Name: Biyolojik gliyom immünhistokimya parafin gömülü 3D tümörü Neurosphere kültürü üzerinde tarafından değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Öğrenin, parafin gömülü immünhistokimya yöntemiyle tümör nörosferlerinin 3D yapısını koruyarak gliyom biyobelirteçlerini nasıl analiz edeceğinizi. Bu protokol, hücre morfolojisini koruyarak kanser araştırmalarında doğru sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser ulusal kurumları, Sağlık/Ulusal Enstitüsü, nörolojik bozukluklar & kontur (NIH/NINDS) hibe R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 için M.G.C. tarafından desteklenen; NIH/NINDS verir R01-NS076991, R01-NS082311 ve R01-NS096756 P.R.L. için; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; Nörocerrahi bölümü; Leah'ın mutlu Kalpler M.G.C. ve P.R.L.; ve RNA Biyomedikal Grant F046166 M.G.C. F.M.M. için bir F31 NIH/NINDS-F31NS103500 tarafından desteklenir. J.P. bir Fulbright-Arjantinli Bakanlığı spor ve eğitim bursu tarafından desteklenmiştir.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Michigan Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. nesil bir fare modelinden türetilmiş Beyin tümör Neurospheres
<ol><li>Diseksiyon yordamı önce sinir kök hücre ortam hazırlamak (NSC medya: DMEM/F12 özel sayı: 1 x B27, 1 x N2 ek, 1 x normocin ve 1 x antibiyotik/insan rekombinant EGF ve basic-FGF konsantrasyonları 20 ng/mL her yönü ile antimycotic). 1.5 mL tüp NSC medya 300 µL ile doldurun ve daha sonrası için saklıdır.</li>
	<li>Bir fare ile büyük bir tümör seçin. Not: plazmid veya virüs enjekte biyoluminesans kodlar Eğer bir tümör boyutu bioluminescence tarafından izlenebilir. Genellikle, büyük bir tümör > 106 fotonlar/s/cm2/sr biyolüminesans var.</li>
	<li>Fare ile bir doz aşımı isoflurane ötenazi: kağıt mendil isoflurane ile demlemek ve tahriş önlemek için fare ile doğrudan temas kaçınarak doku euthanization odasında tanıtmak. Fareler pedal refleks (genellikle 5-10 dk) gösterme kadar bekleyin. Fare başını kesmek ve beyin Calinescu vd içinde açıklandığı gibi incelemek 13.</li>
	<li>Tümör floresan, floresan lamba ile donatılmış diseksiyon mikroskop içinde beyin tümörü kitle tanımlamak için kullanın. İyi forseps ile normal beyin dokusundan (genellikle 5-7 mm çapında) tümör incelemek.</li>
	<li>NSC medya (adım 1.1) ile 1,5 mL tüp disseke tümör yerleştirin. Hafif basınç uygulayarak microcentrifuge tüp duvarlara uyan bir tek kullanımlık plastik havaneli ile tümör lunaparkçı.</li>
	<li>Hücre kümeleri ayırmak için enzim-Alerjik ayrışma ortamının 1 mL ekleyin ve 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya</li>
	<li>Hücre süspansiyon 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre ve süzgeç NSC medya 20 mL ile yıkayın.</li>
	<li>300 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi, süpernatant dikkatle boşaltmak ve Pelet 6 mL veya 15 mL NSC medya, Pelet büyüklüğüne bağlı olarak yeniden askıya alma.</li>
	<li>Tümör hücre süspansiyon bir T-25 veya T-75 kültür şişesi ve kültür bir doku kültürü kuluçka 37 ° C'de % 95'i hava ve % 5 CO2bir atmosfer ile plaka.</li>
	<li>3 gün sonra sağlıklı askıya alınmış NS aktarmak ve onları yeniden T-25 veya T-75 doku kültürü şişesi plakası. Gerekirse, daha fazla NSC medya kültür için ekleyin. Not: Genellikle bir nüfus hücre olacak, bazı ölü olacak, bazı yapıştırılır ve bazı medya yüzen NS oluşturan</li>
</ol>2. koruma ve NS Passaging
Not: aşırı büyüme önlemek ve nispeten yüksek yoğunluklu hücreleri korumak. İzdiham küreler boyutu (siyah merkezlerinin büyük küre ortalama büyüme) tarafından belirlenir. NS büyüme hızının tümörler oluşturmak için kullanılan oncogenes bağlı olacaktır.
<ol><li>Bir kez NS kültür confluency ulaştı, steril santrifüj tüpü kültüründe toplamak ve NS 300 x g 5 min için de cips.</li>
	<li>Süpernatant atmak, hücre dekolmanı çözümü 1 mL ekleyin ve pipet Pelet yeniden askıya alma.</li>
	<li>Tüp flicking 5 min için 37 ° C'de hücre ayrılma yardımcı olmak için her 2 dk kuluçkaya. Not: NS confluency ulaştığınızda, onlar genellikle macroscopically küçük beyaz küreler görülebilir. Hücre ayrılma sağlamak için en azından tüm görünür NS kayboldu gerekir.</li>
	<li>HBSS 1 5 mL ekleyin x ve pipet birkaç kez. 5 dakika süreyle 300 x g Pelet hücreleri süpernatant atmak. Pelet NSC medya rekombinant EGF ve temel FGF ile 5 ml yeniden askıya alma.</li>
	<li>Hücre 1 mL NSC medya ve kültür T-75 şişesi bir doku kültürü kuluçka 37 ° C'de 15 mL % 95'i hava ve % 5 CO2atmosferiyle ekleyin.</li>
	<li>Büyüme faktörleri (EGF ve temel FGF) her 3 günde ekleyin. Ortam ışık dönüşürse turuncu ve hücreleri henüz konfluent değil, medya değiştirmek. Bunu yapmak için 300 x g 4 dk için de NS santrifüj kapasitesi ve yeniden büyüme faktörleri ile desteklenmiş NSC medya askıya alma. Not: oluşan Pelet boyutuna bağlı olarak, hücre daha fazla şişeler bölmek gerekebilir.</li>
</ol>3. uzun süreli depolama için NS dondurma
<ol><li>NS kültür konfluent olduğunda hücreleri 2.1-2.4 adımlarda açıklandığı gibi ayırmak. Pelet HBSS içinde yeniden askıya alınmış edildikten sonra bir aliquot çıkarmak ve hücreleri saymak.</li>
	<li>300 x g 4 dk için hücreleri santrifüj kapasitesi ve süpernatant mümkün olduğu kadar kaldırın.</li>
	<li>Medya (ısı-inaktive FBS, % 10 DMSO) dondurma Pelet yeniden askıya alma. 1 x 106 ve 3 x 10 mL başına şişe başına6 hücre arasında dondurmak için tavsiye edilir.</li>
	<li>Çok cryovials ve yavaş yavaş şişeleri soğumasını gerekli olarak yeniden askıya alınmış hücrelerde tarafından ilk buz için aktarmadan sonra -20 ° c sonra-80 ° C ve nihayet bir sıvı azot saklama kabı için ertesi gün bölün.</li>
</ol>4. tümör NS fiksasyonu
<ol><li>Kültür tümör T-25 şişesi 2-3 gün kadar hücreleri konfluent NS (~ 3 x 106 hücre). Tümör NS bir 15 mL konik tüp bir en az bir T-25 konfluent şişesi toplamak. 300 x g 5 min için de cips.</li>
	<li>Pelet 1 mL % 10 formalin yeniden askıya alma ve oda sıcaklığında (RT) 1 x HBSS 10 dk. eklemek 5 mL için tutmak ve adım 3.2 yapılır gibi hücreleri cips. Bu işlemi bir kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Buzda Pelet içeren 15 mL konik tüp yerleştirin.</li>
</ol>5. parafin tümör NS katıştırma
<ol><li>Yıkanmış NS Pelet % 2 sıcak sıvı özel 500 µL içinde yeniden askıya alma ve karışımı yavaşça pipetting tarafından.</li>
	<li>Hemen özel polymerizes kadar özel katıştırılmış NS buza koyun. NS barındıran özel parça kaldırın. Kaset (Şekil 2) işleme doku için NS ile polimerli özel parça yerleştirin.</li>
	<li>(Bir otomatik parafin işlemci kullanarak) doku işleme devam etmek ve (bir gömme istasyonunu kullanarak) katıştırma alkol.</li>
</ol>6. NS parafin gömülü kesit
<ol><li>Su banyosu 42 ° C-ayarla ve dikkatlice o dümdüz edildi emin olmak için iki boya fırçaları kullanarak microtome üzerinde bıçak ekleyin. Bu bıçak sadece kırpma için kullanın.</li>
	<li>Parafin blok üzerinde microtome yerleştirin. Sigara dominant el ile her bölümün kalınlığını denetler sol tarafta bulunan kolu üzerinde bastırın. 30 µm kalınlık gösterir ikinci durdurmak için tuşuna basın.</li>
	<li>Blok kesme başlar (i.e., aşırı parafin kaldırma) örnek yüzeyine ulaşılana kadar sağ eli ile kaba el çarkı çevirerek. Bu noktada, döşeme kalınlığı 10 mikron veya 5 mikron kontrol kolu bırakın. Örnek yüzeyinin ulaşıldığında kısaltma kesin.</li>
	<li>Bir buz kutusu buz ile doldurun ve parafin blok buz üzerinde yerleştirildiğinde, su doğrudan buz dokunmaktan korumak parafin blok etrafında bir film gibi davranan sadece yeteri kadar su ekleyin. Parafin blok 20 dk için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Eski bıçak atmak ve kesit için yeni bir tane ekleyin. Kuru blok gazlı bez kullanarak sonra yere microtome.</li>
	<li>Sigara dominant el ile parafin şerit çekmek için kullanılan Kıvrımlı pensler çifti elde edilir. Parafin şerit su banyosu aktarmak için kullanılan sağ yakınındaki bir nemli boya fırçası tut. Başlamak bölümüne hızlı bir sağ eli ile kaba el çarkı çevirerek pace. Forseps sol el parafin şerit tutmak için kullanın.</li>
	<li>Islak boya fırçası parafin şerit su banyosu aktarmak için kullanın.</li>
	<li>Forseps eğrisi bölümleri yüzeysel forseps iki parafin kesitler arasında yerleştirerek, daha sonra iki bölüm uzağa hafifçe iterek tarafından parçalayın için kullanın. Not: Bu hareket tamamen parafin bölüm yüzeyinde olmalıdır. Aşağı üstünde belgili tanımlık parça bastırmayın.</li>
	<li>Pozitif yüklü yapışma mikroskop slayta ayrı parafin kesitler itmek için nemli boya fırçası kullanın.</li>
	<li>Bunları slayt kutularına saklamak önce kuru gecede bir kimyasal başlık içinde slaytlara izin. Slaytlar depolanmasını gerçekleştirilen leke türüne göre değişir.</li>
</ol>7. immünhistokimya (IHC) parafin gömülü NS
<ol><li>Parafin bir metal raf slaytlar yerleştirip onlara 20 dk 60 ° C'de kuluçka eritebilir.</li>
	<li>Slayt kuluçka RT bir rehidrasyon Tren içinde tarafından deparaffinize: 3 x 5 min için ksilen, %100 2 x etanol için 2 dk, %95 2 x etanol için 2 dk, %70 1 x etanol için 2 dk ve 1 x 2 dk. Hereonu, deiyonize su musluk suyu antijen alma kadar slaytları tutmak , kurumasını olarak neden olur non-spesifik antikor bağlama.</li>
	<li>Sitrat arabellek (10 mM sitrik asit, %0.05 non-iyonik deterjan, pH 6) 125 ° c 30 için slaytları kuluçkaya s ve 90 ° c 10 s. Onları soğumasını sonra slayt 5 kez distile su ile durulayın.</li>
	<li>RT, Slaytlar %0,3 H2O2 30 dk içinde kuluçkaya.</li>
	<li>3 kez nazik ajitasyon ile 5 min için arabellek (TBS % 0,025 deterjan) yıkama içinde slaytlar yıkayın.</li>
	<li>RT, slaytlar 30 dk için çözüm (% 10 at serum, TBS % 0,1 BSA) engelleme ile kuluçkaya.</li>
	<li>Gecede 4 ° C'de oksijen odasında slaytlar ile birincil antikor seyreltme çözüm (TBS % 0,1 BSA) hazırlanan kuluçkaya. 3 kez nazik ajitasyon ile 5 min için arabellek yıkama içinde slaytlar yıkayın.</li>
	<li>RT, Slayt 1 h için biotinylated ikincil antikor seyreltme çözümde hazırlanan ile kuluçkaya. 3 kez nazik ajitasyon ile 5 min için arabellek yıkama içinde slaytlar yıkayın.</li>
	<li>RT, slaytlar avidin-biotinylated horseradish peroksidaz karmaşık ile 30 dk için karanlıkta kuluçkaya. 3 kez nazik ajitasyon ile 5 min için arabellek yıkama içinde slaytlar yıkayın.</li>
	<li>DAB-H2O2 substrat markalar burada için 2-5 dk RT. az slaytlarla kuluçkaya</li>
	<li>3 kez dokunun su ile durulayın. (1-2 s) hematoksilen çözüm counterstain için slaytları daldırma ve takas kadar musluk suyu iyice yıka.</li>
	<li>Slaytları aşağıdaki gibi kurutmak: 2 min için distile suda kuluçkaya, % 80'i etanol içinde 3 kez daldırma, % 95 etanol 2 min için 2 kez kuluçkaya, % 100 etanol 2 dk her, için 2 kez kuluçkaya ve sonunda 3 dakika için 3 kez ksilen içinde.</li>
	<li>Coverslip ksilen tabanlı montaj orta ile slaytlar ve koyup RT, düz bir yüzeye kadar görüntüleme için hazır kuruyuncaya kadar bırakın.       Not: 3, 3'-boyama, diaminobenzidine (DAB) gerçekleştirme slaytları RT. saklanabilir Ayirt boyama gerçekleştirilirse, ancak, slaytlar karanlıkta fotoğraf beyazlatma azaltmak için-20 ° C'de muhafaza edilmelidir.</li>
</ol>

<ol><li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2016+World+Health+Organization+Classification+of+Tumors+of+the+Central+Nervous+System%3A+a+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropatholica%22%5BJournal%5D)">The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary.</a> Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).</li>
<li>Hochberg, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+diagnostics+and+biomarkers%3A+an+ongoing+challenge+in+the+field+of+medicine+and+science%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnosis%22%5BJournal%5D)">Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science.</a> Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).</li>
<li>Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+medicine+using+DNA+biomarkers%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Personalized medicine using DNA biomarkers: a review.</a> Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).</li>
<li>Ceccarelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Profiling+Reveals+Biologically+Discrete+Subsets+and+Pathways+of+Progression+in+Diffuse+Glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma.</a> Cell. 164 (3), 550-563 (2016).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Research, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive%2C+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li>
<li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Molecular+Meta-Analysis+of+1%2C000+Pediatric+High-Grade+and+Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li>
<li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li>
<li>Ward, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Biomarkers of apoptosis.</a> British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).</li>
<li>Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((May+autophagy+be+a+novel+biomarker+and+antitumor+target+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarkers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer.</a> Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).</li>
<li>Williams, G. H., Stoeber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The cell cycle and cancer.</a> Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).</li>
<li>Preusser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki67+index+in+intracranial+ependymoma%3A+a+promising+histopathological+candidate+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker.</a> Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).</li>
<li>Trepant, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+OLIG2+as+the+most+specific+glioblastoma+stem+cell+marker+starting+from+comparative+analysis+of+data+from+similar+DNA+chip+microarray+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms.</a> Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).</li>
<li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li>
<li>Wiesner, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+induction+of+genetically+engineered+brain+tumors+in+mice+using+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA.</a> Cancer Research. 69 (2), 431-439 (2009).</li>
<li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Glioblastoma+Cell+Culture+Resource%3A+Validated+Cell+Models+Representing+All+Molecular+Subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes.</a> EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).</li>
<li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumour+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Brain tumour stem cells.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 425(2006).</li>
<li>Dirks, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+stem+cells%3A+bringing+order+to+the+chaos+of+brain+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).</li>
<li>Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma%3A+experimental+models+and+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Glioma: experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).</li>
<li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).</li>
<li>Hasselbach, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+high+grade+glioma+cell+culture+from+surgical+specimens+for+use+in+clinically+relevant+animal+models+and+3D+immunochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51088(2014).</li>
<li>Pileri, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+techniques+in+immunohistochemistry%3A+comparison+of+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods.</a> The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu makalede, hangi içinde beyin içinde in situbüyüyen tümör hücreleri karakteristik 3D yapısını korumak immünhistokimya parafin gömülü gliyom NS, gerçekleştirmek için çok yönlü ve tekrarlanabilir bir yöntem ayrıntı. Bu teknik cam veya plastik yüzeyler kaplama hücreleri kullanarak üzerinde aşağıdaki avantajları vardır: Ben) NS; 3D yapısını korunması II) protein ifade analiz önce hücre ayrılma stresinin önlenmesi; III) genetiği tümör NS, floresan spectra boyama etkinleştirme herhangi bir endojen fluorophore ifaded...

Gliomas tarafından fenotipik ve genotypic özellikleri1Dünya Sağlık Örgütü göre sınıflandırılmış merkez sinir sisteminin birincil solid tümör vardır. Bu sınıflandırma varlığı ya da yokluğu biyolojik2çekici bir kaynağı temsil sürücü mutasyonlar içermektedir. Biyolojik ölçülen ve terapötik müdahale3farmakolojik yanıtlarının yanı sıra normal ve patolojik işlemleri belirtmek için değerlendirilen biyolojik özellikleri vardır. Biyolojik tespit tümör doku ve hücreleri tümörü türetilmiş, farklı açıdan biyolojik onun karakterizasyonu etkinleştirme. Mutasyona uğramış isocitrate dehidrogenaz 1 (IDH1), bir mutant enzim daha iyi prognoz4ile ilişkili alt-sınıf gliomas karakteristik gliyom biyolojik bazı örnekler. Mutasyona uğramış IDH1 sık sık TP53 ve alfa-talasemi/mental retardasyon sendromu X'e (ATRX) ile birlikte dile getirdi-mutasyon ihracı, belirli bir gliyom tanımlama alt tür4,5. ATRX ihracı mutasyonlar da Pediatrik yüksek kalitede gliomas2,%6 44'ortaya çikmaktadir ve agresif tümörler ve genomik istikrarsızlık6,7ile ilişkili bulunmuştur. Buna ek olarak, Pediatrik diffüz içsel pontine gliomas (DIPG) bir K27M mutasyon histon H3 gen H3F3A veya HIST1H3B/C gen1,6olup göre alt gruplar farklı. Bu nedenle, alt bölümü, çalışma ve gliomas tedavisi daha daha fazla gelişimi sağlayacak ayrı varlıklar olarak Moleküler Karakterizasyonu giriş izni hedefli tedaviler her alt türü için. Buna ek olarak, biyolojik analizini apoptosis8, autophagy9, hücre döngüsü ilerleme10, hücre proliferasyonu11ve hücre farklılaşması12 gibi farklı biyolojik süreçlerin değerlendirmek için kullanılabilir .
İnsan kanser mevcut genetik lezyonlar liman genetiği hayvan modelleri hastalık ilerleme aracılık yolları sinyal çalışması için kritik önem taşımaktadır. Bizim Laboratuvar insan gliyom alt türlerinden13,14özetlemek belirli mutasyonlar yataklık gliyom genetiği fare modelleri geliştirmek için uyku Güzellik (SB) transposase sistemi hayata geçirdi. Bu genetik fare modelleri vitro çalışmalar 3D sisteminde etkinleştirmek tümör kaynaklı NS oluşturmak için kullanılır, tümör içinde in situ15' te yansıtma belirgin özellikleri mevcut. Ayrıca, NS orthotopical nakli fareler içine özelliklerini birincil tümör korumak ve karşılık gelen birincil tümörün15histopatolojik, genomik ve fenotipik özellikleri taklit ikincil tümörler oluşturabilirsiniz.
Kültür, serum-Alerjik Beyin tümör hücreleri kök hücre özellikleri ile zenginleştirilmiş ve epidermal büyüme faktörleri (EGF) ve fibroblast büyüme faktörü (FGF) huzurunda onlar NS kültürler gibi tek hücre kaynaklı koloniler olarak yetiştirilir. Kök Hücre Böl ve hücresel kümeleri oluşturur, ancak bu seçici kültür sistemi içinde en ayırt edici veya farklılaşmış hücreler hızla, ölmek. Bu tümörü tümör Özellikler16,17,18tutar bir NS kültür üretimi sağlar. Tümörü NS tümör biyolojisi, tanı, prognoz, sınıflandırma, tümör ilerleme durumunu ve hücre farklılaşma durumu da biyolojik analizi de dahil olmak üzere çeşitli yönlerini değerlendirmek için kullanılabilir. Burada, tümörü NS oluşturmak ve 3D kültürler parafin içinde kullanılmak üzere embed için bir protokol ayrıntılı IHC boyama için. Sabitleme ve tümörü NS gömme bir NS morfolojisi daha iyi hangi gliyom NS hücre ayrılma için stresli işleme tabi tutulur ve basık haline geleneksel cytospin yöntemi19' a, göre korunur üstünlüktür. Buna ek olarak, gömme genetiği tümör NS, floresan spectra boyama etkinleştirme herhangi bir endojen fluorophore ifadeden quenches. Bu yöntem genel işlem katıştırma parafin ile tümörü hücreleri 3D yapısını korumak ve karakterizasyonu tümörü neurospheres immünhistokimya kullanarak etkinleştirmek için hedeftir.

<table><tbody><tr><td>Kaplamalı mikrotom bıçağı HP35</td><td>Thermo Scientific</td><td>3150734</td><td></td></tr><tr><td>Microtome RM 2135</td><td>Leica</td><td>MR2135</td><td></td></tr><tr><td>Formalin çözeltisi, nötr tamponlu,% 10</td> <td>Sigma-aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan poliklonal anti-ATRX,</td> <td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-15408</td><td>IHC, 1:250 seyreltme</td></tr><tr><td>Tavşan poliklonal anti-Ki-67</td><td>Abcam</td><td>Ab15580</td><td>IHC, 1:1000 seyreltme</td></tr><tr><td>Tavşan poliklonal anti-OLIG2</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td>IHC, 1:500 seyreltme</td></tr><tr><td>Keçi poliklonal anti-tavşan biyotin konjuge</td><td>Dako</td><td>E0432</td><td>IHC, 1:1000 seyreltme</td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC HRP kiti</td><td>Vector Laboratories Inc</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>BETAZOID DAB KROMOJEN KITI</td><td>Biocare medikal</td><td>BDB2004 L/fiyata kadar 12/18</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Takviye Edici</td><td>Gıda ThermoFisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-27 Takviye Edici Gıda</td><td>ThermoFisher</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>Accutase&reg; Hücre Ayırma Çözeltisi</td><td>Biolegend</td><td>423201</td><td></td></tr><tr><td>AGAROSE LE</td><td>GoldBio</td><td>A-201-1000</td><td></td></tr><tr><td>Genesee Sc. Corporation</td><td>Olympus 15 ml</td><td>21-103</td><td></td></tr><tr><td>Genesee Sc. Corporation</td><td>TC-75 ile işlenmiş Flask</td><td>25-209</td><td></td></tr><tr><td>Genesee Sc. Corporation</td><td>TC-25 ile işlenmiş Flask</td><td>25-207</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330-057</td><td>NS ortamı</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GibcoTM</sup</td><td>>14175-103</td><td>dengeli tuz çözeltisi</td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>Taconic</td><td>B6-f</td><td>C57BL/6 fare</td></tr></tbody></table>

biyolojik gliyom immünhistokimya parafin gömülü 3d tümörü neurosphere kültürü üzerinde tarafından değerlendirilmesi

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Tümörü ifadede protein analizi onun patoloji çalışma çeşitli yönlerini ilgilidir. Çok sayıda protein tanı, prognoz, sınıflandırma, tümör ilerleme durumunu ve hücre farklılaşması devlet uygulamaları ile biyolojik olarak tarif edilmiştir. Bu biyolojik analizleri de tümörü hasta ve tümörü modelleri üretilen tümör neurospheres (NS) karakterize etmek kullanışlıdır. Tümör NS hangi onlar türetilmiştir ve daha doğru olabilir ayna gliyom biyoloji tümör farklı özelliklerini değerlendirmek için değerli vitro modeli sağlar. Burada biz biyolojik tümör NS içinde analiz etmek için ayrıntılı bir yöntem tarif parafin gömülü tümörle NS immünhistokimya (IHC) kullanarak.

Değer biçmek Eğer tümör NS üretmek için gereken boyuta ulaştı ve tümör gelişimi izlemek için bioluminescence kullanarak tümör tarafından yayılan ışıma analiz ettik. Bu luciferase (Şekil 1A ve 1B) ışıldama sinyal ile iletim verimliliği pups ve tümör ilerleme çalışma sağlar. 1 x 107 fotonlar/s/cm2/sr (Şekil 1B) bir sinyal tümör boyutu eriştiği zaman, beyin NS üretimi içi...

3D kültürler yetiştirilen Neurospheres tümörü biyoloji eğitim için güçlü bir araç oluşturur. Burada parafin katıştırma üzerinden tümörü neurospheres 3D yapısını koruyarak immünhistokimya gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem, tümörü neurosphere özellikleri stemness ve sinirsel farklılaşma gibi karakterizasyonu sağlar.

Biyolojik gliyom immünhistokimya parafin gömülü 3D tümörü Neurosphere kültürü üzerinde tarafından değerlendirilmesi

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Tümör nörosferlerinin 3Boyutlu yapısını koruyan bir yöntemle glioma biyomarkervarlığını incelemek için kullanılabilir, çünkü bu protokol önemlidir. Bu protokolün en büyük avantajı, hücrelerin stresli manipülasyona maruz kaldığı ve düzleştirildiği sitospin yöntemine göre nörosferlerin morfolojisinin korunmasıdır. Bu yöntem, hücrelerin 3Boyutlu olarak kültürlendiği diğer doku kültürü sistemlerine uygulanabilir ve yapının bakımı önemlidir.Başlamak için, bir T-25 şişesinde kültür tümör nörosferler veya NS hücreleri confluent kadar. 15 mililitrelik konik tüpte tümör NS'i seçin. NS'i 300 Gs'ye beş dakika lığına itin.Bundan sonra, peletin mililitresini %10 formalin olarak yeniden askıya alın ve tüpü oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Yeniden askıya alınan NS'ye beş mililitre HBSS ekleyin. Daha önce açıklandığı gibi hücreleri impellet. Pelet içeren tüpü buz üzerine yerleştirin.Yıkanmış NS peletini %2'lik ılık sıvı agarose'un 500 mikrolitresinde yeniden askıya alın. Ve nazik bir pipetleme veya karıştırarak karıştırın. Agarose polimerize olana kadar buz üzerinde agarose gömülü NS yerleştirin.Sonra ns tutarak, agarose parçası çıkarın. Doku işleme için bir kaset içine agarose parças

evaluation-biomarkers-glioma-immunohistochemistry-on-paraffin

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu video protokolü neurosphere tahlil kültürü yöntemi kullanılarak insan glioblastoma mutliforme cerrahi rezeksiyon (GBM) tümör dokusu hücreleri gibi izolasyon ve kök genişlemesi göstermektedir.

Neurosphere Testi İnsan Glioblastoma Multiforme Tümör Hücreleri İzolasyon ve Genişleme

Kaynak: Núñez, F. J.,  et al. Parafin Gömülü 3D Glioma Nörosfer Kültürlerinde İmmünohistokimya ile Gliomdaki Biyobelirteçlerin Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2019). Bu video, parafine gömülü beyin tümörü nörosferlerinde tümör biyobelirteçlerini etiketlemek için immünohistokimyasal bir tekniği göstermektedir. Nörosfer bölümleri parafin uzaklaştırma ve rehidrasyona tabi tutulur, ardından biyobelirteç bölgelerini ortaya çıkarmak için tedavi uygulanır. Birincil ve ikincil antikorlar daha sonra bu...

Beyin Tümörü Nörosfer Kesitlerinde Biyobelirteçlerin İmmünohistokimyasal Boyanması

Kanser kök hücre fenotipi olan hücreler için seçmek üzere serumsuz nörosfer ortamında ayrışmış yüksek dereceli glioma cerrahi örneklerinin yayılması için protokol. Nörosfer olarak yetişemeyen örnekler için alternatif bir protokol önerilmiştir. İmmünostokimya için 3D nörosfer mimarisini korumak için bir parafin gömme tekniği tanımlanmıştır.

Klinik Olarak İlgili Hayvan Modellerinde ve 3D İmmün entrikalarda Kullanılmak Üzere Cerrahi Örneklerden Yüksek Dereceli Glioma Hücre Kültürünün Optimizasyonu

Bu protokol, kromojenik immünhistokimya ve ImageJ kullanılarak glioblastoma hasta rezeksiyonlarında tümör mikro çevre bileşenlerini nicel olarak tanımlamak için geliştirildi.

Hasta Glioblastoma Rezeksiyonlarında Hücresel Mikro Çevrenin Kantitatif İmmünohistokimyası

Burada gerçek zamanlı olarak insan glioma hücre (hGC) göç çalışması için eski vivo karışık monolayer kültür sistemi saiyoruz. Bu model, hGC'ler ile hem miyelinli hem de miyeline olmayan aksonlar arasındaki etkileşimleri bölümlere ayrılmış bir oda içinde gözlemleme olanağı sağlar.

Dorsal Kök Ganglion Akson-Oligodendrocyte Co-Kültürler İnsan Glioma Hücre Göç Gerçek Zamanlı İzleme

Lazer mikrodisesi ( LMD) glioma heterojenite ve invazyon aracılık yolları ortaya çıkarmak için kullanılabilecek hassas ve son derece tekrarlanabilir bir tekniktir. Burada lazer LMD kullanarak glioma dokusundan ayrık alanları izole etmek ve ardından transkripsiyonanalizi yapmak için optimize edilmiş bir protokol tanımlıyoruz.

İntratümöral Heterojenite, Oncostreams ve Invasion'ın Mekansal ve Moleküler Karakterizasyonu için Glioma Alt Bölgelerinin Lazer Yakalama Mikrodizması

Burada glioblastoma için kullanımı kolay bir istila çıktısını tanımlıyoruz. Bu töz glioblastoma kök benzeri hücreler için uygundur. İstilanın, göçün ve çoğalmanın kolay ölçülmesi için bir Fiji makrosu da tanımlanmıştır.

Glioblastoma için 3D Spheroid Model

Burada, üç boyutlu (3D) glioma sferoidlerini ve hücre dışı akı analizi yoluyla görüntülemeye dayalı normalizasyonu entegre eden bir metabolik profilleme platformu oluşturuyoruz. Bu yaklaşım, ilaç tedavilerine tümör metabolik yanıtlarının daha doğru değerlendirilmesini sağlar ve potansiyel direnç mekanizmaları hakkında bilgi sağlar.

İlaç Taraması için Üç Boyutlu Beyin Tümörü Sferoidlerinin Metabolik Profillemesindeki Gelişmeler

Yeni teşhis edilen ve tekrarlayan tümörlerden üretilen hastadan türetilen manyetik gliomakürleri kullanarak 3D glioblastoma göç modeli sunuyoruz. Bu platform, hastaya özgü göç dinamiklerinin görselleştirilmesine ve terapötik etkinliğin değerlendirilmesine olanak tanır. Test, protein lokalizasyonu ve ifade desenlerini değerlendirmek için göç sonrası çoklu eklenebilir.

Hipoksik Koşullarda Manyetik Nanopartikül Aracılı Sferoid Lokalizasyon ile Tekrarlanabilir 3D Glioblastoma Göç Testi

Bu protokol, bir hastada elde edilen hücre kültürü modelleri ya da tümör ve mikro-hücrelerinin doğrudan karakterizasyonu kurulması için ölüm sonrası yaygın iç pontin glioma örnekleri hızlı işlem için bir yöntem tarif eder.

Diffüz İçsel Pontine Glioma Hızlı post-mortem Hücre Kültürü için Protokol (DIPG)

Öğrenin, parafin gömülü immünhistokimya yöntemiyle tümör nörosferlerinin 3D yapısını koruyarak gliyom biyobelirteçlerini nasıl analiz edeceğinizi. Bu protokol, hücre morfolojisini koruyarak kanser araştırmalarında doğru sonuçlar sağlar.

Biyolojik gliyom immünhistokimya parafin gömülü 3D tümörü Neurosphere kültürü üzerinde tarafından değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet