Name: Canlı hücre analizi, yamultma stres bir otomatik yüksek üretilen iş mikrosıvısal sistemi kullanarak Pseudomonas aeruginosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Keşfedin, mikroakışkan biyoreaktör kullanarak Pseudomonas aeruginosa biyofilmlerinde yalpalama stresinin etkilerini canlı hücre analiziyle. Bu yöntem, biyofilm yapısı ve antibiyotik tedavileri üzerine istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser hibe tarafından Ulusal Enstitüsü'nden genel tıbbi bilim (NIGMS için) (5P20GM103427), bir bileşen, ulusal kurumları sağlık (NIH) mümkün yapıldı

1. medyası hazırlama
<ol><li>En az medya (MM) %0,25 ile glikoz hazırlayın. Mm 1 L % 0.25 glikoz ile yapmak için su son hacmi 1 L. (dH2O) 200 mL steril M9 tuz çözeltisi, 2 mL steril 1 M MgSO4, steril 1 M CaCl2100 µL ve 12,5 mL steril (w/v) glikoz ekleyin</li>
	<li>Gerekli ortam steril teknikleri kullanarak bir steril şişe transfer. Miktarı kullanılan kanal sayısına bağlı olarak gerekli hazırlayın. Genellikle, her kanal için astar, tohum ve 1300 µL 24 h deneme için için 300 µL 200 µL gerektirir.</li>
	<li>Bir inkübatöre veya su banyosu deneysel sıcaklık ayarla şişe yerleştirin. Medya içinde Mikro şekillendirme kabarcıklar önlemek için kullanmadan önce deneme sıcaklığında olmalıdır.</li>
</ol>2. PA01-EGFP bir gecede ve deneysel kültürünün hazırlanması.
<ol><li>Deneysel medya 15 mL steril bir tabancan şişesi yerleştirin ve bir ya da iki koloniler PA01-EGFP ile çizgili bir agar plaka ile aşılamak. Kültür için bir kuluçka makinesi/shaker tablo 37 ° C ve 180-220 rpm, 12-16 h genişletin.</li>
	<li>Gecede kültür OD600 ölçmek. OD600 0,80 büyük olduğunda, gecede kültür için son OD kullanım taze MM. yeri bir inkübatöre veya su banyosu deneysel kültüründe mikrosıvısal kanalları tohum için ihtiyaç kadar 37 ° C'de 0,8 oranında seyreltin. OD600 tekrar tohum önce hemen bu önemli ölçüde hedef OD600, 0,8 Bu durumda değişmediğini emin olmak için denetleyin.</li>
</ol>3. ekipman başlangıç
<ol><li>Şekil 1' deki kurulum için benzer kullanıcı kılavuzuna göre sistem istasyonu ayarlayın. Yazılım enstrümanın bağlantısındaki bir hatanın oluşmaması için aşağıdaki sırada enstrüman açın: PC iş istasyonu Floresans modülü. Floresans çekim (mavi ışıkla Obtüratör butonuna) açık olduğundan emin olun Donanım denetleyicileri Görüntüleme sistemi denetleyicisi ( Tablo malzemelerigörmek) CCD kamera Görüntüleme İstasyonu (mikroskop) Not: Ateşli tabağı sıcaklığını istenilen deneysel sıcaklık için ayarlanmalıdır.</li>
	<li>Denetim uygulamayı başlatmak ve plaka yan tarafındaki etikette yer alan plaka numarası girin. Not: denetim uygulama başladıktan sonra orada-ecek var olmak iki ayrı uygulama windows, mikroskop/görüntüleme yazılımı denetleyen yazılım diğeri pompa ve iyi-plaka arabirimi denetimleri denetim modülü için. Bu nerede "Çok boyutlu edinme" menü üstte açıktır ve kontrol modülü için bir autorun üstünde belgili tanımlık dip ayarlanır Şekil S1, gösterilir.</li>
</ol>4. astar ve mikrosıvısal plaka tohumlama
Not: Astar, tohumlama, bakteriyel eki ve büyüme Şekil 3' te gösterilmiştir.
<ol><li>48-şey mikrosıvısal plaka alt plaka cam yüzey dokunmak emin paketinden çıkarın. Cam slayt alt plaka bir objektif doku, tüysüz ücretsiz bez veya düşük-tüysüz mendil ile iyi temizle.</li>
	<li>Mikrosıvısal kanalları hazırlamak için 37 ° c MM 200 µL çıkış, kabarcıklar önlemek için dikkatli olmak pipet. Plaka plaka sahne alanı yerleştirin ve etanol, plaka sahneye sızdırmazlık önce kurumasını sağlayan arabirimiyle silin.</li>
	<li>Manuel mod kontrol modülü üzerinde sıvı LB 37 ° C ve Max kayma 5,00 din/cm2' de ayarla. Giriş çıkış akış, etkinleştirmek için çıkış wells kanalları priming'ı tıklatın. Priming 5 dk sonra tohum için hazırlamak için akışı duraklatın. Dikkatle plaka sahne alanı'ndan kaldırın ve çıktı ama herhangi bir medya değil mikrosıvısal kanallara giden iç daire izale artık medyadan pipet.</li>
	<li>İlk 300 MM µL de iyi çıktı de çıkış içine bakteri kültürü pipetting 300 µL tarafından takip giriş içine pipet deneysel kanalları temel için. Plaka plaka üzerinde yerleştirmeden önce arabirim silmek emin plaka sahne içine koyun.</li>
	<li>Mikroskop sahne plaka sahneye koyduktan sonra yem canlı kamera kullanarak tek bir kanal kontrol modülü üzerinde odaklanmak. Görsel olarak tarafından canlı yayın izleme sırasında akış 1,00-2.00 din/cm2 yılan gibi kanalları değil, ancak yaklaşık 2-4 s hücreleri deneysel kanal girmek izin vermek için devam edin. Hücre eki için izin vermek 1 h için sıcaklık kontrollü sahnede plaka bırakın. 1 h kuluçka sırasında belgili tanımlık autorun (adım 5) kontrol modülü ve montaj yazılım ayarlanabilir. Not: en iyi duruma getirilmiş kadar genel bir zaman dilimi kullanılan canlı yayın tarafından yakından izlenmeli bu yüzden tohum için gereken süreyi medya ve organizma, ile değişir. Plaka tohum tam tohum için hangi kanalları belirli sütunlara uygulanan akışının daha fazla zaman gerektirecektir değişebilir.</li>
	<li>Ek süre sonra yavaşça plaka sahne alanı'ndan kaldırın ve ilk kanal rahatsız edici kaçınarak çıkış bakterilerden pipette. Yeni bir pipet ucu ile giriş kuyulardan medyayı çıkarın.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig3.jpg"> Şekil 3 : Astar, tohum ve PA01-EGFP ek olarak mikrosıvısal kanalları deneysel bakış. Astar, tohum ve eki anlattı. Astar ilk adım çıktısına tanıttı taze medya gerektirir. Tohumlama gerektirdiği giriş medya ve bakteriyel kültür hacimleri eşit ve wells, sırasıyla çıktı. Kültür, serpantin kanalları tıkanmasını önlemek için deneysel kanal (kırmızı çizgi) görüntüleme segment geçmek değil. Kuluçka dönemi bittikten sonra taze medya izleme odası ve prize sürekli olarak girişten akar. Bu eki ve biyofilm bakteri oluşumunu başlatır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
5. belgili tanımlık bilgisayar yazılımı ayarlama
<ol><li>Yazılım, "mikroskop resim alma denetlemek için,Birden çok boyutlu edinme" açın. "Ana" menüsünün altında "Timelapse", "Birden çok sahne pozisyonlar" ve "Birden çok dalga boylarında" (Şekil S1A) seçin.<ol>
<li>Ayarları kaydetme kurulumunu dosya varsa artışı temel adı seçeneğinin işaretli olduğundan emin yapma basit Temel adı, oluşturun. Tüm dosyalar kaydedilir klasörü seçmek için Dizin Seç'i tıklatın. Deneme temel ayrıntıları Açıklamaiçerir.</li>
		<li>Timelapse sekmesi altında 24 h deneysel zaman süresi ayarlayın. Görüntüleri ne kadar sıklıkla kontrol etmek için elde, her 5 dk boyunca deneme görüntüleri elde bu yüzden Zaman aralığını ayarlayın. Zaman puan sayısı ile parametreleri ayarlama otomatik olarak ayarlar.</li>
		<li>Sahne pozisyonları doğru yerleştirme ve odak için izin parlak alan mikroskop içerik canlı kamera kullanarak ayarlayın. 10 X amacı ile başlangıç, plaka üzerinde oyulmuş kanal numaraları altında veya üstünde bulunan kanal merkezinde odaklanın. En iyi görüntüleme alanı ve odak düzlemi içinde kanal bulma 20 X amaç geçin. Pozisyon listeye eklemek veya hazır ayar Kanal konumu yeni ayarlarla değiştirmek.</li>
		<li>Dalga boylarında menüsünün altında dalga boylarında sayısını 3'e ayarlayın. 1 (W1) dalga boyu için FITC % 100 CAM 10 ms çekim hızı ile seçin. Yani dalga boyu 2 (W2), seçmek için aydınlık alan % 50 CAM % 50 VIS 3 Bayan Tüm kapalı filtre ayarlamak için dalga boyu 3 (W3), en az pozlama süresi ile ışık edinme kez arasında geçen kanal üzerinde kalır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kontrol modülü ayarlarken, koşmak belgili tanımlık elle yapılan durdurdu emin olmak için denetleyin.<ol>
<li>İletişim kuralı Kur sekmesinin altındaki Düzenle Autorun menüsünde Yeni bir iletişim kuralı için 24 saat süre zaman, istenen kesme hızında ileriye doğru yönde akan ayarlayın. Kesme hızı kesme oranı ile biyofilm büyüme etkisini incelemek için zengindir. Ekle ve Farklı kaydet iletişim kuralı tıklatın.</li>
		<li>Sıra Kur sekmesi altında bulunan tüm kanallar için varsayılan sıvı olarak LB@37degrees seçerek yeni bir sıra oluşturmak. Adım yineleme 1, Kanal 1-12, altında tüm kanallar istenen kesme hızı ve Etkinleştir protokolü seçin. 13-24, kanallar için ikinci istenen kesme hızı ve etkinleştirmek protokolüyle tüm kanalları seçin. Uygula ve Farklı kaydet sırası seçin.</li>
		<li>Autorun autorun için kullanılacak kaydedilmiş sırası menü.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. biyofilm büyüme deneme kurulumu zaman aşımına uğradı
<ol><li>En fazla 1.300 µL steril mm giriş de mikrosıvısal plaka pipette. Plaka sahne geri tabağa yerleştirin ve etanol etanol plaka sızdırmazlık önce kurumasını sağlayan, arabirimiyle silin.</li>
	<li>Plaka yerleştirerek mikroskop sahneye sahne ve protokollerini emin olun ve sequence(s) doğru şekilde ayarlanır. Mikroskop imge toplama başlatmak için Al ' ı tıklatarak hızlı bir şekilde takip autorun başlatmak için Başlat ' ı seçin.</li>
	<li>Odak ve görüntü acquirements arasında tüm sahne pozisyonlar yerleşimini ayarlayın. Duraklat seçin ve canlı görüntü modu parlak alan dalga boyu kullanılarak, her aşamada pozisyonları görüntülemek için Gitmek seçin. Yeni ayarlar geçerli ayarlaseçerek ayarlayın. Bir sonraki zamanlanmış satın alma sırasında önce Sürdür ' ü tıklatın.</li>
</ol>7. gözden geçirin ve görüntü sıralarını zamanlanmış biyofilm büyüme deneyden sonra analiz
<ol><li>Her kanal 24 saat takip incelemek için autorun, yazılım, açın Gözden geçirmek çok boyutlu veri Çözümleme araçları' nın altındaki. Tıkırtı üstünde seçin temel eğe | Dizini seçin görüntü sıralarını deney ilgi ile klasöre gidin. Veri kümesi oluşturduğunuz klasör listesinde, veri ilgi temel adını seçin.</li>
	<li>Faiz veri seçildikten sonra bu verileri gözden geçirmek için görünümü ' nü tıklatın. Dalga dalga boyu pencere (Şekil S2) altında bu verileri gözden geçirmek için seçin.</li>
	<li>Bir daha gözden geçirme (görüntüleri her 5 dk 24 h saat çerçevenin üzerine elde edilen varsayarak) görüntü sırası Sahne konum'un altında kanal numarası seçerek ve 289 kez için verileri çözümlemek için video kontrolleri kullanarak her kanal için puan. Kullanışlı büyüme veri dikkat edin. Not: her kanalda, hava kabarcıklarının ve biyofilm büyüme verileri etkilemeden kanal içinde rahatsız etmeyecek takunya gelişimi için dikkat et. Bunlar daha sonra bu şartlar önce çalışma, verileri oluşursa ancak, yararlı bulunabilir.</li>
	<li>Gözden geçirme ve çözümleme için istenen veri seçme sonra her kanal için görüntülerin yığınlar oluşturun. Dosya altında açık özel menü | Yığını oluşturmak | Adları sayılı. Yığını oluşturmak penceresinde, İlk görüntü Seç butonunu seçin, ardından dosya klasöründe yığını için ilk resmi seçin; Son görüntü Seç düğmesini seçin ve sonra son görüntü yığınında karşılık gelen dosyayı seçin. Kronolojik olarak kanal tüm görüntüleri ile yığın açmak için Tamam ' ı tıklatın. Yığınlar, Dosya menüsündeki Farklı kaydet TIFF dosyaları olarak kaydedilebilir. Not: yığınları ile başparmak görüntüleri oluşturun. Bu dosyalar çok yararlı değildir ve sabit diskinizde yer kazanmak için silinebilir. Ayrıca, görüntü dosyaları aşağıdaki gibi kaydedilir: TEMEL NAME_WAVELENGTH_sCHANNEL #_tIMAGE #. Örneğin, 07062018_W1FITC 100_s12_t112 Kanal 12, süresi noktası 112, görüntü ilk dalga boyu-FITC % 100 kamera veri taban adı "07062018" ile olur.</li>
	<li>Son olarak, sıra bir TIFF yığını olarak kaydetmek için Dosya açılan menüsünden Farklı Kaydet'i seçin. Yığınlar da overlaid ve film olarak kaydedilir. Bu adım 9 ele olduğunu.</li>
	<li>% Yüzey kapsama miktarının önce görüntü mesafeler kalibre edin. Çözümleme araçları' nın altında Kalibre mesafelerüzerinde'yi tıklatın. Uygun kalibrasyon ölçüm seçin ve tüm görüntüleri aç Uygula' yı tıklatın.</li>
	<li>Yığın sırası ilk görüntü üzerinde olmakla birlikte, eşik butonuna tıklayın. Otomatik eşik ışık nesneler için eşik için eşik parlak alanındaki floresan sinyal (FITC dalga boyları) ve Karanlık nesneler için otomatik eşik için kullanın. Görüntü kapsama temsil eden kapsama için eşik ayarlayın.<ol>
<li>Floresan eşikleri için herhangi bir arka plan sinyal ve hücreleri sinyal ölçüm sağlamak için yapar bunlar sigara floresan içeren kanallarında sinyal dışlamak için minimum eşik değeri tespit seti kurmak olmayan floresan hücreleri ile bir kanalı kullanmak floresans alan abartma değil. Dolayısıyla en az bir, kullanmak için iyi bir fikir değil daha, kanal (lar), floresan sigara denetimlerinde bu koş koş farklı olabilir.</li>
		<li>Tüm hücreleri tarafından turuncu eşik imza kapsamına girmez, parlak alan eşikler, kayan araç çubuğu veya tüm hücreleri ( Çözümleme araçları' nın altında bulunur) Eşik görüntü kullanılarak en fazla eşik değeri ayarlamak Ama kapalı herhangi bir arka plan söz konusu değildir. Not: Bu eşik değerler ideal bir yığın içinde tüm görüntüler için ve tüm kanallar için kullanılacak, bir görüntü/kanal için seçili eşik değerleri bu nedenle Kullanıcı eşik aralığı ayarlamanız gerekebilir diğer görüntüleri veya kanal için uygun olmayabilir düzenli olarak. Bu nedenle, her zaman en fazla kaydetmek için iyi bir fikirdir ve kullanılan minimum eşik değerleri veri daha sonra gözden geçirilmesi gerek gerekir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çözümleme araçları' nın altında kapsama ölçmek için Bölge istatistikleri göster'itıklatın. Kullanım eşik , Tüm resim seçili denetlendiğinden emin olun ve Veri eldealtında istediğiniz ölçüleri/ayarları seçilir emin olun (eşik alan, ortalama, standart sapma, min, max ve % eşik alan). Açık oturum aç'ı tıklatın ve Tamam' ı tıklatmadan önce DDE dosya seçili olduğundan emin olun. Microsoft Excel'i seçin ve Tamam' ı tıklatın. Elektronik tabloda bu açık, otomatik olarak görüntü analiz ediliyor ölçümleri kaydetmek için Günlük verilerini ' ı tıklatın.</li>
	<li>Bu elektronik tablo açık bırakarak, aynı sayfadaki tüm görüntü analiz verileri tek bir yığın için toplamak için kullanın. Yığın içinde dördüncü resim ve eşik için en iyi ayarları gidin. Günlük verilerini üzerinde Bölge istatistikleri göster ekran'ı tıklatın ve değerleri elektronik tabloda günlüğe kaydedilir. Bu her 15dk görüntüleri analiz için işlemi yineleyin.</li>
</ol>8. diğer analizi de dahil olmak üzere Morfoloji ve yüzey kapsama ölçü kullanarak Python komut dosyaları biyofilm morfoloji Suite
<ol><li>Anaconda, https://www.anaconda.com/download kullanılabilir gibi bir standart bilimsel Python dağılımı kullanarak standart bilimsel modüller içerir Python 3.6 bir dağıtımını yükleyin.</li>
	<li>Biyofilm morfoloji Suite GitHub bir tarayıcıda https://github.com/cdwentworth/Biofilm-Morphology-Suite.git için gezinme tarafından elde sonra klon ya da download (yeşil düğmeye) seçin ve Download Zipseçin. Unzip belgili tanımlık eğe ve kod klasörleri çalışma dizinine taşıyın.</li>
	<li>Yüzde thresholded kapsama görüntü yığını "kapsam" klasörüne kopyalayarak ölçmek. Bu klasöre gidin ve sonra komutu ile komut dosyasını çalıştırmak için bir terminal penceresi kullanın Python bfCoverage.py tiffStackName.tif komut satırı burada tiffStackName.tif görüntüleri TIFF yığını içeren dosya adıdır arabiriminden. Zaman bir fonksiyonu adı ile oluşturulacak gibi her zaman bir noktada kapsamı ölçümleri içeren bir metin dosyası adı tiffStackName.txt ve kapsamının bir arsa ile bir grafik dosyası oluşturulur tiffStackName.png.
</li>
	<li>Diğer morfolojik özelliklerini ölçmek için 8.3. adımda belirtilen aynı yordamı kullanın: biyofilm birikimi, pürüzlülük katsayısı ve dokusal entropi. Birikimi ölçüm için bfAcc.py komut dosyası, pürüzlülük katsayısı ölçüm için roughCoef.py komut dosyası ve TEvsTime.py komut dosyası dokusal entropi ölçüm için kullanın.</li>
</ol>9. diğer yazılım uygulamaları - bindirmeleri ve film yapım
<ol><li>Birden çok dalga boylarında kullandıysanız, bu dalga boylarında da dahil olmak üzere bindirme yığınlar oluşturun. Tüm yığınları ilgi açın ve mesafe adım 7,6 olarak kalibre.<ol>
<li>Çözümleme araçları' nın altında Overlay görüntüleriseçin. Kaynakları faiz yığınlar ayarlayın. FITC yığını, gökkuşağı yuvarlağına tıklatın ve yeşil renk filtresi bu dalga boyu vurgulamak için eklemek için seçin.</li>
		<li>Bal FITC yığın Albümdeki bariz bindirmeyi ayarlamak için kullanın. Tüm ayarlamalar yaptıktan sonra Tüm uçaklar her iki yığınlar için seçin ve Uygula' yı tıklatın. 7.5. adımda anlatılan yığınları veya 9.2. adımda anlatıldığı bir film olarak aynı şekilde bindirmeleri kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yığınları veya bindirmeleri MM standart ve yığın, altında bir timelapse film olarak kaydetmek için Yapmak filmüzerinde tıklatın. Kaynak yığını veya istenilen kaplama seçin. Kaydet ' i tıklatın ve 70-80 arası ayarla bir kalite ile bir Microsoft Video 1 olarak kaydedin.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Mikrosıvısal sistemi ve görüntü analizi prosedürü burada genellikle gelen confocal bulunan tam üç boyutlu bilgi gerektirmeyen morfolojik özellikleri belirlemek için mikrosıvısal biyofilm deneyler yürütülmesi üzerinde odaklanır ele mikroskop çalışmaları. Bunlar microcolony terkedilemeyen kapsama (yüzde kapsama), yüzey pürüzlülüğü pürüzlülük katsayısı ve dokusal entropi tarafından ölçülen dahil. Toplam göreli biyofilm hücre birikimi tahmin etmek için bir yöntem de aşama günlüğünde hangi büyüme oranları üzerinden hesaplanan olamaz sunulur.
Bu yöntemde vurgulanmış olmalıdır birkaç küçük ama önemli adım vardır. Arabirimin alkolle silerek deneme deneme ama aynı zamanda iyi de bir deneyde gidiş diğer bakteri kontaminasyonu önlemek yardımcı olur. Astar ve tohum da çok önemli astar hangi kanalları medya kanalları herhangi bir rahatsızlık olmadan akışı sağlayan belirlemek kullanıcının verdiğinden veya tıkanma vardır. Kanalları da olmamalıdır hiçbir hava kabarcıkları ile başarılı bir deneme şansını artırmak için macun veya tıkanma sonra (yani onlar-meli var olmak sürekli medya tam) rahatsız. Tohumlama adım bakteri türüne göre farklı olabilir ve bu yüzden cep eki için optimize edilmelidir. Örneğin, hücreleri eklemek için görünmüyor yüzey değişiklikler Ekim tarihi öncesinde mikrosıvısal plaka üzerinde gerçekleşmesi olabilir veya daha uzun incubations zaman gerekli olabilir. Mikroskop doğru bir şekilde, odakta görüntüyü elde etmek için kurulmuş ve kaliteli görüntüler elde edilir sağlamak için deney boyunca düzenli aralıklarla izlenmelidir emin olmak önemlidir. Odak noktası kapalıysa, mikroskop olabilir ve deneme devam ederken ayarlanmalıdır. Görüntü toplama süre boyunca, son dalga boyu Tüm kapalı filtreleri ve görüntü Devralmalar arasında oluşan bekleme süresi sırasında tek bir kanal için aydınlatma maruz önlemek için ayarlanması gerekir. Ayrıca, montaj yazılımının kılavuzuna yordamı açıkça tarif değil çünkü % yüzey kapsama belirler görüntü analizi içinde ev dizayn edilmiştir. Ayrıca, görüntü analizi üzerinde genişletin ve yüzey pürüzlülüğü, vbgibi diğer özelliklerini belirlemek için., açık kaynak kodu Python tabanlı45 içinde ev ve paylaşılan üzerindeki gitHub repository geliştirilmiştir. Ayrıca ne kadar veri saklanan ve bir harici sabit disk veya online veri paylaşımı CyVerse46gibi gerekli değildir yerel sabit diske yönetilen sınırlamalar vardır.
CDC reaktör ve damla akış reaktör34, gibi geleneksel Biyoreaktörler çok medya gerektiren, daha az sayıda örnek boyutları sağlamak ve sterilizasyon ekipman yüksek miktarda talep ediyorum. Buna ek olarak, bu daha yüksek üretilen iş platformu avantajları denetim kesme, debi, yeteneği dahil ve içinde vitro yakından deneyler varsayım vivo içinde koşullar benzer. Dezavantaj-in sistem birden fazla aksesuarları içerir ve titiz bir kurulum gerektiren yazılım olayları doğru sırayla gerçekleştirilmesi gerekir. Ayrıca, ekipman için sağlanan kılavuza deneyler ve yazılımı komutları her adımında tam olarak açıklamaz ve sonuç olarak, pek çok hata tıkanma kanalları, büyüme veya eki eksikliği de dahil olmak üzere deneyler sırasında meydana, ya da eksikliği yüksek kaliteli mikroskobu görüntüler veya filmler. Enstrüman kendisi ve mikrosıvısal tabak gibi sarf malzemeleri da plaka başına 200 $ bir fiyat etiketi ile göreceli olarak pahalı ve yeniden kullanılabilir değildir. Böylece, teknik güçlü sonuçlar oldukça rahat, kullanımı için gereken teknik uzmanlık nispeten yüksektir ve alanında uzman tarafından tekrarlanan eğitim gerektirir. Bu rapor biyofilmler özellikleri çalışma için bir kılavuz bu Biyoreaktörler, yeni kullanıcılarına sağlayarak bu sorunu çözümlemeye çalışır.
Hücresel analiz yapmak mümkün mikrosıvısal sistemi büyük ilgi için çeşitli bilimsel yöntemleri, gibi Mikrobiyoloji, immünoloji, Hematoloji, Onkoloji ve kök hücre araştırma kazanmıştır. Daha ayrıntılı olarak, teknoloji birçok yayın mikrobiyal sözlü yapışma48etkilerini belirleme, dahil olmak üzere tıbbi uygulamalar37,47için son derece alakalı konuları açıklama sonuçlandı biosurfactants tarihinde Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus49,50, E. coli51, Streptococcus bağlılık52ve tedavi patojen etkileşimlerde ev sahipliği Kistik fibrozis53. Bu mikrosıvısal sistem çok yönlü olduğu gerçeği göz önüne alındığında, daha fazla sistem dünya çapında dağıtılacak öngörülmektedir.
Bazı belirli iletişim kuralı adımlar dikkatle düşünülmelidir. Medya % 50 kabarcıklar ve tıkanma önlemeye yardımcı olmak için dH2O ile seyreltilmiş ancak bu durumda gerekli değildi. OD600 tohum için kullanılan özel değeri kullanılan koşulları belirli kümesi için en iyi olanı görmek için bir büyüme deneme deneme ishal kullanarak belirlenmelidir. Sızdırmazlık önce kuyu kabarcıkları mikrosıvısal kanalları kabarcıkları yol açabilir ve ya attı ya her şeyi bir pipet ucu ile berbat ettin tarafından kaldırılması gerekir. Bakteri küçük yılan gibi kanal dışarı tutmak önemlidir. Akış sistemi uygulanan basınç nedeniyle sadece bu yüzden giriş ve çıkış medya eşit miktarda tohumlama işlemi sırasında yanında having, sıvı cilt baskısı nedeniyle akış kontrol edilecektir. Kalibrasyon mesafeler yüklenmesi sırasında şirket temsilcisi tarafından düzenlenmiş olmalıdır. Bu ayarlar her kamera için özeldir.
Bir resim için en iyi temsil eden eşik bulma oluşur birkaç sorun vardır. En fazla eşik değerlerinin belirlenmesi yerinde arka plan ortalama piksel yoğunluğu her iki kanal veya enkaz plaka üzerinde merkezi değil bir sahne konumunu seçerek neden tutarlı değilse zor olabilir. MM standartaltında işlem' i tıklatın ve sonra düzeltme bu tutarsızlıklar için arka plan ve gölgelendirme düzeltme aracını seçin. Ancak, bu araç genellikle yalnızca Kullanıcı referans görüntü olarak kullanabileceklerini görüntüleri tohum önce kanal yaparsa yararlı olur. Ya da, Eğer arka plan/başvuru gölgelendirme görüntüleri kullanılamaz, Kullanıcı kendi yargı da dahil olmak üzere tüm görüntü için arka plan olmadan en hücre alan kaplayan bir eşik değeri için kullanmanız gerekir. Alternatif olarak, tutarsızlık tıklama Dikdörtgen, Elips bölgeninveya bir bölge seçin ve Tüm yerine Etkin bölge seçmek için İzleme bölgesi bölgeleri hariç ölçmek için temsilcisi alanları seçin Görüntü Bölge istatistikleri göster penceresinde (altında Analiz araçları). Eğer bir temsilcisi bölge kullanılmaktadır eşik parlak alan görüntü için aynı bölgede karşılık gelen FITC görüntü ölçüm için kullanılmalıdır. Bu yüzden aynı bölgede bulundu temsilcisi bu bölge ile ilişkili belirli mekansal istatistik (sol, üst, Genişlik, Yükseklik, alan, çevre) kaydı yararlıdır ve karşılık gelen FITC görüntü ölçülür.
Bilgisayar yavaşlatmak neden olur sabit sürücüdeki verilere birikimini önlemek için veri depolama için bir harici sabit disk satın alınabilir. Veri depolama ve kolaylaştırıcı veri paylaşımı için başka bir seçenek CyVerse Biyoinformatik platformudur. Bir hesap için http://www.cyverse.org/ giderek CyVerse sistemde oluşturun. Bir kez logged içinde keşif çevre denize indirmek o zaman "CyVerse günlük" seçin. "Veri" seçin ve gidin klasörü sensin. Görüntü yığını yerel bilgisayar üzerinde ise "Upload" sonra "Basit Upload--dan okul sırası" seçin. Görüntü yığını dosyayı bulmak ve yüklemek için seçin. Eğer onlar-si olmak bir CyVerse rapor ve izin verilir dosya veya klasör ortak çalışanlarla paylaşılabilir. Halka verisi klasörünün paylaşım bu meta verileri olmak mülhak her dosyayı kullanmak için CyVerse standartları onaylanmış gerektirir. Bu Bu eser kapsamında olmadığı için bu yordamı burada ele alınacak değil.

Burada, floresan oluşumu kesme stres etkisini ölçmek için bir yöntem gösterecek bir otomatik akışı sağlayarak daha yüksek mikrosıvısal sistemi kullanarak Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) PA01 biyofilmler.
Biyofilmler bakteri, bir destek için eklenir ve genellikle bir sıvı ve katı yüzey1arasında arayüz, bulunan hücre dışı bir Polimer madde tarafından düzenlenen gibi mikroorganizmaların topluluklar vardır. 2,3iyileştirilmesi su kalitesi su hatlarının ve inatçı biyoremidasyon bileşikleri gibi bu biyofilm toplulukların çevreye, yararlı olabilir. Ancak, biyofilmler de son derece istenmeyen sonuçlar ile insan sağlığı için zararlı olabilir. Örneğin, tıbbi cihazlar, implantlar, kalça ve diz gibi nerede biyofilm birikimi bir mücadele vardı ve ciddi sağlık komplikasyonlar4,5nedenleri yüzey bir türüdür. Biyofilmler doğal su sistemleri, nehirler ve göller, gibi girin ve enfeksiyonlar6,7,8' kaynaklanan içme suyundaki bakteri kirlenme önde gelen su boruları sızmak. Deniz ortamlarda oluşan biyofilmler gemiler ve diğer insan yapımı yüzeylerde uygun ve artan sürtünme yakıt tüketimi9,10artırmak için yol açar gibi büyük bir ekonomik ve çevresel sorun mevcut. Antimikrobiyal astarlar, Tribülitin gibi bu sorunları önlemek için geliştirilmiştir ancak deniz yaşamı11' e zehirlidir.
P. aeruginosa ile yüksek gelişen yeteneklilik içinde a değişiklik-in çevre ve nutrimental koşulları12gram-negatif bir bakteridir. P. aeruginosa ortak topluluk ve hastane edinsel enfeksiyonlar nedeni ve yakından olmak yaralanmalar, ciddi yanıklar ve immün ana bilgisayarlar, gibi gibi kistik fibrozis (CF)5,12ile ilişkili bulundu, 13, AIDS ve kanser hastaları5,13. P. aeruginosa biyofilmler oluşumu en ciddi CF, kronik akciğer enfeksiyonları bu hastalık5ölüm önde gelen nedenidir nerede için bağlı olmuştur.
P. aeruginosa, PA01, başvuru suşu bu raporda kullanılan ve genetik olarak geliştirilmiş bir yeşil flüoresan protein (PA-EGFP) hızlı şekilde değiştirilir. EGFP floresan mikroskopi14,15,16kullanarak situ biyofilm analiz için izin veren bir mutant formu GFP ile büyük floresans özelliklerini temsil eder. Hücre büyümesi ve işlev17ile önemli ölçüde GFP müdahale değil çünkü bu türde bir floresan çözümlemesini biyofilmler çalışma için avantajlıdır. Örneğin, GFP ile öğesini Escherichia coli hücreleri herhangi bir toksik etkisi ile karşılaştırıldığında denetim bakteri17acı olmadan iyi ve sürekli olarak büyüdü. Diğer raporlar bu iddia18,19,20kanıtlamak. Ayrıca, floresan muhabir EGFP gibi hızlı ve basit kullanmaktır, henüz ölü hücreleri hızlı bir şekilde21bulabilsem sona çünkü sadece canlı hücreleri ölçülecektir.
Biyofilmler farklı akış oranları olanlar dahil olmak üzere çeşitli çevresel koşullar altında büyüyebilir. Örneğin, filmler yüksek shear stres gibi yüksek su akışı koşulları için büyük bir mikrobiyal çeşitlilik22nereye nehirler, büyüyebilir. Aksine, ayakta su havuzları veya sözlü biyofilmler deneyim bir çok daha düşük kesme kuvvetleri23. Akış oranına ek olarak, orada biyofilm yapışma, yüzey pürüzlülüğü ve hydrophobicity, medya kompozisyon, dahil olmak üzere etkileyen diğer faktörler ve hatta bakteriyel hücre yüzey1,4,7, 24. koşulları da neden olabilir değişim kayma yapısı veya morfolojisi bir biyofilm. Bu makaslama hareketli sıvı tarafından sarf stres gibi çevre koşulları içerir veya degradeler besin kullanılabilirlik ve tür gibi biyolojik faktörler spesifik proteinlerin hücre dışı içinde mevcut sistem ve hücreleri hareket mevcut Polimer madde25,26,27. Bazı koşullarda, biyofilm çim gibi olacak (pürüzsüz ve düz), süre diğer koşullarda biyofilm kaba, kabarık ya da mantar gibi28. Biyofilm çimlere ve mantar yapıları arasındaki nitel farkı açıkça mikroskobik Albümdeki görülebilir iken, film yapısı ve filmin içinde Biyolojik süreçler arasındaki ilişkiyi anlamak sistematik ve nicel gerektirir morfolojisi açıklayan yöntemleri. Morfolojik özellikleri çalışma için araştırmacılar tarafından önerilen içerir gözeneklilik, Fraktal boyut, diffusional uzunluğu, terkedilemeyen, microcolony cilt, pürüzlülük katsayısı ve dokusal entropi29,30 microcolony alan .
Biyoreaktörler biyofilmler çalışmada gerçek hayat koşulları31taklit etmek için kullanılır. Damla Akış reaktörler (DFR) nerede besin medya yavaş yavaş bir yüzeye bir biyofilm ile yüksek hücre yoğunluğu32oluşturmak için zaman içinde bağlama hücreler boyunca akışı düşük-makaslama ortamı temsil eder. CDC reaktörler ortam içinde sürekli olarak dönen bir karıştırma çubuk kontrolünü tarafından yüksek shear stres sıvı ortam oluşturmak Biyoreaktörler tank33dolu vardır. Bu tür Biyoreaktörler kurmak basit, ama nispeten düşük örnek boyutu, medya, medya damla akar damla Akış reaktörler için 125 µL/dakika arasında değişen üretilen biyolojik atık büyük miktarda yüksek tüketim nedeniyle kapsam içinde sınırlıdır daha--dan 1 mL/dk'ya için CDC reaktörler ve Züccaciye Mağazaları ve atık medya34otoklav büyük miktarda gerek. Biyofilmler eşit bir damla akış reaktör yüzey üzerinde P. aeruginosa bakteri nin şirketler büyük bu nedenle izleyen medya düşük kesme nedenleri, biyofilm büyüme çok düzgün değil ve düzensiz örnekleri olamaz çünkü büyümek değil kolayca floresans mikroskobu35,36 ile analiz.
Bazı ortak biyoreaktör sınırlamalar nerede sadece medya mililitre gereklidir ve reaksiyon plakaları ısıyla37sonra küçük ve kolayca tek kullanımlık bir orta-den geçerek mikrosıvısal biyoreaktör kullanarak üstesinden vardır. Ayrıca, kuyu sayısına bağlı olarak, birçok çoğaltmalar koş, yeterli miktarda anlamlı istatistiksel analizi yapmak için veri sağlayan bir reaktörde gerçekleştirilebilir. Şekil 1' de, sıcaklık da dahil olmak üzere denetlenen koşullar için izin ve akış hızı38,39,40, farklı mikrosıvısal mikroskobu sisteminin bileşenleri gösterilir. Biyoreaktör düşük ortamlarda veya Biyomedikal alanında karşılaşılan daha gerçekçi senaryolar taklit yüksek kesme koşulları uygulanan PA01 altında EGFP etiketinde floresans görselleştirmek için floresans mikroskobu ile birleştirilmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig1.jpg"> Resim 1 : Mikrosıvısal sisteminin bireysel bileşenleri. Bireysel bileşenleri soldan sağa doğru listelenir: 1. CCD kamera, 2. yüksek çözünürlük ters mikroskopla otomatik sahne, otomatik floresans modülü ve otofokus modül, 3. plaka evre, 4: görüntüleme sistemi arabirimi, 5: manuel mikroskop sahne Kontrol, 6: Buhar kapanı, 7: görüntüleme sistemi denetleyicisi (dahil olmak üzere sıcaklık denetleyicisi), 8: Donanım kontrolörleri, 9: floresan denetleyicisi, 10: kesintisiz güç kaynağı, 11: harici sabit sürücü görüntü saklamak için 12: PC iş istasyonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Bir alıntıyı mikrosıvısal plaka Şekil 2' de gösterilmiştir. En sık kullanılan plakalar 48 kuyu oluşur. Bir deneme gerektirir bir giriş ve bir çıkış wells, toplam 2 Wells. Böylece bakteri suşları gibi çeşitli deneysel koşullarda gerçekleştirilen 24 eşzamanlı deneyler için antimikrobiyal tedaviler ve medya Kanal Kanal çeşitli ve yamultma akışı altı kanal, her sütun için kontrol edilir. Deneysel sıcaklık da plaka boyunca bir sıcaklık ayarıyla denetlenir. Mikrosıvısal kanalları her kanal yeterli geri dönüş basıncı ve kontrollü kayma sağlamak için yılan gibi bir bölge vardır.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig2.jpg"> Resim 2: mikrosıvısal kanalları ve görüş pencere görselleştirme. İki giriş ve çıkış wells ile onları bağlayan mikrosıvısal kanalları ile kırmızı ve yeşil boya vurgulanmıştır. Boya bir yılan gibi bölge yeterli geri dönüş basıncı ve kontrollü kayma sırasında sıvı akış oluşturan her kanaldaki görünür yapar. Her kanalının (içinde kırmızı daire) ile istenilen dalga boylarında yansıması. Parlak alan (üst) ve floresan (alt) gösterilmiştir tek kanalı ile 20 X amacı istimal PA01-EGFP biyofilm görüntülerini mikroskobu. Ölçek çubuğu 80 µm. = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Bir adım adım kılavuz farklı kesme ortamları kullanarak roman biyofilm deney için floresans mikroskobu ile birleştiğinde mikrosıvısal Biyoreaktörler kullanıcılarının olanak tanımak için sağlanmıştır. Bu yöntem diğer mikroorganizmalar bakteriler, mantarlar ve tıbbi ve çevresel uygulamaları41,42,43olan yosun gibi yanı sıra içeren deneyler genişlemesi için izin verir. Detaylı yaklaşım PA01-EGFP kültür, 48-şey plaka aşılamak ve mikrosıvısal cihaz ve yazılım ayarlamak, Floresan Mikroskobu hazırlayın ve biyofilm kapsamı, büyüme oranı, edinmek için yazılım analiz göstermek açıklar ve Yüzey pürüzlülük gibi morfolojik özellikleri.

<table><tbody><tr><td>Amonyum Klorür, ACS</td><td>VWR</td><td>BDH9208-500G</td><td>Minimal medya bileşiminin bir parçası</td></tr><tr><td>BioFlux 1000 48 Kuyulu Düşük Kesme Plakası</td><td>Fluxion Biosciences</td><td>910-0047</td><td></td></tr><tr><td>BioFlux 1000Z Mikroakışkan Görüntüleme Sistemi</td><td>Fluxion Biosciences</td><td>BF 1000Z</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür Dihidrit, ACD Sınıfı</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td>Minimal medya bileşiminin bir parçası</td></tr><tr><td>Dekstroz, Susuz, ACS</td><td>VWR</td><td>BDH9230-500G</td><td>Minimal medya bileşiminin bir parçası</td></tr><tr><td>Magnezyum Sülfat ACS Sınıfı</td><td></td><td>VWR EM-MX0070-1</td><td>Minimal medya bileşiminin bir parçası</td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat Monobazik, ACS Sınıfı</td><td>VWR</td><td>BDH9268-500G</td><td>Minimal medya bileşiminin bir parçası</td></tr><tr><td>Pseudomonas Aeurginosa GFP</td><td>ATCC</td><td>15692GFP</td><td>Bu çalışma için GFP modifikasyonlu Pseudomonas aeurinosa bakteri suşu PA01 kullanılmıştır.</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür, ACS</td><td>VWR</td><td>BDH9286-500G</td><td>Minimal ortam bileşiminin bir parçası</td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat, Monobazik, Susuz, Reaktif Sınıfı</td><td>VWR</td><td>97061-942</td><td>Minimal ortam bileşiminin bir parçası</td></tr></tbody></table>

canlı hücre analizi, yamultma stres bir otomatik yüksek üretilen iş mikrosıvısal sistemi kullanarak pseudomonas aeruginosa

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Floresans mikroskobu ile birleştiğinde bir akışı sağlayarak daha yüksek mikrosıvısal vitro biyoreaktör bakteriyel biyofilm büyüme ve morfoloji, Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) dahil olmak üzere çalışmaya kullanılmıştır. Burada, büyüme kinetik ve yüzey pürüzlülüğü ve dokusal entropi P. aeruginosa baskı gelişmiş bir yeşil flüoresan protein (PA01-EGFP ifade eden PA01 gibi morfolojik özellikleri çalışmaya sistem nasıl kullanılacağını anlatacağım ). Detaylı bir protokol büyümeye ve PA01-EGFP kültürler tohum nasıl anlatacağım, nasıl ayarlamak için mikroskop ve autorun ve büyüme oranı ve morfolojik özellikleri tarafından denetlenir kesme kuvvetleri çeşitli kullanarak belirlemek için görüntü analizi yapmak mikrosıvısal aygıt. Bu makalenin sonunda diğer suşların bakteri, mantar veya yosun biyofilmler mikrosıvısal platformu kullanarak doğru uygulanabilen PA01-EGFP biyofilmler çalışma geliştirmek için bir teknik ayrıntılı bir açıklamasını sağlar.

Şekil 4 bir yüzde thresholded alan zaman içinde 24 h 0,2, 0.5 ve 1.0 din/cm2kesme akışının çalıştırmak gösterilmiştir. Biyofilm kapsama veya yüzde eşik yüzey alanı (C [%]) için tüm üç kesme ayarları farklı. Biyofilm kapsama nerede eşik alan 2-%5 100 artış 1.0 din/cm2 kesme en hızlı büyüme % 200 dk sonra ve durağan faz 400 dk sonra ulaştı. 0.5 din/cm2, biyofilm kapsamı ertelendi ve 400 dk % 100 kapsama 800 dakika sonra ulaşan artmaya başladı. En düşük fiyat makas 0.2 din/cm2 nerede yüzde kapsama 500 dk az artmaya başladı ama hiç olarak % 65 eşik alanı ulaştı biyofilm kapsamı, en yavaş artış sergilenmez. Bu sonuçlar kesme biyofilm yüzey kapsamında doğrudan bir etkisi vardı belirtti. Daha yüksek kesme gerçeğini biyofilm daha hızlı prolifere daha fazla besin bakterilerle medya sağlanan nedeniyle muhtemelen biyofilm büyüme için daha iyi bir durum gibi görünüyordu.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig4.jpg"> Şekil 4: 0,2, 0.5 ve 1.0 din/cm2 üzerinde 24 h saat dönemi'ni kullanarak zamanla yüzde eşik alanı, toplam biyofilm birikimi, pürüzlülük katsayısı ve dokusal entropi. a) yüzde eşik alan (C [%]). Veri her kesme koşul bir kanal üzerinden elde edildi. b) biyofilm birikimi (göreli ölçümü) 0,2, 0.5 ve 1.0 din/cm2 üzerinde 24 h saat dönemi'ni kullanarak zaman bir fonksiyonu toplam. En küçük kareler uyan üstel bir model siyah çizgilerdir. Veri her kesme koşul bir kanal üzerinden elde edildi. c) PA01-EGFP pürüzlülük katsayısı 0,2, 0.5 ve 1.0 din/cm kesme stres değerleri kullanarak üzerinde 24 h veri izlenen2 her kesme koşul bir kanal üzerinden elde edildi. d) PA01-EGFP dokusal entropi 0,2, 0.5 ve 1.0 din/cm2. kesme stres değerleri kullanarak Her kesme koşul bir kanal üzerinden elde edilen veriler (Valquier-Flynn, H., Sutlief, al, Wentworth, C.D., 2018). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Şekil 4 b Şekil 4biriçinde gösterilen bulguları ile tutarlıdır. Biyofilm birikimi (N[rel]) görüntüdeki bir noktada GFP sinyal canlı hücre yoğunluğu o konumdaki orantılıdır varsayımına göre ölçüldü. Toplam göreli ölçüm biyofilm birikimi 0,2, 0.5 ve 1.0 din/cm2 üzerinde 24 h zaman dilimi kullanarak zaman bir fonksiyonu olarak artmış ve büyüme oranı en yüksek kesme stresten en düşük kesme stres için reddetti gösterir. Üstel büyüme içinden bir kantitatif büyüme oranı hesaplanabilir veren açık bir dönem vardır.
Şekil 4 c pürüzlülük katsayısı (Rbir) 0,2, 0.5 ve 1.0 din/cm2kesme akışının gösterir. Yüzey pürüzlülüğü, pürüzlülük katsayısı tarafından sayısal film kalınlığı profilde varyansını ölçer. Resmi tanımı
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926eq1.jpg">
ortalama kalınlık Tben ben-th kalınlığı ölçümü, Tbir nerede olduğunu ve N kalınlık ölçüm30sayısıdır. Bu araştırmada açıklanan yordamı canlı hücreler ile ilişkili kalınlık ölçer. Birden büyük bir pürüzlülük katsayısı üzerinden ortalama kalınlığı önemli farklılıklar ortaya çıkarır ise düz bir düzenleme hücrelerin pürüzlülük katsayısı sıfır ortaya çıkarır. Benzer şekilde büyüme oranı ve yüzde eşik kapsama film kesme etkisi, biyofilmler zaman içinde farklı Topografyaları sergiledi. Genel olarak, Rbir bütün yüzeyleri pürüzsüz oldu gösteren tüm kesme koşulları için zamanla azalmıştır. Ancak, 0.2 din/cm en düşük kesme ile karşılaştırıldığında, daha hızlı bir makaslama akışı daha yumuşak ve daha da yüzey ve en yüksek kesme, katkıda gösteren zaman içinde daha düzgün bir yüzey daha yüksek kesme ayarları 0.5 ve 1.0 din/cm2 sonuçlandı 1.0 din/cm2 0,2 Rbirulaşan.
Pürüzsüzlük, düzenli olarak veya bir yüzey kalitesizlik da dokusal entropi (TE) ifade edilebilir. TE görüntü analizinde randomness iki boyutlu bir resim derecesini ölçmek için kullanılan bir özelliktir. Onun hesaplama gri düzey ortak oluşumu matris üzerinde Haralick ve arktarafından tanımlanan temel., hangi olup bir yerde piksel değerlerini piksel değerlerini başka bir konuma44ile correlated adlı görünüyor. Korelasyon yüksek derecede düşük entropi yol açacaktır. Şekil 4 d TE 0,2, 0.5 ve 1.0 din/cm2kesme akışının yönü gösteriyor. TE kesme koşulların tümü ama 1.0 din/cm daha düşük kesme stresleri 900 dk öncesindeki maksimum TE (1.0) ulaştı en yüksek kesme stres için zaman içinde artmıştır. 0.2 din/cm2 en düşük kesme maksimum 1000 dk sonra ulaşan en düşük TE (0,8) vardı. Ancak, 0.5 din/cm2 ara kesme stres onun en büyük TE (1.2) çok yüksek veya düşük kesme stres koşulları daha sonra ulaştı.
Pürüzlülük katsayısı ve TE farklı özellikler ölçmek. Düz bir film düşük pürüzlülük katsayısı ve düşük entropi gerekir iken, bir film kalınlığı önemli varyasyon ile yüksek pürüzlülük katsayısı olurdu ama düşük entropi değişimi yerine rasgele sinüsoidal ise hala olabilir. Süre TE trendleri doğrudan biyofilm oluşumu zaman içinde uygulanan stres yamultmak için ilgili değil bu durumda, Rbir artan kesme stres ve zamanla azalmıştır.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS1.jpg"> Şekil S1 : Görüntü yakalama, denetim yazılımı Windows'un. Yazılım pencere ile çok boyutlu edinme yemek listesi (üst). Kontrol modülü bir AutoRun (alt) için ayarlayın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS2.jpg"> Şekil S2 Görüntü yakalama veri izlemeye yarayan yazılım. Uygulama penceresi faiz Analizi Araçlar menüsünden İnceleme çok boyutlu veri aracını kullanarak veri kümesi seçtikten sonra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Burada, Pseudomonas aeruginosa biyofilmler araç da dahil olmak üzere yeşil flüoresan proteinler ifade üzerinde kesme stres etkileri analizi için floresan mikroskop ile birleştiğinde bir akışı sağlayarak daha yüksek mikrosıvısal biyoreaktör kullanımını açıklar biyofilm kapsamı, büyüme oranı ve morfolojik özellikleri belirlenmesi, ayarla.

Canlı hücre analizi, yamultma stres bir otomatik yüksek üretilen iş mikrosıvısal sistemi kullanarak Pseudomonas aeruginosa

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Bu yöntem, biyofilm büyümesini ve geliştirme sırasında davranışsal özellikleri etkileyen temel çevre koşullarının nasıl belirleneceği gibi biyofilm gelişimi ile ilgili temel soruların yanıtlatılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, çok kanallı, mikro-akışkan plakalar, istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar hızlı elde etmek için izin olmasıdır. Bu yöntem biyofilm yapısı hakkında bilgi sağlasa da antibiyotik tedavileri ve biyoremediasyon çalışmalarında da uygulanabilir.Genellikle, bu yönteme yeni bireyler mücadele edecek, çünkü protokol detaylarına dikkat ve titiz beceriler, ihtiyaç vardır. Cihazın yazılıma bağlanmasında bir hata olmasını önlemek için önce PC iş istasyonunu açın ve ardından floresan modülü açın. Floresan deklanşörün anın dadiğinden emin olun ve donanım denetleyicilerini açın.Ardından, görüntüleme sistemi denetleyicisini ve CCD kamerayı açın. O zaman görüntüleme istasyonunu aç. Tüm ekipman hazır olduğunda, kontrol uygulamasını başlatın ve plakanın yan tarafındaki etikette bulunan plaka numarasını girin.Astarlama için, önce 48 iyi mikro-akışkan plakayı plakanın altındaki cam yüzeye dokunmadan ambalajından çıkarın ve plakanın altındaki cam kaydırağı mercek dokusuyla temizleyin. Mikro-akışkan kanalları astarlamak için, pipet 200 mikrolitre 37 santigrat santigrat minimum orta çıkış içine, kabarcıklar önlemek için dikkat. Daha sonra plakayı plaka aşamasına yerleştirin.Etanol kuruduktan sonra plaka aşamasına mühürleyerek, etanol ile arayüzü silin. Kontrol modülündeki manuel modda, sıvıyı Luria-Bertani suyu olarak 37 santigrat derece, maksimum da santimetre kare başına beş dym olarak ayarlayın. Çıkıştan giriş kuyuya giden akışı etkinleştirmek, kanalları astarlamak için çıkış kuyularını tıklatın.Beş dakika sonra, tohumlama için hazırlamak için akışı duraklatın ve dikkatle sahneden plaka kaldırın. Daha sonra, mikro-akışkan kanallara yol açan iç daire herhangi bir orta çıkarmadan çıkış iyi herhangi bir artık orta aspire. Deneysel kanalları tohumlamak için, giriş kuyusu içine minimum orta 300 mikrolitre ekleyin, bakteri kültürü 300 mikrolitre eklenmesi takip, çıkış kuyusu içine.Plakayı görüntüleme aşamasına getirerek, plakaya yerleştirmeden önce arayüzü etanolle silmeyi ve tek bir kanala odaklanmak için canlı kamera yayınını kullanın. Canlı yayını görsel olarak izlerken, yaklaşık 2 ila 4 saniye boyunca santimetre kare başına 1-2 dym'lik akışa devam edin, hücrelerin serpantin kanallarına değil deneysel kanala girmesine izin verin ve hücrelerin bağlanmasını sağlamak için plakayı sıcaklık kontrollü sahnede bir saat bekletin. Ek süresinin sonunda, plakayı sahneden dikkatlice çıkarın ve kanalı bozmadan bakterileri çıkış kuyularından aspire edin.Daha sonra, giriş kuyularından orta kaldırmak için yeni bir pipet ucu kullanın. Yazılımda, mikroskop görüntü edinimi kontrol etmek için birden fazla boyutlu edinimi açın ve zaman atlamasını, birden çok aşamalı pozisyonu ve birden çok dalga boyu seçin. Kaydetme sekmesinde, dosya varsa incroments taban adının denetlendirilediğinden emin olmak için basit bir temel ad oluşturun.Açıklamaya deneyin tüm önemli ayrıntılarını ekleyin. Zaman atlama sekmesi altında tüm dosyaların kaydedilen klasörü seçmek, deneme süresinin süresini 24 saate ayarlamak ve deneme boyunca her beş dakikada bir görüntü elde etmek için zaman aralığını ayarlamak için seç dizini seçin. Plakaya kazınmış kanal numaralarının üstünde veya altında yer alan kanalın merkezine odaklanarak sahne pozisyonlarını ayarlamak için canlı kamera yayınını ve 10x hedefini kullanın.20x hedefine geçin ve kanal içindeki en uygun görüntüleme alanını ve odak düzlemini bulun. Ardından, yeni ayarlarla birlikte sahne konumunu listeye ekleyin. Dalga boyları menüsü altında, dalga boylarının sayısını 3'e ayarlayın ve ilk dalga boyunu FITC %100 kameraya ayarlayın, on milisaniyelik pozlama süresiyle, brightfield'a ikinci dalga boyu %50 görünür, en az 3 milisaniye pozlama süresi yle ve üçüncü dalga boyu tüm kapalı, böylece satın alma süreleri arasında son kanalda ışık kalmaz.AutoRun'u düzenle menüsünde, protokol kurulum sekmesini açın ve uygun deneysel kesme hızında ileri yönde ayarlanan akışla 24 saatlik bir süreyle yeni bir protokol ayarlayın. Protokolü kaydetmek ve sıra kurulum sekmesini açmak için ekle ve kaydet'i tıklatın. Yeni bir dizi ayarlamak için, luria-Bertani et suyu 37 derece, tüm kanallar için varsayılan sıvı olarak seçin.1 ile 12 arasında kanallar için adım yineleme 1 altında, ilk deneme kesme oranı ile protokolü seçin ve tüm kanalları etkinleştirin. 13 ile 24 arası kanallar için, ikinci deneme kesme oranıyla protokolü seçin ve tüm kanalları etkinleştirin. Ardından Sırayı kaydetmek ve AutoRun için kullanılacak kayıtlı sırayı seçmek için AutoRun menüsünü açmak için Uygula ve Kaydet'i seçin.Zamanlanmış büyüme biyofilm deneyini ayarlamak için, mikro akışkan plakanın giriş kuyununa 1300 mikrolitreye kadar steril minimal ortam ekleyin ve plakayı görüntüleme aşamasına geri döndürün. Sonra, etanol ile arayüzü silin ve plaka mühür. Protokollerin ve dizilerin doğru şekilde ayarlanıp ayarlandırı.AutoRun'u başlatmak için başlat'ı seçin ve mikroskop görüntü koleksiyonunu başlatmak için hemen satın alın'ı tıklatın. İlk görüntü edinmenin sonunda, duraklat'ı tıklatın ve brightfield dalga boyunda canlı görüntü modunu seçin. Her aşama konumunu görüntülemek için git'i seçin ve yeni ayarları ayarlamak için geçerliye ayarla'yı seçin.Ardından, bir sonraki zamanlanmış edinme başlamadan önce devam'ı tıklatın. Bu temsili zamanlı biyofilm büyüme deneyinde, biyofilm kapsamı veya yüzde eşik yüzey alanı, her üç kesme ayarı için farklıydı, bu da makasın biyofilm yüzey kapsamı üzerinde doğrudan bir etkisi olduğunu gösteriyordu. Biyofilm birikiminin toplam göreceli ölçümü, zamanın bir fonksiyonu olarak artmış, büyüme hızı en yüksek kesme stresinden en düşük kesme stresine kadar azalmaktadır.Her koşulda, nicel büyüme hızının hesaplanabileceği açık bir üstel büyüme dönemi de vardı. Genel olarak, pürüzlülük katsayısı tüm kesme koşullarında zaman içinde azalmış, biyofilm yüzeyleri tüm pürüzsüz hale geldiğini gösteren. Ancak, en düşük kesme yle karşılaştırıldığında, daha yüksek kesme ayarları zaman içinde daha yumuşak bir yüzeyle sonuçlanır ve bu da daha hızlı bir kesme akışının daha yumuşak ve daha düzgün bir yüzeye katkıda bulunduğunu gösterir.Ayrıca, dokusal entropi, ya da morfolojide rasgelelik, tüm kesme koşulları için zaman içinde artmıştır. Bu yordamı gerçekleştirirken belirtilen sırayı izlemeyi ve her adımı tam olarak gerçekleştirmek için zaman ayırın hatırlamak önemlidir. Gerekli becerileri ustalaşmak için birkaç çalışır alabilir.Bu prosedürü takiben, HBLC veya GCMS gibi diğer yöntemler, tüketilen glikoz gibi substraights konsantrasyonları hakkında ek soruları cevaplamak için gerçekleştirilebilir. Bu teknik, geliştirildikten sonra, biyofilm alanındaki araştırmacıların kontrollü deneysel koşullar ve hidroterapi örneklemesi ile genel akış ortamlarını gerçek zamanlı olarak keşfetmelerinin önünü açmıştır. BSL2 bakteri suşları ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken uygun koruyucu ekipman takmak ve uygun atık protokolleri kullanmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

live-cell-analysis-shear-stress-on-pseudomonas-aeruginosa-using-an

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Protokolü Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu (CLSM) mikrobiyal biyofilm büyüyen ve analiz etmek için bir akış hücresi sistemi uygulama nitelendirdi.

Pseudomonas aeruginosa ve Saccharomyces cerevisiae Biyofilm Akış Hücreler

Enfeksiyon süreci boyunca, önemli bir adım patojenlerin konak hücrelerine yapışma. Çoğu durumda bu yapışma adım akan sıvı tarafından üretilen mekanik stres varlığında oluşur. Biz kayma gerilmesi bakteriyel yapışma çalışmada önemli bir parametre olarak tanıtan bir tekniktir açıklar.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

Steril bir sürekli akış devresi, laminer akış kayma gerilmesi tabi yapışık hücrelere için bir yöntem tarif. Hücrelerin yapışma, morfoloji, şeffaf oda ile devre metaboliti analizi ve gelecek deneyler ya da kültür için kayma maruz kaldıktan sonra hasat hücreleri için alınan numuneler incelenmiştir olabilir.

Laminer Akış Kesme Stres altında endotel progenitör hücrelerin değerlendirin Paralel plakalı Akış Odası ve Sürekli Akış Devre

Kaynak: Cayron, J., ve diğerleri. Stres Tedavileri Altında Bakteriyel Büyümenin Çok Ölçekli Analizi. J. Vis. Uzm. (2019).Bu video, stres koşulları altında bakteri hücrelerini görüntülemek için mikroakışkan bir plakanın nasıl hazırlanacağını ve kullanılacağını gösterir. Bir bakteri kültürü ve strese neden olan bir antibiyotik ortamının tanıtılması, ardından hücre yüklemesi ve mikroskobik kurulum sürecini ana hatlarıyla belirtir. Faz kontrast modunda hızlandırılmış görüntüleme daha sonra, inhibe...

Mikroakışkan Odalar Kullanılarak Stres Altında Bakteri Büyümesinin Mikroskobik Analizi

Kaynak: Sutlief, A. L. ve diğerleri.  Pseudomonas aeruginosa üzerindeki kayma stresinin otomatik yüksek verimli mikrofluidik sistem kullanılarak canlı hücre analizi. J. Vis. Exp. (2019).Bu video, bakteriyel kültürlerde kesme stresi çalışmaları için mikrofluidik bir plakanın hazırlanmasını göstermektedir. Kanallar ortamla astarlandıktan sonra, bakteri hücreleri deneysel kanala getirilir ve bağlanmak üzere kuluçka yapılır. Kalıntı ortam ve kültür çıkarılarak sistem sonraki kesme stresi...

Bakteriyel Hücrelerle Mikrofluidik Plakanın Hazırlanması

Mikrobiyal toplulukların gelişimi, çevresel mimari, üye bolluğu, özellikleri ve etkileşimleri de içeren faktörlerin bir kombinasyonuna bağlıdır. Bu protokol, femtolitör kuyularda bulunan binlerce topluluğun eşzamanlı olarak izlenebilmesi için sentetik, mikrofabrik bir ortam tanımlamakta olup niş boyut ve sınırlama gibi anahtar faktörler yaklaşık olarak belirlenebilmektedir.

Bir Mikro Kuyruklu Dizi Platformunda Mikrobik Topluluk Geliştirmenin Montajı ve Takibi

Burada, sıvı kesme stres altında endotel hücre kültür ve gen ifade analizi için iş akışı gösterilmektedir. Dahil aynı anda konut ve kontrollü bir ortamda ve eksojen başvuru RNA kullanım kantitatif PCR için birden çok akış odalarında takibi için fiziksel bir düzenlemedir.

Stres birden çok paralel-plaka akışı Chambers kullanarak yamultmak için maruz endotel hücrelerinin gen ifade Analizi

Bu çalışmada, tanımlanmış akış koşullarında kesme stresi altında farklılaştırılmış insan primer endotel hücrelerinin yüzeyinde üretilen pnömokok komponent dizelerine bağlıpnozyağının mikroskobik takibi açıklanmaktadır. Bu protokol, diferansiyel immünboyama prosedürleri uygulanarak belirli hücre yapılarının ayrıntılı görselleştirilmesi ve bakterilerin sayısallaştırılması için genişletilebilir.

Sürekli Akışta Birincil İnsan Endotel Hücrelerinin Pnömokok Enfeksiyonu

Sentetik kistik fibrozis balgam ortamı (SCFM2), bakteriyel agregaları yüksek çözünürlükte gözlemlemek için hem konfokal lazer tarama mikroskopisi hem de floresan ile aktive hücre sıralama ile birlikte kullanılabilir. Bu makalede, antimikrobiyal tedavi sırasında toplam popülasyonları gelecekteki çalışmalar için bir platform olarak değerlendirme yöntemleri ayrıntılı olarak açıklar.

Pseudomonas aeruginosa Enfeksiyon Modelinin Gerçek Zamanlı Değerlendirilmesi için Araçlar

Bu protokol, kanserli ve kanserli olmayan hücre hatlarının mekanik özelliklerinin in vitro olarak ölçülmesini özetlemektedir. Kanserli ve normal hücrelerin mekaniğindeki korunmuş farklılıklar, prognoz ve tanıda etkileri olabilecek bir biyobelirteç görevi görebilir.

Tek Hücreli Malzeme Özelliklerinin Belirlenmesi için Kesme Testi Protokolü

Keşfedin, mikroakışkan biyoreaktör kullanarak Pseudomonas aeruginosa biyofilmlerinde yalpalama stresinin etkilerini canlı hücre analiziyle. Bu yöntem, biyofilm yapısı ve antibiyotik tedavileri üzerine istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmeyi sağlar.

Canlı hücre analizi, yamultma stres bir otomatik yüksek üretilen iş mikrosıvısal sistemi kullanarak Pseudomonas aeruginosa

Daha fazla video keşfet