Yüksek kaliteli lazer RNA izolasyonu için paslanmaz bir protokol yakalama insan öldükten sonra beyincik Microdissected Purkinje hücreleri

Bu protokol önemli, çünkü post-mortem insan beyin dokusunda boya bazlı görselleştirme yerine lekesiz bir görselleştirme yöntemi kullanır, bu da RNA bütünlüğünükorumaya yardımcı olur. RNA korunması bu protokolde büyük bir avantajdır, bu yararlıdır, sadece post-mortem insan beyin dokusu, ama aynı zamanda diğer doku tipleri, yüksek RNase aktivitesi ile. Başlamak için, dondurucudan doku çıkarın ve kriyostat taşınması için kuru buz üzerine yerleştirin.

En uygun sıcaklığa ulaşmalarını sağlamak için temiz fırçaları, chuck'ı ve dokuyu en az 20 dakika kriyostatiçine yerleştirin. Çift odacıklı ve numune tutma sıcaklığına sahip kriyostatlar için nesne sıcaklığıeksi 16 derece, oda sıcaklığı eksi 18 dereceye ayarlayın. Kriyostat'ın kesit kalınlığını 14 mikrometreye, döşeme kalınlığını 30 mikrometreye ayarlayın.

Daha sonra, donma önlemek için RNase dekontamine oridi ve% 70 etanol bire bir karışımı ile sahne temizleyin. Yeni, tek kullanımlık kriyostat bıçak edinin ve RNase dekontalüile temizleyin. Temizlenmiş bıçağı sahnedeki bıçak tutucuya yerleştirin.

Daha sonra anti-roll plakasını RNase dekontalüor ile temizleyin. Temizlenmiş plakayı sahneye takın ve bıçağın ve anti-roll plakasının kriyostat sıcaklığına inmesini en az 20 dakika bekleyin. İlk olarak, kesit için doku küçük bir parça kesilmiş, bu bölüm yaklaşık% 95 serebellar korteks olduğundan emin olun.

Kalan dokuyu eksi 80 derecede kuru buza veya dondurucuya geri getirin. Daha sonra, yavaş, dairesel bir hareket le yavaşça chuck üstüne OCT eklemeye başlayın. Yaklaşık üç milimetre yüksekliğinde bir montaj chuck kapsayan kadar OTC katmanları oluşturun.

OCT kısmen dondurulmuş, ancak hala merkezinde bazı sıvı olduğunda, montaj üstüne dokuları yerleştirin. Doku tamamen dondurulana kadar bir ila iki dakika için OKT üstüne oturalım. Sonra, dondurulmuş OKT ve doku ile chuck transfer kriyostat kesme koluiçine.

Dokuyu kesme bıçağıyla temizleyebilsin diye ayarlayın ve yeni sıcaklığa uyum sağlamak için dokunun kesme kolunda 20 dakika beklemesine izin verin. En kritik adım, dokunun kriyostat kesme kolunda gerektiği kadar alışmasını sağlamaktır. Doku parçalanırsa, purkinje hücre görselleştirmesi çok zor olacaktır.

Ben doku daha hızlı alışmak için izin vermek için doku daha küçük, ince parçaları kullanmanızı öneririz. Bundan sonra, yavaş yavaş bıçak yakın doku hareket ettirin. Doku bıçak ulaştıktan sonra, kesme işlemi başlar.

Korteks tabakaları görünene kadar dokuyu 2-3 kez kırpın. Daha sonra, anti-roll plakasını kriyostat bıçağının hemen üzerine yerleştirin ve hizalayın. 14 mikrometre kalınlığında dört ila altı bölüm keserek, düzgün kesilmiş kesitlerin anti-roll plakasının altında düz olacağını belirtin.

Kesme bölümlerini kriyostat aşamasında yatay olarak hizalayın. Açı aynı anda tüm doku parçaları almak için bir slayt. Dokuyu kesitle dikten hemen sonra, slaytı iki dakika boyunca %70 etanolile buza yerleştirin.

Slaytı 45 saniye boyunca buz üzerinde %95 etanol içeren bir slayt tutucuya aktarın. Daha sonra, slaytı iki dakika oda sıcaklığında %100 etanolile slayt tutucuya yerleştirin. Slaytı oda sıcaklığında bir numaralı ksilen içeren slayt tutucuya üç kez batırın.

Daha sonra, slaytı slayt tutucuya ksilen iki ile oda sıcaklığında beş dakika yerleştirin. Temiz bir duman kaputunda slaytlar standı ve onları en az 30 dakika kuru hava sağlar. Slaytları depolarken, her birini ayrı bir 50 mililitrelik tüpe yerleştirin ve tüpleri eksi 80 derecede yedi güne kadar dondurucuya yerleştirin.

İlk olarak, mikroskop aşamasını ve kapak toplama kolunu temizlemek için RNase dekontamine oramasını kullanın. Eldivenli ellerle, slaytı mikroskoba ve 500 mikrolitrelik opak kapağı toplama koluna yerleştirin. Düşük büyütme de, serebellar doku üzerinde opak kap hizalamak, bu kap göz parçası görselleştirilmiş tüm alanı kapsadığını sigortalayan.

Serebellar katmanları görselleştirmek için beş kez ila 10 kez objektif kullanın. İmleci moleküler tabaka ve granül hücre tabakasının kesiştiği bölümün üzerine yerleştirin. 40 kat büyütme ye geçin ve purkinje hücrelerini görselleştirin.

Sonra, onları yakalamaya başlayın. Mikrodiseksiyondan sonra RNA koleksiyonuna başlamak için, kapağı yukarı bakacak şekilde opak kapak için 50 mikrolitre hücre lisis tamponu ekleyin. Tüpü kapağın üzerine dikkatlice kapatın ve metin protokolünde belirtildiği gibi koleksiyona devam edin.

Bu protokolde, taze, dondurulmuş, post-mortem, insan beyin dokusu UV lazer yakalama mikrodizise için hazırlanır. Kriyostat'ın ayrılan çizim süresiiçinde kesilmesinden sonra, beyinciğin hücresel katmanları beş kat ve 10 kat objektif merceklerle kolayca görülebilir. Burada görüldüğü gibi, uygun ksilen kuluçka doku koyu ve daha iyi tek başına etanol daha hücresel katmanları ortaya çıkarmak neden olur.

Lazer yakalama mikroskobu keserken, 40 kez objektif lens sadece purkinje hücreleri değil, çevreleyen doku yakalama sağlamak için gereklidir. Burada görüldüğü gibi, ksilen uygun kuluçka sadece etanol fiksasyonu ile karşılaştırıldığında yüksek kaliteli morfolojik olarak bozulmamış görüntü üretir. Diğer protokoller sıvı dolu bir kapak kullanırken opak bir kapağın kapak kayma yeteneği test edilir, bu kapaklar doku görselleştirmesini azaltabilir ve ortaya çıkan görüntünün mikroskop altında taneli ve yanardöner olmasına neden olabilir.

Ancak, opak bir kapak ile görselleştirme yumuşak ve formda keskin pürüzsüzleştirilmiş doku görünümünü sonuçlanır. Düşük güçte ve yüksek güçte eksinyeden çıkarılan purkinje hücrelerinin temsili görüntüleri sadece purkinje hücre gövdesinin hassas bir şekilde ortadan kaldırıldığını göstermektedir. Bundan sonra, yüksek kaliteli Rnase sonraki RNA sıralama için elde edilir.

Altı temsili numune RNA ekstraksiyonuna alındı ve 14 mikrolitre Rna-free su ile yeniden askıya alındı ve altı numune de sekize eşit veya daha büyük RNA bütünlüğü sayılarına sahip yüksek kaliteli RNA üretti. Hatırlanması gereken en önemli şey doku kalitesi her şeydir. Hatta kesme ve slayt yerleşimi bu protokolü yapar veya kırar.

Bu prosedürü takiben, RNA veya DNA'yı araştıran herhangi bir yöntem yapılabilir, özellikle diferansiyel gen ekspresyonu için RNA'mızı inceleriz, ancak gen regülasyonu ile ilgili diğer sorular da araştırılabilir. Bu yöntem, ilgi hücrelerinin belirlenmesi için antijen veya boyaya özgü reaktiflerin kullanılmasını gerektirmeyen özel şekillenmiş morfolojiye sahip herhangi bir doku tipine uygulanabilir. Bu tekniğin, esansiyel titreme ve titreme fenotipine sahip diğer hastalıkların genetiğini anlamamıza yardımcı olacağını umuyoruz.

Bu protokolde kullanılan en tehlikeli kimyasal ksilen'dir. Bir duman kaputunda düzgün bir şekilde ele alınmalı, düzgün bir şekilde atılmalı ve slaytların açık bir alanda kullanılana kadar yeterince kurumasına izin verilmelidir. Ayrıca, insan örnekleri ile çalışırken, biyolojik atık yönetimi ve güvenlik kullanılmalıdır.