dil, yemek borusu, trakea, gırtlak ve kafatası ve omurilik tabanı üzerinde diğer yumuşak doku ve kas kaldırmak için göğüs kafesi bağlı yumuşak doku kesip. Sert paleti tanımlamak için, kafatasının tabanındaki bu dikdörtgen kemik tabakasının üzerini örten dokuyu inceleyin, v şeklinde bir girinti içerir. Sonra paletin orta hattı boyunca kesilmiş, dikkatle yukarı doku kaldırarak ve kaldırmak için bir enine kesim gerçekleştirin.

Ventral laminektomiye başlamak için, lamina yı kaldırıp, beyin sapının ventral yüzeyini ve omuriliği ilk servikal vertebradan yaklaşık olarak torasik vertebra yediye maruz bırakın ve laminadaki omurkolboyunca 5 ila 10 milimetre dolayın. Omurilik maruz kaldığında, yaklaşık 20-25 milimetre çift taraflı olarak, omurilik boyunca yaklaşık T7 ve dikkatle c1, C2 ve C3 rostral kenarı kancalı veya bükülmüş forseps ile üç omur çıkarılması için kemik altında yudumlama izin asansör köklerinin iki taraflı olarak snip. Omurilik istenilen uzunluğu vertebral kolon izole edildiğinde, omurilik dokusu kaldırmak için bir enine kesim yapmak.

Dura çıkardıktan sonra, plastik kesme bloğu üzerinde parafin platformunun merkezinde beyin sapı yerleştirin ve ince böcek iğneleri kullanın, distal omurilik aracılığıyla beyin sapı kaudal ucunu sabitlemek için uzunluğu en fazla bir santimetre kesilmiş. Daha sonra parafin kaplı kesme bloğunu Vibratone blok tutucusundaki iğneli beyin sapıyla hizalayın, böylece bıçak beyin sapının rostral yüzüne dik olarak kesecektir. Daha sonra, doku rostral-en ucunda düzensiz yabancı doku 200 ila 300 mikrometre kaldırmak için bir başlangıç dilimi yapmak, herhangi bir düzensiz doku kaldırmak için PARP doğrusallık ve küçük kesim sağlamak için gerekli küçük ayarlamalar yapma.

Glossopharyngeal rootlets beyin sapı lateral kenarında görünür hale gelecek, pre-Botzinger kompleksi ve ilişkili iletim devreyakalamak için bu rostral nöroanatomik belirteçleri beyin sapı bir 300 ila 500 mikrometre dilim kesti. Tüm dilimleme prosedürü adımları, sağlam ritim üretmek için doğru yönde gerekli nöronal devretüm, tekrarlanabilir, uygun bir dilim oluşturmak için önemlidir. İnspiratuar ritim üretmek ve iletmek için gerekli olan tüm nöral devre elemanları bu yöntem kullanılarak ince bir dilim içinde yakalanabilir.

Pre-Botzinger kompleksi de dahil olmak üzere, hipoglossal motor nöronlar ve hipoglossal sinir köklerine projekting öncesi motor nöronlar. Pre-Botzinger kompleksi, hipoglossal veya 12 kranial sinir kökleri ve C4 sinir kökleri daha sonra inspiratuar kayıt için kullanılabilir. Bu işlemin temel yönü köklerin dikkatli izolasyon ve son dilim kesmeden önce beyin sapı zarar görmediğini onay.

Bu işlemden sonra, elektrofizyoloji kayıtları, şebeke tarafından üretilen elektriksel aktiviteyi kaydetmek için yama kelepçesi yöntemleri, ekstra hücresel kayıtlar veya emme elektrotları kullanılarak yapılabilir. Daha önce yayınlanan protokoller, yeni araştırmacıların başka bir laboratuvara gitmeden ve deneyimli bir araştırmacıyla vakit geçirmeden bu yöntemi kullanmalarını zorlaştıran çok az adım adım ayrıntı sağlamıştır.