Name: Calvaria Co-culture ve Histomorfometri Kullanarak Kemik Remodeling ve Tümör-Kemik Mikroortamı yeniden oluşturma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Keşfedin kemik remodelasyonunu ve tümör-kemik mikroortamını yeniden oluşturmayı yeni doğan farelerden izole edilen kalvaria eks vivo kültürü ile. Bu yöntem ilaç etkilerini değerlendirmek için basit ve düşük maliyetli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, mario Nomura, M.D. ve Rodolfo Díaz histoloji ile ilgili yardımları için teşekkür eder ve Pierrick Fournier, Ph.D. onun değerli yorum için kağıt kalitesini artırmak için.

Bu tahlillerde kullanılan tüm fareler BALB/c fare suşlarından elde edilip, erkek ve dişi farelerin gelişigüzel kullanılmasına neden oldu. Önceki kültür deneyleri de FVB, İsviçre fareler, CD-1 ve CsA fareler11,,12,14gibi diğer suşları kullanılarak yapılmıştır. Tüm fareler Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) yönergelerine göre barındırıldı, Ek S. Hayvan denekleri içeren prosedürler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından Ensenada Bilimsel Araştırma ve Yüksek Öğretim Merkezi (CICESE) tarafından onaylanmıştır.
1. Kalvariyal diseksiyon
<ol><li>Diseksiyon aletlerini (örn. 1 x 2 diş doku kasları, düz cerrahi makas, diseksiyon makasları, ince uçlu cımbızlar, ince kavisli uçlu kesme terpler, diseksiyon perçeleri, neşter) sterilize edin. Steril distile su her diseksiyon arasındaki cerrahi araçları temizlemek için kullanılabilir ve steril 1x PBS her hemi-calvaria temizlik için kullanılabilir.</li>
	<li>Steril diseksiyon aletleri, su, 1x PBS ve prosedürü gerçekleştirmek için gerekli malzemeleri (örn. mikro pipetler, çökelti gözlükleri, steril Petri kaportaları) laminar akış kaputuna yerleştirin. NOT: Tüm prosedürü steril koşullarda gerçekleştirin.</li>
	<li>İki 10 cm Petri kabına 12 mL steril 1x PBS ekleyin.</li>
	<li>Yavruları seçin ve kaputun yakınına yerleştirin. NOT: 5-7 günlük yavrulardan kalvariaları inceleyin.</li>
	<li>Kesme forceps kullanarak fareyi dikkatlice seçin ve tutun.</li>
	<li>Kesme makası kullanarak farenin kafasını koparın ve başı PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin. NOT: Decapitation yaşlı fareler için uygun değildir. Deney daha yaşlı farelerle yapılacaksa, ötanazi yöntemi hayvan deney kurallarına göre değiştirilmelidir.</li>
	<li>1 x 2 diş dokusu forceps ile burun bölgesi tarafından sıkıca baş tutun ve calvaria görünür olana kadar kafatası üzerinde deri çıkarın.</li>
	<li>Maruz kalan kalvariüzerinde kafatasının dikişlerini (yani sagittal, koronal ve lambdoid) tanımlayın.</li>
	<li>Lambdoid sütür arkasında yaklaşık 2 mm mikrosksorucu ucu ile nüfuz ve yanında düz bir kesim yapmak.</li>
	<li>Kafatasının arka tarafına mikrosksorsucu ucu nu yerleştirin. Koronal sütür doğru lambdoid sütür distal tarafı boyunca düz bir kesim olun. Diğer lambdoid dikiş ile benzer devam edin.</li>
	<li>Ön fontanel kesim ile yapılan kesim sonunda bağlamak için başka bir kesim (45 ° açıyla) olun.</li>
	<li>Diğer lambdoid sütür ile 1.10 ve 1.11 adımlarını tekrarlayın. NOT: Uygun kesimler yapmak ve yeterli katıştırma ve veri analizi yapabilmek için dikişleri belirlemek önemlidir.</li>
	<li>Calvaria kaldırmak ve bir Petri kabına yerleştirmek için ince uçlu forceps kullanın. Bir neşter ile, koronal sütür ile sagittal sütür boyunca posterior fontanel düz bir kesim yapmak ve iki hemi-calvarias elde etmek için ön fontanel biten.</li>
	<li>İnce uçlu cımbızile hemi-calvarias her almak ve PBS içeren yeni bir Petri kabına yerleştirin.</li>
</ol>2. Calvaria kültürü
<ol><li>24 kuyunun kuyularına %0.1 büyükbaş hayvan serum albumini (BSA) ve %1 antibiyotik/antimikotik (yani penisilin ve streptomisin) ile takviye edilmiş 1 mL yüksek glukozlu DMEM ortamı ekleyin. İnce uçlu forceps ile, her hemi-calvaria almak ve bir kuyuya yerleştirin. NOT: Hemi-calvarias içbükey tarafını aşağı koyun.</li>
	<li>Hemi-kalvarileri %5 CO2ile 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Kültür ortamını her kuyudan çıkarın ve diğer hücrelerden test etmek veya koşullandırılmış ortam için bileşiği içeren 1 mL taze ortam ekleyin. NOT: Her tedavi grubu için en az üç hemi-kalvarikullanın ve negatif ve pozitif kontroller kullanın.</li>
	<li>Hemi-kalvarileri 7 gün kuluçkaya yatırın, 2-3 günde bir ortam değiştirin.</li>
</ol>3. Kanser hücreleri ile Kültür
<ol><li>%80-90 oranında kanser hücrelerinin birleştiği bir Petri kabı seçin ve onları deneyin. Tripsin için kanser hücrelerini 1 x PBS (75 cmbaşına 5 mL 2 şişe) kullanarak yıkayın ve ardından %0.05 tripsin ve 0.53 mM EDTA (75 cm2 şişede 2 mL) içeren HBSS çözeltisinde kuluçka yada kuluçka yada sın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonuna 15 mL konik tüp ve 800 x g'de oda sıcaklığında 5 dakika (RT) aktarın.</li>
	<li>Supernatant'ı çıkarın ve atın.</li>
	<li>%2 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 antibiyotik/antimikotik içeren 2 mL DMEM'deki peleti yeniden askıya alın. Canlı hücreleri say.</li>
	<li>Her çalışma grubuna hemi-kalvarias atayın (yani RNA veya histoloji analizi için negatif kontrol ve kokültür grubu).</li>
	<li>Kültür ortamını hemi-kalvarilerden çıkarın ve %2 FBS ve %1 antibiyotik/antimikotik içeren 1 mL DMEM ekleyin veya kanser hücreleriyle desteklenmez. NOT: Eklenecek hücre miktarı, test edilen hücre satırına bağlı olarak değişebilir. MDA-MB-231 veya PC-3 gibi kanser hücreleri ile, iyi başına 500.000 hücreleri uygun çalışır.</li>
	<li>37 °C'de %5 CO2ile 24 saat kuluçka . Kemik dokusuna yapışan sadece kanser hücrelerini korumak için yeni bir kuyuya her hemi-calvaria geçirin.</li>
	<li>%5 CO2 ile 37 °C'de 7 gün kuluçkaya yatırın ve 2-3 günde bir ortamı değiştirin.</li>
</ol>4. Fiksasyon
<ol><li>Hemi-calvarias sarmak için kağıt mendil kareler kesin. NOT: Küçük biyopsiler için biyopsi köpük pedleri veya çelik kapsüller de kullanılabilir.</li>
	<li>Sagittal sütür her hemi-calvaria almak için düz ince uçlu forceps kullanın, bir doku kağıt üzerine yerleştirin, ve sarın.</li>
	<li>Sarılmış hemi-calvaria etiketli bir gömme kaset içine yerleştirin.</li>
	<li>Kaseti %10 fosfat tamponlu formalin içeren bir kaba yerleştirin.</li>
	<li>4 °C'de 24 saat için düzeltin.</li>
</ol>5. Kireçlenme
<ol><li>Formalin çıkarın, 1x PBS ekleyin ve hemi-calvarias durulamak için 30 dakika boyunca dokuları ajite.</li>
	<li>PBS'yi çıkarın ve %10 EDTA ekleyin (pH = 8, 0,34 M). NOT: Çözümün dokuları tamamen kapsadığını doğrulayın.</li>
	<li>4 °C'de 48 saat dokuları dekalsite edin.</li>
	<li>EDTA çözeltisini atın ve doymak için 1x PBS ekleyin.</li>
	<li>Histoloji işlemine kadar hemi-kalvarileri %70 etanolde saklayın.</li>
</ol>6. Doku işleme
<ol><li>% 96 etanol, 60 dakika (3x), % 100 etanol, 60 dakika (3x) tur ile dokuları dehydrate.</li>
	<li>Etanol% 100 ksilen, 60 dakika (3x) ile değiştirin.</li>
	<li>Parafin balmumu, 60 dk (2x) kasetler kuluçka.</li>
</ol>7. Gömme
<ol><li>Kasetleri açın, kağıt mendilini dikkatlice çıkarın ve calvaria'yı açın.</li>
	<li>Her calvaria dikkatle almak ve aynı oryantasyon da aynı gruptan tüm hemi-calvarias yığını.</li>
	<li>Kalıba biraz parafin koy.</li>
	<li>Tüm hemi-calvarias'ları çifenler ile toplayın ve kalıbın tabanına doğru sagittal sütür ile kalıbın içine yerleştirin. NOT: Dahil sırasında kalıptaki hemi-kalvarilerin oryantasyonu tutarlı histolojik kesitler ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için çok önemlidir, çünkü bu oryantasyon kalvarilerden ön ve parietal kemiklerin posterior olarak tanımlanmasına olanak sağlar. ve koronal sütür kantitatif değerlendirmeyi kolaylaştırır.</li>
	<li>Forceps bırakın ve hemi-calvarias yerinde kalmak doğrulayın.</li>
	<li>Etiketli kaseti kalıbın üzerine yerleştirin ve hemi-calvarias'ı kapsayacak şekilde daha fazla parafinle doldurun.</li>
	<li>Kalıpları soğuk yüzeye taşıyın.</li>
</ol>8. Kesitleme
<ol><li>Mikrotom ile sagittal sütür 500-600 μm trim.</li>
	<li>4 μm kalınlığında kesin ve gerekli bölümleri toplayın.</li>
	<li>300 μm daha kırpın.</li>
	<li>Kesip altı 4 μm kalınlığında kesin.</li>
	<li>Bloğu 300 μm daha fazla kırpın ve daha fazla kesit toplayın.</li>
	<li>Bölümleri cam mikroskop slaytlarına monte edin.</li>
	<li>Slaytları RT'de kurutun.</li>
</ol>9. Boyama
<ol><li>3 dakika için% 100 xylene bölümleri batırın.</li>
	<li>1 dakika boyunca % 100 etanol batırın.</li>
	<li>1 dakika için% 96 etanol birleştirin.</li>
	<li>1 dakika boyunca % 80 etanol batırın.</li>
	<li>1 dakika boyunca % 70 etanol batırın.</li>
	<li>3 dakika suda durulayın.</li>
	<li>3 dakika hematoksilin batırın.</li>
	<li>Bölüm temizlenene kadar suda durulayın.</li>
	<li>10 sn için doymuş lityum karbonat çözeltisine batırın.</li>
	<li>3 dakika suda durulayın.</li>
	<li>1 dakika boyunca % 96 etanol batırın.</li>
	<li>3 dakika boyunca eozin batırın.</li>
	<li>1 dakika boyunca %96 etanol batırın.</li>
	<li>1 dakika boyunca % 100 etanol batırın.</li>
	<li>3 dk için% 100 xylene batırın.</li>
	<li>Slayta montaj ortamı başına biraz ekleyin ve bir kapak kayma ile koruyun. NOT: Osteoklast ve osteolizi değerlendirmek için hematoksilin ve eozin (H&E) lekesini tartaratdirençli asit fosfataz (TRAP) boyama ile tamamlayabilirsiniz.</li>
</ol>10. Nicel değerlendirme: analiz alanının tanımlanması
<ol><li>Oryantasyonu ve dikişleri tanımlamak için düşük güç altındaki bölümleri (yani 4x) inceleyin.</li>
	<li>Koronal sütür tanımlayın ve bir tarafta uzun kemik yüzeyi ve diğer kısa yüzeyi tanımlayın.</li>
	<li>40x büyütme altında koronal sütür tanımlayın ve uzun yüzey boyunca dikiş uzak iki veya üç optik alanları hareket ettirin. Analiz için bu alanın görüntülerini yakalayın.</li>
	<li>Eski kemik bölgesini ve yeni kemik bölgesini tanımlayın. Turuncu G lekeleri ile eozin Y eski kemik koyu ve yeni kemik çakmak lekeleri.</li>
	<li>Renk eşik aracını kullanarak Image J yazılımı ile eski ve yeni kemiğin toplam kemik alanını ölçün. Sonuçları μm2olarak ifade edin.</li>
</ol>11. Veri analizi
<ol><li>Sonuçları istatistiksel yazılımkullanarak analiz edin. Gruplar arasındaki önemli farklar uygun testler kullanılarak belirlenebilir (örn. herel yapıldığı gibi parametrik olmayan Mann-Whitney U testi).</li>
</ol>

<ol><li>Boyce, B. Bone biology and pathology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoyce%2C+B+%22Handbook+of+Cancer-Related+Bone+Disease%22">Handbook of Cancer-Related Bone Disease</a>. Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. , 3-21 (2012).</li>
<li>Clark, R. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClark%2C+RK+%22Anatomy+and+Physiology%3A+Understanding+the+Human+Body%22">Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body</a>. 474, Jones & Bartlett Learning. (2005).</li>
<li>Fournier, P. G. J., Juárez, P., Guise, T. A. Tumor-bone interactions: there is no place like bone. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFournier%2C+PGJ+%22Bone+Cancer%3A+Primary+Bone+Cancers+and+Bone+Metastases%22">Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases</a>. Heymann, D. , 13-28 (2014).</li>
<li>Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stephen+Paget+and+the+%22seed+and+soil%22+theory+of+metastatic+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Stephen Paget and the "seed and soil" theory of metastatic dissemination.</a> Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).</li>
<li>Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vicious+cycle+of+bone+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Musculoskeletal+%26+Neuronal+Interactions%22%5BJournal%5D)">The vicious cycle of bone metastases.</a> Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).</li>
<li>Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of bone metastasis.</a> Cancer. 80 (8), 1546-1556 (1997).</li>
<li>Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+to+bone%3A+causes%2C+consequences+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).</li>
<li>Chong, S. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+bone+metastasis%3A+Opportunities+for+the+study+of+cancer+dormancy%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).</li>
<li>Deguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+model+of+bone+to+facilitate+measurement+of+adhesion+forces+and+super-resolution+imaging+of+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts.</a> Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).</li>
<li>Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+ex+vivo+explant+cultures%3A+applications+in+bone+research%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEY+Reports%22%5BJournal%5D)">Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research.</a> BoneKEY Reports. 5, 818(2016).</li>
<li>Nordstrand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+validation+of+an+in+vitro+coculture+model+to+study+the+interactions+between+bone+and+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).</li>
<li>Curtin, P., Youm, H., Salih, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cancer-bone+metastasis+model+using+ex+vivo+cocultures+of+live+calvaria+bones+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells.</a> Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).</li>
<li>Garret, R. Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarret%2C+R+%22Bone+Research+Protocols%22">Bone Research Protocols</a>. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana press. Totowa, New Jersey. 183-198 (2003).</li>
<li>Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+new+bone+formation+in+neonatal+calvarial+organ+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan.

Burada, kemik oluşumunu veya rezorpsiyonlarını değerlendirmek ve kanser hücrelerinin kalvarial fare kemiği ile etkileşimlerini incelemek için kalvarial ex vivo modelinin protokolünü açıklıyoruz. Bu tekniğin kritik adımları kalvariaların diseksiyon, kültür, katıştırma ve histomorfometrik analizidir. Calvarias diseksiyon sırasında, bir yamuk içine hemi-kalvarias kesmek için çok önemlidir, bu kuvvetle parafin dahil sırasında yönünü kolaylaştıracak gibi. Calvarias ile kanser hücresi etkileşimleri incelerken, bu kemi...

Kemik, kasların desteklenmesi, iç organların ve kemik iliğinin korunması, kalsiyum ve büyümefaktörlerinin,depolanması ve serbest bırakılması dahil olmak üzere çeşitli işlevleri olan dinamik bir bağ dokusudur.2 Bütünlüğünü ve uygun işlevini korumak için, kemik dokusu sürekli remodeling süreci altındadır. Genel anlamda, kemik remodeling döngüsü kemik rezorpsiyonu ve kemik oluşumu1ayrılabilir. Kemik remodeling bu iki aşamaları arasında bir dengesizlik kemik patolojilerinin gelişmesine yol açabilir. Ayrıca, meme kanseri gibi hastalıklar genellikle kemik bütünlüğünü etkiler; ileri evrelerde hastaların yaklaşık %70'inde kemik metastazı vardır veya olacaktır. Meme kanseri hücreleri kemiklere girdiğinde, kemik metabolizmasını etkiler, aşırı rezorpsiyon (osteoklastik lezyonlar) ve /veya oluşum (osteoblastiklezyonlar)ile sonuçlanır 3 .
Kemik hastalıklarının biyolojisini anlamak ve yeni tedaviler geliştirmek için kemik remodeling ile ilgili mekanizmaları anlamak gerekir. Kanser araştırmalarında kemik metastazı prosesi ve metastatik mikroçevre ile ilişkisi nin araştırılması esastır. 1889 yılında, Stephen Paget metastaztümör hücreleri ve hedef doku arasında uyumluluk olduğunda meydana geldiğini hipotez, ve metastatik site mikroçevre için tümörün yakınlık bağlıdır önerdi4. 1997 yılında, Mundy ve Guise tümör hücrelerinin hayatta kalma ve büyüme elde etmek için kemik mikroçevre değiştirmek nasıl açıklamak için "kemik metastazlarının kısır döngüsü" kavramını tanıttı, ve nasıl kemik mikroçevre kalsiyum ve büyümefaktörlerisağlayarak büyümesini teşvik 5,6,7.
Kemik remodeling ve kemik metastazı ile ilgili mekanizmaları karakterize etmek ve olası terapötik potansiyele sahip molekülleri değerlendirmek için in vitro ve in vivo modellerin geliştirilmesi gerekmektedir. Ancak, bu modeller şu anda kemik mikroortamının basitleştirilmiş temsili gibi birçok sınırlamalar mevcut, ve maliyet8,9. Kemik eksektis ex vivo kültürü, kemik hücrelerinin çeşitliliğinin yanı sıra üç boyutlu organizasyonu koruma avantajına sahiptir. Buna ek olarak, deneysel koşullar kontrol edilebilir. Eksplant modelleri metatarsal kemikler, femoral kafaları, calvarias ve mandibular veya trabeküler çekirdek10kültürünü içerir. Ex vivo modellerinin avantajları çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir. 2009 yılında, Nordstrand ve işbirlikçileri kemik ve prostat kanseri hücreleri arasındaki etkileşimleri dayalı bir coculture modelinin kurulması bildirdi11. Ayrıca, 2012 yılında, Curtin ve işbirlikçileri ex vivo cocultures12kullanarak üç boyutlu bir modelin geliştirilmesi rapor . Bu tür ex vivo modellerinin amacı, normal veya patolojik kemik remodeling inde yer alan mekanizmaları karakterize edebilmek ve yeni terapötik ajanların etkinliğini değerlendirmek için kemik mikroortamının koşullarını mümkün olduğunca doğru bir şekilde yeniden oluşturmaktır.
Bu protokol Garrett13 ve Mohammad ve ark.14tarafından yayınlanan prosedürlere dayanmaktadır. Yenidoğan fare kalvari kültürleri deneysel bir model olarak kullanılmıştır, onlar geliştirme ve kemik hücreleri altında kemik üç boyutlu mimarisi korumak gibi, farklılaşma tüm aşamalarında hücreleri de dahil olmak üzere (yani, osteoblastlar, osteositler, stromal hücreler) olgun osteoklastlar ve osteoblastlar yol, yanı sıra mineralize matris14. Ex vivo modeli kemik hastalıklarının patolojik sürecini tam olarak temsil etmez. Ancak, kemik remodeling veya kansere bağlı kemik osteoliz üzerindeki etkileri doğru ölçülebilir.
Kısaca, bu protokol aşağıdaki adımlardan oluşur: 5-7 günlük fareler, calvaria preculture, calvaria kültür uygulamaları (örneğin, insülin varlığında kültür, kanser hücreleri veya şartlı orta ve hatta ajanlar gelen kalvarias diseksiyon terapötik potansiyel, araştırma amacına göre), kemik fiksasyonu ve kalsifikasyon, doku işleme, histolojik analiz ve sonuç yorumu.

<table><tbody><tr><td>24 kuyulu hücre kültürü</td><td>Corning</td><td>CLS3524</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu doku dışı kültür</td><td>Falcon</td><td>15705-060</td><td></td></tr><tr><td>2 mL kriyoviyal</td><td>SSI</td><td>2341-S0S</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotikler-Antimikotik</td><td>Corning</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Biowest</td><td>P6154-100GR</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>22628188</td><td>Santrifüj 5810R</td></tr><tr><td>Lameller</td><td>Corning</td><td>2935-24X50</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal reçinesi</td><td>Richard Allen</td><td>8310-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td></td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Eagles Medium, 4.5 g/L glikoz ve L-glutamin ile, sodyum piruvat olmadan</td><td>Modifikasyonu Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun PBS (10X)</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ebedding Kasetleri</td><td>Sigma</td><td>Z672122-500EA</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Golden</td><td>26400</td><td></td></tr><tr><td>Gömme İş İstasyonu</td><td>Thermo Scientific</td><td>A81000001</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Golden</td><td>60600</td><td></td></tr><tr><td>Etanol mutlak</td><td>JALMEK</td><td>E5325-17P</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Biowest</td><td>BIO-S1650-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtreler</td><td>Corning</td><td>CLS431229</td><td></td></tr><tr><td>Forseps ve makas</td><td>LANCETA HG</td><td>74165</td><td></td></tr><tr><td>Formalin tamponlu %10</td> <td>Sigma</td><td>HT501320</td><td></td></tr><tr><td>Cam slaytlar 25 x 75 mm</td><td>Premiere</td><td>9105</td><td></td></tr><tr><td>Harris'in Hematoksilen</td><td>Jalmek</td><td>SH025-13</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek profilli bıçaklar</td><td>Thermo Scientific</td><td>1001259</td><td></td></tr><tr><td>Histoquinet</td><td>Thermo Scientific</td><td>813150</td><td>STP 120</td></tr><tr><td>Sığır pankreasından insülin</td><td>Sigma</td><td>16634</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>ZEISS</td><td>Axio Scope.A1</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Thermo Scientific</td><td>905200</td><td>MICROM HM 355S</td></tr><tr><td>Fare maması, %18 prot, 2018S</td><td>Harlan</td><td>T.2018S.15</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer</td><td>VWR</td><td>631-0696</td><td></td></tr><tr><td>Turuncu G Biyotemel</td><td></td><td>OB0674-25G</td><td></td></tr><tr><td>Parafin Paraplast</td><td>39601006</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafin Bölümü Flotasyon Banyosu</td><td>Elektrotermal</td><td>MH8517X1</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Corning</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Phloxin B</td><td>Probiotek</td><td>166-02072</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-051-CI</td><td></td></tr><tr><td>Balmumu dağıtıcı</td><td>Elektrotermal</td><td>MH8523BX1</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Altın</td><td>534056-500ML</td><td></td></tr></tbody></table>

calvaria co-culture ve histomorfometri kullanarak kemik remodeling ve tümör-kemik mikroortamı yeniden oluşturma

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Kemik osteoblastlar, osteositler ve osteoklastlar oluşan bir bağ dokusu ve onun güç ve esneklik verir ve işlevlerini yerine getirmek için izin veren bir mineralize ekstrasellüler matris vardır. Kemik sürekli olarak çeşitli uyaranlara maruz kalır ve patolojik koşullarda kemik remodelingini bozabilir. Kemik biyolojisi ve hastalıkları nın incelenmesi ve potansiyel terapötik ajanların değerlendirilmesi için in vitro ve in vivo modellerin geliştirilmesi gerekmektedir.
Bu makale, kemik oluşumu nu ve kemik tümörü mikroçevresini incelemek için neonatal farelerden izole edilen kalvariaların diseksiyon sürecini ve kültür koşullarını açıklamaktadır. In vitro ve in vivo modellerin aksine, bu ex vivo modeli istenilen mikroortamı simüle etmek için tanımlanmış koşullar altında kültürleme sırasında dokununma sırasında dokunun üç boyutlu ortamının yanı sıra kemik hücresel çeşitliliğin korunmasına olanak sağlar. Bu nedenle, kemik remodeling ve mekanizmaları, yanı sıra diğer hücre tipleri ile etkileşimleri araştırmak mümkündür, kanser hücreleri ve kemik arasındaki etkileşimler gibi.
Burada bildirilen tahliller 5-7 günlük BALB/C farelerden calvarias kullanır. Elde edilen hemi-kalvarias insülin varlığında kültürlü, meme kanseri hücreleri (MDA-MB-231), ya da meme kanseri hücre kültürlerinden klimalı orta. Analizden sonra insülinin yeni kemik oluşumuna neden olduğu, kanser hücreleri ve bunların şartlı orta indüklenen kemik rezorpsiyonu olduğu saptandı. Kalvarial model, kemik gelişimi ve kansere bağlı kemik hastalıklarının araştırılmasında temel ve uygulamalı araştırmalarda başarıyla kullanılmıştır. Genel olarak, kolay, bilgilendirici ve düşük maliyetli bir teşp için mükemmel bir seçenektir.

Kalvarial modelde kemik oluşumunu değerlendirmek için hemi-kalvariaları 50 g/mL insüliniçeren veya olmayan ortamda yetiştirdik. Doku bölümleri hazırlandı ve H&amp;E ile boyandı. Bu koşullarda histoloji, kalvariyal kemiğin yapısal bütünlüğünün korunarak farklı bileşenlerinin tanımlanmasına olanak sağladığını göstermiştir(Şekil 1). İnsülin ile tedavi edilen kalvariler kontrole göre kemik dokusu miktarında artış gösterdiler (Şekil 2...

Kemik eksektijinin ex vivo kültürü kemik fizyolojisi ve kemik remodeling ve kemik hastalıklarında ilaçların potansiyel değerlendirilmesi çalışmaları için değerli bir araç olabilir. Sunulan protokol, yeni doğan fare kafataslarından izole edilen calvariaların hazırlanmasını ve kültürünün yanı sıra uygulamalarını da açıklamaktadır.

Calvaria Co-culture ve Histomorfometri Kullanarak Kemik Remodeling ve Tümör-Kemik Mikroortamı yeniden oluşturma

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Bu işlemin amacı, kemik remodeling değerlendirmek ve tümör-kemik mikroçevre calvaria kültürü veya kanser hücreleri ile co-kültür kullanarak yeniden oluşturmak için bir ex vivo modeli olmasıdır. Kalvari tekniğinin çoğu, kemik remodelingini değerlendirmek için yenidoğan farelerden kalvaria kemikleri kullanan bir organ kültür sistemidir. Farklı moleküllerin terapötik potansiyelini test edebilir, hatta kanser hücreleri ile co-kültürleri kullandığınızda kemik tümörü mikroortamı yeniden.Tüm bu kısa bir süre ve düşük bir maliyetle basit ve kolay bir tayiş. Bu tekniğin amacı, fare kalvariyal organ kültürünün ex vivo modelini kullanarak, kanser kemik mikroortamında kemik rejenerasyonu değerlendirmek için bir araç olmasıdır. İlk olarak, bir fare yavrusu seçin ve başlık altına yerleştirin.5-7 günlük fare yavrularından calvaria kullanıyoruz. Şırıngayla baş alın, deriyi kesin ve kalvariyi incelemek için kafa derisi alanını temizleyin. Kafatası, sagittal, koronal ve lambdoids dikişleri tanımlayın.Göz seviyesine lambdoid dikişler boyunca düz bir kesim yapmak. Lambdoid sütürlerden koronal dikişe doğru her iki tarafı da kesin. 45 açı, ön fontanel kesim ile yapılan kesim ucunu bağlamak için başka bir kesim yapmak.Doğru doku dahil etme ve histoloji analizini garanti altına almak için kafatası sütür, sagittal, frontal, koronal, lambdoid tanımlamak son derece önemlidir. Ince ipuçları forceps ile, calvaria çıkarın ve petri çanak kapağı üzerine koyun. Bir neşter ile, koronal sütür ile sagittal sütür boyunca posterior fontanel düz bir kesim yapmak.İki hemicalvarias elde edilir. Her calvaria'yı çifenler ile toplayın ve PBS'li yeni bir Petri kabına yerleştirin. Kültür için, 24-iyi doku kültür plakası, medya bir mililitre içeren hemicalvaria yerleştirin ve 37 derece 24 saat kuluçka.Ayrıca kemik rezorpsiyonu için tümör-kemik mikroçevresini yeniden üretmek için birincil kalvarial kültürleri de kullanabiliriz. Bunu yapmak için, biz kanser hücreleri ile ortak kültür calvarias, ya da kanser hücrelerinden koşullu medya ile. 24 saat sonra, ortamı çıkarın ve test etmek istediğiniz tedaviyi içeren ortamla değiştirin.Kanser hücrelerini ve kemik etkileşimlerini değerlendirmek veya tümör-kemik mikroçevresini yeniden oluşturmak istiyorsanız, kanser hücrelerinin tabağa bağlanmasını önlemek için kalvariyi düşük hücresel bağlanma plakasına geçirin. Kanser hücrelerini deneyin, sayılayın ve hemicalvarianın en üstüne dikkatlice yerleştirin. Ayrıca kanser hücrelerinden koşullu medya kullanabilirsiniz, ve hemicalvaria kuluçka için kullanabilirsiniz.37 derecede 6-7 gün kuluçkaya yat, %5 CO2 ile. Üçüncü gün, medya yıkın ve kuluçkaya devam edin. Co-kültür kullanan hücrelerin sayısı kanser hücresel hattına bağlıdır.Öncelikle, bir yanıt ı ikna etmek için gereken hücre sayısını optimize etmek gerekir. Kültürden sonra, calvaria fiksasyon, kireçlenme ve parafin gömülü bir süreçten geçer. Ayrıca dokular mikrotom, lekeli olarak kesitlenir ve histomorfometrik analiz yapılır.Calvaria dahil zor olabilir. Doku dahil sırasında korunduğundan emin olmak için, süngerler arasında doku koymak veya kaset koymak için önce bir doku kağıt veya diğer emici kağıt kullanabilirsiniz. Doku işleme için, kağıt mendil hemicalvaria sarın.Sonra, bir gömme kaset içine yerleştirin ve formalin nötr tampon düzeltmek, dört derece 24 saat boyunca. Calvaria dekalsitif etmek için, dört derece 48 saat boyunca% 10 EDTA içine kaset yerleştirin. Bir otomatik doku işlemci içinde hemicalvaria ile doku kasetleri işleme.Normal bir gün dönüş döngüsü izleyin, sonra, parafin ekleyin. Kesit için, bir mikrotom ile dört mikrotik bölüm kesti, cam mikroskop slaytlar üzerine bölümleri monte ve hematoksilin, eozin ile leke. Histoloji analizi kemik yüzeyi ve kemik remodeling alanlarının kantitatif analizini yapmak için kullanıldı.Calvaria'nın yedi gün deki görüntüleri görüntüleme yazılımı kullanılarak analiz edildi. Nicel değerlendirme için öncelikle analiz alanını tanımlayın. Telopa'daki bölümlere bakın, oryantasyonu ve dikişleri tanımlamak için dört X.Koronal sütür tanımlayın ve bir tarafta uzun kemik yüzeyi tanımlamak, ve sonra diğer kısa yüzey. 40X büyütme altında, koronal sütür tanımlayın ve uzun yüzey boyunca, dikiş uzak iki veya üç optik alanları hareket ettirin. Analiz için bu alanın görüntüsünü yakalayın.Kemiğin yapısal bütünlüğünü analiz etmek için görüntü yazılımı kullanabilirsiniz. Hemicalvarianın kalınlığı ve kemik bölgesi için kantitatif histomorfometrik analiz yapılabilir. Doğru kalvari analizi, tutarlı histolojik sonuçlar için iyi bir katıştırma ve uygun oryantasyona bağlıdır.Deneysel durum başına en az üç calvaria kullandığınızdan emin olun. Burada kemiğin yapısını görebiliyoruz. Turuncuda kemik gözlenir.Ayrıca periost, ostosit, endosteum ve kemiğin başka bir bölümünün varlığını da görebiliriz. Bizim durumumuzda, biz kemik remodeling artırmak için insülin kullanın. Bir kontrol le karşılaştırıldığında, kemik bölgesinde önemli bir artış görebiliriz.Burada MDA-MB-231 hücre hattının model kalvaria üzerindeki etkisini görebiliriz. Biz görebilirsiniz, kontrol ile karşılaştırıldığında, kanser hücrelerinin varlığı kemik yıkımını teşvik osteolitik faktörlere neden. Biz kanser hücresi ve histoloji ile co-kültürler tarafından kemik rejenerasyonu ve kanser hücre-kemik etkileşimlerini ölçmek için calvaria modeli kullanılır.Ayrıca verilerimizi nicel gerçek zamanlı PCR ile de doğrularız. Bu ex vivo modeli, üç boyutlu organizasyon ve kemiğin hücresel çeşitliliği korunur gibi birçok avantajı vardır, ve deneysel koşullar kontrol edilebilir. Ayrıca, model basit, kısa bir süre içinde sonuçları görebilirsiniz, ve düşük maliyetli.Ve diğer tekniklerle kombine edilebilir, kantitatif gerçek zamanlı PCR, mikroskopi ve mikro-BT gibi.

measuring-bone-remodeling-recreating-tumor-bone-microenvironment

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu protokol izolasyonu açıklar adipoz-türetilmiş lipoaspirate ve iskelet rejenerasyon değerlendirmek için 4 mm kritik ölçüdeki kalvaryal defekt oluşturmadan stromal hücreler.

Lipoaspirate itibaren hasat Yağ kaynaklı stromal hücreler kullanarak Kritik ölçekli Kalvaryum Defekt Model tamiri

Standart yöntemlerle olarak hücreler, fizyolojik bir ortam üzerinden alınır ve bir çanak plastik yüzeyi üzerinde büyütülür. Birincil insan kemik iliği hücrelerinin davranışını incelemek için biz hücreler doku yerel mikro yansıtan koşullar altında yetiştirilen bir 3-D kültür sistemi oluşturulur.

İlköğretim İnsan Kemik İliği ve Maligniteleri Eğitim Bir Üç boyutlu Doku Kültürü Modeli

Protokoller, insan kemik doku eksplantı model sisteminde göğüs kanseri hücre hareketi, çoğalması ve kolonizasyonu çalışmak için tarif edilmiştir.

Kültürleme İnsan Femur Doku Eksplantlarından yöntemleri Metastatik Niche Meme Kanseri Hücre Kolonizasyon Eğitim için

Otolog ve allojenik kemik greft implantasyonu önemli kraniofasial kemik kaybını tedavi yaklaşımları kabul teşkil. Oysa neovaskülarizasyon, hücre farklılaşması ve kemik oluşumu arasındaki etkileşime greft bileşiminin etkisi belirsizdir. Biz greft yakınlık anjiyogenez-osteogenesis bağımlılığın aydınlatmak için amaçlandığı multimodal görüntüleme protokol mevcut.

Bilgisayarlı Tomografi ve Osteogenezi-anjiyogenez bağlamalar Optik Görüntüleme Kranial Kemik Otogreftlerin ve allogreft Entegrasyon değerlendirmek için

Adipoz kaynaklı stromal hücreler, bir hastanın kendi hücrelerinden yeni doku mühendisliği için yararlı olabilir. Artmış osteojenik potansiyele sahip insan adipoz kaynaklı stromal hücrelerin (ASC'ler) bir alt popülasyonunun izolasyonu için bir protokol sunuyoruz, ardından hücrelerin in vivo kalvarial iyileşme testinde uygulanması izleyeceğiz.

BMPR-IB + hızlı İzolasyon Kalvaryum Hata Şifa Modeli Kullanılan Stromal Hücreleri yağ kaynaklı

Burada, damar oluşumu içinde vivo görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut ve gerçek zamanlı olarak 3D İskele tarafından multiphoton mikroskobu. Genetiği değiştirilmiş iskele anjiogenez bir fare grefti kritik Kemik defekti modelinde incelenmiştir. Daha fazla yeni kan damarları tedavi grubunda denetimlerde tespit edildi.

Angiogenez Multiphoton mikroskobu In Vivo genetiği değiştirilmiş 3D-PLGA/nHAp İskele tarafından grefti kritik Kemik defekti tamir için görselleştirme

Bu el yazması CoCrMo parçacıklar, aşınma partikülleri ve aseptik gevşeme çeşitli hücreler arasındaki etkileşimler değerlendirmek için ideal bir hayvan modeli oluşturan maruz bir fare grefti Osteoliz modeli açıklar.

İnşaat ve bir fare grefti Osteoliz modeli aseptik gevşeme içinde CoCrMo parçacıklar maruz tarafından değerlendirilmesi

Burada, hem fetal hem de yenidoğan aşamalarında uzun duvar kemiklerinin ex vivo kültürü için bir yöntem sunuyoruz, kontrollü koşullarda kemik ve kıkırdak gelişimini ve homeostazisini analiz etmek için uygun ve in vivo sürecini yeniden özetlemekteyiz.

Kültür ve ölçme fetal ve yenidoğan Murine uzun kemikler

Burada kemik değiştirme malzemelerini kemik rejenerasyon kapasiteleri açısından değerlendirmek amacıyla tavşanlarda cerrahi bir protokol sunacağız. Tavşan kafataslarına sabitlenmiş PEEK silindirleri kullanılarak, osteokondasyon, osteoindüksiyon, osteonezogenez ve vaskülogenez indüklenen malzemeler canlı veya ötenazi yapılan hayvanlarda değerlendirilebilir.

Kemik İkmal Malzemelerinde Kemik Büyümesi ve Neaskülarizasyonunun Değerlendirilmesi İçin Tavşanda Kemik Büyütmenin Kalvarial Modeli

Kemik metastazı modellerinde metastaz düzgün bir şekilde veya %100 insidansla gelişmez. Doğrudan intraosseöz tümör hücresi enjeksiyonu akciğerin embolizasyonu ile sonuçlanabilir. Primer kemik tümörlerini ve kemik metastazlarını, kemik içine solid tümör grefti implantasyonu kullanılarak modelleyen, tekrarlanabilir engraftman ve büyümeye yol açan tekniğimizi sunuyoruz.

Primer Kemik Tümörleri ve Kemik Metastazlarının Solid Tümör Grefti İmplantasyonu ile Modellenmesi

İntravital mikroskopi, doku rejenerasyonu ve tümör gelişimi gibi dinamik biyolojik süreçlerin incelenmesine izin verir. Oldukça dinamik bir doku olan kalvarial kemik iliği, hematopoez ve vasküler fonksiyon hakkında bilgi verir. Biyouyumlu bir 3D baskılı kafa sabitleme implantı kullanmak, tekrarlayan uzunlamasına görüntülemeye olanak tanıyarak doku dinamikleri ve tümör mikro çevresi hakkındaki anlayışımızı geliştirir.

Kalvarial Kemik İliğinde Vasküler Dinamiklerin İntravital Longitudinal Görüntülenmesi

Keşfedin kemik remodelasyonunu ve tümör-kemik mikroortamını yeniden oluşturmayı yeni doğan farelerden izole edilen kalvaria eks vivo kültürü ile. Bu yöntem ilaç etkilerini değerlendirmek için basit ve düşük maliyetli bir araç sunar.

Calvaria Co-culture ve Histomorfometri Kullanarak Kemik Remodeling ve Tümör-Kemik Mikroortamı yeniden oluşturma

Daha fazla video keşfet