Oksijen tüketim oranını bir hücre dışı akı Analyzer kullanarak birincil kültürlü fare yenidoğan Cardiomyocytes içinde analiz

Bu protokol bize izole ve kültür yüksek bi-BBT, sadece fare kardiyomiyositler bilinen sağlar. Mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için, kardiyomiyositlerin oksijen tüketim hızı gerçek bir gümüş akısı analizörü tarafından analiz edilebilir. Bu tekniğin avantajlarından biri, kardiyomiyositlerin oksijen tüketiminin 96-iyi formatında yapışık durumda kolayca ölçülebilmeleridir, bu da çok sayıda çoğaltma ile birden fazla koşulun test edilmesini sağlar.

Bu damar kardiyoloji araştırma alanı içine önemli bilgiler sağlar. Oksijen tüketimine ek olarak, greygrices ve perasit epoksidasyon gibi diğer metabolik parametreleri de inceleyebiliriz. Kardiyomiyositlerin yüksek değişkenlik elde etmek bu deney için çok önemlidir.

Bu kalplerin verimli sindirim gerektirir. Neo-natal kardiyomiyositler çok kırılgan olduğundan, kardiyomiyositlerin nazik kullanımı da önemlidir. Hücre kültürü başlık olarak, 6-iyi hücre kültür plaka her kuyuya HBSS 5ml aliquot ve buz üzerine yerleştirin.

Buna ek olarak, 10cm hücre kültürü çanak HBSS aliquot 10ml, daha sonra, 50ml steril konik tüp trypsin Prehazus solüsyonu 20 ml hazırlamak. Tüm çözümleri buzda tutun. Sonra, kalp ayıklayın ve hbss içeren steril hücre kültür çanak hemen aktarın.

Herhangi bir kalıntı akciğer dokusu ve büyük damarları çıkarın. Nazik ajitasyon kullanarak KALBI HBSS'de yıkayın. Daha sonra, 8 adet ince makas ile kalp kesmek ve HBSS ile 6-iyi hücre kültür plaka bir kuyu içine forceps ile kalp dokusu aktarın.

Moria kaşığı kullanarak, HBSS ile dolu 6 kuyulu tabakta iyiden kuyuya aktararak kalp dokusunu yıkayın. Daha sonra kalp dokusunu 20ml Tripsin içeren konik bir tüpe aktarın ve 4 saat boyunca 4 derece santigrat derecede hafif ajitasyonla inkübün. Bu işlemde, 37 santigrat derece bir su banyosunda kollajenaz sindirim çözeltisi önceden ısıtın.

Kalp dokusu ve sindirim öncesi solüsyon içeren konik tüpü 4 dereceden hücre kültürüne aktarın. 10ml serolojik pipet kullanarak kalp dokusu tüp altına lavabo ve presindirimi solüsyon kaldırmak sağlar. Daha sonra, tüp içine HBSS 10ml ekleyin.

10ml serolojik pipet kullanarak Trypsin yıkamak için HBSS ile kalp dokusu nu 2-3 kez yeniden askıya alın. Aspire HBSS ve kalp dokusu ile tüp içine önceden ısıtılmış kollajenaz sindirim çözeltisi 10ml ekleyin. İlk sindirim için, ajitasyon olmadan 10 dakika boyunca 37 santigrat derece bir su banyosunda kalp dokusu ile tüp kuluçka.

Daha sonra, hücre kültürü başlık için tüp aktarın. 10ml serolojik pipet kullanarak 10 kez hafifçe resuusing tarafından doku triturate. Bu kalp dağıtmak ve hücrelerin kalp dokusundan serbest bırakılması sağlayacaktır.

Sindirilmemiş dokunun batmasına izin ver. Kardiyomiyositlerle zenginleştirilmiş sindirilmiş çözeltiyi yeni bir konik tüpe aktarın ve kollajenaz sindirimini durdurmak için hemen eşit miktarda hücre kültürü ortamı ekleyin. Sonra kalan sindirilmemiş kalp dokusu içeren tüp içine kollajenaz sindirim çözeltisi 10ml ekleyin.

İkinci sindirim için, 10 dakika boyunca 37 derece santigrat su banyosunda kalp dokusu ile tüp kuluçka. Kollajenaz sindirimdurdurmadan önce ilk sindirim prosedürlerini tekrarlayın ve kardiyomiyositler zenginleştirilmiş sindirilmiş çözeltiyi yeni bir konik tüpe aktarın. Sonra, yeni bir steril 50ml konik tüp steril bir hücre süzgeci yerleştirin.

Hücre süzgecinden 2-3 ml'lik bir ortam alabilmek için önceden ıslanın ve hücreleri hücre süzgecinden geçirin. Daha sonra, hücre kültürü ortamı ile hücre süzgeci durular. Daha sonra, 180 kez yerçekimi 5 dakika kardiyomiyosit içeren konik tüp santrifüj.

5 dakika sonra, supernatant aspire ve hücre kültürü orta 10ml hücre pelet resuspend. 10cm hücre kültür çanak üzerine plaka hücreleri ve bir saat kuluçka. Daha sonra, yavaşça plaka ajite.

Non-yapışık hücreleri yıkayın ve tekrar tekrar 10ml serolojik pipet kullanarak çanak üzerinde hücre kültürü orta pipetting hücreleri yeniden askıya. Daha sonra, yeni bir 10cm hücre kültürü çanak içine non-adherent hücreleri aktarın ve başka bir saat için kuluçka. Bir saat sonra, yavaşça plakaaj ve non-yapışık hücreleri yıkayın.

Kardiyomiyositleri yeni bir 50ml konik tüpe aktarın. Ardından, 96 kuyulu hücre kültür plakasının her kuyuda 50 mikrolitre kaplama çözeltisi ekleyerek 96 kuyulu bir kültür plakası hazırlayın. Kabarcıklar varsa, 20 mikrolitrelik pipet kullanarak çıkarın.

Matris kaplamanın kurutulması için plakayı en az bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak. Hücreleri hücre dışı matrisin içine, kuyu başına 10 ila 30 bin hücre arasında bir yoğunlukta 96 kuyulu hücre kültür plakasına yerleştirin.

Ve hücreleri kuluçkaya yatırın. Oksijen tüketimi analizini azaltmak için, bir akı analizörlü kartuşunu en az 3 saat nemlendirin, yardımcı plakanın her kuyusuna 200 mikrolitre kalibran çözeltisi ekleyin. Sensör kartuşunu yardımcı plakaya geri yerleştirin ve en az 3 saat boyunca CO2 veya O2 takviyesi olmadan 37 santigrat derece kuluçkaya yatırın.

Bir saat önce tisbym, yavaşça hücre kültürü orta kaldırmak ve önceden ısıtılmış mitokondriyal stres testi orta iki kez 200 mikrolitre ile hücreleri yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, önceden ısıtılmış mitokondriyal stres testi orta 175 mikrolitre ekleyin. Sonra kültür karbondioksit veya oksijen takviyesi olmadan 37 santigrat derece hücreleri.

Mitokondriyal stres testi orta test bileşikleri her 3ml hazırlayın. Çok kanallı bir pipet kullanarak sensör kartuşu enjektör portlarına her bileşiğin 25 mikrolitresini yükleyin. Hücrelerin durumu ve herhangi bir ön tedavi uncoupler FCCP enjeksiyonu ile ortaya maksimum restorasyon etkileyebilir.

Uncoupler hücre duyarlılığı da değişebilir, bu nedenle, her tedavi için FCCP çalışma konsantrasyonu optimize etmek önemlidir. Daha sonra, ekstra-hücresel akı test protokolü kurmak ve programı başlatın. İlk olarak, kalibrasyon için makineye sensör kartilik koyun.

Kalibrasyon adımı yapıldıktan sonra, kalıtım plakası için kalikan değiştirin. İstenirse, teşbikten sonra, çok kanallı pipet kullanarak tüm teşbib ortamını dikkatlice atın. Ve protein testini kullanarak hücre normalleşmesi için hücre kültürünü negatif 20 santigrat derecede saklayın.

Açıklanan protokol kullanılarak kalpler 0. Gece kültüründen sonra, kardiyomiyositler iyi kaplı plastik yüzeye bağlı bulundu ve çok az bekar hücreler vardı. Bu noktada, kendiliğinden kasıldıktan sonra kardiyomiyositler kolayca görülebiliyordu.

Her kuyu başına 30.000 hücrelik bir tohumlama yoğunluğu, hücreler yayıldıkça tohumlamadan bir gün sonra birleştiğiyer gösterdi. Kardiyomiyositler sarkoerik alfa aktin, bir kardiyomiyosit spesifik belirteç karşı bir antikor ile immünosiyon edildi. Burada gösterildiği gibi, hücrelerin çoğu kardiyomiyosit izolasyonu yüksek saflıkgösteren alfa aktin pozitif boyama gösterdi.

Tipik bir mitokondriyal stres testi bir şema burada gösterilmiştir. Mitokondriyal stres testi oksijen tüketim oranının bir temel ölçü ile başlar, Bu ATPA inhibe Oligo miyozin enjeksiyonu takip eder. Daha sonra, ayırma maddesi FCCP maksimum oksijen tüketim oranını ölçmek için enjekte edildi.

Son olarak, iki elektron taşıma kompleksi inhibitörlerinin enjeksiyonu ile mitokondriyal solunum tamamen durur ve OCR en düşük seviyesine düşer. Tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için. Yüksek hayatta kalma elde etmek çok önemlidir.

Bu nedenle kardiyomiyositlerde yenidoğan yenidoğan ve hafifçe işlenmiş kalp dokularının kullanılması önemlidir. Yeni veya mevcut genetik olarak manipüle fare hatları kullanılarak, bu yöntem kolayca kalpbiyoenerjetik düzenleme için yeni mekanizmaları anlamak için yol açabilir verilere çevrilebilir. Mitokondriyal kalp fonksiyonunda kilit rol oynar.

Bu yöntemin, metabolizmayı düzenleyen yeni düzenleyicilerin ve yolların belirlenmesine ve kalp yetmezliğinin tedavisinde yeni tedavi hedeflerinin bulunmasına yardımcı olmasını bekliyoruz.