Calvaria Co-culture ve Histomorfometri Kullanarak Kemik Remodeling ve Tümör-Kemik Mikroortamı yeniden oluşturma
14 Mart 2020
Kemik eksektijinin ex vivo kültürü kemik fizyolojisi ve kemik remodeling ve kemik hastalıklarında ilaçların potansiyel değerlendirilmesi çalışmaları için değerli bir araç olabilir. Sunulan protokol, yeni doğan fare kafataslarından izole edilen calvariaların hazırlanmasını ve kültürünün yanı sıra uygulamalarını da açıklamaktadır.
Bu işlemin amacı, kemik remodeling değerlendirmek ve tümör-kemik mikroçevre calvaria kültürü veya kanser hücreleri ile co-kültür kullanarak yeniden oluşturmak için bir ex vivo modeli olmasıdır. Kalvari tekniğinin çoğu, kemik remodelingini değerlendirmek için yenidoğan farelerden kalvaria kemikleri kullanan bir organ kültür sistemidir. Farklı moleküllerin terapötik potansiyelini test edebilir, hatta kanser hücreleri ile co-kültürleri kullandığınızda kemik tümörü mikroortamı yeniden.
Tüm bu kısa bir süre ve düşük bir maliyetle basit ve kolay bir tayiş. Bu tekniğin amacı, fare kalvariyal organ kültürünün ex vivo modelini kullanarak, kanser kemik mikroortamında kemik rejenerasyonu değerlendirmek için bir araç olmasıdır. İlk olarak, bir fare yavrusu seçin ve başlık altına yerleştirin.
5-7 günlük fare yavrularından calvaria kullanıyoruz. Şırıngayla baş alın, deriyi kesin ve kalvariyi incelemek için kafa derisi alanını temizleyin. Kafatası, sagittal, koronal ve lambdoids dikişleri tanımlayın.
Göz seviyesine lambdoid dikişler boyunca düz bir kesim yapmak. Lambdoid sütürlerden koronal dikişe doğru her iki tarafı da kesin. 45 açı, ön fontanel kesim ile yapılan kesim ucunu bağlamak için başka bir kesim yapmak.
Doğru doku dahil etme ve histoloji analizini garanti altına almak için kafatası sütür, sagittal, frontal, koronal, lambdoid tanımlamak son derece önemlidir. Ince ipuçları forceps ile, calvaria çıkarın ve petri çanak kapağı üzerine koyun. Bir neşter ile, koronal sütür ile sagittal sütür boyunca posterior fontanel düz bir kesim yapmak.
İki hemicalvarias elde edilir. Her calvaria'yı çifenler ile toplayın ve PBS'li yeni bir Petri kabına yerleştirin. Kültür için, 24-iyi doku kültür plakası, medya bir mililitre içeren hemicalvaria yerleştirin ve 37 derece 24 saat kuluçka.
Ayrıca kemik rezorpsiyonu için tümör-kemik mikroçevresini yeniden üretmek için birincil kalvarial kültürleri de kullanabiliriz. Bunu yapmak için, biz kanser hücreleri ile ortak kültür calvarias, ya da kanser hücrelerinden koşullu medya ile. 24 saat sonra, ortamı çıkarın ve test etmek istediğiniz tedaviyi içeren ortamla değiştirin.
Kanser hücrelerini ve kemik etkileşimlerini değerlendirmek veya tümör-kemik mikroçevresini yeniden oluşturmak istiyorsanız, kanser hücrelerinin tabağa bağlanmasını önlemek için kalvariyi düşük hücresel bağlanma plakasına geçirin. Kanser hücrelerini deneyin, sayılayın ve hemicalvarianın en üstüne dikkatlice yerleştirin. Ayrıca kanser hücrelerinden koşullu medya kullanabilirsiniz, ve hemicalvaria kuluçka için kullanabilirsiniz.
37 derecede 6-7 gün kuluçkaya yat, %5 CO2 ile. Üçüncü gün, medya yıkın ve kuluçkaya devam edin. Co-kültür kullanan hücrelerin sayısı kanser hücresel hattına bağlıdır.
Öncelikle, bir yanıt ı ikna etmek için gereken hücre sayısını optimize etmek gerekir. Kültürden sonra, calvaria fiksasyon, kireçlenme ve parafin gömülü bir süreçten geçer. Ayrıca dokular mikrotom, lekeli olarak kesitlenir ve histomorfometrik analiz yapılır.
Calvaria dahil zor olabilir. Doku dahil sırasında korunduğundan emin olmak için, süngerler arasında doku koymak veya kaset koymak için önce bir doku kağıt veya diğer emici kağıt kullanabilirsiniz. Doku işleme için, kağıt mendil hemicalvaria sarın.
Sonra, bir gömme kaset içine yerleştirin ve formalin nötr tampon düzeltmek, dört derece 24 saat boyunca. Calvaria dekalsitif etmek için, dört derece 48 saat boyunca% 10 EDTA içine kaset yerleştirin. Bir otomatik doku işlemci içinde hemicalvaria ile doku kasetleri işleme.
Normal bir gün dönüş döngüsü izleyin, sonra, parafin ekleyin. Kesit için, bir mikrotom ile dört mikrotik bölüm kesti, cam mikroskop slaytlar üzerine bölümleri monte ve hematoksilin, eozin ile leke. Histoloji analizi kemik yüzeyi ve kemik remodeling alanlarının kantitatif analizini yapmak için kullanıldı.
Calvaria'nın yedi gün deki görüntüleri görüntüleme yazılımı kullanılarak analiz edildi. Nicel değerlendirme için öncelikle analiz alanını tanımlayın. Telopa'daki bölümlere bakın, oryantasyonu ve dikişleri tanımlamak için dört X.
Koronal sütür tanımlayın ve bir tarafta uzun kemik yüzeyi tanımlamak, ve sonra diğer kısa yüzey. 40X büyütme altında, koronal sütür tanımlayın ve uzun yüzey boyunca, dikiş uzak iki veya üç optik alanları hareket ettirin. Analiz için bu alanın görüntüsünü yakalayın.
Kemiğin yapısal bütünlüğünü analiz etmek için görüntü yazılımı kullanabilirsiniz. Hemicalvarianın kalınlığı ve kemik bölgesi için kantitatif histomorfometrik analiz yapılabilir. Doğru kalvari analizi, tutarlı histolojik sonuçlar için iyi bir katıştırma ve uygun oryantasyona bağlıdır.
Deneysel durum başına en az üç calvaria kullandığınızdan emin olun. Burada kemiğin yapısını görebiliyoruz. Turuncuda kemik gözlenir.
Ayrıca periost, ostosit, endosteum ve kemiğin başka bir bölümünün varlığını da görebiliriz. Bizim durumumuzda, biz kemik remodeling artırmak için insülin kullanın. Bir kontrol le karşılaştırıldığında, kemik bölgesinde önemli bir artış görebiliriz.
Burada MDA-MB-231 hücre hattının model kalvaria üzerindeki etkisini görebiliriz. Biz görebilirsiniz, kontrol ile karşılaştırıldığında, kanser hücrelerinin varlığı kemik yıkımını teşvik osteolitik faktörlere neden. Biz kanser hücresi ve histoloji ile co-kültürler tarafından kemik rejenerasyonu ve kanser hücre-kemik etkileşimlerini ölçmek için calvaria modeli kullanılır.
Ayrıca verilerimizi nicel gerçek zamanlı PCR ile de doğrularız. Bu ex vivo modeli, üç boyutlu organizasyon ve kemiğin hücresel çeşitliliği korunur gibi birçok avantajı vardır, ve deneysel koşullar kontrol edilebilir. Ayrıca, model basit, kısa bir süre içinde sonuçları görebilirsiniz, ve düşük maliyetli.
Ve diğer tekniklerle kombine edilebilir, kantitatif gerçek zamanlı PCR, mikroskopi ve mikro-BT gibi.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, kemik fizyolojisini incelemek ve ilaçların kemik yeniden modelleme üzerindeki etkilerini değerlendirmek amacıyla, yeni doğmuş farelerin kalvaryumlarının ex vivo kültürü için bir protokol sunmaktadır. Bu teknik, tümör-kemik mikroçevresinin yeniden oluşturulmasına olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kemik fizyolojisi
- Kemik yeniden modellenmesi
- Kanser biyolojisi
Arka Plan
- Fizyolojik süreçleri incelemek için kemik eksplantları kültüre edilebilir.
- Yenidoğan farelerden alınan kalvaria, kemik çalışmaları için bir model görevi görür.
- Kanser hücreleri ile ko-kültür, tümör-kemik mikroçevresini taklit edebilir.
- Bu yöntem maliyet etkin ve basit bir yöntemdir.
Çalışmanın Amacı
- Bir ex vivo modelde kemik yeniden şekillenmesini değerlendirmek.
- Çeşitli moleküllerin terapötik potansiyelini belirlemek.
- Kemik-tümör mikroçevresini yeniden oluşturmak.
Kullanılan Yöntemler
- Yenidoğan farelerden kalvaryum izolasyonu.
- Kemik eksplantları için ex vivo kültür teknikleri.
- Kanser hücreleri ile ko-kültür sistemleri.
- Kemik rejenerasyonunun ve ilaç etkilerinin değerlendirilmesi.
Temel Sonuçlar
- Kemik yeniden şekillenmesinin incelenmesi için kalvaryumun başarılı bir şekilde kültüre edilmesi.
- Terapötik ajanların kontrollü bir ortamda test edilebilme yeteneği.
- Tümör-kemik mikroçevresinin yeniden oluşturulduğunun gösterilmesi.
- Yöntemin verimli ve düşük maliyetli olduğunun kanıtlanması.
Sonuçlar
- Ex vivo kalvaria kültürü, kemik araştırmaları için değerli bir araçtır.
- İlaçların kemik fizyolojisi üzerindeki etkilerinin incelenmesini kolaylaştırır.
- Ko-kültür sistemleri, kanserin kemikle olan etkileşimlerinin anlaşılmasını geliştirir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Alanları
Bu ex vivo kalvaria modeli, kemik yeniden şekillenme dinamiklerini ve tümör-kemik etkileşimlerini kontrollü ve tekrarlanabilir bir formatta değerlendirmek için fizyolojik olarak ilgili bir sistem sunar. Yerli doku mimarisini ve hücresel çeşitliliği koruyarak, kemik metastazını veya osteoporozu hedefleyen terapötik adayların erken aşamadaki mekanistik risklerinin azaltılmasını sağlar. Bu analiz, tanımlanmış koşullar altında anabolik ve katabolik kemik yanıtlarını niceliklendirerek, öncü madde belirlemede öngörücü güveni destekler.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: İnsülin veya kanser hücresi ko-kültürlerini modülatör olarak kullanarak kemik oluşumu ve rezorpsiyon yollarına ilişkin terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Osteolitik veya osteoaktif ajanlara yanıt olarak kemik alanı değişimlerini ölçerek fonksiyonel hedef validasyonuna olanak tanır.
- Öngörücü Değer: Hastalıkla ilişkili bir sistemde kemik yeniden şekillenmesini stimüle eden ve inhibe eden bileşikleri ayırt ederek portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Tespit, kesit alma ve boyama işlemlerinden sonra kemik yüzeyi ve yeniden şekillenme alanı için standardize, kantitatif histomorfometrik çıktılar üretir.
- Tekrarlanabilirlik: Tutarlı histolojik analiz ve veri güvenilirliğini sağlamak için koşul başına en az üç biyolojik replika gerektirir.
- Ölçeklenebilirlik: Kemik-tümör etkileşimlerinin çok parametreli doğrulaması için qPCR, mikroskopi ve mikro-BT gibi alt analizlerle uyumludur.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalık İlişkisi: Osteolitik mikroçevreyi yeniden oluşturmak için MDA-MB-231 hücreleri veya kondisyonlu ortam kullanarak kanser kaynaklı kemik rezorpsiyonunu modeller.
- Translasyonel Süreklilik: Neonatal kalvaryumun 3D doku organizasyonunu ve hücresel çeşitliliğini koruyarak, in vitro bulguları in vivo geçerlilikle ilişkilendirir.
- Mekanistik Risk Azaltma: Test bileşiklerinin kemik yeniden şekillenmesini osteoblastlar/osteoklastlar üzerindeki doğrudan etkiler yoluyla mı yoksa kanser aracılı sinyalizasyon üzerinden mi modüle ettiğini netleştirir.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef doğrulamasından öncü bileşik optimizasyonuna kadar uzanan keşif sürekliliğine, özellikle kemik düzenleyici ajanlar ve iskelet üzerinde etkileri olan antikanser ajanlar için uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Yolak modülatörlerine yanıt olarak kemik oluşumunu/rezorpsiyonunu nicelendirerek Wnt, RANKL veya PTHrP yolakları üzerindeki hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Hit-to-lead (başlıca bileşikten öncü bileşiğe) geçiş süreci için uygun, kemik alanı ve yapısal bütünlüğe ilişkin analize hazır, nicel çıktılar sağlar.
- Analitik: Görüntüleme yazılımı ve histomorfometri kullanarak farklı koşullar arasında kemik kalınlığı ve alanının istatistiksel karşılaştırmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Murin ex vivo sisteminde insanla ilişkili tümör-kemik etkileşimlerini modelleyerek preklinik çalışmalarla bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Kemik patofizyolojisinde küçük moleküller, biyolojikler veya kondisyonlu ortamlar dahil olmak üzere çeşitli bileşiklerin değerlendirilmesi için yeniden kullanılabilir bir platform görevi görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kemik yeniden şekillenme regülasyonuna ve kanser-kemik etkileşimine dair yüksek fizyolojik sadakatle mekanistik içgörüler sağlar.
- Operasyonel Değer: Sonuçların bir hafta içinde elde edilebildiği düşük maliyetli, basit ve hızlı bir ex vivo sistem sunar.
- Stratejik Değer: Hastalıkla ilgili modelleme yoluyla, kemik aktif bileşik taramalarındaki yanlış pozitifleri azaltarak devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Bir ko-kültür bağlamında kemik oluşumu veya rezorpsiyonu üzerindeki doğrulanmış etkilere dayanarak adayların risk ayarlı önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Fare doku diseksiyonu, histolojik işlemleme ve histomorfometrik analiz konularında uzmanlık gerektirir.
- Doku hazırlığı için mikrotom, gömme kasetleri, formalin, EDTA ve boyama reaktiflerine bağımlıdır.
- Tutarlı histolojik ve nicel sonuçlar sağlamak için standartlaştırılmış oryantasyon ve kesit alma protokollerini gerektirir.
- Diğer model sistemlere adaptasyon, doku koruması ve hücresel canlılığın doğrulanmasını gerektirebilir.
- Pratik kısıtlamalar arasında, işlemleme sırasında doku kırılganlığı ve kemik yüzeyi nicelleştirmesinde artefaktları önlemek için dikkatli taşıma gerekliliği yer alır.
