Name: Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Öğrenin, canlı hücre imager kullanarak kanser hücrelerinin göç ve istilasını gerçek zamanlı izleme yöntemini. Bu entegre protokol, hücre hareketliliği ve morfoloji çalışmaları için tekrarlanabilir ve verimli bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bloomfield grup Vakfı aracılığıyla Hunter Tıbbi Araştırma Enstitüsü (HMRI 13-02) tarafından finansman destek kabul etmek istiyoruz. X.Z bir APA burs ile Newcastle Üniversitesi ve HCRA biyolojik amiral gemisi Doktora Bursu tarafından desteklenir.

Not: İki hücre satırı ayrı olarak ele alınmalıdır. Aşağıdaki yordamlar tek tek hücre satıra uygulanan belirtilmediğinde.
1. hücre yoğunluğu yaralama önce optimize
<ol><li>Kültür T75 cm2 doku kültürü şişeler yaklaşık % 80 yapışık hücreleri izdiham içinde fenol kırmızısı ücretsiz Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 fetal Sığır serum (FBS), 200 mM L-glutamin ve % 5 CO2 () ile 37 ° C'de 2 µg/mL insülin ile takıma DMEM) Standart kuluçka koşulları çoğu kanser hücre hatları, kültür formülasyonları için hücre satırı bağımlı vardır).</li>
	<li>Kültür ortamını bir atık konteyner içine kapalı pipetting çıkarın. Önceden ısıtılmış % 0,1 tripsin EDTA kısaca hücre monolayer ve damlalıklı durulayın için 2 mL damlalıklı. Başka bir 2 mL % 0,1 tripsin-EDTA ekleyin ve 5 min için 37 ° C'de standart kuluçka koşulları altında şişeye koyun.</li>
	<li>Şişeye dekolmanı hücrelerin emin olmak için yavaşça dokunun ve sonra önceden ısıtılmış kültür proteolitik reaksiyonu durdurmak için medya 10 mL ekleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 15 mL santrifüj tüpü ve 200 x g (RT) Oda sıcaklığında 5 min için aşağı spin içine aktarın. Dikkatle süpernatant hücre Pelet Tantanacı olmadan kaldırmak ve başka bir 10 mL önceden ısıtılmış Kültür medya ile resuspend.</li>
</ol>2. bir otomatik hücre Counter (veya herhangi bir sayma yöntemi) kullanarak hücre sayılması
<ol><li>Resuspended hücre süspansiyon seyreltik 200 µL ile 1 Dulbecco'nın fosfat x 800 µL serum fizyolojik (DPBS) bir 1,5 mL santrifüj tüpü arabelleğe alınmış.</li>
	<li>60 µm hücre sayısı algılayıcıyı hücre Sayaç Ekle, Değiştir tutun ve ucu hücre süspansiyon birleştirme. Hücre süspansiyon başarıyla sensör çizilmiş kadar yavaş yavaş geçiş serbest bırakın. Hücre konsantrasyonu hücre/mL görüntülenir.</li>
	<li>10 mL hücre süspansiyon hücre sayısında hesaplayın.</li>
</ol>3. hücre kaplama
<ol><li>Bir dizi hücre yoğunluğu (40.000-90.000 hücreler/de) nüsha bir 96-şey plaka, plaka hücreleri.</li>
	<li>
Plaka canlı hücre Imager yerleştirin ve her 2 h 24 h için tarama zamanlayabilirsiniz.
	<ol>
<li>Yazılım, program inceden inceye gözden geçirmek görev listesinden tıklatın. Çekmece Kur bölmesinde, plaka konumunu belirlemek, Ekle gemi tıklatın ve plaka türünü seçin. İnceden inceye gözden geçirmek kurulum bölmesinde seçin veya deneysel plaka kuruluma göre tarama kalıbı düzenlemek ve Tarama türü Standartayarlayın.</li>
		<li>Zaman çizelgesi üzerinde sağ tıklatıp Küme aralıklarıseçin. Eklemek inceden inceye gözden geçirmek her 2 h 24-h zamanlama olarak ayarlayın. Uygula' yı tıklatın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. yoğunluk geçiş tahlil için tohum optimum hücre belirleyin
<ol><li>24 saat sonra tarama Stop çözümleme aracı otomatik olarak toplanan HD-faz kontrast görüntü işleme izdiham uygulamak ve zamana karşı bir hücre proliferasyonu eğrisi oluşturmak.
	<ol>
<li>3-6 temsilcisi görüntüleri belirlemek ve yer onları içinde yeni bir Resim koleksiyonu.</li>
		<li>Uygun bir maske İşleme tanımıolarak belirleyin.</li>
		<li>Bir analiz iş başlatmak.</li>
		<li>En iyi duruma getirilmiş hücre yoğunluğu izdiham zamana karşı göre belirlemek (yaklaşık % 100 izdiham içinde 6-18 h bağlı olarak geçiş tahlil ne zaman başlar). Not: O izdiham için hücreleri büyümek için gereken zaman miktarı tohumlama seyreltme bağlı olarak değişir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. gün 1 ve 2: göç ve işgal deneyleri için hazırlık
<ol><li>
Gün 1'de, plaka işgali tahlil için kat. Not: ECM jel her zaman ele alınabilir buz ve buzdolabında bir gecede yer var ipuçları ile.<ol>
<li>ECM jel ile buz gibi kültür kitle iletişim araçları 100 µg/ml seyreltik ve 50 µL seyreltilmiş ECM jel/medya belirlenen kuyu ekleyin.</li>
		<li>Yer plaka Standart kuluçka koşulları, bir gecede.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gün 2, yavaşça aşırı medya Aspire edin. Geç öğleden sonra (geçerli protokol için en iyi duruma getirilmiş tohumlama yoğunlukları ile en iyi duruma getirilmiş hücre yoğunluğu 2 96-şey tabak (kaplanmamış) geçiş tahlil için belirlenmiş ve (Bölüm 1-3 takip triplicates kaplı) işgali tahlil içine hücreleri plaka ZR75-1 ve MDA-MB-231 edildi 90.000/iyi ve 50.000/iyi, sırasıyla).</li>
	<li>Plakaları standart kuluçka koşulları gecede yerleştirin.</li>
</ol>6. gün 3: Yara çizik
<ol><li>Sprey ve karalama aracı ve tekneler % 70 etanol ile onları içinde Biyogüvenlik kabini yerleştirmeden önce yıkama 2 silin. 1 ve 2 yıkama teknenin sırasıyla tam olarak 45 mL steril (autoclaved) distile su ve % 70 etanol doldurmak.</li>
	<li>Sterilizasyon için karalama aracı iğne bloğu (üst) tekne 1 ve 2 5 min için yıkama üzerine yerleştirin.</li>
	<li>
Geçiş tahlil plaka ile başlayın.
	<ol>
<li>Kuluçka makinesi hücreleri içeren plaka taşımak ve hiçbir şey sıfırdan aracın zarar görmemesi için kuru olduğundan emin olun. Plaka kapağını çıkarın ve karalama aracı taban plakası yuvasına yerleştirin ve dikkatle dübeller göstererek taban parçası üzerine üst kısmında yer. Basýn ve siyah kolu tutun ve bu arada dikkatle PIN blok. Her şey boşluklar genellikle çıplak gözle ve mikroskop altında görülebilir.</li>
		<li>Hızlı bir şekilde iğne suda ıslatın; Bu plaka Kur aynı ise önce işgal tahlil plaka tırmalamak karalama aracı temizlemek yeterlidir. Aksi takdirde, her biri 5 min için steril distile su ve % 70 etanol ile sterilizasyon adımları yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yıkama plaka 1 veya 2 kez önceden ısıtılmış kültür müstakil hücreleri veya hücre önlemek için medya ile kuyuya reattaching sayfaları.</li>
	<li>Taze sıcak ortam 100 µL belirlenen kuyu veya tedavileri olmadan içine ekleyin.</li>
	<li>
İstila tahlil için ek adımlar.
	<ol>
<li>Equilibrate ve dikkatli bir şekilde soğuk ortam Aspire edin 5 min için 4 ° C'de işgali tahlil tabak koyun.</li>
		<li>ECM jel ile buz gibi kültür kitle iletişim araçları 5 mg/ml seyreltik ve 30 dk için standart kuluçka altında yer 50 µL seyreltilmiş ECM jel belirlenen kuyu içine ekleyin.</li>
		<li>Sıcak-up medya veya bileşikler test olmadan 100 µL ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaka canlı hücre Imager koyun ve 5 dk. Seç Gemi türü olarak imagelock plaka için equilibrate izin verin. Tarama türü Sıfırdan yaraayarla, seçin veya Tarama deseni deneysel plaka göre (1 görüntü/iyi ve geniş modu) düzenlemek ve yaraları iyileşene kadar 24-h tekrar her 1-2 h 72 h için tarama zamanlayabilirsiniz.</li>
	<li>Karalama aracı temizlemek için en iyi PIN blok her aşağıdaki çözümleri (45 mL tekneler yıkama içinde) 5 dk: %0.5 deterjan 1 koymak (bakınız Tablo malzemeler), % 1 deterjan (bkz. Tablo reçetesi) 2, steril distile su ve % 70 etanol. Kazı-kazan aracın geri mağaza ve taban plakası üzerine bir tozsuz ortamda getirin.</li>
</ol>7. veri analizi
<ol><li>Çekmece Kur deneysel plaka seçme ve Gemi kaldır'ıtıklatarak tüm yaraları iyileşti sonra belirlenen plaka Taramayı durdur.</li>
	<li>3-6 temsilcisi görüntüleri ses yüzdeleri, yara, yara kapatma % 10 ve % 50 tarafından yapıldıktan sonra görüntüleri hakkı da dahil olmak üzere bir dizi kapsayan toplamak.</li>
	<li>Uygun işlem tanımını belirlemek için uygun Yara maskesi çizik ve İzdiham maskesiuygulamak için Segmentasyon ayarlama, Temizleme ve filtreleri kullanın. Önizleme geçerli/tüm maskeler doğruluğunu görüntülemek için kullanın.</li>
	<li>Analiz iş başlatmak.</li>
	<li>Veri yazılım içinde analiz veya daha ayrıntılı bir çözümleme için verilebilir. Yazılım tarafından sağlanan üç ölçümleri HD fazlı görüntüleri değerlendirmek için kullanılabilir: yara yara genişliği (µm), izdiham (%) ve göreceli yara yoğunluğu (%). Karşılaştırma aşağıdaki bölümde ele alınacaktır.</li>
</ol>

<ol><li>Graham, C. H., Lala, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+placental+invasion+of+the+uterus+and+their+control%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control.</a> Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).</li>
<li>Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+remodelling+through+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue remodelling through branching morphogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).</li>
<li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+driving+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10, 683-690 (2014).</li>
<li>Weigelt, B., Peterse, J. L., van't Veer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+metastasis%3A+markers+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Breast cancer metastasis: markers and models.</a> Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).</li>
<li>Breast Cancer: Estimated Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012. GLOBOCAN. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx">http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx</a> (2012).</li>
<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li>
<li>Scully, O. J., Bay, B. H., Yip, G., Yu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genomics+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Breast cancer metastasis.</a> Cancer Genomics Proteomics. 9, 311-320 (2012).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FReviews+in+Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).</li>
<li>Holliday, D. L., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+right+cell+line+for+breast+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Choosing the right cell line for breast cancer research.</a> Breast Cancer Research. 13, 215(2011).</li>
<li>Clark, A. G., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modes+of+cancer+cell+invasion+and+the+role+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment.</a> Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Göç ve işgal kanser hücrelerinin hareketliliğini değerlendirmek için önemli parametreleridir. 96-pin karalama aracı kullanarak, aynı anda deneyleri 2D ve 3D şifa yara yapmak mümkündür. Otomatik tarama kolaylaştırıcı dışında en az kesinti ile istikrarlı hücre kültür ortamı sağlayarak 96-pin karalama Aracı kullanılarak yürütülen karalama tahlil daha sağlam deneyler etkinleştirme tutarlı sıfırdan yaralar sağlar ve tekrarlanabilir. 96-şey plaka biçim hücre hatları veya farklı ilaç tedavileri sayısı artan ek seçenekler sunar....

Hücre göç ve işgal yara kapatma, plasenta rahim ve meme bezi morfogenez1,2,3içine işgali gibi insan vücudu normal işlevlerini etkinleştirmek önemli biyolojik işlemlerdir. İnsan vücudu bu biyolojik olayların hassas ve sıkı denetime sahip; Ancak, bazı istisnalar vardır. Malign tümörler, örneğin, bu korumayı kaçmak, anormal proliferasyonu sergi ve metastaz denir komşu doku istila edebiliyoruz. Metastaz kanserle ilgili mortalite4önemli nedenidir.
Meme kanseri en sık kadınlarda kanser tanısı ve gelişmiş ülkelerde dünya çapında5' kadınlar arasında kanser ile ilgili ölüm ikinci en yüksek nedeni var. Meme kanseri kanalları veya epitel hücrelerinin bir veya daha fazla kat oluşur lobules gelmektedir. Normal meme, epitel hücreleri birbirleriyle ve üzerinden E-cadherin ve integrinler6gibi membran proteinlerinin membran uygun. Ancak, invaziv meme kanseri hücrelerinin kendi Polarite ve hücre-hücre adezyon, kaybetmiş ve klasik epitel mezenkimal geçiş (EMT) geçmesi ve taşıma becerisi kazanırsınız. Ekstravazasyonu sonra bu hücreler hücre dışı matriks (ECM) gidin ve kan damarı veya lenfatik sistem, o zaman ardından intravasation ve metastatik büyüme7girin. Bu oluştuğu tarafından mekanizmaları anlama büyük önem taşıyor, metastaz Scotlan kanserle ilgili en sık nedenidir ve kanseri ile yakından ilgili geçiş/işgali hücre. Kanser hücrelerinin hareket görselleştirmek için göç ve işgal deneyleri hücre hareketi, 2D ve 3D sırasıyla eğitim için ideal modellerdir. İstila microenvironment ve biyolojik engelleri aşağılamak yeteneği ile etkileşimi içerir, ancak geçiş hücreleri hareket doğrudan değerlendiriyor. Geçiş işgalinin bir gereklilik olduğu gibi iki süreç bir başka tamamen bağımsız değildir.
Göç ve işgal çalışmaya çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Tarafından Kramer ve ark., yara iyileşmesi gibi geçiş deneyleri gözden olarak çit ve mikro-taşıyıcı deneyleri alan değişikliği değerlendiren hücreleri içine, taşımak izin vermek için bir boş hücre alanı oluşturmak; Oysa, transwell ve kılcal deneyleri cezbedici8doğru hareket hücreleri temel alır. İstila deneyleri için bir ECM ortam ECM jel veya kollajen ile örneğin ayarlanması gerekiyor ve 3D hareket değerlendirildi işgal alanı, mesafe ve hücre sayımları (örneğin transwell tahlil, platypus tahlil) izleyerek8. Başka bir istila tahlil non-invaziv hücreleri ile invaziv hücreleri birleştirmek ve invaziv hücreleri davranışını değerlendirmek için türüdür (örneğin küresel deneyleri). Belgili tanımlık yukarıda yöntem kendi artılarını ve eksilerini ve yaklaşım, tekrar ve geçiş tahlil birleştirmek kolay kolay bir şekilde ve işgal tahlil benzer iş akışında deneysel tasarım Tercihli.
Bu iletişim kuralı hücre göç ve canlı hücre Imager kullanarak işgali ölçümü açıklar. Standart hücre kültür kuluçka makinesine yüklü sistem izleme gerçek zamanlı bir hücredir. Yüksek çözünürlüklü görüntüleri tarama aralıkları ve ölçümler hücreleri veya floresan hedefler için uygun maskeleri uygulayarak kümesi göre alır. Geçiş/işgali tahlil modülü bir 96-şey tabak içinde sıfırdan yaraya homojen bir hücre monolayer yapmak için uygun bir 96-pin sıfırdan aracını kullanarak içerir. Mekanizması deneyleri şifa, bir plastik veya kaplı yüzey sadece 2D hücre hareket izleme tüp bebek yara temel alır. İşgal veya 3D hareket yara çizik içinde ek bir ECM arasında da tespit edilebilir. Kısa bir iş akışı Şekil 1' de gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>% 0.5 tripsin-EDTA çözeltisi (10x)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>30028-02</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Countess II FL Otomatik Hücre Sayacı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td>Otomatik hücre sayacı</td></tr><tr><td>Deterjan 1 (Alconox)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>242985</td><td>% 0.5 çalışma konsantrasyonu</td></tr><tr><td>Deterjan 2 (Virkon S)</td> <td>VetProduct DIRECT</td><td></td><td>% 1 çalışıyor konsantrasyon</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium, fenol kırmızısı içermeyen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21063-045</td><td>%10 FBS, 200 mM L-glutamin, 2 & ile birlikte verilir; g/ml insülin</td></tr><tr><td>ECM Jel (matrigel)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6909</td><td>Büyüme faktörü azaltılmış, fenol kırmızısı içermez</td></tr><tr><td>Essen ImageLock 96 oyuklu plaka, düz tabanlı</td><td>Essen</td><td>4379</td><td></td></tr><tr><td>EVE Sayma slaytları</td><td>BioTools</td><td>EVS-50</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Bovogen Biologicals</td><td>SFBS-F-500ml</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 96 oyuklu çizik yara hücresi istilası aksesuarlar</td><td>Essen</td><td>4444</td><td>CoolBox, 2x CoolSink</td></tr><tr><td>IncuCyte Hücre migrasyon kiti</td> dahil <td>Essen</td><td>4493</td><td>96 oyuklu pim bloğu, 2x yıkama teknesi ve</td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM</td> yazılımı dahil <td>Essen</td><td></td><td>Canlı hücre analiz sistemi</td></tr><tr><td>İnsülin çözeltisi insan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin çözeltisi (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-091</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü şişesi, 75 cm2 büyüme alanı</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr></tbody></table>

otomatik bir canlı hücre imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Kanser hücre hareketlilik metastaz kabul töreni için önemlidir. Bu nedenle, araştırma hücre hareket ve invaziv kapasitesi büyük önem taşıyor. İstila deneyleri içinde vivo kanser hücre dislodgment Orijinal siteden taklit ve hücre dışı matriks ile işgal daha fizyolojik alakalı ise geçiş deneyleri 2D bir düzeyde hücre hareketinin temel anlayış sağlar. Geçerli protokol geçişi ve işgal deneyleri için tek bir iş akışı sağlar. Entegre otomatik mikroskobik kamera ile birlikte gerçek zamanlı HD görüntüleri ve yerleşik analizi modülü için araştırmacılar bir zaman verimli, basit ve tekrarlanabilir deneysel seçeneği verir. Bu protokol sarf malzemeleri için oyuncu değişikliği ve alternatif analiz yöntemleri seçmek kullanıcılar için de içerir.

Bu geçiş/işgali tahlil 96-pin karalama aracı tarafından oluşturulan boş hücre alana taşıma hücre oranı değerlendirir yara iyileşme tahlil temel alır. Göç ve işgal deneyleri arasındaki fark vardır geçiş ECM jel arasında hareket doku kültürü tedavi plastik yüzey ve işgal önlemler hücrelerde taşıma ölçü birimi hücre deneyleri.
Karalama aracı belirlenen plaka tutarlı sıfırdan yara açmak için tasarlanmıştır ve canlı hücre Imager sıfı...

Geçerli protokol kanser hücre göç ve gerçek zamanlı olarak tek bir platformda işgali araştırma, kolayca tekrarlanabilir ve zamanı verimli bir seçenek hücre hareketlilik ve morfoloji çalışmaya sağlayan entegre bir yöntemini açıklar.

Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Kanser hücresi hareketliliği metastaz ın başlaması için çok önemlidir. Bu nedenle, hücre hareketi ve tümör hücrelerinin invaziv kapasite nin araştırılması büyük ilgi çekicidir. Kanser hücresi göç ve invazyonunu gerçek zamanlı olarak tek bir platformda araştırmak için kullanılan bu entegre yöntem, hücre hareketliliği ve patolojisi için kolayca tekrarlanabilir ve zaman açısından verimli bir seçenek sunmaktadır.Bu yöntem, ekstra-hücreli matris yoluyla, kanser hücresi invazyonu içine fikir sağlayabilir ve diğer hücre tipleri uygulanabilir. En uygun sıfırdan alma süresini elde etmek için, tohumlama yoğunluğunun optimize edilmiş olduğundan emin olun ve hücre monokatmanı yüzde 100 birleştiğinde kuluçka süresini uzatmayın. Bir geçiş teşpini için en uygun tohumlu hücre sayısını belirlemek için, hücreleri 96 duvarlı bir plakanın üç aylık aralıklarında yoğunluklara yerleştirin.Plakayı canlı hücre görüntüleyicisine yerleştirin ve görüntüleyici yazılımındaki görev listesinden zamanlama taramalarını seçin. Çekmece kurulum bölmesinde, plakanın konumlarını belirleyin ve plaka türünü seçmek için damar ekle'yi tıklatın. Tbmkasyon bölmesinde, deneme plaka kurulumuna göre tbmkasyon deseni seçin veya düzenleve tarama türünü standart olarak ayarlayın.Zaman çizelgesine sağ tıklayın ve ayarlı aralıkları seçin. Daha sonra 24 saat boyunca her iki saat boyunca taramaları ekleyin ve uygula'yı tıklatın. 24 saat sonra, deneysel plakanın seçilmesini sağlamak için çekmece kurulumuna açın ve damarı kaldır'a tıklayın.Üç ila altı temsili resim seçin ve bunları yeni bir resim koleksiyonuna yerleştirin. Uygun bir işleme tanımı belirlemek için, uygun bir birleştirme maskesi uygulamak için segmentasyon ayarlaması, temizleme ve filtreler kullanın ve maskelerin doğruluğunu görüntülemek için önizleme akımı all'ı kullanın. Analiz işini başlatın ve geçiş tahlillerinin ne zaman başladığına bağlı olarak, zamana karşı yaklaşık yüzde 100 birleştiği zamana göre, altı ila on sekiz saat içinde optimize edilmiş bir hücre yoğunluğu belirleyin.Ardından, zamana karşı bir hücre çoğalma eğrisi oluşturmak için otomatik olarak toplanan yüksek tanımlı faz kontrast görüntülerine birleştirme işleme çözümleme aracını uygulayın. Teşbebaşlamadan önce, ekstrasellüler matris jel 50 mikrolitre ile işgali analizi için plaka kat, buz gibi hücre kültürü orta seyreltilmiş, mililitre konsantrasyonu başına 100 mikrogram. Sonra, bir hücre kültürü kuluçka gece plaka yerleştirin.Ertesi öğleden sonra, yavaşça aşırı orta aspire, ve plaka hücreleri optimize yoğunlukta, triplicate, ekstrasellüler matris kaplı plaka uygun kuyulara, ve ek bir kaplamasız 96-iyi plaka içine. Sonra, bir gecede hücre kültürü kuluçka içine plakaları yerleştirin. Ertesi sabah, kaplamasız geçiş istinat plakasını kazıma aracının taban plakası tutucuya yerleştirin ve tutucunun üst kısmını dikkatlice tabanına yerleştirmek için kılavuz dübelleri kullanın.Çizikler yapmak için pim bloğunu dikkatlice kaldırırken siyah kolu bastırın ve tutun. Her kuyudaki çizikler çıplak gözle görülebilmeli, mikroskop altında da. Daha sonra, herhangi bir müstakil hücre veya hücre yaprak kaldırmak için önceden ısıtılmış kültür ortamı ile plaka bir veya iki kez yıkayın.İstila tadına göre, kaplamalı tabağı az önce gösterildiği gibi çizin. Herhangi bir müstakil hücreleri ve sayfaları çıkardıktan sonra, soğuk ortamı dikkatlice aspire etmeden önce plakayı dört santigrat derecede beş dakika boyunca dengelemek için önceden soğutulmuş soğuk bir kutu kullanın. Daha sonra, uygun kuyulara seyreltilmiş ekstrasellüler matriks jel 50 mikrolitre ekleyin ve otuz dakika boyunca hücre kültürü kuluçka içine plaka yerleştirin.Kabarcıklar ekstrasellüler matris jel ile çalışırken yaygındır, ama yüzde 70 etanol spirating tarafından ortadan kaldırılabilir. Daha sonra 100 mikrolitre taze, sıcak ortam ekleyin, test bileşiği ile veya test bileşiği olmadan, göç veya istila test plakasının uygun kuyularına, ve plakayı canlı hücre görüntüleme platformuna yerleştirin. Çizik aleti temizlemek için, yüzde 5 deterjan bir, yüzde bir deterjan iki, steril distile su veya yıkama başına yüzde 70 etanol içeren tek tek 45 mililitrelik yıkama tekneleri üst pin blok yerleştirin geri taban plakası üzerine koymadan önce, tozsuz bir ortamda depolamak için.Yara tahlillerinin görüntülenmesi için, plakanın beş dakika boyunca dengede durmasını sağladıktan sonra, görüntü günlüğü düzlemi olarak damar tipini seçin ve tazyik türünü çizik yarası olarak ayarlayın. Deneysel plaka kurulumuna göre tarama desenini seçin veya düzenleyin ve 72 saat boyunca her 1-2 saatte bir veya yaralar gösterildiği gibi iyileşene kadar 24 saat tekrar taramayı zamanlayın. Tüm yaralar iyileştiğinde, tazyimeyi durdurun ve yara yapıldıktan hemen sonraki görüntüler de dahil olmak üzere bir dizi ses yüzdesini kapsayan ve yaranın yüzde 10 ila 50 oranında kapanması nı içeren üç ila altı temsili görüntü seçin.Uygun bir işleme tanımı belirlemek için, uygun bir çizik yara maskesi ve gösterildiği gibi bir kesişme maskesi uygulayın ve maskelerin doğruluğunu görüntülemek için önizleme akımı all'ı kullanın. Sonra, analiz işini başlatın. Bir geçiş tdoğru, yara genişliği yara nın yanındaki hücre sayfaları arasındaki ortalama mesafedir.Yara nın birleşimi yaralı bölgenin kesiştiği yerdir. İdeal ilk yara birleşimi yüzde sıfıra yakın olmalıdır. Göreceli yara yoğunluğu ve yara birleştiği yer, çizik yarası alanını işgal eden hücrelerin hızını göstermektedir.Bu veriler, bu temsili hücre satırlarının her ikisinde de neredeyse çakışıyor. Farklı hücre çizgileri çok farklı yara iyileşme yeteneklerini gösterir, hücre hatları arasındaki farklı göç yeteneklerini gösterir. Örneğin, lamellipodia göçün başlangıcında göç cephesinde bu meme adenokarsinom hücre hattında görülürken, bu müsin 1 üreten meme kanseri hücre hattı aynı anda hücre göçü belirtisi göstermez.Ayrıca, meme adenokarsinom hattının göreceli yara yoğunluğu 50 saat sonra doymuş, müsin 1 üreten meme kanseri hücre hattının göreceli yara yoğunluğu zaman içinde değişmeyerek, adenokarsinom hücrelerinin son derece invaziv fenotip ve müsin 1 üreten meme kanseri hücrelerinin non-invazivliği altını çizerek. Adenokarsinom hücreleri de hücre dışı matris jel ilerken farklı davranarak, önde gelen çıkıntılarla uzatılmış bir morfoloji sergilediler ve göç tahlillerinde göç cephesindeki bir bleb görselleştirildi. Kaplama yaparken, çok az hücre tohumlu ise, çizik düzgün oluşmayacak ve çok fazla hücre tohumlu ise, aşırı kalabalık olacağını unutmayın.Bu prosedürütaki takip teskometleri eklenebilir ve bu yöntemin yüksek iş lenme li parça taraması için uyarlanmasına olanak sağlar. Bu yöntem, araştırmacıların bu tahlilleri yüksek iş kadar yüksek olan tek bir platformda gerçekleştirmelerine olanak tanır ve araştırmacıların deneysel bitiş noktası yerine hücrelerini gerçek zamanlı olarak izlemelerine olanak tanır. Çizik aletinin sterilizasyonunda kullanılan dezenfektanlar tehlikeli olabilir.Çözümleri ilgili MSDS'ye ve tesisinizin düzenli tetik hatlarına göre topladığınızdan ve elden çıkardığınızdan emin olun.

a-simple-migrationinvasion-workflow-using-an-automated-live-cell

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Burada, fare Kapkaççı lökosit homing çalışmada non-invaziv bir iki foton (2P) mikroskopi yaklaşımı açıklar. Biz, bizim doku görüntüleme hazırlık teknik yönlerini tartışmak ve yürütme ve veri toplama için kurulmuş ilk tipik bir deney yoluyla okuyucu yürümek.

Lökosit Homing Göç ve non-invaziv Görüntüleme In vivo</em

Kanser kök hücre göçü araştırılması için bir bölme oluşturan mikroakışkan cihaz tarif edilmektedir. Bu yeni platform canlı hücresel mikroçevrede oluşturur ve canlı hücre lokomosyon mikroskobik görselleştirme sağlar. Son derece hareketli kanser hücrelerinin potansiyel olarak daha etkin gelecekteki tedaviler neden agresif infiltrasyon moleküler mekanizmaları, çalışma izole edilmiştir.

Bölümlere Mikroakışkan Cihazlar ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma Kanser Kök Hücre Göç Değerlendirilmesi

Bu yöntem gerçek zamanlı ve bu hız, yer değiştirme ve hız gibi farklı hücre göçü parametrelerinin nicel ölçümleri hücrelerin izlenmesine olanak sağlar. Geleneksel yöntemlerin aksine, bu gerçek zamanlı bir yaklaşım uç kantitatif göç ölçümlere dayalı değildir, bunun yerine izlenmesi ve sürekli farklı parametreler hesaplanarak sağlar.

Time-lapse video Mikroskop ile Hücrelerinin Rastgele Göç Kantitatif Analiz

Hücre göçü gibi hücresel süreçleri, geleneksel iki boyutlu, sert plastik yüzeyler üzerinde çalışılmıştır. Bu rapor doğrudan protein lokalizasyon görselleştirme ve daha fizyolojik ilgili üç boyutlu bir matris içinde göç eden hücrelerin protein dinamiklerini analiz etmek için bir teknik anlatılmaktadır.

Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

Biz T-hücre aktivasyonu işlemi sırasında protein dinamiği içgörü sağlayan bir canlı hücre görüntüleme yöntem açıklanmaktadır. Bu kantitatif sonuçlar T-hücresi aktivasyonu boyunca kompleks oluşumu sinyalizasyon takip vermek üzere T-hücresi yayılmasını tahlilinde, konfokal mikroskopi ve görüntü analizi, kombine kullanımını göstermektedir.

T hücre gerçek zamanlı Canlı Görüntüleme Kompleks Oluşum Sinyal

Canlı hücre göç çalışmaları için bir mikroskop odasında yapıştırıcı ve çözünür degradelerin montajı için bir yöntem tarif edilmiştir. Mühendislik ortamı çözümü degradelerle antifouling yüzeyleri ve yapıştırıcı parçaları birleştirir ve bu nedenle bir rehberlik ipuçları göreli önemini belirlemek için izin verir.

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Sinirsel nüfus tarafından hızlandırılmış video mikroskobu esaslı bilgisayar yazılımı Post-processing takip izlemek için sağlam bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem canlı görüntüleme deneyler sırasında seçili bir popülasyondaki biyolojik olayları tanımlamak için güçlü bir araç temsil eder.

Tek hücreli Monitor hücre biyolojisi ve birden çok sinir nüfus Lineage ilerlemesini izleme ve ardından görüntüleme yaşamak

Burada bir otomatik optik kamera mikroskopla hücre göç vitro test etmek için bir yordam açıklanmaktadır. Kazı-kazan tahlil nerede çizik kapatılması için bir süre takip yaygın olarak kullanılmış. Optik mikroskop hücre göç güvenilir ve ucuz tespiti sağlar.

Kazı-kazan tahlil Vitro hücre göç bir otomatik optik kamera ile test etmek için en iyi duruma getirilmiş

Marjinal zon B hücreleri (MZBs) kesme akışı gücüne geçiş yollarına kadar debi yeniden yönlendirme tarafından yanıt. Bu iletişim kuralı, kayıt ve analiz akışkanlar birim, pompa, mikroskop görüntüleme sistemi ve özgür yazılım kullanarak geçiş gösterilmiştir.

Yamultma akış kaynaklı geçiş antikorundan marjinal bölge B hücrelerinin in Vitro analizine

Bu çalışma, 3D hücre invazyonu ve göçü gibi dinamik süreçler sırasında plazma zarı üzerindeki proteinlerin ekspresyonunu gerçek zamanlı olarak incelemek için yararlı olan, pediatrik diffüz orta hat glioma hücre hattına uygulanan bir canlı 3D hücre immünositokimyası protokolü sunmaktadır.

Pediatrik Diffüz Orta Hat Gliomunun Canlı 3D Hücre İmmünositokimya Testleri

Bu protokol, kantitatif analiz ile belirli çevresel koşullar altında primer murin T hücresi izolasyonu ve T hücresi göçünün hızlandırılmış mikroskobu için bir yöntem sağlar.

Primer Murin CD8 + T Hücreleri için Gerçek Zamanlı İn Vitro Migrasyon Testi

Öğrenin, canlı hücre imager kullanarak kanser hücrelerinin göç ve istilasını gerçek zamanlı izleme yöntemini. Bu entegre protokol, hücre hareketliliği ve morfoloji çalışmaları için tekrarlanabilir ve verimli bir yaklaşım sunar.

Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

Daha fazla video keşfet