Calvaria Co-culture ve Histomorfometri Kullanarak Kemik Remodeling ve Tümör-Kemik Mikroortamı yeniden oluşturma
March 14th, 2020
Kemik eksektijinin ex vivo kültürü kemik fizyolojisi ve kemik remodeling ve kemik hastalıklarında ilaçların potansiyel değerlendirilmesi çalışmaları için değerli bir araç olabilir. Sunulan protokol, yeni doğan fare kafataslarından izole edilen calvariaların hazırlanmasını ve kültürünün yanı sıra uygulamalarını da açıklamaktadır.
Bu işlemin amacı, kemik remodeling değerlendirmek ve tümör-kemik mikroçevre calvaria kültürü veya kanser hücreleri ile co-kültür kullanarak yeniden oluşturmak için bir ex vivo modeli olmasıdır. Kalvari tekniğinin çoğu, kemik remodelingini değerlendirmek için yenidoğan farelerden kalvaria kemikleri kullanan bir organ kültür sistemidir. Farklı moleküllerin terapötik potansiyelini test edebilir, hatta kanser hücreleri ile co-kültürleri kullandığınızda kemik tümörü mikroortamı yeniden.
Tüm bu kısa bir süre ve düşük bir maliyetle basit ve kolay bir tayiş. Bu tekniğin amacı, fare kalvariyal organ kültürünün ex vivo modelini kullanarak, kanser kemik mikroortamında kemik rejenerasyonu değerlendirmek için bir araç olmasıdır. İlk olarak, bir fare yavrusu seçin ve başlık altına yerleştirin.
5-7 günlük fare yavrularından calvaria kullanıyoruz. Şırıngayla baş alın, deriyi kesin ve kalvariyi incelemek için kafa derisi alanını temizleyin. Kafatası, sagittal, koronal ve lambdoids dikişleri tanımlayın.
Göz seviyesine lambdoid dikişler boyunca düz bir kesim yapmak. Lambdoid sütürlerden koronal dikişe doğru her iki tarafı da kesin. 45 açı, ön fontanel kesim ile yapılan kesim ucunu bağlamak için başka bir kesim yapmak.
Doğru doku dahil etme ve histoloji analizini garanti altına almak için kafatası sütür, sagittal, frontal, koronal, lambdoid tanımlamak son derece önemlidir. Ince ipuçları forceps ile, calvaria çıkarın ve petri çanak kapağı üzerine koyun. Bir neşter ile, koronal sütür ile sagittal sütür boyunca posterior fontanel düz bir kesim yapmak.
İki hemicalvarias elde edilir. Her calvaria'yı çifenler ile toplayın ve PBS'li yeni bir Petri kabına yerleştirin. Kültür için, 24-iyi doku kültür plakası, medya bir mililitre içeren hemicalvaria yerleştirin ve 37 derece 24 saat kuluçka.
Ayrıca kemik rezorpsiyonu için tümör-kemik mikroçevresini yeniden üretmek için birincil kalvarial kültürleri de kullanabiliriz. Bunu yapmak için, biz kanser hücreleri ile ortak kültür calvarias, ya da kanser hücrelerinden koşullu medya ile. 24 saat sonra, ortamı çıkarın ve test etmek istediğiniz tedaviyi içeren ortamla değiştirin.
Kanser hücrelerini ve kemik etkileşimlerini değerlendirmek veya tümör-kemik mikroçevresini yeniden oluşturmak istiyorsanız, kanser hücrelerinin tabağa bağlanmasını önlemek için kalvariyi düşük hücresel bağlanma plakasına geçirin. Kanser hücrelerini deneyin, sayılayın ve hemicalvarianın en üstüne dikkatlice yerleştirin. Ayrıca kanser hücrelerinden koşullu medya kullanabilirsiniz, ve hemicalvaria kuluçka için kullanabilirsiniz.
37 derecede 6-7 gün kuluçkaya yat, %5 CO2 ile. Üçüncü gün, medya yıkın ve kuluçkaya devam edin. Co-kültür kullanan hücrelerin sayısı kanser hücresel hattına bağlıdır.
Öncelikle, bir yanıt ı ikna etmek için gereken hücre sayısını optimize etmek gerekir. Kültürden sonra, calvaria fiksasyon, kireçlenme ve parafin gömülü bir süreçten geçer. Ayrıca dokular mikrotom, lekeli olarak kesitlenir ve histomorfometrik analiz yapılır.
Calvaria dahil zor olabilir. Doku dahil sırasında korunduğundan emin olmak için, süngerler arasında doku koymak veya kaset koymak için önce bir doku kağıt veya diğer emici kağıt kullanabilirsiniz. Doku işleme için, kağıt mendil hemicalvaria sarın.
Sonra, bir gömme kaset içine yerleştirin ve formalin nötr tampon düzeltmek, dört derece 24 saat boyunca. Calvaria dekalsitif etmek için, dört derece 48 saat boyunca% 10 EDTA içine kaset yerleştirin. Bir otomatik doku işlemci içinde hemicalvaria ile doku kasetleri işleme.
Normal bir gün dönüş döngüsü izleyin, sonra, parafin ekleyin. Kesit için, bir mikrotom ile dört mikrotik bölüm kesti, cam mikroskop slaytlar üzerine bölümleri monte ve hematoksilin, eozin ile leke. Histoloji analizi kemik yüzeyi ve kemik remodeling alanlarının kantitatif analizini yapmak için kullanıldı.
Calvaria'nın yedi gün deki görüntüleri görüntüleme yazılımı kullanılarak analiz edildi. Nicel değerlendirme için öncelikle analiz alanını tanımlayın. Telopa'daki bölümlere bakın, oryantasyonu ve dikişleri tanımlamak için dört X.
Koronal sütür tanımlayın ve bir tarafta uzun kemik yüzeyi tanımlamak, ve sonra diğer kısa yüzey. 40X büyütme altında, koronal sütür tanımlayın ve uzun yüzey boyunca, dikiş uzak iki veya üç optik alanları hareket ettirin. Analiz için bu alanın görüntüsünü yakalayın.
Kemiğin yapısal bütünlüğünü analiz etmek için görüntü yazılımı kullanabilirsiniz. Hemicalvarianın kalınlığı ve kemik bölgesi için kantitatif histomorfometrik analiz yapılabilir. Doğru kalvari analizi, tutarlı histolojik sonuçlar için iyi bir katıştırma ve uygun oryantasyona bağlıdır.
Deneysel durum başına en az üç calvaria kullandığınızdan emin olun. Burada kemiğin yapısını görebiliyoruz. Turuncuda kemik gözlenir.
Ayrıca periost, ostosit, endosteum ve kemiğin başka bir bölümünün varlığını da görebiliriz. Bizim durumumuzda, biz kemik remodeling artırmak için insülin kullanın. Bir kontrol le karşılaştırıldığında, kemik bölgesinde önemli bir artış görebiliriz.
Burada MDA-MB-231 hücre hattının model kalvaria üzerindeki etkisini görebiliriz. Biz görebilirsiniz, kontrol ile karşılaştırıldığında, kanser hücrelerinin varlığı kemik yıkımını teşvik osteolitik faktörlere neden. Biz kanser hücresi ve histoloji ile co-kültürler tarafından kemik rejenerasyonu ve kanser hücre-kemik etkileşimlerini ölçmek için calvaria modeli kullanılır.
Ayrıca verilerimizi nicel gerçek zamanlı PCR ile de doğrularız. Bu ex vivo modeli, üç boyutlu organizasyon ve kemiğin hücresel çeşitliliği korunur gibi birçok avantajı vardır, ve deneysel koşullar kontrol edilebilir. Ayrıca, model basit, kısa bir süre içinde sonuçları görebilirsiniz, ve düşük maliyetli.
Ve diğer tekniklerle kombine edilebilir, kantitatif gerçek zamanlı PCR, mikroskopi ve mikro-BT gibi.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, yenidoğan farelerden alınan kafataslarının ex vivo kültürü için bir protokol sunar ve kemik fizyolojisinin incelenmesi ve ilaçların kemik yeniden modellenmesi üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi amaçlanmaktadır. Teknik, tümör-kemik mikroçevresinin yeniden yaratılmasını sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kemik fizyolojisi
- Kemik yeniden modellenmesi
- Kanser biyolojisi
Arka Plan
- Kemik ekplantları fizyolojik süreçleri incelemek için kültürlenebilir.
- Neonatal farelerden alınan kafatasları kemik çalışmaları için bir model olarak hizmet eder.
- Kanser hücreleri ile birlikte kültür, tümör-kemik mikroçevresini taklit edebilir.
- Bu yöntem maliyet-etkili ve basittir.
Çalışmanın Amacı
- Bir ex vivo modelde kemik yeniden modellenmesini değerlendirmek.
- Çeşitli moleküllerin terapötik potansiyelini değerlendirmek.
- Kemik-tümör mikroçevresini yeniden yaratmak.
Kullanılan Yöntemler
- Yenidoğan farelerden kafataslarının izolasyonu.
- Kemik ekplantları için ex vivo kültür teknikleri.
- Kanser hücreleri ile birlikte kültür sistemleri.
- Kemik rejenerasyonu ve ilaç etkilerinin değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Kemik yeniden modellenmesini incelemek için başarılı kafatası kültürü.
- Kontrollü bir ortamda terapötik ajanları test etme yeteneği.
- Tümör-kemik mikroçevresinin yeniden yaratıldığını gösterdi.
- Yöntemin verimli ve düşük maliyetli olduğu gösterildi.
Sonuçlar
- Ex vivo kafatası kültürü kemik araştırması için değerli bir araçtır.
- Kemik fizyolojisi üzerindeki ilaç etkilerinin incelenmesini kolaylaştırır.
- Birlikte kültür sistemleri, kanserin kemik ile etkileşimlerinin anlaşılmasına yardımcı olur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This ex vivo calvaria model provides a physiologically relevant system for evaluating bone remodeling dynamics and tumor-bone interactions in a controlled, reproducible format. It enables early-stage mechanistic de-risking of therapeutic candidates targeting bone metastasis or osteoporosis by preserving native tissue architecture and cellular diversity. The assay supports predictive confidence in lead identification by quantifying anabolic and catabolic bone responses under defined conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses on bone formation and resorption pathways using insulin or cancer cell co-culture as modulators.
- Operational Value: Enables functional target validation by measuring bone area changes in response to osteolytic or osteoactive agents.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing compounds that stimulate versus inhibit bone remodeling in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative histomorphometric outputs for bone surface and remodeling area after fixation, sectioning, and staining.
- Reproducibility: Requires a minimum of three biological replicates per condition to ensure consistent histological analysis and data reliability.
- Scalability: Compatible with downstream analytics such as qPCR, microscopy, and micro-CT for multi-parametric validation of bone-tumor interactions.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models cancer-induced bone resorption using MDA-MB-231 cells or conditioned medium to recapitulate osteolytic microenvironment.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo relevance by maintaining 3D tissue organization and cellular diversity of neonatal calvaria.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether test compounds modulate bone remodeling via direct effects on osteoblasts/osteoclasts or through cancer-mediated signaling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, particularly for bone-modulating agents and anticancer agents with skeletal effects.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on Wnt, RANKL, or PTHrP pathways by quantifying bone formation/resorption in response to pathway modulators.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs on bone area and structural integrity suitable for hit-to-lead progression.
- Analytics: Enables statistical comparison of bone thickness and area across conditions using imaging software and histomorphometry.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling human-relevant tumor-bone interactions in a murine ex vivo system.
- Enterprise Reuse: Serves as a reusable platform for evaluating diverse compounds, including small molecules, biologics, or conditioned media, in bone pathophysiology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into bone remodeling regulation and cancer-bone crosstalk with high physiological fidelity.
- Operational Value: Offers a low-cost, simple, and rapid ex vivo system with results achievable within one week.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing false positives in bone-active compound screening through disease-relevant modeling.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on validated effects on bone formation or resorption in a co-culture context.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine tissue dissection, histology processing, and histomorphometric analysis.
- Dependent on microtome, embedding cassettes, formalin, EDTA, and staining reagents for tissue preparation.
- Necessitates standardized orientation and sectioning protocols to ensure consistent histological and quantitative results.
- Adaptation to other model systems may require validation of tissue preservation and cellular viability.
- Practical limitations include tissue fragility during processing and the need for careful handling to avoid artifacts in bone surface quantification.
