Name: Floresan peptid Zymography tarafından proteaz aktivitesinin algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Öğrenin, floresan peptit zimografi ile proteaz aktivitesini nasıl tespit edeceğinizi. Bu modüler yöntem, biyomalzeme araştırmalarında ve doku mühendisliğinde geniş bir proteaz yelpazesini algılamanızı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansman Ohio Devlet Üniversitesi kolej Mühendisliği, Biyomedikal Mühendisliği Bölümü ve kapsamlı Kanser Merkezi - Arthur G. James Kanser Hastanesi ve Richard J. Solove Araştırma Enstitüsü tarafından sağlanmıştır.

1. çözme jel katman hazırlanması
<ol><li>Jel çözüm Tablo 1göre çözme bir % 10 polyacrylamide hazırlayın. Tetramethylethylenediamine (TEMED) ve amonyum Persülfat (APS) onların ek polimerizasyon reaksiyonu başlatır gibi hemen jel dökme önce ekleyin.</li>
	<li>Bir boş 1.5 mm mini jel kaset yarı yolda (5 mL) % 10 çözme jel çözüm ile doldurun.</li>
	<li>Bir düzey jel üretmek ve kabarcıklar önlemek için polyacrylamide jel üstüne ince bir tabaka halinde isopropanol (~ 500 µL) ekleyin. Artık polyacrylamide çözüm polimerizasyon reaksiyonu ilerlemesini izlemek için kullanın. Ne zaman tüp içinde polyacrylamide tamamen katılaşmış, tam (~ 40 dk) tepkidir.</li>
</ol>2. Azido-PEG3-maleimide bağlayıcı molekül hazırlanması
<ol><li>İlk çözme jel katman polymerizing, azido-PEG3-maleimide seti-20 ° C depolama--dan almak ve oda sıcaklığında ulaşmak bileşenleri sağlar. Her kit içinde iki bileşeni vardır. Şişe 1 maleimide-NHS ester, bir off-beyaz gri katı için içerir. Şişe 2 azido-PEG3-Amin, biraz sarı yağ içerir. Not: Yazarlar yalnızca kısa bir süre (1-2 saat) için saklanabilir gibi 25 mg azido-PEG3-maleimide kiti kullanmanızı-20 ° C'de aşağılamak başlamadan önce sonra hazırlıklı olmak öneririz. 25 mg 10 peptid jelleri üretmek yeterli olur. Jelleri hazırlık 3 hafta içinde kullanın.</li>
	<li>Şişe 2 bileşenlerinde hacmi dimetil sülfoksit (DMSO) ve 30 için girdap tavsiye üreticisi dağıtılması sıvılar sağlamak için s-var karışık şey.</li>
	<li>Şişe 1 içeriği bir heyecan çubuğunu içeren bir temiz, Kuru 100 mL yuvarlak alt şişesi aktarın. Not: şişeye aseton ile durulayın ve nem ile reaksiyonu engellemesini önlemek için kullanım önce kurumasını.</li>
	<li>Hemen bir kauçuk septum tıpa şırıngayla balonun ağız içine delinmiş bir diyafram ile ekleyin. Hızlı nem şişeye girmesini önlemek için çalışın.</li>
	<li>Ekle iki 18 gauge iğne diyafram şırınga ve bir asal gaz tankı (Örneğin argon gazı) birine bağlayın. 3 dk. Mix şişeye doldurmak için asal gaz tüpleri 1 ve 2 inert gaz altında istenmeyen reaksiyon ürünleri önlemek için bileşenleri sağlar. Dikkat: İkinci şırınga iğne böylece inert gaz ile doldurur gibi dışarı şişeye akmaya balonun içindeki atmosferik hava izin veren bir havalandırma sağlamaktır. Havalandırma iğne eklemeyi unutmayın!</li>
	<li>İnert gaz kapalı kapa ve iğneden bağlantısını kesin. Bir Ģırınga kullanarak, şişe 2 tam içeriğini balonun enjekte.</li>
	<li>İğne ve şırınga kaldırmak ve karıştırma sırasında oda sıcaklığında 30 dakika karıştırmak bileşenleri sağlar.</li>
	<li>Ve içeriği bir temiz 5 mL santrifüj tüpü transfer kauçuk septum tıpa çıkarın. Azido-PEG3-maleimide çözüm oda sıcaklığında 1 saat içinde kullanılmalıdır.</li>
</ol>3. jel katman çözme peptid hazırlanması
<ol><li>Sonra ilk çözme jel katman polimerli, isopropanol katman dökün. Pipetting 1 mL deiyonize su üstünde jel tarafından jel üst durulama ve sonra suyu dökün.</li>
	<li>-80 ° C depodan thiol functionalized floresan peptid almak ve oda sıcaklığında erimek izin. Not: Thiol functionalized peptid11,12daha önce açıklandığı gibi hazır olun. Piyasada bulunan peptidler de kullanılabilir ama maleimide thiol etkinleştirmek için terminal sistein kalıntıları eklenmesi tıklatın tepki gerektirir. 10 mM bir hisse senedi konsantrasyon için peptid erimesi ve tekrar tekrar donma-çözülme çevrimleri sınırlamak için küçük (30 uL) aliquots içinde-80 ° C'de saklayın.</li>
	<li>% 10 azido-PEG3-maleimide bağlayıcı molekül ve Tablo 1göre floresan peptid içeren jel çözüm çözme hazırlayın. TEMED ve APS onların ek polimerizasyon reaksiyonu başlatır gibi hemen jel dökme önce ekleyin.</li>
	<li>Jel kaset (3 mL) kalan bölümünün yarısını jel çözüm çözme peptid ile doldurun. Not: Bir çok katmanlı çözme jel yaklaşım peptid ve bağlayıcı her jel için gerekli miktarını azaltır. Peptid çözme jel katman boyutunu gerektiği gibi moleküler ağırlık daha büyük bir dizi karşılamak için ayarlanabilir.</li>
	<li>İsopropanol (~ 500 µL) ince bir tabaka polyacrylamide düzey bir jel üretmek ve kabarcıklar önlemek için jel tepesine pipette. Artık polyacrylamide çözüm polimerizasyon reaksiyonu ilerlemesini izlemek için kullanın. Ne zaman tüp içinde polyacrylamide tamamen katılaşmış, tam (~ 40 dk) tepkidir. Not: Floresan peptid ışığa duyarlı olduğunu. Photobleaching jel hazırlık, Elektroforez, çamaşır ve geliştirme sırasında önlemek için alüminyum folyo ile kaplı jelleri tutun.</li>
	<li>İsopropanol katman dökün ve jel gibi adım 3.1 deiyonize su ile çözme peptid üst durulayın.</li>
	<li>Adım 4'e jelleri hemen, kullanmaya devam ederseniz, aksi takdirde, 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) jeller kurumasını önlemek için plastik bir kutu içinde 4 ° C'de x 100 ml hazırlanmış jelleri bırakın. Photobleaching önlemek için alüminyum folyo kutusunda sarın. Jelleri PBS içinde 3 hafta kadar önce kullanım için saklanır.</li>
</ol>4. yığın jel hazırlanması
<ol><li>Bir % 5 yığın jel çözüm Tablo 1göre hazırlayın. TEMED ve APS onların ek polimerizasyon reaksiyonu başlatır gibi hemen jel dökme önce ekleyin.</li>
	<li>Jel kaset (~ 2 mL) boş kalan kısmı yığın jel çözüm ile doldurun.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde bir 1.5 mm jel tarak hava kabarcığı yok wells altında sıkışıp kalır emin yığın jel katmanına yerleştirin. Artık polyacrylamide çözüm polimerizasyon reaksiyonu ilerlemesini izlemek için kullanın. Ne zaman tüp içinde polyacrylamide tamamen katılaşmış, tam (~ 10 dk) tepkidir.</li>
	<li>Yavaşça tarak ve kaseti jel kaset arkasından çıkarın.</li>
</ol>5. Elektroforez için biyolojik örnek hazırlanması
<ol><li>Klimalı hücre medya, hücre lysates, doku homogenates ve MMP standartları başka bir yerde sigara azaltarak koşulları2altında açıklandığı şekilde hazırlayın. Örnekleri ısı değil.</li>
	<li>Örneğin, aşağıdaki gibi şartına hücre medya hazırlayın:<ol>
<li>Plaka 40.000 hücreleri/cm2 hücrelerin % 10 fetal Sığır serum (FBS) Kültür medya bir 6-şey plaka. Hücrelere oksijen odası (%5 CO2 37 ° C'de) için 24 saat kuluçkaya ve % 70-80 izdiham ulaşmak izin. Not: hücreleri istenilen confluency 24 saat sonra ulaşılmış, ek bir 24 saat boyunca % 10 FBS kültür medyada büyümeye izin.</li>
		<li>PBS iki kez hücrelerle yıkama ve 2 mL serum serbest Kültür medya ekleyin. Oksijen odası (%5 CO2 37 ° C'de) hücrelerde için ek bir 24 saat kuluçkaya.</li>
		<li>Serolojik pipet kullanarak, klimalı ortam her kuyudan toplamak. Herhangi bir hücre artıkları kaldırmak 3 dakika için 1200 rpm'de medya santrifüj kapasitesi. Süpernatant al ve kullanarak 15 mL, 10 kDa molekül ağırlığı kesme santrifüj filtre ünitesi konsantre ol. 4000 x g sallanan bir kova Open End 15 dakika veya 15 dakika içinde bir sabit açılı rotor 5000 x g filtre daxilində santrifüj kapasitesi. Not: Bu adım isteğe bağlıdır ancak peptid zymography jeller proteolitik bantlarında şiddetini artırabilir.</li>
		<li>Konsantre filtrate taze 1,5 mL santrifüj tüpü aktarın. Aliquot ve mağaza örnekleri-80 ° c ilâ üç donma-çözülme döngüsü.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Protein içeriği bir standart protein miktar tahlil kullanarak ölçmek (Örneğin BCA, Bradford tahlil, vb).</li>
</ol>6. biyolojik Elektroforez peptid Zymography jeller örnekleri
<ol><li>Geleneksel zymography örnek arabellek örneklerinde dağıtılması (62,5 mM Tris-HCl, pH 6.8, % 25 gliserol, % 4 SDS, %0.01 bromophenol mavi). Hücre ve doku örnekleri için ~ 30 µg iyi başına toplam protein tavsiye edilir ve 50-100 ng protein MMP standartları için.</li>
	<li>1 400 mL ekleyin jel aparatı Tris-glisin SDS çalıştıran arabelleğe x. Örnek iyi başına 35 µL yükleyin. 1,5 saat ya da moleküler ağırlık standartları faiz proteaz (görünür bir portakal rengi olan) jel katman çözme peptid içinde olduğunu belirtecek kadar 120 V 4 ° C'de örnekleri çalıştırmak. Not: Çoğu MMPs ve onların türevleri 35-100 kDa aralığı içinde düşer. Moleküler Ağırlık standartlarını o ağırlıkları jel katman çözme peptid içinde olduğunu belirttiğinizde, Elektroforez durdurulabilir. Aynı prensip diğer sınıfların proteaz bilinen moleküler ağırlıkları ile uygulanabilir. Moleküler ağırlık daha büyük bir dizi üzerinde birden fazla proteaz algılama bir ilgi ise, çözme jel katman boyutunu ve peptid çözme jel katman boyutunu artırın.</li>
	<li>Elektroforez, jelleri Plastik kaset kaldırmak ve nazik ajitasyon %2.5 Triton X-100, 1 µM ZnCl2ve 5 mM CaCl2 50 mM'içeren renaturing tampon altında oda sıcaklığında jelleri 10 min için üç kez yıkamak Tris-HCl, pH 7.5.</li>
	<li>Transfer % 1'i içeren gelişmekte olan bir arabellek çözüm Triton X-100, 1 µM ZnCl2 jelleri ve 5 mM CaCl2 . 50 mM Tris-HCl, taze geliştirme ile pH 7.5 15 dk. eski yerine koymak için çözüm tampon ve jelleri 24 saat nazik ajitasyon altında 37 ° C'de kuluçkaya , jelleri tam çözümde örtülü emin olmak istedim.</li>
</ol>7. görüntüleme peptid Zymography jelleri
<ol><li>24 saat sonra tarayıcı/Imager uygun uyarma ve emisyon filtreleri kullanarak bir floresan kullanarak görüntü jelleri jel. Örneğin, temsilcisi sonuçlarında gösterilen peptid jelleri floresein ile Birleşik ve 488 bir uyarma filtre kullanarak yansıma nm ve bir emisyon filtresi 521 nm. Senin fluorophore için uygun filtreler kullanarak proteolitik aktivite tespiti en üst düzeye çıkarır. Not: Görüntüleri de DNA jelleri etidyum bromür ile lekeli görüntüleme için sık kullanılan bir UV transilluminator ile donatılmış bir jel Imager ile alınabilir. UV transilluminator kullanarak jelleri görüntü (365 nm) ayarı ve bir emisyon filtre 590 nm.</li>
	<li>Başka bir yerde13açıklandığı gibi ImageJ kullanarak bant yoğunluklarını densitometric değerlendirme yapmak.</li>
</ol>

<ol><li>Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymography+methods+for+visualizing+hydrolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes.</a> Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).</li>
<li>Toth, M., Fridman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Gelatinases+%28MMP-2+and+MMP-9%29+by+Gelatin+Zymography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography.</a> Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).</li>
<li>Heussen, C., Dowdle, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+analysis+of+plasminogen+activators+in+polyacrylamide+gels+containing+sodium+dodecyl+sulfate+and+copolymerized+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates.</a> Analytical Biochemistry. 102 (1), 196-202 (1980).</li>
<li>Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+zymography+as+a+sensitive+and+specific+technique+for+the+determination+of+subpicogram+levels+of+interstitial+collagenase%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase.</a> Analytical Biochemistry. 255 (2), 211-216 (1998).</li>
<li>Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+collagen+zymography+approach+for+evaluating+the+collagenases+MMP-1%2C+MMP-8%2C+and+MMP-13%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13.</a> BioTechniques. 63 (4), 174-180 (2017).</li>
<li>Perera, H. K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Aspartic+Proteinase+Activities+Using+Gel+Zymography%5BTitle%5D)+AND+%22Zymography%22%5BJournal%5D)">Detection of Aspartic Proteinase Activities Using Gel Zymography.</a> Zymography. , 43-52 (2017).</li>
<li>van Beurden, P. A. M. S. noek-, Vonden Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymographic+techniques+for+the+analysis+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> BioTechniques. 38 (1), 73-83 (2005).</li>
<li>Oliver, G. W., Stetler-Stevenson, W. G., Kleiner, D. E., Zymography, Zymography, Casein Zymography, and Reverse Zymography: Activity Assays for Proteases and their Inhibitors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOliver%2C+GW+%22Proteolytic+Enzymes.+Springer+Lab+Manual%22">Proteolytic Enzymes. Springer Lab Manual</a>. , Springer. Berlin, Heidelberg. 63-76 (1999).</li>
<li>Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+proteolytic+activity+by+covalent+tethering+of+fluorogenic+substrates+in+zymogram+gels%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels.</a> BioTechniques. 64 (5), 203-210 (2018).</li>
<li>Yasothornsrikul, S., Hook, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+proteolytic+activity+by+fluorescent+zymogram+in-gel+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Detection of proteolytic activity by fluorescent zymogram in-gel assays.</a> BioTechniques. 28 (6), 1172-1173 (2000).</li>
<li>Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+matrix+metalloproteinase+activity+in+3D+cellular+microenvironments+using+a+fluorogenic+peptide+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate.</a> Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).</li>
<li>Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+bioscaffolds+for+3D+culture+of+melanoma+cells+reveal+increased+MMP+activity+and+migration+with+BRAF+kinase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).</li>
<li>Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymography+as+a+Research+Tool+in+the+Study+of+Matrix+Metalloproteinase+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors.</a> Methods in Molecular Biology. 1626, Clifton, N.J. 79-102 (2017).</li>
<li>Nagase, H., Fields, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+matrix+metalloproteinase+specificity+studies+using+collagen+sequence-based+synthetic+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide.</a> Biopolymers. 40 (4), 399-416 (1996).</li>
<li>Mucha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Type-1+Matrix+Metalloprotease+and+Stromelysin-3+Cleave+More+Efficiently+Synthetic+Substrates+Containing+Unusual+Amino+Acids+in+Their+P1%E2%80%B2+Positions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).</li>
<li>Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -L., Gatti, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-+and+two-dimensional+SDS-PAGE+zymography+with+quenched+fluorogenic+substrates+provides+identification+of+biological+fluid+proteases+by+direct+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 375 (2), 382-384 (2008).</li>
<li>Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+mass+spectrometric+characterization+of+proteases+and+inhibitors+in+human+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics.+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva.</a> Proteomics. Clinical Applications. 3 (7), 810-820 (2009).</li>
<li>Yu, W., Woessner, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin-Enhanced+Zymographic+Detection+of+Matrilysin+and+Collagenases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases.</a> Analytical Biochemistry. 293 (1), 38-42 (2001).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Geçerli zymographic teknikleri yerel yüzeylerde birleşme polyacrylamide jeller proteolizis tespiti için içine güveniyor. Bu teknikler yaygın kullanımı topladı sahip iken, onlar-ebilmek bulmak proteaz sayısında hala sınırlıdır. Burada, bir protokol hangi floresan, proteaz parçalanabilir peptidler jel çözme polyacrylamide dahil edilmiştir tanımlanmıştır. Kovalent kullanarak kaplin bir azido-PEG3-maleimide bağlayıcı molekül ayrılık ve proteaz daha çok tespiti ile yerel yüzeylerde Şu anda ulaşılabilir olduğunu daha sağlar. F...

Jel zymography biyolojik örnekleri, vücut sıvıları veya hücre kültür medya1,2,3gibi içinde proteolitik aktivite ölçmek için kullanılan biyolojik bir tekniktir. Örnekleri onların moleküler ağırlıkları aracılığıyla parçalanabilir bir substrat ile gömülü bir polyacrylamide jel elektroforez ile ayrılır. Jelatin, kazein, kolajen ve elastin, matriks metalloproteinazların (MMPs) -1, -2, -3 -7 -8, -9 ve cathepsins1,2 çeşitli ek -11 etkinliğini ölçmek için kullanılan ortak parçalanabilir yüzeylerde dahil , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. sonra Elektroforez, enzim renatured vardır ve jel içinde protein düşmesine izin. Geleneksel jel zymography, jel Coomassie mavi gibi bir protein boya lekeli ve proteaz aktivitesi Yani, beyaz şeritler (protein yıkımı) koyu mavi zemin üzerine sinyal, bir kaybı algılanır.
Burada, jel zymography parçalanabilir substrat kısa bir fluorogenic peptid kovalent polyacrylamide jel (Şekil 1) dahil olduğu, alternatif bir yöntem için bir protokol açıklayın. Sentetik peptidler ikame olarak parçalanabilir yüzeylerde proteaz geleneksel jel zymography yerli protein9ile karşılaştırıldığında daha geniş olarak algılanmasını sağlar. Fluorogenic peptid kovalent bağ peptid difüzyon ve geçiş sırasında jel elektroforez ile önceki yöntemleri9,10gözlenen engeller. Ayrıca, bir fluorogenic substrat kullanımı ek boyama ve de-boyama adımları proteaz aktivitesinin doğrudan algılama sağlar. Bu yöntem genel amacı fluorogenic peptidler zymogram jeller, kovalent Incorporation aracılığıyla biyolojik örneklerde proteaz aktivitesinin algılama olduğunu.

<table><tbody><tr><td>1,5 mm Boş Jel Kasetleri</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC2015</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mm, 10 kuyulu Boş Jel Kaset Tarakları</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC3510</td><td></td></tr><tr><td>1x Fosfat Tamponlu Tuzlu</td><td>Su Fisher Scientific</td><td>10-010-049</td><td></td></tr><tr><td>%20 SDS Çözeltisi</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>3x Zymography Örnek Tamponu</td><td>Bio-Rad</td><td>1610764</td><td></td></tr><tr><td>%40 (a/h) Akrilamid/Bis (19:1)</td><td>Ambion</td><td>AM9022</td><td></td></tr><tr><td>6 Kuyulu Doku Kültürü</td><td>Plakaları ThermoFisher Scientific</td><td>087721B</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-2 Santrifüj Filtre Ünitesi (10 kDa MWCO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC201024</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Persülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Azido-PEG3-Maleimid Kiti</td><td>Kimyaya Tıklayın Araçlar</td><td>AZ107</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP510100</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416P</td><td></td></tr><tr><td>Mikro BCA Protein Test Kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>N N N 'N' -Tetrametiletilendiamin (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Temel Güç Kaynağı</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Çift Renk Standardı</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide Hipodermik İğneler</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak Tabanlı Şişe (100 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-873-144</td><td></td></tr><tr><td>Septum Kauçuk Tıpa</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-872-546</td><td></td></tr><tr><td>Steril Kayma Uçlu Şırınga (1 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hidroklroidi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9410 Moleküler Görüntüleyici</td><td>GE Amersham</td><td>8149-30-9410</td><td></td></tr><tr><td>Çinko Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>208086</tr></tbody></table>

floresan peptid zymography tarafından proteaz aktivitesinin algılama

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

Bu yöntemin amacı karmaşık biyolojik örneklerin proteolitik aktivite ölçmek etmektir. Örnekleri moleküler ağırlık kullanarak Elektroforez ile parçalanabilir bir substrat gömülü bir çözme jel ile ayrılır. Bu yöntem bir yüzeyi fluorogenic peptid kovalent jelatin veya kazein gibi tam uzunlukta proteinler yerine çözme jel içine dahil geleneksel jel zymography farklıdır. Fluorogenic peptidler proteolitik aktivite ek boyama adımları olmadan doğrudan algılama sağlar. Biyolojik örnekler içinde enzimler floresans içinde bir artış kaynaklanan çeliklerini fluorogenic peptid ayırmak. Jelleri floresan sinyalin sonra Standart Floresan jel tarayıcıyla görüntüsü ve Dansitometresi kullanarak sayılabilir. Parçalanabilir substrat olarak peptidler kullanımı büyük ölçüde zymographic teknikleri ile tespit mümkün proteaz genişletir.

Burada açıklanan yöntemi kullanarak, iki floresan proteaz parçalanabilir peptidler polyacrylamide jeller dahil edilmiştir: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (metin ve resimler QGIW kısaltılır) ve GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (metin ve resimler LACW kısaltılır). ↓ dekolte sitesi gösterir. QGIW olan bir kollajen-hücresel collagenases14algılamak için tasarlanmış sıra türetilmiş. LACW MMP-14 ve MMP-1115tespiti için optimize edilmi...

Burada, floresan peptidler yerli protein yerine parçalanabilir substrat olarak kullanıldığı bir değiştirilmiş zymographic teknik için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Elektroforez floresan peptid zymograms Biyolojik örneklerin daha önceki zymographic teknikleri geniş proteaz tespiti sağlar.

Floresan peptid Zymography tarafından proteaz aktivitesinin algılama

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Mevcut zimografik teknikler proteazsınırlı sayıda tespit. Floresan peptid zimografide floresan peptidler daha geniş bir proteoz aralığının ölçülmesini sağlayan bozunabilir substrat olarak kullanılır. Bu yöntemin en büyük avantajı modüler tasarımıdır.Floresan peptid dizisi hangi proteazların tespit edilip tespit edilgenolduğunu belirler ve floresan peptid kolayca farklı bir dizinin peptidi ile değiştirilebilir, diğer proteazlar tespit etmek için bir yetenek. Bu teknik, peptidlerin ilaç dağıtımı veya doku mühendisliği uygulamaları gibi mühendislik biyomalzemelerde bozunabilir çapraz bağlayıcılar olarak kullanılmasının tasarımını bilgilendirmeye yardımcı olabilir. Bu peptidin bu teknikle birleştirilmesi, biyomalzeme bozulmasından sorumlu doku salgılanan proteazları belirleyebilir.Bu tekniğin gösterilmesi, diğer zimografi tekniklerine göre benzersiz olan çok katmanlı yaklaşımı görselleştirmek için önemlidir. Bu tekniği gösteren, Ameya Deshmukh, benim laboratuvar bir yüksek lisans öğrencisi olacaktır. Başlamak için, metin protokolütabloda belirtildiği gibi% 10 poliakrilamid çözme jel çözüm ünü hazırlamak.Jeli dökmeden hemen önce TEMED ve APS'yi ekleyin. Daha sonra, 1,5 milimetrelik mini jel kaseti çözücü jel çözeltisi ile yarıya kadar doldurun ve boşaltın. Bir seviye jel üretmek ve kabarcıklar önlemek için poliakrilamid jel üstüne izopropanol ince bir tabaka ekleyin.Polimerizasyon reaksiyonunun ilerlemesini izlemek için artık poliakrilamid çözeltisini kullanın. Tüpteki poliakrilamid tamamen katılaştırDığında reaksiyon tamamlanır. İlk çözücü jel tabakası polimerize olurken, Azido-PEG3-Maleimide kitini 20 santigrat dereceden depodan alın ve bileşenlerin oda sıcaklığına ulaşmasını bekleyin.Daha sonra, üretici dmso önerilen hacmi şişe iki bileşenleri eritin. Ve sıvıların iyice karışmasını sağlamak için 30 saniye boyunca girdap. Şişe bir içeriğini temiz, kuru 100 milileter yuvarlak alt şişe içine bir karıştırma çubuğu içeren aktarın.Hemen şişenin ağzına bir şırınga ile delinebilir bir diyafram ile kauçuk septum stoper takın. Sonra, diyafram içine iki 18-gauge şırınga iğnesi takın. Şırınga iğnelerinden birini inert bir gaz tankına bağlayın ve gazın yuvarlak alt şişeyi üç dakika boyunca doldurmasına izin verin.Sonra, inert gazı kapatın ve iğneden ayırın. Bir şırınga kullanarak, şişe iki tam içeriğini şişe içine enjekte. İğneleri ve şırıngayı da çıkarın.Karıştırma sırasında oda sıcaklığında 30 dakika karıştırmak için bileşenleri bekleyin. Bundan sonra kauçuk septum durdurucu çıkarın ve temiz bir beş mililitre centrifuge tüp içeriğini aktarın. Bir kez ilk çözücü jel tabakası polimerize vardır izopropanol tabakası dökün.Jel üstüne de-iyonize su bir mililitre Pipet ve sonra jel durulamak için su dökün. 80 santigrat derecede depolama dan tiyol fonksiyonel floresan peptid alın. Oda sıcaklığında erimesine izin verin.Metin protokolünün birinci tablosunda belirtildiği gibi Azido-PEG3-Maleimide bağlayıcı molekülü ve floresan peptid içeren %10'luk bir çözüm lüzumlu bir jel çözeltisi hazırlayın. Jeli dökmeden hemen önce TMED ve APS ekleyin. Daha sonra, jel kasetin kalan kısmının yarısını peptit çözümlü jel çözeltisi ile doldurun.Bir seviye jel üretmek ve kabarcıklar önlemek için poliakrilamid jel üstüne izopropanol ince bir tabaka ekleyin. Polimerizasyon reaksiyonunun ilerlemesini izlemek için artık poliakrilamid çözeltisini kullanın. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, izopropanol tabakası dökün.Jel üstüne de-iyonize su bir mililitre Pipet ve sonra jel durulamak için su dökün. Jelleri hemen kullanmıyorsanız, 100 mililitre 1x PBS ile dolu plastik bir kutuya daldırarak saklayın. Fotobeyaztma önlemek için alüminyum folyo kutuyu sarın.İlk olarak, metin protokolütabloda özetlenen% 5 istifleme jel çözüm ünü hazırlayın. Jeli dökmeden hemen önce TMED ve APS ekleyin. Jel kasetin kalan boş kısmını istifleme jeli çözeltisi ile doldurun.Hızlı bir şekilde istifleme jel tabakası içine bir 1.5 milimetrelik jel tarak tarak eklemek hiçbir kabarcıklar kuyuların altında sıkışıp kalmasını sağlamak. Polimerizasyon reaksiyonunun ilerlemesini izlemek için artık poliakrilamid çözeltisini kullanın. Reaksiyon tamamlandığında, tarak ve bandı jel kasetin inarkasından yavaşça çıkarın.Başlamak için, geleneksel zimografi örnek tampon örnekleri çözün. Jel cihaza tampon çalışan 400 mililitre os 1X tris glis glis sds ekleyin. Kuyu başına 35 mikrolitreye kadar numune yükleyin.Numuneleri 1,5 saat boyunca veya molekül ağırlığı standartları, ilgi proteazlarının peptid çözme jel tabakası içinde olduğunu gösterene kadar dört santigrat derecede 120 voltta çalıştırın. Bundan sonra, plastik kaset jelleri çıkarın. Jelleri oda sıcaklığında hafif ajitasyon altında yeniden olgunlaşma tamponu içinde üç kez yıkayın.Her yıkama ile, 10 dakika sürer. Jelleri 15 dakika boyunca gelişmekte olan bir tampon çözeltisine aktarın. Daha sonra 24 saat boyunca nazik ajitasyon altında 37 santigrat derecede taze gelişen tampon ve kuluçka ile çözüm değiştirin.Bundan sonra, jelleri görüntülemek için uygun uyarma ve emisyon filtreleri ile bir floresan jel tarayıcı görüntüleyici kullanın. Floresan proteaz bozunabilir peptidler için bu çalışmada poliakrilamid jeller dahil edilmiştir. QGIW hücresel kollagenezi tespit etmek için tasarlanmış bir kollajen bir türemiş dizi, LACW MMP-14 ve MMP-11 tespiti için optimize edilmiş bir dizi ise.Floresan görüntüleme LACW peptid jelleri içinde çok sayıda bantları ortaya koymaktadır, QGIW jelleri sadece tek bir bant görülür iken. Jelatin zimografi ile karşılaştırıldığında, LACW jelleri daha proteolitik bantları tespit edebiliyoruz, hangi peptit zimografi yeteneğini gösteren yerli substratlar kullanarak geleneksel yöntemlerden daha biyolojik örnekler içinde mevcut proteazlar daha geniş bir yelpazede tespit etmek. Peptit zimografi hücreleri daha sonra gm6001, geniş spektrumlu MMP inhibitörü veya genel bir kathepsin inhibitörü olan E64 içeren geliştirme tamponunda kuluçkaya yatırılır.LACW peptid jellerinin GM6001 ile tedavisi, bantların yoğunluğunu azaltır. E64 ile tedavinin fark edilebilir bir etkisi yoktur. QGIQ peptid jellerinin GM6001 ile tedavisi daha önce görülen bantların tam ablasyonile sonuçlanmasına neden olabilir.E64'ün bir etkisi yoktur. Jelatin zimografi, peptid zimografisinin duyarlılığını mevcut altın standartla karşılaştırmak için saflaştırılmış, aktif MMP-9 kullanılarak yapılır. LACW jelleri MMP-9 en küçük konsantrasyonları tespit edebiliyoruz.Proteazlar yeniden doğaya yeniden yapmak ve aktif hale gelmek için özel koşullar gerektirir. Kompozisyonun ve PH'nin doğru olduğundan emin olmak için arabellek çözümlerini dikkatlice hazırlayın. Bu yöntem, kimlik doğrulamak ve ölçülen proteazlar daha fazla analiz gerçekleştirmek için mevcut teknikler ile tamamlanabilir.Bu batı blot, gerçek zamanlı PCR ve kütle spektrometresi içerir. Poliakrilamid kullanırken dikkatli olun. Polimerize olmayan çözelti güçlü bir nörotoksin olarak kabul edilir ve uygun kişisel koruyucu ekipman her zaman onu kullanırken giyilmelidir.

detection-of-protease-activity-by-fluorescent-peptide-zymography

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Proteaz Floresan Algılama Kit Florimetri kullanarak proteaz aktivitesi ölçümü için tasarlanmıştır. Ayrıca eser miktarda proteaz kontaminasyon tespiti için uygundur. Yöntem FITC etiketli kazein substrat özel bir formülasyon proteolitik hydroysis dayanmaktadır.

Proteaz Aktivitesi belirleme Proteaz Floresan Algılama Kit kullanın

Bu protokol, kültür süpernatantlar veya vücut sıvıları matriks metalloproteinazların tespit etmek için bir faaliyet tabanlı test açıklamaktadır.

Zymography Fonksiyonel Matrix Metalloproteinazlar Tespiti

Bu videoda, biyolojik örneklerdeki proteolitik aktiviteyi analiz etmek için elektroforetik bir teknik olan zimografi uyguluyoruz.

Floresan Peptit Zimografi: Zymogram Jellerinde Florojenik Substratlar Kullanılarak Proteaz Aktivitesini Tespit Etmek İçin Modifiye Edilmiş Bir Teknik

Bu video, hücre kültürü süpernatanında bulunan matris metaloproteinazların (MMP'ler) aktivitesini değerlendirmek için zimografi jel elektroforezi tekniğini göstermektedir. Aktif MMP'ler, boyamayı takiben koyu lekeli bir arka plana karşı şeffaf bantlar olarak görünen bir poliakrilamid jel içine gömülü MMP'ye özgü substratı bozar.

Zymography Jel Elektroforezi: Enzimatik aktiviteyi değerlendirerek matris metaloproteinazları tespit etmek için elektroforetik bir teknik

Bu video, florojenik peptitler kullanılarak proteazların proteolitik aktivitesini taramak için bir testi göstermektedir. Proteaz, peptit üzerindeki bölünme bölgesini tanır, onu parçalar ve söndürücüyü florofordan ayırarak floresan emisyonunu sağlar. Floresan sinyali, farklı peptit varyantlarının bölünme verimliliğini kontrol etmek için tespit edilir ve analiz edilir.

Proteazların proteolitik aktivitesini taramak için bir florojenik peptit bölünme testi

İnsan, fare veya sıçan Granzyme B'nin (GzmB) proteolitik aktivitesini spesifik olarak ölçen basit, kantitatif bir kolorimetrik testi tanımlıyoruz. Bu protokol, uygun bir tanıma dizisi ile diğer sentetik peptit substratlarının hidrolizi yoluyla diğer granül serin proteazların proteaz aktivitesini belirlemek için kolayca uyarlanabilir.

Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl hidrolizi, A Kolorimetrik Özellikle Granzim B proteolitik aktivitesini ölçer Deneyi

Burada, canlı hücrelerdeki integral zar proteinlerinin oryantasyonunu ve topolojisini belirlemek için bir protokol sunuyoruz. Bu basit protokol, ilgilenilen protein ile GFP arasındaki kimeraların seçici proteaz duyarlılığına dayanır.

Floresan Proteaz Koruma Kullanma Membran Protein topolojisini belirlenmesi (FPP)

Burada, proteaz özgüllük ham fare doku belirlemek için bir protokol MALDI-TOF spektrometresi kullanılarak özleri mevcut.

Proteaz özgüllük fare doku belirlenmesi MALDI-TOF Kütle spektrometresi tarafından ayıklar: PH özgüllük değişiklikler neden manipüle

Burada, N-terminal hexahistidine/maltoz-bağlayıcı protein ve nikel-nitrilotriacetic yüzeye bağlı floresan protein erimiş rekombinant yüzeylerde kullanan bir son zamanlarda geliştirilen proteaz tahlil platform ayrıntılı yordam mevcut asit manyetik özel boncuk. Bir sonraki jel analiz Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide jel elektroforez tarafından ayrılmış tahlil örnekleri de sunulmaktadır.

Rekombinant füzyon protein flüoresan proteaz tahlil Platform ve onların jel Renaturation kullanımı

Biz peptidler viral füzyon peptidler bölünme sitenin temsil eden proteaz proteolitik aktivite hızlı bir tarama sağlayan bir fluorogenic peptid bölünme tahlil mevcut. Bu yöntem aynı zamanda bir protein sıra içinde diğer amino asit motif üzerinde proteaz aktivitesi için test etmek için kullanılabilir.

Bir Fluorogenic peptid bölünme tahlil için proteolitik aktivite ekran: coronavirus uygulamalarda spike protein etkinleştirme

Proteinazlar bakteriyel patogenez için hayati öneme sahiptir, invazyon ve immün kaçışı sağlar. Bakterilerin sitoplazmik ve membran proteinlerinin aktif formlarında tek aşamalı ekstraksiyonu üzücüdür. Bu video makalesi, jelatinazları tespit etmek ve karakterize etmek için zimografi analizi için Leptospira'nın tüm hücresel proteinlerinin ekstraksiyonunu göstermektedir.

Bakteriyel Jelatinazların Tek Adımda Ekstraksiyonu ve Zymografik Analizi

Öğrenin, floresan peptit zimografi ile proteaz aktivitesini nasıl tespit edeceğinizi. Bu modüler yöntem, biyomalzeme araştırmalarında ve doku mühendisliğinde geniş bir proteaz yelpazesini algılamanızı sağlar.

Floresan peptid Zymography tarafından proteaz aktivitesinin algılama

Daha fazla video keşfet