Candida albicans kullanarak gerçek zamanlı ekstraselüler akı analiz biyo-enerji incelenmesi

Bu protokol Candida albicans glikolitik fonksiyon ve mitokondriyal solunum belirlenmesi için önemlidir. Bu tekniğin en büyük avantajı, mitokondriyal fonksiyonun Candida albicans'dan mitokondriyi arındırmaya gerek kalmadan ölçülmesine olanak sağlamasıdır. Bu yöntem, candida albicans veya diğer mantar patojenlerinde mitokondriyal ve glikolitik yollar üzerinde genetik manipülasyon veya kimyasal modülatörlerin etkilerini araştırmak için optimize edilebilir.

Bu teknik nispeten basittir. Ya da organizmaya bağlı olarak, onların kullanımı hücre numarasını ve onların tsay mitokondriyal inhibitörlerin konsantrasyonu optimize etmek için yardımcı olabilir. Bir laminar akış kaputunda, doku ızgara susında ki Poli-D-Lizin'i mililitre başına 50 mikrogramlık son konsantrasyona eritin.

Çözeltiyi iyice karıştırın ve 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplere yerleştirin ve tüp başına en az 1,3 mililitre aliquot olmasını unutmayın. Bu karışımın 50 mikrolitresini her bir kuyuya tazyik plakasının her kuyusuna ekleyin, kapağı kapatın ve oda sıcaklığında 1-2 saat kuluçkaya yatırın. Sonra çözelti aspire.

500 mikrolitre steril doku kültürü sınıfı su ile bir kez yüzer, kapağı açın ve kuyuların kurumasını bekleyin. Plakayı hazırlandığı gün kullanmıyorsanız, en fazla iki ila üç gün süreyle dört derece saklayın. Denemeden bir gün önce, ekstra akı temizleme kitini açın ve içeriğini çıkarın.

Sensör kartuşu yardımcı plakanın yanına ters yerleştirin. Yardımcı plakanın her kuyusunu bir mililitre kalibrrant ile doldurun ve sensör kartuşu geri yerleştirin. Florofor içeren sensörlerin kalibreğe batırDığından emin olun.

Sensör kartuşu bir gecede karbondioksit olmayan bir kuluçka makinesinde 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Bir gün önce, YPD suyu hazırlanan C albicans aşılamak ve 200 rpm bir shaker 30 derece santigrat gecede büyümek. Tahlil günü, 100 mikrolitre başına 100, 000 hücre nihai konsantrasyon verim tahlil orta hücrelerin uygun sayıda seyreltmek.

A1, B4, C3 ve D6 kuyuları dışında, sulandırılmış hücrelerin her bir kuyuya 100 mikrolitre sini ekleyin. Bu kuyular için, arka plan düzeltme için sadece 100 mikrolitre araştırma ortamı ekleyin. Hücreleri plaka yüzeyine yapışmasını sağlamak için 60 dakika boyunca karbondioksit olmayan bir kuluçka makinesinde 37 santigrat derecede plaka kuluçka. Metin protokolünde belirtildiği gibi karşılık gelen test orta 10X konsantrasyonda mitokondriyal fonksiyon tsay için bileşikler hazırlayın.

A limanına 50 mikrolitre SHAM, B limanına 50 mikrolitre Oligomisin, C limanına 62 mikrolitre potasyum siyanür ve 68 mikrolitre Antimisin A'yı port D.Next'e ekleyin, metprotokolde belirtildiği gibi ilgili test te 10X konsantrasyonunda glikolitik stres analizi için bileşikleri hazırlayın. A limanına 50 mikrolitre glikoz, B limanına 55 mikrolitre Oligomisin, C limanına 62 mikrolitre 2-DG ve 68 mikrolitre Antimisin A'yı port D.Before porta ekleyin, ekstra akı analizörü açın ve tahmin sihirbazı sekmesini kullanarak analiz şablonu ayarlayın. Adım adım yönergeleri izleyin ve kurulum sırasında ortaya çıkan tüm bilgileri doldurun.

Bir grup düzeni oluşturun ve metin protokolünde belirtildiği gibi protokolü ayarlayın. Bu düzenleri tramadan önce kaydedin. Tarama sırasında, ilgili dosyayı test sihirbazı sekmesinde açık dosya seçeneğinde açarak kaydedilen protokolü geri yükleyin.

Daha sonra 10X bileşikleri, kalibrant içeren sulu sensör kartuşu ilgili portlarına yükleyin. Sensör kartuşunu ekstra akı analizörünün taşıyıcı tepsisine yükleyin. Ekrandaki başlat düğmesine tıklayarak kalibrasyonu başlatın.

Daha sonra, son hacmi 450 mikrolitreye çıkaran hücre bozulmasını en aza indirmek için duvarların yan tarafındaki hücre plakasına 350 mikrolitre tahlil ortamı ekleyin. Kalibrant içeren yardımcı plakayı, kalıtım plakası ile değiştirin ve taramaya devam edin. Tsama tamamlandıktan sonra sensör kartuşu ve plakayı çıkarın.

Dosyayı uygun hedef klasörüne kaydedin. Bu çalışmada, C albicans biyo-enerjik fonksiyonları ekstra akı analizörü tarafından değerlendirilir. Mitokondriyal protein mam33'ten yoksun bir mutant, mitokondriyal proteinin oksijen tüketimi ve hücre dışı asitleşme oranları üzerindeki etkilerini incelemek için tamamlayıcı suşuyla birlikte dahildir.

C albicans yabani türü herhangi bir ekstrasellüler akı tsay için en uygun aralık içinde de dakikada 145 pikomoles bir oksijen tüketim oranı gösterir. Yabani tip, mam33 mutant ve mam33 tamamlayıcı suşları bazal oksijen tüketim oranı hiçbir fark göstermektedir. Benzer şekilde, suşlar arasında bazal ekstrasellüler asitleşme oranlarında anlamlı bir fark görülmez.

Ancak, potasyum siyanür ile kompleks-IV inhibe ederek, yabani tip ve mam33 mutant, mam33 tamamlayıcı suşları glikolizine doğru önemli bir kayma göstermektedir. Mam33 mutant suşu ancak bileşik-IV bağımlı yolu bu zorlanma bozulmuş olduğunu düşündüren bir telafi glikolitik değişim göstermek için başarısız oldu. Glikolitik stres testinde hücreler bir saat boyunca glikozdan yoksun kalınır ve bazal oksijen tüketim hızı ve ekstrasellüler asitleşme oranı ölçülür.

Açlık üzerine, mam33 mutant suşu diğer suşlara göre önemli ölçüde daha düşük oksijen tüketimi ve ekstrasellüler asitleşme oranları göstermektedir. Bu hücreler açlık durumuna zorlandığında hem solunum hem de glikoliz için glikoz kullanımının bozulduğunu düşündürmektedir. Glikoz enjekte ettikten sonra, tüm suşlar hem oksijen tüketim hızı hem de hücre dışı asitleşme oranının uyarılmasını gösterir.

Asay makinasının kaplaması, Candida albicans hücrelerinin plakaya yapışmasını sağlar. Candida albicans hücrelerinin uygunsuz yapışması, sonuç sonucunu etkileyecektir. Bu tekniğin geliştirilmesinden sonra, fizyolojik ve patolojik durumlarda mitokondrinin nasıl işlediğini ele alan çok çeşitli hücre tipleri ve hastalıklarında kullanılmaktadır.

Örneğin, bu testte hasta kaynaklı ve kontrol hücreleri istihdam, mitokondriyal fonksiyonun nasıl değiştirildiğine ilgili belirli soruları ele almak mümkündür. Bu bileşikler son derece zehirli olduğu için potasyum siyanür ve antimisin A gibi mitokondriyal inhibitörleri hazırlanırken dikkatli olunmalıdır.