Name: Kanser hücresel Phenotypes üzerinde Mikroçevresel etki Interrogate için Microdiziler kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Öğrenin mikroçevre mikrodizileri (MEMA) kullanarak kanser hücre fenotiplerini nasıl inceleyeceğinizi. Bu yöntem tümör davranışlarını etkileyen faktörleri belirlemeyi kolaylaştırır ve doku mühendisliği araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, ağ hücresel Imzaları (LıNCS) Grant HG008100 (J.W.G., L.M.H. ve J. E. K) NıH ortak fon Kütüphanesi tarafından destekleniyordu.

Not: Tahmini saat de dahil olmak üzere tüm MEMA işleminin genel bakışı Şekil 1' de gösterilen akış diyagramında özetlenmiştir. Bu protokol 8-kuyu plakaları içinde MEMAs imalatı ayrıntıları. Protokol diğer plakalar veya slaytlar için uyarlanabilir.
1. protein, Seyreltilme ve boyama tamponları hazırlanması
<ol><li>ECMs, ligler ve sitokinlerin oda sıcaklığına (RT) ve kısaca santrifüjlerin dengelenme şişeleri. Uygun RT arabelleğinin uygun hacmini ürün veri sayfasında belirtildiği şekilde ekleyin. Stok konsantrasyonları için üreticinin tavsiyesini takip edin. Not: Tablo 1 ve Tablo 2' de hisse senetleri ve nihai konsantrasyonları Ile ligler ve ECMS tam listesi sağlanmıştır. Her iki ligler ve ECMs genellikle standart 2 günlük kültür assays bir biyolojik etkisi ortaya çıkarır üretici tarafından önerilen aralığın en yüksek konsantrasyonda kullanılır. Kontaminasyonu önlemek için laminar akımı altında yavaşça ve biyogüvenlik dolapları proteinleri ele.</li>
	<li>1 h için RT 'de hafif sallanan şişeleri kulkaylar. Bu onları denature neden olabilir gibi protein Vortex etmeyin.</li>
	<li>Uzun süreli depolama için aliquot proteinleri böylece tüm plakaya sadece tekrarlanan dondurma/çözme döngüleri ile bozulma önlemek için tek kullanımlık. Likofilize proteinlerin-80 °C ' de (aksi belirtilmediği sürece) gerekli olana kadar saklayın. : (İ) protein adı, (ii) hazırlanan Tarih, (iii) lot/toplu iş numarası, (iv) Tedarikçi, (v) katalog numarası, (vi) konsantrasyon, (vii) hacim ve (VIII) preparer gibi gelecekteki referanslar için tüm meta verileri toplamak için özen yapın.</li>
	<li>% 20 (v/v) gliserol, 10 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl, pH 7,2 ve filtre sterilizasyonu içeren seyreltilici tampon hazırlayın. Bu tamponu steril tutun ve RT 'de saklayın.</li>
	<li>% 2 (w/v) BSA, 1 mM MgCl2ve 0,02% Nan3 ' ü fosfat-TAMPONLU tuz (PBS) içeren boyama tamponunu hazırlayın. 4 °C ' de filtreleyin ve saklayın.</li>
</ol>2. ECM kaynak plakasının hazırlanması
<ol><li>ECM proteinleri, yazılı ve buzda çözülecek olan seyreltilmemeli stokları çıkarın. Meta veri izleme için tüm lot numaralarını kaydedin.</li>
	<li>Çözülür proteinleri yavaşça doğru Resuspension sağlamak ve bir santrifüjte aşağı döndürmek için fiske tüpler.</li>
	<li>
ECM baskı karışımları (EPMs) ve randomize 384-Well kaynak plakaları yaratacak bir sıvı taşıma robotu tarafından kullanılacak bir floresan fiducial olun. Not: 384-Well kaynak plakaları, 8 kuyu plakalarına yazdırılan dizileri oluşturmak için bir dokunma pin dizisi yazıcısı tarafından kullanılacaktır.<ol>
<li>Etiket 1,5 her EPM ve fiducial için mL mikrosantrifüjler tüpleri.</li>
		<li>Her bir EPM 'ye, 125 μL seyreltilme tamponunu birleştirerek (bkz. Adım 1,4) ECM stokunun uygun hacmine göre hazırlayın ve karışımı PBS ile toplam 250 μL hacmine getirin. Her EPM tüpünün son konsantrasyonları 1x ECM protein, 5 mM EDTA,% 10 gliserol ve 100 mM Tris olacaktır.</li>
		<li>Üretici tarafından belirtilen uygun tamponda çözülerek floresan fiducial hazırlayın ve 250 μL 'yi etiketli bir fiducial tüpe aktarın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. sıvı Işleyici kullanarak kaynak plakasının oluşturulması
<ol><li>ECMs konumlarını randomizes ve kullanılan dizi yazıcı pin kafası için optimize edilmiş bir 384-kuyu plaka düzeni tasarlayın. Dizi oryantasyonunda yardımcı olmak için her iyi satır 1, sütun 1 pozisyon yazdırılır böylece fiducial yerleşimi tasarlayın. Not: Her ECM 'nin toplam 14 − 15 çoğaltır güçlü veri sağlamak için kullanılır. Bağlayıcı tekdüzelik değerlendirmesi için sağlam bir ek veren kollajen veya başka bir ECM ek çoğaltır dahil. Düzen ilgi ECMs sayısına bağlı olarak birden fazla 384-kuyu plakaları kullanmak gerekebilir.</li>
	<li>EPM tüpleri soğutulmuş bir tüp raf ile veya soğuk bir odada bulunan bir sıvı taşıma robotu kullanarak, 4 °C ' de tüpler tutarak, bir sıvı işleyici aktarın.</li>
	<li>Sıvı iþleyicinin yazılımını kullanarak, her EPM 'nin 15 μL 'i ve 384-Well kaynak plaka (lar) içinde önceden belirlenmiş kuyulara fiducial aktarmak için bir program çalıştırın.</li>
	<li>Pipet, baskı işlemi sırasında nem ve kurutmaya karşı koruma artırmak için kullanılmayan kuyuların içine PBS. Not: 4 x 7 pin kafası için optimize edilmiş ve ı bloğu ve PBS kollajen içeren bir 384-iyi kaynak plaka seti örneği için Şekil 2 bakın.</li>
	<li>Plakayı (s) mühürleyin ve yazdırmaya hazır olana kadar 4 °C ' de tutun.</li>
</ol>4. bir dizi baskı robotu kullanarak MEMAs yazdırma
Not: Protokolün aşağıdaki bölümü, MCF7 hücrelerinin büyümesi ve proliferasyonu üzerinde farklı mikroçevre proteinlerinin etkisini araştırmak için MEMA 'nın hazırlanması ve kullanımını özellikle açıklar. Ancak, protokol kolayca farklı ligler, ECMs ve hücre diğer hücre hatları ve ilgi uç noktalarını incelemek için kullanılmak üzere adapte edilebilir.
<ol><li>
Bir dokunmatik PIN yazıcısı kullanarak, EPMs ve fiducial lekeler 8 kuyu plakaları içine yazdırın. Tekrarlanabilirlik sağlamak için her ECM koşulunun birden çok çoğaltır yazdırın. Not: diğer plaka formatları veya slaytlar yazdırmak için kullanılabilir, ancak optimum spot oluşumu elde etmek için tampon optimizasyonu gerekebilir.<ol>
<li>4 x 7 baskı kafası konfigürasyonda düzenlenmiş 350 μm çap pimleri kullanarak MEMA için ECMs 'i yazdırın. 8-Well plakalardaki dizileri, toplam ~ 700 Spotlar için 35 satır olarak 20 sütun olarak yazdırın. Bu plaklarda daha büyük diziler mümkündür ancak hem hücre bağlaması hem de boyama sırasında artan kenar efektlerinin takas edilmesi ile birlikte gelir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yazdırdıktan sonra, kullanım öncesinde en az 3 gün boyunca bir kurutucu içinde depo plakaları.</li>
</ol>5. ligand tedavi plakalarının oluşturulması
<ol><li>İlgi liglerini de içeren bir 96-Well plaka düzeni Tasarla. Aynı anda birçok MEMA plakasının tedavisinde kolaylaştırmak için, 8-Well MEMAs ve 96-Well plaka kuyuları arasında sıvı aktarmak için 4 aralıklı ipuçları ile çok kanallı pipet kullanımı için izin aralığı ile bu plaka tasarımı. Not: Bu protokolde, Tablo 2 ' de listelenen ligin tam kümesi kullanılır.</li>
	<li>Buz üzerinde ligin çözülmesi. Kısaca Flick ve her tüp aşağı spin.</li>
	<li>Üreticinin önerilen arabelleğini (genellikle PBS) kullanarak 200x çalışma stokunda seyreltmeli ligeler.</li>
	<li>Her 200x ligand stoktaki pipet 10 μL, 96-kuyu plakasının içinde karşılık gelen kuyu içine girer.</li>
	<li>-20 °C ' de mühür ve saklama plakaları. Not: Akış Analizi için tüm meta verileri yakalama, gruplar halinde ligand tedavi plakaları olun.</li>
</ol>6. MEMAs üzerindeki hücreler kültür
<ol><li>Çift distile su (ddH2O) içinde 1% kirlenme engelleme maddesi (malzeme tablosu) içeren, kirlenme yapmayan engelleme tamponunun başına 2 ml Ile 20 dakika boyunca Memas engelleyin.</li>
	<li>Aspirate engelleme tampon ve üçlü durulama kuyuları PBS ile. Kurutma önlemek için, hücre kaplama için hazır olana kadar kuyularda PBS son hacmi bırakın. Not: MEMAs üzerinde hücre kültürü adımları için iki tezgah çalışanı olması son derece yararlıdır. Bir tezgah çalışanı aspirasyon adımlarını gerçekleştirebilir, ikincisi ise ek adımlar gerçekleştirir. 1 mL çok kanallı pipet ile pipetleme için 8-kuyu plakasını ve iki Pasteur pipeti ile Y-Splitter ile aynı anda birden fazla kuyu aspirine uyacak şekilde aralıklı ipuçları kullanmak önerilir.</li>
	<li>Tohum 2 x 105 MCF7 hücrelerde her Iyi 2 ml Dulbecco 'Nun modifiye kartal Orta (dmem) orta içeren 10% fetal sığır serumu (FBS). Not: Tam MEMA deneyinden önce, MEMA noktalarının yüksek hücre numaralarıyla (ancak confluent olmayan) istenen deneysel sürenin sonunda hücre numaralarını en iyi duruma getirmek için bir hücre titrasyon deneyi gerçekleştirin.</li>
	<li>2 − 18 h yapışma, aspirat orta ve 2 mL azaltılmış büyüme orta (DMEM ile 0,1% FBS) ile değiştirin. Not: Azaltılmış serum (örn.% 0,1 FBS) veya büyüme faktörü-tükenmiş koşullar Şu anda belirli liglerin uyarıcı etkisini izole etmek için kullanılabilir.</li>
	<li>Buz üzerinde bir ligand tedavi plakasını çözün. Santrifüjlü çözünen plaka 200 x g 'de 1 dk.</li>
	<li>Transfer 200 μL, kültür plakasının her bir kuyunda, tedavi plakasında uygun bir şekilde orta olan. Pipet yukarı ve aşağı orta ile ligand hacmi karıştırın ve MEMA plaka uygun iyi geri bu karışımı aktarmak için.</li>
	<li>Elle hafifçe kaya ve MEMA plakaları inküyaya dönün. 37 °C ve 5% CO2' de ligand/ECM kombinasyonunun varlığını deneme süresi için kültür. Not: Tipik bir MEMA deneyi 72 h için çalışır; uzun süreli deneyler orta ve yeniden tedavi ligand ile değiştirilmesi gerekebilir.</li>
	<li>71 h 'de nabız MEMA kuyuları 10 μM son konsantrasyon için 100x 5-etynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ile. EdU ile deneysel koşullarda, 37 °C ' de 1 h ve% 5 CO2' de inkük edilir. Not: Diğer canlı hücre uygulamaları da şu anda kullanılabilir.</li>
</ol>7. sabitleme ve boyama MEMAs
<ol><li>Sonra 72 h ve herhangi bir canlı hücre tedavileri, Aspire kuyuları. Min 'de 15 dakika boyunca 2% civarında formaldehite (PFA) başına 2 ml 'de Memas 'ı düzeltin.</li>
	<li>Aspirate PFA. 15 dk için 0,1% noniyonik yüzey başına 2 mL ile geçirgen.</li>
	<li>Noniyonik yüzey kaynağı aspirate ve PBS iyi başına 2 mL ile yıkayın. Aspirate PBS. 0,05% polisorbat 20 (PBS-T) ile 2 ml PBS ile yıkayın. Not: MEMA yüzeyi hidrofobiktir ve leke ve antikor inkübasyon öncesinde PBS-T ile yıkanmaması, kuluçk basamakları sırasında kuyularda boşlukların oluşması ve boyama yapılarına yol açacaktır.</li>
	<li>Aspirate PBS-T. EdU algılama reaksiyon reaktifleri ekleyin. RT 'de 1 saat boyunca kulbirer yapın, sallanan ve ışıkta korunur. 1 h inkübasyon sonra, sağlanan ticari gidermek tampon ile reaksiyonu azaltma. Not: EdU algılama ve boyama/antikor basamakları maliyeti azaltmak için iyi başına 1,5 mL 'de gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Su giderici tamponu aspirate ve lekeleri veya antikorlar ile inküp önce PBS-T ile yıkayın.</li>
	<li>MEMA kuyularını% 2 (w/v) Sığır serum albümin (BSA), 1 mM MgCl2 ve 0,02% Nan3 gece 4 °c ' de içeren boyama tamponunda histon H3K9me3 (1:1000) ve fibrillarin (1:400) karşı antikorlar ile kulbin. Not: Tam MEMA kümesinde kullanmadan önce optimum konsantrasyonları belirlemek için antikor titrasyonları gerçekleştirin.</li>
	<li>Primer antikor veya leke İnkübasyon sonrasında, 2x PBS ile ve bir kez PBS-T ile yıkayın kuyuları.</li>
	<li>İkincil antikorlar ekleyin (eşek Anti-fare IgG ve eşek Anti-tavşan IgG, hem 1:300) ve 0,5 μg/mL 4 ′ 6 ‐ diamidino ‐ 2 ‐ phenylindole (DAPI). Karanlıkta RT 'de 1 saat boyunca inküye yapın.</li>
	<li>2 mL 'Lik PBS 'ye kadar, iki adet x, 2 ml ile yıkayın.</li>
	<li>Işıktan korunan 4 °C ' de PBS 'de daha sonra görüntüleme için görüntülenmiş MEMAs 'a devam edin.</li>
</ol>8. MEMAs 'ın görüntülenmesi
<ol><li>Uygun floresan algılama kanalları ile otomatik görüntüleme sistemi üzerinde görüntü MEMA.</li>
	<li>Bir görüntü yönetim sistemine elde edilen görüntü verilerini çıktı. Hücreleri segment ve Cell Profiler8kullanarak yoğunluk düzeylerini hesaplayın.</li>
</ol>9. veri analizi
Not: Veri Analizi normalleştirme, varyasyon düzeltme ve ham CellProfiler türetilmiş veri özetleme oluşur. Bu örnekte, özel kod ile R-ortamı tüm adımları gerçekleştirmek için kullanılır. Ancak, herhangi bir istatistiksel ortam veya yazılım programı eşdeğer eylemleri gerçekleştirmek için kullanılabilir. Çözümleme için R ortamı için açık kaynak özel kod örneği kullanılabilir: https://www.SYNAPSE.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.
<ol><li>Bölümlenmiş görüntü verilerini preprocess ve Normalleştir.</li>
	<li>DAPı lekeli çekirdekleri kullanarak spot hücre sayısını belirleyin.</li>
	<li>Hücreleri EdU+olarak etiketlemek için edu yoğunluğu otomatik kapı. Her noktada EdU+ hücre oranını kullanarak proliferasyonu ölçün.</li>
	<li>Sitoplazmik lekeleri ve nükleer morfoloji ölçümlerini spot düzeyde özetlemektedir.</li>
	<li>Veri kalitesini artırmak için veriler üzerinde istenmeyen varyasyon (RUV) normalleştirme kaldırılması gerçekleştirin9. Not: Bu yaklaşım, her yoğunluğa ve morfoloji sinyaline, daha önce9olarak açıklandığı gibi satırlar ve lekeler kullanarak diziler içeren bir matris olarak bağımsız olarak uygulanır.</li>
	<li>Uzamsal veya yoğunlukla ilgili efektler için düzeltmek için bağımsız değişkenler olarak dizi satırını ve dizi sütununu kullanarak ruv normalleştirilmiş kalıntılar için iki değişkenli Loess normalleştirme uygulayın.</li>
	<li>Normalleştirme tamamlandıktan sonra medyan, raporlama ve daha fazla çözümleme için her mikro ortam koşulu için çoğaltır özetler.</li>
</ol>

<ol><li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li>
<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>LaBarge, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mammary+progenitor+cell+fate+decisions+are+products+of+interactions+with+combinatorial+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments.</a> Integrative Biology (Cambridge). 1 (1), 70-79 (2009).</li>
<li>Watson, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-Mediated+Mechanisms+of+Resistance+to+HER2+Inhibitors+Differ+between+HER2%2B+Breast+Cancer+Subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-Mediated Mechanisms of Resistance to HER2 Inhibitors Differ between HER2+ Breast Cancer Subtypes.</a> Cell Systems. 6 (3), 329-342 (2018).</li>
<li>Ranga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+niche+microarrays+for+systems-level+analyses+of+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate.</a> Nature Communications. 5, 4324(2014).</li>
<li>Malta, D. F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+microarrays+to+study+inductive+signaling+for+endoderm+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification.</a> Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).</li>
<li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+structure%2C+function+and+compatibility+for+CellProfiler%3A+modular+high-throughput+image+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).</li>
<li>Gagnon-Bartsch, J. A., Jacob, L., Speed, T. P. Removing Unwanted Variation from High Dimensional Data with Negative Controls. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGagnon-Bartsch%2C+JA+%22University+of+California%2C+Berkeley%2C+Department+of+Statistics%2C+University+of+California%2C+Berkeley%22">University of California, Berkeley, Department of Statistics, University of California, Berkeley</a>. , Report No. 820 (2013).</li>
<li>Allan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMERO%3A+flexible%2C+model-driven+data+management+for+experimental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology.</a> Nature Methods. 9 (3), 245-253 (2012).</li>
<li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li>
<li>Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differentiated+state+of+normal+and+malignant+cells+or+how+to+define+a+%22normal%22+cell+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a "normal" cell in culture.</a> International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).</li>
<li>Serban, M. A., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+extracellular+matrices%3A+solutions+for+the+puzzle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Modular extracellular matrices: solutions for the puzzle.</a> Methods. 45 (1), 93-98 (2008).</li>
<li>Kaylan, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+lung+tumor+cell+drug+responses+as+a+function+of+matrix+context+and+genotype+using+cell+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays.</a> Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).</li>
<li>Lin, C. H., Jokela, T., Gray, J., LaBarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+Microenvironments+Impose+a+Continuum+of+Cellular+Responses+to+a+Single+Pathway-Targeted+Anti-cancer+Compound%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound.</a> Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

"Dimensionality" ve içeriğin önemi, mikroçevre11ile etkileşimi ile kanser hücrelerinin karakterizasyonu araçları olarak in vitro kültür sistemlerinin geliştirilmesi konusunda motive edici bir faktör olmuştur ve in vitro yeteneği Kültür sistemleri in vivo çevre taklit etmek için bu kültür sistemleri geliştirmek için arayışı arkasında bir itici kuvvettir. In vitro sistemlerde, ancak, oldukça basitleştirilmiş bir model12aşağı kompleks in vivo durumda damıtmak yeteneğini nedeni...

İki boyutlu (2D) monolayers plastik üzerinde kanser hücre hatları kültür kanser araştırmacıları için büyük workhorses vardır biri kalır. Ancak, mikroortam giderek hücresel fenotürleri etkisi yeteneği için tanınıyor. Kanserde, tümör mikroçevre, büyüme, hayatta kalma, invazyon ve tedaviye yanıt dahil olmak üzere birden fazla hücresel davranışları etkileyen bilinmektedir1,2. Geleneksel Tek tabakalı hücre kültürler genellikle mikroçevre etkileri eksikliği, hangi daha karmaşık üç boyutlu gelişimine yol açmıştır (3D) hücreleri büyümek için tespit, ticari olarak kullanılabilir arıtılmış Bodrum membran özler de dahil olmak üzere. Ancak, bu saflaştırılmış matrisler genellikle kullanmak ve toplu değişkenlik3 ve karmaşık kompozisyonlar3gibi teknik sorunlardan muzdarip karmaşıklaşır. Sonuç olarak, hücresel fenotürleri etkileyen olabilir belirli proteinler için fonksiyon atamak zor olabilir3.
Bu sınırlamaları gidermek için, mikroortam Mikroarray (Mema) teknolojisini geliştirdik, bu da mikro 'ı basit bileşimsiz matris (ECM) ve çözünebilir büyüme faktörü proteinlerinin kolay kombinasyonuna düşüren4,5 . MEMA platformu, hücrelerin davranışını etkileyen baskın mikroçevresel faktörlerin tanımlanması sağlar. Bir dizi biçimi kullanarak, mikro ortam faktörlerinin kombinasyonları binlerce tek bir denemede farklı teknik kullanılarak olabilir. MEMA burada açıklanan interrogates ~ 2.500 farklı benzersiz mikroçevre koşulları. İyi plakalara yazdırılan ECM proteinleri, hücrelerin kültürlü olması üzerine büyüme pedleri oluşturur. Çözünür ligler bireysel kuyulara eklenir, hücrelerin maruz kaldığı her farklı noktada benzersiz Kombinatoryal mikroortamlar (ECM + ligand) oluşturma. Hücreler birkaç gün boyunca kültürlü, sonra sabit, lekeli, ve bu özel mikroçevre kombinasyonları maruz kalma sonucu hücresel fenotipleri değerlendirmek için görüntülenmiştir. Mikroortamlar basit kombinasyonları olduğundan, hücrelerde büyük fenotipi değişiklikler yapan proteinlerin tanımlanması basittir. Memalar, hücre kaderi kararları ve terapi4,5,6,7tepki sürücü olanlar da dahil olmak üzere, birden fazla hücresel fenotürleri etkileyen faktörleri belirlemek için başarıyla kullanılmıştır. Bu tepkiler basit 2D deneylerde doğrulanabilir ve daha sonra tümör mikroortamının karmaşıklığını daha tam olarak tekrar eden koşullar altında değerlendirilebilir. MEMA platformu, iyi fenotip biyomarkerlerin mevcut olması koşuluyla, çeşitli hücre türleri ve uç noktalarıyla oldukça uyarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>Aushon 2470</td><td>Aushon BioSystems</td><td></td><td>Arrayer protokolde kullanılan</td></tr><tr><td>robot sistemi Nikon HCA</td> Nikon Eclipse Ti etrafında tasarlanan <td>Nikon</td><td></td><td>Yüksek İçerikli Görüntüleme sistemi Ters Mikroskop</td></tr><tr><td>BioTek Precision XS sıvı İşleyici</td><td>Trizma</td> hidroklorür tampon çözeltisi Sigma T2069 <td></td>protokolünde kullanılan BioTek <td></td> sıvı işleme robotu</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Kolliphor P338</td><td>BASF</td><td>50424591</td><td></td></tr><tr><td>384 kuyulu mikrodizi plaka, silindirik kuyu</td><td>Thermo Fisher</td><td>ab1055</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 8 kuyu çanak</td><td>Thermo Fisher</td><td>267062</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit% 16 çözelti</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimi</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP-1600</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Hücre</td><td>Maskesi Moleküler Problar</td><td>H32713</td><td></td></tr><tr><td>Click-iTEdU Alexa Flor Moleküler</td><td>Problar</td><td>C10357</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Promosyon Kine</td><td>PK-CA70740043</td><td></td></tr><tr><td>ALCAM</td><td>R & D Systems</td><td>656-AL</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Cadherin-20 (CDH20)</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>5604-CA</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Cadherin-6 (CDH6)</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>2715-CA</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Cadherin-8 (CDH8)</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>188-C8</td><td>ECM</td></tr><tr><td>CD44</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>3660-CD</td><td>ECM</td></tr><tr><td>CEACAM6</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>3934-CM</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Kollajen I</td><td>Cultrex</td><td>3442-050-01</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Kollajen Tip II</td><td>Millipore</td><td>CC052</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Kollajen Tip III</td><td>Millipore</td><td>CC054</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Kollajen Tip IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Kollajen Tip V</td><td>Millipore</td><td>CC077</td><td>ECM</td></tr><tr><td>COL23A1</td><td>R & D Sistemleri</td><td>4165-CL</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Desmoglein 2</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>947-DM</td><td>ECM</td></tr><tr><td>E-kaderin (CDH1)</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>648-EC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>ECM1</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>3937-EC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>1918-FN</td><td>ECM</td></tr><tr><td>GAP43</td><td>Abcam</td><td>ab114188</td><td>ECM</td></tr><tr><td>HyA-500K</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>GLR002</td><td>ECM</td></tr><tr><td>HyA-50K</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>GLR001</td><td>ECM</td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>720-IC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L6274</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Laminin-5</td><td>Abcam</td><td>ab42326</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Lumican</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>2846-LU</td><td>ECM</td></tr><tr><td>M-Cad (CDH15)</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>4096-MC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Nidogen-1</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>2570-ND</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Osteoadherin/OSAD</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>2884-AD</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Osteopontin (SPP)</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>1433-OP</td><td>ECM</td></tr><tr><td>P-Cadherin (CDH3)</td><td>R & D Systems</td><td>861-PC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>PECAM1</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>ADP6</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Tenascin C</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>3358-TC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>VCAM1</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>ADP5 ECM</td><td></td></tr><tr><td>Vitronektin</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>2308-VN</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Biglycan</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>2667-CM</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Decorin</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>143-DE</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Periostin</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>3548-F2</td><td>ECM</td></tr><tr><td>SPARC/osteonektin</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>941-SP</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Trombospondin-1/2</td><td>R & D Systems</td><td>3074-TH</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Brevican</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>4009-BC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Elastin</td><td>BioMatrix</td><td>5052</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Fibrillin</td><td>Lynn Sakai Lab OHSU</td><td>N/A</td><td>ECM</td></tr><tr><td>ANGPT2</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>623-AN-025</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>IL1B</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>201-LB-005</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>CXCL8</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>208-IL-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>IGF1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>291-G1-200</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>TNFRSF11B</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>185-OS</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>BMP6</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>507-BP-020</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>FLT3LG</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>308-FK-005</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>CXCL1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>275-GR-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>DLL4</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>1506-D4-050</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>HGF</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>294-HGN-005</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>Wnt5a</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>645-WN-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>CTGF</td><td>Life_Technologies_Own</td><td>PHG0286</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>LEP</td><td></td><td>RnD_Systems_Own 398-LP-01M</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Sigma_Aldrich_Own</td><td>SRP4037-50UG</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>FGF6</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>238-F6</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>IL7</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>207-IL-005</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>TGFB1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>246-LP-025</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>PDGFB</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>220-BB-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>WNT10A</td><td>Genemed_Own</td><td>90009</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>PTN</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>252-PL-050</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>BMP3</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>113-BP-100</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>314-BP-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>TNFSF11</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>390-TN-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>CSF2</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>215-GM-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>BMP5</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>615-BMC-020</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>DLL1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>1818-DL-050</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>NRG1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>296-HR-050</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>KNG1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>1569-PI-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>GPNMB</td><td></td><td>RnD_Systems_Own 2550-AC-050</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>CXCL12</td><td></td><td>RnD_Systems_Own 350-NS-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>IL15</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>247-ILB-005</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>TNF</td><td>RnD_ Systems_Own</td><td>210-TA-020</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>IGFBP3</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>675-B3-025</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>WNT3A</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>5036-WNP-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>PDGFAB</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>222-AB</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>AREG</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>262-AR-100</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>JAG1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>1277-JG-050</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>BMP7</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>354-BP-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>TGFB2</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>302-B2-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>VEGFA</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>293-VE-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>IL6</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>206-IL-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>CXCL12</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>351-FS-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>NRG1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>378-SM</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>IGFBP2</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>674-B2-025</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>SHH</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>1314-SH-025</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>FASLG</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>126-FL-010</td><td>Ligand</td></tr></tbody></table>

kanser hücresel phenotypes üzerinde mikroçevresel etki interrogate için microdiziler kullanma

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Mikroortamın hücrelerin phenoype üzerindeki etkisini anlamak, hem çözünür büyüme faktörleri hem de mikro ortamda matris ilişkili proteinlerin kompleks karışımı nedeniyle zor bir sorundur. Ayrıca, mikroortamlar içinde vitro modelleme için kolayca kullanılabilir reaktifler genellikle tamamen tanımlanmış ve toplu değişkenlik için toplu muzdarip proteinlerin karmaşık karışımları kullanın. Mikro Mikroarray (Mema) platformu tek bir tahlil içinde hücresel fenotipleri üzerindeki etkileri için mikro çevre proteinleri binlerce basit kombinasyonları değerlendirilmesi için izin verir. Memalar, bireysel liglerin dizilmiş ekstrenüler matris (ECM) proteinlerini içeren ayrı kuyulara eklenmesini sağlayan iyi plakalar halinde hazırlanmaktadır. Her basılı ECM ile çözünür ligand kombinasyonu benzersiz bir kombinasyon oluşturur. Tipik bir Mema tahlil hücre tek bir tahlil maruz kalan 2.500 benzersiz Kombinatoryal mikroortamlar büyük içerir. Bir test durumu olarak, meme kanseri hücre hattı MCF7 MEMA platformunda kaplama oldu. Bu tahlil Analizi hem geliştirmek ve bu hücrelerin büyümesi ve proliferasyonu inhibe faktörler tespit. MEMA platformu son derece esnektir ve kanser araştırmalarının ötesinde diğer biyolojik sorularla kullanılmak üzere uzatılabilir.

Hücre büyümesi ve proliferasyonu üzerinde mikroçevresel etkileri kolaylaştırmak ve hücre büyümesini ve proliferasyonu teşvik eden veya engellenmiş olan koşulları belirlemek için, meme kanseri hücre hattı MCF7 protokolde açıklandığı gibi sekiz 8-iyi Memas bir dizi üzerinde seribaşı oldu. Bu tahlil 48 farklı ECMs ve 57 farklı ligler, toplam 2736 Kombinatoryal mikroçevre koşulları için hücreleri maruz. Kültüre 71 h sonra, hücreler EdU ile darbeli, sabit, geçirgen, ve DAPı ile lekelenmiş, EdU algılama için reaksiyon, bir ant...

Burada sunulan yöntemin amacı, mikroortam mikrodiziler (Mema) nasıl imal edilebilir ve kültürlü hücrelerin fenotürü üzerinde basit Kombinatoryal mikroortamlar binlerce etkisini sorgulamak için kullanılan göstermek için.

Kanser hücresel Phenotypes üzerinde Mikroçevresel etki Interrogate için Microdiziler kullanma

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Tümör mikroçevresini incelemek karmaşıklığı nedeniyle zordur. Tümör hücre fenotiplerinin ana sürücülerinin belirlenmesine olanak tanıyan basit kombinatorial mikroortamlardan oluşan mikroçevre mikrodizileri geliştirdik. MEMA platformunun en büyük avantajı, mikroçevre koşullarının tümü tanımlanmış olduğundan, ilgi nin fenotiplerini yönlendiren mikroçevre faktörlerini tanımlamanın kolay olmasıdır.MEMA platformu, primer hücre suşları ve kök hücreler de dahil olmak üzere diğer kanser dışı sistemlerde yaygın olarak uygulanabilir. Islık tezgah çağrılarını hızlandırmak ve protokolü basitleştirmek için geliştirdiğimiz bir dizi mühendislik hilesi ve adımı var. Başlamak için, hücre dışı matris baskı karışımını sekiz kuyuplakaya sabit noktalara yazdırmak için dokunmatik pimli yazıcı kullanın.Mikroçevre mikrodizileri için hücre dışı matrisi yazdırmak için dört kez-yedi baskı kafası yapılandırmasında düzenlenmiş 350 mikrometre çapındaki pimleri kullanın. Kollajen blok bir ızgara olarak MEMA üzerine basılır. PBS dolu kuyular, hücre dışı matris baskı karışımı kaynak plakasının kurumasını önlemek için ekstra nem sağlar.Dizileri sekiz kuyulu plakalara, toplam 700 nokta için 35 satıra 20 sütun halinde yazdırın. Baskıdan sonra, plakaları kullanmadan önce en az üç gün boyunca kurutucuda saklayın. İlk olarak, birçok MEMA plakasının tedavisinin aynı anda yapılabilmeleri için, dört aralıklı uçlu çok kanallı pipet kullanımına olanak tanıyan aralıklı 96 kuyuluk bir plaka düzeni tasarlayın.Sonra dondurucudan ligands almak ve bir laminar akış kaputunda buz içinde çözülür. Kısaca flick ve her tüp aşağı spin. Ligandları 200 kat çalışan bir stokla seyreltmek için üreticinin tavsiye edilen tamponu kullanın.Pipet 10 mikrolitre her 200-kez ligand stok 96-iyi plaka içinde ilgili kuyuiçine. Plakaları mühürlemek ve eksi-20 santigrat derecede saklamak için sızdırmazlık filmini kullanın. Ligand tedavi plakalarını gruplar halinde yapın ve akış aşağı analizi için tüm meta verileri yakalayın.Hücreleri çiftlemeden önce, 20 dakika boyunca kirlenmez engelleme tampon kuyubaşına iki mililitre ile MEMA'ları engelleyin. Aynı anda birden fazla kuyuda engelleme tamponu aspire etmek için iki Pasteur pipetleri ile bir Y-splitter kullanın ve sonra pbs ile kuyuları üç kez yıkayın. Kurutmayı önlemek için, hücre kaplaması için hazır olana kadar pbs'nin son hacmini kuyularda bırakın.Tam bir MEMA denemesiöncesinde, hücre titrasyonu deneyi yaparak MCF7 hücre tohumlama konsantrasyonu optimize edin. İdeal bir nokta, burada gösterildiği gibi, veri ayıklamak için yeterli hücre numaraları vardır, ama nokta aşırı confluent olduğunu çok değil. MEMA'da, kalan PBS ve tohum MCF7 hücrelerini 30, 000 ila 35, 000 hücreyi iki mililitrelik tohumlama ortamında alıto.MEMA'yı 37 derecede bir kuvöze yerleştirin. Kuvözde bir gecede yapvere den sonra, orta aspire ve belirli ligandların uyarıcı etkisini izole etmek için azaltılmış büyüme ortamı iki mililitre ile değiştirin. Sonra buz üzerinde daha önce dondurulmuş ligand tedavi plakası eritin.Santrifüj bir dakika için 200 kez g'de erimiş plaka. MEMA kültür plakasındaki her kuyudan 200 mikrolitre orta yı ligand arıtma plakasına uygun kuyuya aktarın. Pipet yukarı ve aşağı orta ile ligand karıştırmak ve mema kültür plaka uygun kuyuya bu karışımı geri aktarın.Elle hafifçe kayan ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit ligand-ECM kombinasyonu kültür için kuvöz MEMA plakaları dönmek. 71 saat sonra, 10 mikromolar son konsantrasyon için MEMA kuyuları için 100 kez EdU ekleyin. 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle bir saat daha kuluçkaya yatırın.Son kuluçkadan sonra, kuyuları aspire edin. MM'leri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %2 PFA'nın kuyusu başına iki mililitre de düzeltin. Sonra kuyulardan PfA aspire.15 dakika boyunca % 0.1 noniyonik yüzey aktif kuyu başına iki mililitre ile permeabilize. Sürfaktanas, ve sonra sırayla, PBS ve PBS-T iki mililitre ile kuyuları yıkayın. Bundan sonra, her kuyuya 1,5 mililitre EdU algılama reaksiyonu reaktifi ekleyin.Oda sıcaklığında bir saat kuluçka, sallanan ve ışıktan korunmaktadır. Sonra iyi başına 1.5 mililitre ticari söndürme tampon ile reaksiyon söndürmek. Tekrar aspire edin ve en iyi şekilde boya veya antikor konsantrasyonları ile kuluçkaya yatırmadan önce PBS-T ile yıkayın.Mema,tamponun boyanmasında birincil antikorlara sahip, bir gecede dört derece santigrat derecede sallayarak MEMA kuyularını inkübün. Primer antikor inkübasyonundan sonra kuyuları PBS ve ardından PBS-T ile yıkayın. Mililitre DAPI başına 0,5 mikrogram ikincil antikorlar ekleyin, boyama tampon seyreltilmiş.Kuluçka, karanlıkta oda sıcaklığında bir saat sallanan. Kuyuları pbs kuyusu başına iki mililitre ile iki kez yıkayın ve pbs'nin son iki mililitresinde bırakın. Lekeli MEMA'yı görüntülemek için, uygun floresan algılama kanallarına sahip otomatik görüntüleme sisteminin mikroskop aşamasına yerleştirin.Görüntü yönetim sistemine çıkan görüntü verilerinin çıktısı. Hücreleri segmente edin ve CellProfiler kullanarak yoğunluk düzeylerini hesaplayın. Bu protokolde, binned DAPI yoğunluk değerlerinin hücre döngüsü profilleri ile sekiz kuyulu bir plakadan alınan hücre sayıları G1 ve G2 hücre döngüsü fazındaki hücreleri gösterir.Bu, erken büyüme evresinde hücrelerdeki iki nDNA içeriğine ve mitoz bölünmek üzere olan hücrelerdeki dört nDNA içeriğine karşılık gelir. Ligandların ve ECM'lerin mikro ortamının hem hücre numarası hem de EdU dahili olması üzerindeki etkisi gösterilmiştir. Kırmızı daha yüksek hücre numarasını gösterir ve mavi daha düşük hücre numarasıdır.Etkileri çoğu ligand odaklı, ECM durumu güçlü hücre numarası veya EdU pozitifliği etkilemedi gibi. Natagen 1 açık bir istisna, Bu ECM molekülün varlığı hücre bağlanması ve MCF7 büyümesini inhibe olarak. FGF6 ve neuregulin-1 alfa gibi ligandlar hücre sayısını artırır ve yüksek EdU birleşme oranlarına sahiptir, amphiregülin ve neuregulin-1 SMDF gibi ligandlar hücre bağlanmasını ve hücrelerin büyümesini engeller.Neuregulin-1 alfa ile tedavi edilen bir MEMA yerinde büyüyen MCF7 hücrelerinin bir örneği, pembe çekirdekleri ile gösterilen yüksek EdU birleşme oranlarını göstermektedir. Bu resimde, yeşil leke hücre maskesi ve mavi DAPI olduğunu. Tam bir MEMA deneyi pahalı olduğundan, tam denemeyi gerçekleştirmeden önce hücre ve serum titrasyonları gibi optimizasyon adımlarını gerçekleştirmek çok önemlidir.Mema platformu kullanılarak mikroçevresel koşullar tanımlandıktan sonra, spesifik ligandlar ve hücre dışı matriks proteinleri geleneksel 2D ve 3D hücre kültür sistemleri kullanılarak daha derinlemesine incelenebilir.

using-microarrays-to-interrogate-microenvironmental-impact-on

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Hücresel fonksiyonları üzerinde mikro moleküler bileşim etkileri ilgili bilgi sağlamak için bir kombinatoryal fonksiyonel tarama yöntemi tarif edilmektedir. Yöntemi hücre yapışması ve fonksiyonel analiz destekleyen tanımlı Kombinatoryal mikroçevrelerde diziler oluşturmak için varolan mikroarray tabanlı teknolojileri yararlanır.

Fabrikasyon ve mikroçevresindeki microarrays Kullanımı (MEArrays)

Bu videoda, spesifik gen ekspresyonunu ölçmek için antikor mikrodizisi kullanarak miRNA transfekte edilmiş akciğer kanseri hücrelerindeki protein ekspresyonunu inceleme tekniği açıklanmaktadır. Özellikli protokolde, hücre döngüsünü ve anjiyogenezi durdurmada kombinatoryal bir miRNA tedavisinin aktivitesinin tanımlanması için antikor mikrodizisi gerçekleştiriyoruz.

Antikor mikrodizisi: miRNA ile tedavi edilen akciğer kanseri hücrelerinin protein ekspresyonunu incelemek için bir teknik

Hücresel süreçlerin bir sistem düzeyinde anlayış elde günümüz hücre biyolojisi bir hedeftir. Burada çeşitli hücresel fonksiyonunun çoklama lusiferaz gazetecilere yönelik stratejiler tarif son noktaları genom ölçekli RNAi kütüphaneleri kullanılarak gen işlevini sorgulamak için.

Kültür Hücreler Kanser ile ilişkili Sinyal İletimi sorgulanması için bir Multiplexed Lusiferaz tabanlı Tarama Platformu

Östrojen ve mikroRNA'lar hem aracılığıyla sinyal Moleküler meme kanseri gelişiminde ve büyümesinde önemli olan. Östrojen transkripsiyon faktörleri olan östrojen reseptörleri aktive eder. Pek çok transkripsiyon faktörleri microRNA ekspresyonunu düzenleyen ve estrojen ile düzenlenen microRNA farklı büyük ölçekli teknikler kullanılarak profilli olabilir.

Meme Kanseri Hücrelerinde östrojen düzenlenmiş microRNA profil

Tümör mikroçevresini (TME) taklit etmek için geçirgen bir mikro gözenekli membran ekini uyarladık. Model, karışık bir hücre kültüründen oluşur, floresan etiketleme veya hücre sıralama kullanmadan yüksek oranda zenginleştirilmiş bireysel hücre popülasyonlarının basitleştirilmiş üretimine izin verir ve normal veya stres koşulları altında TME içinde hücreler arası iletişimin incelenmesine izin verir.

Tümör mikroçevresinin A Mimik: Hücreler arası İletişim Zenginleştirilmiş hücre popülasyonları oluşturma ve incelenmesi için Basit Bir Yöntem

Hücre farklılaşması, iki matris bileşimi ve substrat malzeme özellikleri de dahil olmak üzere mikro-çevresel faktörlerin, bir ana bilgisayar tarafından kontrol edilir. Biz burada hücre farklılaşması ve microenvironmental bağlamında bir fonksiyonu olarak biyomekanik hücre substrat etkileşimleri hem değerlendirmek için çekiş kuvvet mikroskobu ile birlikte hücre mikrodiziler kullanan bir tekniği açıklar.

Hücre farklılaşması ve Çekiş Kuvvetleri Korelatif Analizi için Yüksek verim Hücre Mikroarray Platformu

Burada ayırmak ve kurulan subkutan tümörler tümör bağışıklık ve non-immün microenvironment bileşenlerinin zenginleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik tümör bağışıklık sızmak ve tümör bağışıklık microenvironment kapsamlı karakterizasyonu izin verebilir non-immün tümör kesirler ayrı analiz için sağlar.

Zenginleştirme ve kurulan subkutan fare tümör tümör bağışıklık ve Non-immün Microenvironments karakterizasyonu

Burada, bir protokol sinyal yolları çeşitli hücresel modellerinde değişiklikler tanımlamak antikor diziler için mevcut. Uyuşturucu/hipoksi/ultra-violet ışık/radyasyon, veya overexpression/downregülasyon/altını gizleme, neden bu değişiklikleri çeşitli hastalık modelleri için önemlidir ve bir tedavi etkili olacak veya mekanizmaları ilaçların belirleyebilirsiniz olup olmadığını gösterir direnç.

Direnç Tirozin kinaz inhibitörleri sinyal iletim yollarının antikor dizileri tarafından bir sorgulama tarafından değerlendirilmesi

miRNA tedavi kanser ilerleme düzenlenmesinde önemli potansiyele sahip. Aşağıda gösterildiği analitik yaklaşımlar hücre döngüsü ve anjiogenezi durdurma içinde bir birleşimsel miRNA tedavi faaliyetinin tanımlaması için kullanılır.

Kombinatorik miRNA düzenleyen hücre döngüsü ve anjiogenezi tedavilere analizi

Bu el yazması, tümör hipoksisinin metastaz üzerindeki etkilerinin doğrudan test edilmesine ve etki mekanizmalarının deşifre edilmesine izin veren bir hayvan modelinin geliştirilmesini açıklamaktadır. Burada açıklanan deneyler Ewing sarkomuna odaklansa da, benzer bir yaklaşım diğer tümör tiplerine de uygulanabilir.

Tümör metastaz üzerinde Hipoksi Test Etkisinin Vivo Modeli

Öğrenin mikroçevre mikrodizileri (MEMA) kullanarak kanser hücre fenotiplerini nasıl inceleyeceğinizi. Bu yöntem tümör davranışlarını etkileyen faktörleri belirlemeyi kolaylaştırır ve doku mühendisliği araştırmalarına katkı sağlar.

Kanser hücresel Phenotypes üzerinde Mikroçevresel etki Interrogate için Microdiziler kullanma

Daha fazla video keşfet