Name: Oksijen tüketim oranını bir hücre dışı akı Analyzer kullanarak birincil kültürlü fare yenidoğan Cardiomyocytes içinde analiz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Öğrenin, hücre dışı akı analizörü kullanarak yeni doğan fare kardiyomiyositlerinde oksijen tüketim oranını nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem, mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için güvenilir bir çerçeve sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tüm Ross laboratuvar ve Murphy laboratuvar üye teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Y.C. NIH (HL115933, HL127806) ve R.S.R. için VA hak (BX003260) Amerikan Kalp Derneği (14SDG17790005) tarafından desteklenmektedir

Yenidoğan fareler ile çalışmaları için lütfen yerel üniversite/Enstitü yönergeleri ileri hayvan bakımı programlar tarafından bakın ve kişinin kurumsal ve diğer uygun düzenlemeler için uygun. Bu protokol için açıklanan tüm yöntemleri UC San Diego kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır ve federal ve eyalet düzenlemelere uygun.
1. hazırlanması reaktifler
<ol><li>25 mL öncesi sindirim çözeltisihazırlamak: tripsin (0,5 mg/mL) ile birlikte HBSS (olmadan Ca2 + ve Mg2 +). 0,22 µm filtre kullanarak çözüm sterilize ve buza kadar kullanmak tutun. Öncesi sindirim çözüm deneme günü olun. Not: HBSS Ca2 + kullanmak için önemlidir ve Mg2 +, olarak Ca2 + ve Mg2 + myocyte kasılma ve yalıtım sırasında sonraki hücre ölümüne neden olur.</li>
	<li>30 mL collagenase sindirimarabelleği hazırlamak: HBSS (olmadan Ca2 + ve Mg2 +) arabellekte çözünmüş collagenase (0,8 mg/mL, yaklaşık 350 U/mL). 0,22 µm filtre kullanarak çözüm sterilize ve buza kadar kullanmak tutun. Collagenase sindirim çözüm deneme günü olun.</li>
	<li>Cardiomyocyte kültürortamının (büyüme medya) 500 mL hazırlamak: Mix DMEM 375 mL, M-199 125 mL, at serum 25 mL ve FBS 12,5 mL. % 1 penisilin ve % 1 streptomisin çözüm ile ek.</li>
	<li>Mitokondrial stres testi ortahazırlamak: DMEM yapmak 200 mL dayalı (DMEM NaHCO3, olmadan görmek Tablo reçetesi) stres testi orta 1 mM sodyum pyruvate, 2 mM L-glutamin ve 10 mM glikoz ve 2 mM Hepes ile desteklenmiştir. Not: Orta 1 L DMEM ile sodyum pyruvate, L-glutamine, glikoz ve Hepes, steril, filler yapmak ve 4 ° c'saklamak Stres testi orta tahlil gününde diğer ayıraçlar ekleyerek hazırlayın. DMEM kullanarak NaHCO3 olmadan orta önemlidir.</li>
	<li>PH 7.4 medyaya mitokondrial stres testi kullanım gününde ayarlayın. Kullanmadan önce 37 ° C sıcak ortama.</li>
	<li>Oligomycinhazırlamak: 5 mL 5 mM stok çözeltisi içinde DMSO hazırlamak, 250 µL aliquots alın ve saklayın-20 ° C'de</li>
	<li>FCCPhazırlamak: 5 mL 5 mM stok çözeltisi içinde DMSO hazırlamak, 250 µL aliquots alın ve saklayın-20 ° C'de</li>
	<li>Antimycin Ahazırlamak: 5 mL 5 mM stok çözeltisi içinde DMSO hazırlamak, 250 µL aliquots alın ve saklayın-20 ° C'de</li>
	<li>Rotenonhazırlamak: 5 mL 5 mM stok çözeltisi içinde DMSO hazırlamak, 250 µL aliquots alın ve saklayın-20 ° C'de Not: Tüm reaktifler ve çözümleri bu protokol için kullanılan Tablo 1' de listelenmiştir.</li>
</ol>2. hasat ve Neonatal fareler (gün 1) üzerinden kalplerin öncesi sindirim
<ol><li>Otoklav makas, pens ve sterilize etmek için Moria kaşıkla.</li>
	<li>Hücre kültür mahalle kısırlık için tüm adımları gerçekleştirin.</li>
	<li>Her şey bir 6-şey hücre kültür plaka için aliquot 5 mL HBSS (olmadan Ca+ 2, Mg2 +) de; Buza koyun. HBSS aliquot 10 mL 10 cm hücre kültür çanak içine.</li>
	<li>20 mL 50 mL steril konik tüp içinde tripsin öncesi sindirim çözeltisi hazırlamak. Tüm çözümler buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde % 70 etanol çözüm sterilizasyon için yenidoğan (0 gün) farelerde daldırma.</li>
	<li>Steril makas (düz) anestezi kullanarak pups başını kesmek ve göğüs göğüs boşluğu ve kalp erişmesine izin vermek için göğüs kemiği boyunca açın. (Şekil 1A) Not: 1) P0 yenidoğan fareler yüksek hücre canlılık elde etmek için kullanmak için önemlidir. 2) bu ötenazi Yöntem ventilasyon NIH ve Amerikalı hayvan hastalıklarıyla ilgili tıbbi kurum yönergeleri 17uyarınca yasaktır.</li>
	<li>Kalpler vücuttan bir iyi makas ve transfer hemen HBSS (Ca2 +, Mg2 +) içeren steril hücre kültür çanak içine extract (Şekil 1B).</li>
	<li>Kaldır herhangi bir kalıntı akciğer dokusu, daha büyük gemiler, vb (ve istenirse atria,). Kalpler nazik ajitasyon kullanarak HBSS solüsyonu içinde yıkayın.</li>
	<li>Her kalp ince bir makasla 8 parçalar halinde kesilmiş ve tüm kalp doku 6-şey hücre kültür plaka HBSS (Şekil 1 c ve 1 D) ile bir kuyuya forseps ile aktarın.</li>
	<li>Kalpleri bir Moria kaşık (Şekil 1 d) kullanarak HBSS ile dolu 6-şey plaka iyi iyi kalpleri aktararak yıkayın. Not: İyi iyi kalpleri aktarma kan yıkamak için yeterli olacaktır. Kan ile enzimatik sindirim engelleyen beri kalpler HBSS ile yıkama ve kan kaldırmak önemlidir.</li>
	<li>Kalpleri Moria kaşıkla tripsin (0,5 mg/mL) 20 mL içeren bir konik tüp içine aktarmak ve 4 h (Şekil 1E) için 4 ° C'de nazik ajitasyon ile kuluçkaya.</li>
</ol>3. bir 96-şey kültür plaka (gün 1) hazırlayın
<ol><li>5 mL kaplama çözeltisi hazırlamak: % 0.5 jelatin (otoklav kullanmadan önce) ve % 1 fibronektin çözüm içeren PBS. (örneğin 5 mL jelatin çözüm artı 50 µL fibronektin çözüm)</li>
	<li>96-şey hücre kültür plaka her kuyuya kaplama çözümün aliquot 50 µL ( Tablo malzemelerigörmek). Kabarcıklar varsa, onları dışarı kabarcıklar emmeye 20 µL pipet kullanarak kaldırın. Not: Her şey kaplama solüsyonu ile tüm yüzey alanı kapsayacak şekilde önemlidir.</li>
	<li>37 ° C hücre kültür kuluçka 1 h veya matris kaplama kurutma izin vermek için daha fazla plaka kuluçkaya.</li>
	<li>Herhangi bir kalıntı kaplama çözüm cardiomyocytes tohum önce Aspire edin.</li>
</ol>4. enzimatik sindirim ve kaplama hücre (1 gün)
<ol><li>Collagenase sindirim çözüm 37 ° C su banyosu içinde önceden ısıtmak. Not: Bu verimli enzimatik sindirim elde etmek önemli bir adımdır bu.</li>
	<li>Kalpleri ve 4 ° C ön sindirim çözümden bir hücre kültür hood için içeren konik tüp taşıyın. (Şekil 1F)</li>
	<li>Kalpleri ve lavabo tüp altına 10 mL serolojik pipet öncesi sindirim çözüm kaldırmak izin (yalıtım orta 1-2 mL tüp kalabilir).</li>
	<li>HBSS 10 mL tüp içine ekleyin. Kalpler HBSS ile 2 - 3 kez yeniden askıya bir 10 mL serolojik pipet kullanarak tripsin yıkamak için. HBSS Aspire edin (1-2 mL tüp kalabilir).</li>
	<li>Önceden ısıtılmış collagenase sindirim çözüm 10 mL yürekleri tüp içine ekleyin. (Şekil 1G)</li>
	<li>Ajitasyon olmadan 10 dk 37 ° C su banyosunda yürekleri tüp kuluçkaya (1 sindirim).</li>
	<li>1 sindirim sonra hücre kültür hood için tüp taşıyın. Yavaşça kalpler yavaşça 10 kat 10 mL serolojik pipet kullanarak tüp içinde kalpleri yeniden askıya tarafından triturate. Bu dağıtmak için kalpleri ve kalp dokudan var olmak serbest bırakmak hücrelere izin verir. (Şekil 1 H) Not: Cardiomyocytes kırılgan olduğundan, nazik toz yüksek canlılık elde etmek önemlidir.</li>
	<li>Lavabo, sindirilmiş çözüm cardiomyocytes (yaklaşık 9-10 mL) için yeni bir konik tüp içinde zenginleştirilmiş aktarmak ve hemen collagenase sindirim durdurmak için hücre kültür ortamının eşit miktarda ekleyin sindirilmemiş doku izin.</li>
	<li>Kalan sindirilmemiş kalp dokusu içeren tüpe 10 mL collagenase sindirim çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>10 dk 37 ° C su banyosunda kalp dokusu ile tüp kuluçkaya (2 sindirim).</li>
	<li>4.7 ve 4,8 yordamı yineleyin. Not: Hala çok sindirilmemiş doku, sindirim bir kez daha yineleyin. Ancak, çoğu durumda, iki kesimi hücrelerin çoğu kalp dokudan dağıtmak için yeterlidir.</li>
	<li>Steril hücre süzgeç (100 µm naylon mesh) yeni bir steril 50 mL konik tüpü yerleştirin. 2-3 mL hücre kültür ortamının ile hücre süzgeç önceden ıslak ve hücre-süzgeç ile hücreleri geçirin. Hücre-süzgeç ile 2-3 mL hücre kültür ortamının durulayın. (Şekil 1I)</li>
	<li>Konik tüp cardiomyocytes 180 x g (Şekil 1J), 5 min için içeren santrifüj kapasitesi. Hücre doku artıkları içeren ve hücre Pelet 10 mL hücre kültür medya (Şekil 1 L) yeniden askıya süpernatant (Şekil 1 K), Aspire edin.</li>
	<li>Yavaşça hücreleri ve plaka hücreleri üzerine 10 cm hücre kültür çanak (plastik kaplama her türlü olmadan) resuspend ve bir hücre kültür kuluçka (1 ön kaplama) 1 h için kuluçkaya (Şekil 1 M). Bu ön kaplama adım sigara-cardiomyocytes, fibroblastlar ve kaplamasız hücre kültürü yemek için uymaları endotel hücreleri gibi sağlar. Not: Bu noktada, cardiomyocytes genellikle yuvarlak bir şekli olan ve mikroskop altında parlak görünür. (Şekil 1N).</li>
	<li>1 h kuluçka sonra yavaşça plaka kışkırtmak, yapışık olmayan hücreleri (cardiomyocytes içinde zenginleştirilmiş) 10 cm kültür bulaşık yıkama ve hücreleri hücre kültür orta 10 mL serolojik pipet kullanarak çanak üzerinde art arda pipetting tarafından yeniden askıya alma. Sonra bir yeni 10 cm hücre kültür çanak (plastik olmadan herhangi bir kaplama) içine yapışık olmayan hücreleri (cardiomyocytes içinde zenginleştirilmiş) aktarmak ve bir hücre kültür kuluçka (2 ön kaplama) ek bir 1 h için kuluçkaya. Not: Sigara kaplı plakasına eklemek hücrelerdir baskın sigara cardiomyocytes: fibroblast ve endotel hücreleri, mikroskop (Şekil 1O) altında görüntülenir.</li>
	<li>2 öncesi kaplama sonra yavaşça plaka kışkırtmak, yapışık olmayan hücreleri (cardiomyocytes) 10 cm kültür bulaşık yıkamak, sonra cardiomyocytes bir yeni 50 mL konik tüp içine aktarın.</li>
</ol>5. hücre sayımı ve hücreleri bir 96-şey hücre kültür plaka (gün 1) kaplama
<ol><li>Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.</li>
	<li>Hücreleri içine bir yoğunluk arasında 10-30 x 103 hücreleri/200 µL (Şekil 1 P) son bir hacim içinde bir çok kanallı pipet kullanarak iyi bir hücre dışı matriks kaplı 96-şey hücre kültür plaka plaka. Kuyu A1, A12, H1 ve H12 arka planı olarak kullanabilir: 200 µL kültür ortamının diğer kuyu bu Wells (hücreler) olarak ekleyin. 37 ° C hücre kültür kuluçka plaka kuluçkaya. Not: Bu çalışmada, oksijen tüketimi farklı hücre yoğunlukları 10 x 103, 20 x 103veya 30 x 103 hücreleri/iyi gibi kullanarak test edildi. (Şekil 2A). Ayrıca, yukarıdaki gibi cardiomyocytes hemen sonra yalıtım genellikle yuvarlak bir şekli olan ve mikroskop altında parlak görünür. Hücrelerin içinde 16-24 h kültürünün dümdüz.</li>
</ol>6. oksijen tüketimi tahlil bir 96-iyi format hücre dışı akı Analyzer'ı (2 gün)
Not: Oksijen tüketimi tahlil hücreleri kaplama sonra bir gün dışarı taşınan veya daha sonra. Bu iletişim kuralı 7 gün yaşayabilir yenidoğan cardiomyocytes kültürlü kullanarak yalıtım sonrası.
<ol><li>Akı analyzer sensör kartuş hidrat ( Tablo malzemelerigörmek) en az 3 saat ama ideal olarak tahlil önce tam bir gün için. Calibrant çözümün 200 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) yardımcı programı plaka her kuyuya, sensör kartuşu yardımcı programı tabağa koy ve 37 ° C kuluçka CO2 veya O2 takviyesi olmadan kuluçkaya.</li>
	<li>Hücre kültür medya bir saat önce tahlil mitokondri stres testi orta olarak değiştirin. Cardiomyocytes kırılgandır. Bu nedenle, yavaşça bir çok kanallı pipet kullanarak hücre kültür ortamını çıkarın ve önceden ısıtılmış mitokondrial stres testi medya 200 µL hücrelerle iki kez yıkayın. İkinci yıkama sonra önceden ısıtılmış mitokondri stres testi medya 175 µL ekleyin ve 37° C kuluçka CO2 veya O2 takviyesi olmadan hücreler kültür.</li>
	<li>Konsantre test bileşikler hazırlayın. Mitokondri stres testi için 3,0 mL her 16 µM oligomycin, 9 µM FCCP ve 20 µM Rotenon ve 20 µM antimycin A, tüm mitokondrial stres testi ortamda karışımı hazırlayın. Not: Her kampta açıklanan konsantrasyon test edilmiştir. Ancak, kişinin kendi laboratuvarında her bileşik toplama titrating gereklidir.</li>
	<li>Her bileşik 25 µL sensör kartuş çok kanallı pipet (Şekil 1Ç) kullanarak enjektör bağlantı noktalarına yükleyin. Birim ve nihai toplama Tablo 2' de açıklanmıştır.</li>
	<li>Hücre dışı akı tahlil Protokolü ayarlayın. Program açıklandığı Tablo 3.
</li>
	<li>Programı başlatın. İlk olarak, sensör kartuş kalibrasyon (Şekil 1R) için makine içine koymak. Kalibrasyon adım işlem tamamlandıktan sonra tahlil plaka için calibrant değiştirin. Not: Üreticisi tarafından sağlanan yazılımı kullanmanız, kuyu ve her bileşik grupları ve bağlantı noktası anlamına gelir.</li>
	<li>İstenirse, tahlil sonra dikkatli bir şekilde bir çok kanallı pipet kullanarak tüm tahlil orta atmak ve hücre kültür Mikroplaka protein tahlil kullanarak gelecekteki hücre normalleştirme için-20 ° C'de depolayın.</li>
	<li>Protein içeriği ölçmek. Standart RIPA hücre lizis çözüm 50 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek). Plaka tam hücreleri parçalayıcı için 30 dakika buz üzerinde kuluçkaya. Tüm malzeme için yeni bir açık düz dipli 96 iyi tahlil plaka aktarın.</li>
	<li>BCA tahlil üreticisinin protokolüne göre tarafından protein konsantrasyonu ölçmek. Not: Hücre dışı matriks ile iyi kaplama yüksek protein konsantrasyonu her iyi sonuçlanır. Bu nedenle, gerçek hücre protein konsantrasyonu almak için arka plan well(s) (hücre) tutarını çıkarmak. Hücrelerinden elde edilen protein konsantrasyonu bir 96-şey kültür tabağına düşüktür. Buna ek olarak, protein konsantrasyonu iyi iyi hücre dışı matriks kaplama nedeniyle farklı. Bu nedenle, OCR normalleştirmek için cep telefonu numarasını kullanarak önerilir.</li>
</ol>

<ol><li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+regulate+cardiac+contraction+through+ATP-dependent+and+independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms.</a> Free Radical Research. , 1-10 (2018).</li>
<li>Kolwicz, S. C. Jr, Purohit, S., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+metabolism+and+its+interactions+with+contraction%2C+growth%2C+and+survival+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).</li>
<li>Rosca, M. G., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in heart failure.</a> Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).</li>
<li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imbalanced+OPA1+processing+and+mitochondrial+fragmentation+cause+heart+failure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice.</a> Science. 350 (6265), aad0116(2015).</li>
<li>Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+College+Cardiololgy%22%5BJournal%5D)">Mitochondria as a therapeutic target in heart failure.</a> Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).</li>
<li>Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+approaches+to+protect+against+cardiac+ischemia+and+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury.</a> Frontiers in Physiology. 2, 13(2011).</li>
<li>Brown, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expert+consensus+document%3A+Mitochondrial+function+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).</li>
<li>Zhou, P., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recounting+Cardiac+Cellular+Composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Recounting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).</li>
<li>Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+culture+-+an+update+on+the+in+vitro+cardiovascular+model+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).</li>
<li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vissualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).</li>
<li>Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+basal+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac basal metabolism.</a> Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).</li>
<li>Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+Related+Bioenergetics+Profiles+in+Isolated+Rat+Cardiomyocytes+Using+Extracellular+Flux+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses.</a> PLoS One. 11 (2), e0149002(2016).</li>
<li>Neary, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+signaling+controls+postnatal+changes+in+cardiac+mitochondrial+morphology+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).</li>
<li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).</li>
<li>Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+primary+culture+of+cardiomyocyte+from+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice.</a> In vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).</li>
<li>AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2013).</li>
<li>Manso, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Talin1+has+unique+expression+versus+talin+2+in+the+heart+and+modifies+the+hypertrophic+response+to+pressure+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).</li>
<li>Wang, G. W., Kang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+doxorubicin+toxicity+in+cultured+neonatal+mouse+cardiomyocytes+with+elevated+metallothionein+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).</li>
<li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazolidinediones+are+acute%2C+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), e21746(2011).</li>
<li>Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+function+in+cardiovascular+cells%3A+the+importance+of+the+reserve+capacity+and+its+biological+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation.</a> Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).</li>
<li>Sharp, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-related+protein+1+%28Drp1%29-mediated+diastolic+dysfunction+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury%3A+therapeutic+benefits+of+Drp1+inhibition+to+reduce+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission.</a> FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).</li>
<li>Tigchelaar, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophy+induced+KIF5B+controls+mitochondrial+localization+and+function+in+neonatal+rat+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).</li>
<li>Graham, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+mitochondrial+myopathy+and+cardiomyopathy+resulting+from+a+deficiency+in+the+heart%2Fmuscle+isoform+of+the+adenine+nucleotide+translocator%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator.</a> Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).</li>
<li>Zhao, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defects+in+caveolin-1+cause+dilated+cardiomyopathy+and+pulmonary+hypertension+in+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).</li>
<li>Vander Heiden, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+can+influence+cell+growth+and+survival+through+effects+on+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).</li>
<li>Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+activities+of+fibroblast+growth+factor-2+in+the+adult+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium.</a> Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+extracellular+flux+%28XF%29+assay+to+assess+compound+effects+on+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).</li>
<li>Dai, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+cardiomyopathy+in+mitochondrial+mutator+mice+is+attenuated+by+overexpression+of+catalase+targeted+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria.</a> Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).</li>
<li>Ritterhoff, J., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+in+cardiomyopathy%3A+every+substrate+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters.</a> Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).</li>
<li>Uosaki, H., Taguchi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Gene+Expression+Analysis+of+Mouse+and+Human+Cardiac+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%2C+Proteomics+%26+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation.</a> Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Bu çalışmada, yalıtma ve fare yenidoğan cardiomyocytes kültür için basit bir protokol kurduk. Bu cardiomyocytes kullanarak, biz de bir hücre dışı akı analiz sistemi kullanılarak oksijen tüketim oranını ölçmek için koşulları optimize. Protokol bir fare yenidoğan cardiomyocytes nasıl çeşitli faktörlere ne olduğu gibi organ ölçülen akin to Heart, asıl çalışma hücrelerdeki oksijen tüketimi değiştirebilirsiniz incelemek için bir model sistemi olarak kullanmak izin verir. Bizim daha önce yayımlanmış protokolleri<sup class="xre...

Sürekli kardiyak contractile işlevini sürdürebilmek için cardiomyocytes hücresel enerji ATP1şeklinde öncelikle sürekli bir tedarik korumak gerekir. Kalbinden, ATP yaklaşık % 95'i mitokondri, Oksidatif fosforilasyon, mitokondri kardiyak fonksiyon2,3' te çok önemli bir Biyo-enerjetik rol oynamak gösterilen üzerinden olmak üzere oluşturulur. Bu fikri destekleyen olduğunu mitokondriyal işlev bozukluk kardiyomiyopati ve kalp yetmezliği4,5' e neden olabilir. Diğer taraftan, mitokondriyal işlev geri yükleme başarısız kardiyak fonksiyon geliştirmek için gösterilmiştir kalp6,7. Bu nedenle, mitokondriyal bioenergetics mekanizması eğitim ve mitokondrial fonksiyonunu kullanabilirsiniz cardiomyocytes roman düzenleyiciler belirlenmesi sadece kalp enerji üretim mekanik anlayışlar ortaya değil ama ayrıca yol açacak fikir sağlayabilir kalp hastalıkları6,8tedavisi için yeni tedavi hedefleri gelişimi için.
Tüm kalp için karşılaştırıldığında, hangi miyositler ve sigara miyositler9, cardiomyocyte kültürlerin karışımı içeren son derece saf, yürekten, fibroblastlar ve endotel hücreleri10gibi miyositler en az kirlenme ile. Buna ek olarak, cardiomyocytes yenidoğan pups dan izole zaman, Yetişkin kalpler10,11' den izole hücrelere kıyasla küçük bir miktarda çok sayıda hücre kültürü çalışmalarının sağlar. En önemlisi, birincil kültürlü yetişkin fare cardiomyocytes (örneğin 24 h) kez kısa hayatta kalma var ve de-puan daha uzun zaman ayırmak. Yenidoğan fare cardiomyocytes yaşayabilir ve yukarı 7 gün içinde kültür, onları cardiomyocytes10dakika sonra uyuşturucu bileşikler ve mitokondri gen düzenleme fonksiyonları üzerine etkilerini test etmek için idealdir için manipüle edilebilir. Tabii ki, Yetişkin ve neonatal hücreler arasında önemli biyolojik farklılıklar vardır, ama yenidoğan hücre kültürü için daha uzun süre onları çalışmalar, mitokondriyal işlev de dahil olmak üzere birçok farklı türleri için uygun hale getirir.
Bugüne kadar birincil kültürlü yenidoğan fare ve sıçan cardiomyocytes model olarak kardiyak bioenergetics12,13eğitim için kullanılmaktadır. Son yıllarda çalışmalar bir hücre dışı akı analizörü oksijen tüketim oranını (OCR) ölçmek ve fare ve sıçan yenidoğan cardiomyocytes14,15dakika sonra oksidatif kapasite değerlendirmek için kullanılır. Fareler için karşılaştırıldığında, fare yenidoğan cardiomyocytes hücre canlılığı düşüktür ve büyük değişkenlik16vardır. Ayrıca, hücre genetiği fare modelleri arasında çalışma olanağı fare hücre modeli çok önemli yapar. OCR çalışmalar hücre sayısı ve yoğunluğu tohum kadar hassas olduğunu göz önüne alındığında, tutarlı hücre verim ve canlılık elde etmek için tekrarlanabilir, güvenilir ve basit bir iletişim kuralı geliştirilmesi gereklidir.
Burada, kültürlü fare yenidoğan cardiomyocytes 96-iyi format hücre dışı akı analyzer ile birlikte OCR analiz için kullanan geliştirilmiştir bir en iyi duruma getirilmiş protokol raporu. Bu iletişim kuralı büyük tekrarlanabilirlik testin artırır. Ayrıca, protokol sadece bir roman ve OCR analiz için tekrarlanabilir yöntemi sağlar, ama aynı zamanda daha büyük bir boyut kültür ve hücre içi myofibrillar fonksiyonlar çalışma için gerekli olabilen bu gibi diğer Deneysel amaçlar için adapte Sinyal yollar.
Özellikle, bu iletişim kuralı bir günlük yordam yalıtım ve neonatal fare cardiomyocytes bir 96-şey hücre kültür plaka kültür açıklar. Buna ek olarak, bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak oksijen tüketimi ölçmek için yordamı açıklar. Tüm çözümler kullanılan steril veya steril filtre. Tüm araçları % 75 etanol tarafından sterilize. Yordamı çeşitli bölümleri için bir Tablo malzeme sağlar. Cardiomyocytes kültür için tüm yordamları ve adımları bir standart hücre kültür mahallede gerçekleştirilir. Bu iletişim kuralı--dan bir çöp (yaklaşık 8-10 yavru) yenidoğan fare kalplerin yalıtım için geliştirilmiştir. Ancak, iletişim kuralı da cardiomyocytes birden çok çöp üzerinden yalıtmak için adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Antimisin A</td><td>SIGMA</td><td>A8674</td> Mitokondri Hücre süzgeci 100 & <td>mu'nun kompleks III'ünü inhibe eder</td></tr><tr><td>; m gözenekler</td><td>FALCON</td><td>352360</td><td>Sindirilmemiş dokuyu yakalamak için</td></tr><tr><td>Kollajenaz tip II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>Kollajenaz sindirim çözeltisi yapmak için</td></tr><tr><td>D-Glukoz</td><td>SIGMA</td><td>75351</td><td>Mitokodansyal stres testi ortamı yapmak için</td></tr><tr><td>DMEM yüksek glikoz</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>11965-092</td><td>Hücre kültürü ortamı yapmak</td></tr><tr><td>NaHCO3, Glukoz, piruvat, glumanin ve Heps içermeyen DMEM</td><td>SIGMA</td><td>D5030-10X1L</td><td>Mitokodniyal stres testi ortamı yapmak için</td></tr><tr><td>FCCP (Karbonil siyanür 4- (triflorometoksi) fenilhidrazon)</td> <td>SIGMA</td><td>C2920</td><td>Mitokondriyal solunumu ayırır</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>26140-079</td><td>Hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>yapmak için Fibronektin sığır plazması</td><td>SIGMA</td><td>F1141-5MG</td><td>Doku kültürü plakaları için kaplama çözeltisi yapmak için</td></tr><tr><td>İnce makas</td><td>Güzel Bilimler Araçları</td><td>14060-10</td><td>Kalplerin diseksiyonu için</td></tr><tr><td>Domuz derisinden jelatin</td><td>SIGMA</td><td>G-1890</td><td>Doku kültürü plakaları için kaplama çözeltisi yapmak için</td></tr><tr><td>HBSS (Hank'in dengeli tuz çözeltisi, Ca2 + , Mg2 + )</td><td>Cellgro</td><td>21-022-CV</td><td>Kalpleri yıkamak ve ön sindirim ve kollagnaz sindirim solüsyonu yapmak için</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Fisher scientific</td><td>15630080</td><td>Mitokodnriyal stres testi ortamı yapmak At</td></tr><tr><td>serumu</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>26050-088</td><td>Hücre kültürü ortamı yapmak için</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>SIGMA</td><td>G-3126</td><td>Mitokodniyal stres testi ortamı yapmak için</td></tr><tr><td>M-199</td><td>Cellgro</td><td>10-060-CV</td><td>Hücre kültürü ortamı yapmak için</td></tr><tr><td>Moria kaşığı</td><td>Fisher bilimsel</td><td>NC9190356</td><td>Kalpleri yıkamak için&nbsp;</td></tr><tr><td>Oligomisin</td><td>SIGMA</td><td>75351-5MG</td><td>Mitokondriyal ATP sentazı inhibe eder</td></tr><tr><td>RIPA tamponu</td><td>Fisher scientific</td><td>89900</td><td>Protein tahlili için hücreleri parçalamak için</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>SIGMA</td><td>R8875</td><td>Mitokondrinin kompleks I'ini inhibe eder</td></tr><tr><td>Denizatı XFe96 Hücre Dışı Akı Analizörü</td><td>Agilent</td><td></td><td>Oksijen tüketim oranını</td></tr> <tr>analiz etmek için kullanılan cihaz<td>Denizatı XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102601-100</td><td>Akı analizörü kültür plakaları, sensör kartuşları ve kalibant</td></tr><tr><td>paketi Sodyum piruvat</td><td>SIGMA</td><td>P2256</td><td>Mitokodneryal stres testi ortamı yapmak için</td></tr><tr><td>Düz makas</td><td>Güzel Bilimler Araçları</td><td>91401-12</td><td>Kalplerin diseksiyonu için</td></tr><tr><td>Şırınga filtresi 0.2 & mu; m boyutu</td><td></td><td></td><td>Sindirim ortamının steril filtrasyonu için</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>USB Corporation</td><td>22715 25GM</td><td>Ön sindirim çözeltisi yapmak için</td></tr></tbody></table>

oksijen tüketim oranını bir hücre dışı akı analyzer kullanarak birincil kültürlü fare yenidoğan cardiomyocytes içinde analiz

Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer

Mitokondri ve oksidatif metabolizma kalp kası fonksiyonu korumak için önemlidir. Araştırmalar bu mitokondrial disfonksiyon kalp yetmezliği bulunan Engelli kardiyak fonksiyon için önemli bir faktör olduğunu göstermiştir. Buna karşılık, arızalı mitokondriyal işlev geri yükleme başarısız kalbinde kardiyak fonksiyon geliştirmek için yararlı etkileri olabilir. Bu nedenle, düzenleyici mekanizmaları eğitim ve Roman düzenleyiciler, mitokondriyal işlev için tanımlama kalp hastalığı tedavisi için yeni tedavi hedefleri geliştirmek için kullanılan fikir sağlayabilir. Burada, kardiyak myocyte mitokondrial solunum benzersiz hücre kültür sistemi kullanılarak analiz edilir. İlk olarak, bir protokol hızla yalıtmak ve yüksek canlılık yenidoğan fare cardiomyocytes kültür için optimize edilmiştir. Daha sonra bir 96-iyi biçim hücre dışı akı analyzer bu cardiomyocytes oksijen tüketim hızı değerlendirmek için kullanılır. Bu iletişim kuralı için koşullar tohum en iyi duruma getirilmiş ve o yenidoğan fare cardiomyocytes oksijen tüketim oranını kolayca bir hücre dışı akı Çözümleyicisi'nde tespit edilebilir gösterdi. Son olarak, biz daha büyük bir kültür boyutu bizim iletişim kuralı uygulanabilir ve diğer çalışmalar, contractile ve hücre içi sinyal gibi analiz çalışması unutmayın.

Açıklanan iletişim kuralını kullanarak, kalpleri gün 0 yenidoğan pups izole edildi. 5 x 105 hücreleri/yavru elde ve cardiomyocytes, yoğunlukları 10 x 103, 20 x 103veya 30 x 103 hücreleri/iyi, 96 iyi tabak (Şekil 2A) numaralı seribaşı. Gecede kültür sonra cardiomyocytes bulundu iyi kaplı plastik yüzey için ekli vardı (ekli olmayan hücreleri hala görünür gibi yuvarlak ve parlak, dağılın olan sağlıklı, ekli hücreleri i...

Bu iletişim kuralının amacı fare yenidoğan cardiomyocytes bir modeli sistemi olarak nasıl çeşitli faktörler oksijen tüketimi kalp değiştirebilirsiniz incelemek için nasıl kullanılacağını göstermektir.

Oksijen tüketim oranını bir hücre dışı akı Analyzer kullanarak birincil kültürlü fare yenidoğan Cardiomyocytes içinde analiz

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an ...

Bu protokol bize izole ve kültür yüksek bi-BBT, sadece fare kardiyomiyositler bilinen sağlar. Mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için, kardiyomiyositlerin oksijen tüketim hızı gerçek bir gümüş akısı analizörü tarafından analiz edilebilir. Bu tekniğin avantajlarından biri, kardiyomiyositlerin oksijen tüketiminin 96-iyi formatında yapışık durumda kolayca ölçülebilmeleridir, bu da çok sayıda çoğaltma ile birden fazla koşulun test edilmesini sağlar.Bu damar kardiyoloji araştırma alanı içine önemli bilgiler sağlar. Oksijen tüketimine ek olarak, greygrices ve perasit epoksidasyon gibi diğer metabolik parametreleri de inceleyebiliriz. Kardiyomiyositlerin yüksek değişkenlik elde etmek bu deney için çok önemlidir.Bu kalplerin verimli sindirim gerektirir. Neo-natal kardiyomiyositler çok kırılgan olduğundan, kardiyomiyositlerin nazik kullanımı da önemlidir. Hücre kültürü başlık olarak, 6-iyi hücre kültür plaka her kuyuya HBSS 5ml aliquot ve buz üzerine yerleştirin.Buna ek olarak, 10cm hücre kültürü çanak HBSS aliquot 10ml, daha sonra, 50ml steril konik tüp trypsin Prehazus solüsyonu 20 ml hazırlamak. Tüm çözümleri buzda tutun. Sonra, kalp ayıklayın ve hbss içeren steril hücre kültür çanak hemen aktarın.Herhangi bir kalıntı akciğer dokusu ve büyük damarları çıkarın. Nazik ajitasyon kullanarak KALBI HBSS'de yıkayın. Daha sonra, 8 adet ince makas ile kalp kesmek ve HBSS ile 6-iyi hücre kültür plaka bir kuyu içine forceps ile kalp dokusu aktarın.Moria kaşığı kullanarak, HBSS ile dolu 6 kuyulu tabakta iyiden kuyuya aktararak kalp dokusunu yıkayın. Daha sonra kalp dokusunu 20ml Tripsin içeren konik bir tüpe aktarın ve 4 saat boyunca 4 derece santigrat derecede hafif ajitasyonla inkübün. Bu işlemde, 37 santigrat derece bir su banyosunda kollajenaz sindirim çözeltisi önceden ısıtın.Kalp dokusu ve sindirim öncesi solüsyon içeren konik tüpü 4 dereceden hücre kültürüne aktarın. 10ml serolojik pipet kullanarak kalp dokusu tüp altına lavabo ve presindirimi solüsyon kaldırmak sağlar. Daha sonra, tüp içine HBSS 10ml ekleyin.10ml serolojik pipet kullanarak Trypsin yıkamak için HBSS ile kalp dokusu nu 2-3 kez yeniden askıya alın. Aspire HBSS ve kalp dokusu ile tüp içine önceden ısıtılmış kollajenaz sindirim çözeltisi 10ml ekleyin. İlk sindirim için, ajitasyon olmadan 10 dakika boyunca 37 santigrat derece bir su banyosunda kalp dokusu ile tüp kuluçka.Daha sonra, hücre kültürü başlık için tüp aktarın. 10ml serolojik pipet kullanarak 10 kez hafifçe resuusing tarafından doku triturate. Bu kalp dağıtmak ve hücrelerin kalp dokusundan serbest bırakılması sağlayacaktır.Sindirilmemiş dokunun batmasına izin ver. Kardiyomiyositlerle zenginleştirilmiş sindirilmiş çözeltiyi yeni bir konik tüpe aktarın ve kollajenaz sindirimini durdurmak için hemen eşit miktarda hücre kültürü ortamı ekleyin. Sonra kalan sindirilmemiş kalp dokusu içeren tüp içine kollajenaz sindirim çözeltisi 10ml ekleyin.İkinci sindirim için, 10 dakika boyunca 37 derece santigrat su banyosunda kalp dokusu ile tüp kuluçka. Kollajenaz sindirimdurdurmadan önce ilk sindirim prosedürlerini tekrarlayın ve kardiyomiyositler zenginleştirilmiş sindirilmiş çözeltiyi yeni bir konik tüpe aktarın. Sonra, yeni bir steril 50ml konik tüp steril bir hücre süzgeci yerleştirin.Hücre süzgecinden 2-3 ml'lik bir ortam alabilmek için önceden ıslanın ve hücreleri hücre süzgecinden geçirin. Daha sonra, hücre kültürü ortamı ile hücre süzgeci durular. Daha sonra, 180 kez yerçekimi 5 dakika kardiyomiyosit içeren konik tüp santrifüj.5 dakika sonra, supernatant aspire ve hücre kültürü orta 10ml hücre pelet resuspend. 10cm hücre kültür çanak üzerine plaka hücreleri ve bir saat kuluçka. Daha sonra, yavaşça plaka ajite.Non-yapışık hücreleri yıkayın ve tekrar tekrar 10ml serolojik pipet kullanarak çanak üzerinde hücre kültürü orta pipetting hücreleri yeniden askıya. Daha sonra, yeni bir 10cm hücre kültürü çanak içine non-adherent hücreleri aktarın ve başka bir saat için kuluçka. Bir saat sonra, yavaşça plakaaj ve non-yapışık hücreleri yıkayın.Kardiyomiyositleri yeni bir 50ml konik tüpe aktarın. Ardından, 96 kuyulu hücre kültür plakasının her kuyuda 50 mikrolitre kaplama çözeltisi ekleyerek 96 kuyulu bir kültür plakası hazırlayın. Kabarcıklar varsa, 20 mikrolitrelik pipet kullanarak çıkarın.Matris kaplamanın kurutulması için plakayı en az bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak. Hücreleri hücre dışı matrisin içine, kuyu başına 10 ila 30 bin hücre arasında bir yoğunlukta 96 kuyulu hücre kültür plakasına yerleştirin.Ve hücreleri kuluçkaya yatırın. Oksijen tüketimi analizini azaltmak için, bir akı analizörlü kartuşunu en az 3 saat nemlendirin, yardımcı plakanın her kuyusuna 200 mikrolitre kalibran çözeltisi ekleyin. Sensör kartuşunu yardımcı plakaya geri yerleştirin ve en az 3 saat boyunca CO2 veya O2 takviyesi olmadan 37 santigrat derece kuluçkaya yatırın.Bir saat önce tisbym, yavaşça hücre kültürü orta kaldırmak ve önceden ısıtılmış mitokondriyal stres testi orta iki kez 200 mikrolitre ile hücreleri yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, önceden ısıtılmış mitokondriyal stres testi orta 175 mikrolitre ekleyin. Sonra kültür karbondioksit veya oksijen takviyesi olmadan 37 santigrat derece hücreleri.Mitokondriyal stres testi orta test bileşikleri her 3ml hazırlayın. Çok kanallı bir pipet kullanarak sensör kartuşu enjektör portlarına her bileşiğin 25 mikrolitresini yükleyin. Hücrelerin durumu ve herhangi bir ön tedavi uncoupler FCCP enjeksiyonu ile ortaya maksimum restorasyon etkileyebilir.Uncoupler hücre duyarlılığı da değişebilir, bu nedenle, her tedavi için FCCP çalışma konsantrasyonu optimize etmek önemlidir. Daha sonra, ekstra-hücresel akı test protokolü kurmak ve programı başlatın. İlk olarak, kalibrasyon için makineye sensör kartilik koyun.Kalibrasyon adımı yapıldıktan sonra, kalıtım plakası için kalikan değiştirin. İstenirse, teşbikten sonra, çok kanallı pipet kullanarak tüm teşbib ortamını dikkatlice atın. Ve protein testini kullanarak hücre normalleşmesi için hücre kültürünü negatif 20 santigrat derecede saklayın.Açıklanan protokol kullanılarak kalpler 0. Gece kültüründen sonra, kardiyomiyositler iyi kaplı plastik yüzeye bağlı bulundu ve çok az bekar hücreler vardı. Bu noktada, kendiliğinden kasıldıktan sonra kardiyomiyositler kolayca görülebiliyordu.Her kuyu başına 30.000 hücrelik bir tohumlama yoğunluğu, hücreler yayıldıkça tohumlamadan bir gün sonra birleştiğiyer gösterdi. Kardiyomiyositler sarkoerik alfa aktin, bir kardiyomiyosit spesifik belirteç karşı bir antikor ile immünosiyon edildi. Burada gösterildiği gibi, hücrelerin çoğu kardiyomiyosit izolasyonu yüksek saflıkgösteren alfa aktin pozitif boyama gösterdi.Tipik bir mitokondriyal stres testi bir şema burada gösterilmiştir. Mitokondriyal stres testi oksijen tüketim oranının bir temel ölçü ile başlar, Bu ATPA inhibe Oligo miyozin enjeksiyonu takip eder. Daha sonra, ayırma maddesi FCCP maksimum oksijen tüketim oranını ölçmek için enjekte edildi.Son olarak, iki elektron taşıma kompleksi inhibitörlerinin enjeksiyonu ile mitokondriyal solunum tamamen durur ve OCR en düşük seviyesine düşer. Tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için. Yüksek hayatta kalma elde etmek çok önemlidir.Bu nedenle kardiyomiyositlerde yenidoğan yenidoğan ve hafifçe işlenmiş kalp dokularının kullanılması önemlidir. Yeni veya mevcut genetik olarak manipüle fare hatları kullanılarak, bu yöntem kolayca kalpbiyoenerjetik düzenleme için yeni mekanizmaları anlamak için yol açabilir verilere çevrilebilir. Mitokondriyal kalp fonksiyonunda kilit rol oynar.Bu yöntemin, metabolizmayı düzenleyen yeni düzenleyicilerin ve yolların belirlenmesine ve kalp yetmezliğinin tedavisinde yeni tedavi hedeflerinin bulunmasına yardımcı olmasını bekliyoruz.

analyzing-oxygen-consumption-rate-primary-cultured-mouse-neonatal

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kaynak:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Oroboros EnstrümanlarıBu video, canlı ve geçirgen memeli hücrelerinde mitokondriyal solunumu değerlendirmek için oksijen akışının nasıl kullanıldığını açıklamaktadır. Farklı solunum durumlarını karakterize etmek için digitonin, metabolik substratlar, ADP, bir ayırıcı ve bir inhibitörün sıralı kullanımını gösterir. Ortaya çıkan oksijen akışı profili, tanımlanmış koşullar altında mitokondriyal fonksiyonu ve enerji...

Canlı ve geçirgen hücrelerde mitokondriyal solunumu değerlendirmek için oksijen akısı ölçümleri

Glikoliz, çoklu biyolojik sistemlerde tanımlayıcı bir metabolik belirteçtir. H + hücre dışı akışını ölçerek glikolizin izlenmesi yaygındır, ancak kantitatif ve açık olması için düzeltme gerektirir. Burada, hücre dışı asitlenmenin solunum ve glikolitik kaynaklarını ayırt etmek için hücre dışı akı verilerinin nasıl toplanacağını ve düzeltileceğini gösteriyoruz.

Ekstraselüler Asit Üretim Ölçüm ve Analiz Glikolitik Hızı belirleme

Bu teknik oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme oranları explanted fare Retina dokularında bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak gerçek zamanlı kayıt açıklar.

Explanted Retina doku hücre dışı akı analizi ile enerji metabolizmasında ölçümü

Burada sunulan yöntem, HSPC'lerin hücre dışı asitlenme hızını (ECAR) ve oksijen tüketim hızını (OCR) gerçek zamanlı olarak ölçmek için hücre dışı akı analizörünü kullanarak yapışkan olmayan fare hematopoetik kök ve ilkel progenitör hücrelerinde (HSPC'ler) hücresel biyoenerjetik değerlendirme için optimize edilmiş protokolleri özetlemektedir.

Hücre Dışı Akı Analizörü Kullanılarak Fare Hematopoetik Kök ve İlkel Progenitör Hücrelerinde Hücresel Biyoenerjetik Verilerin Değerlendirilmesi

Gerçek zamanlı hücre metabolik akısı testi, pH ve oksijen sensörlerini kullanarak mitokondriyal ve glikolitik adenozin trifosfat üretimine karşılık gelen oksijen tüketim oranını ve hücre dışı asitleşme oranını ölçer. Bu yazıda osteoblastların enerji durumunu ve hücresel biyoenerjetik durumun karakterizasyonu ve yorumlanmasını anlamak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Osteoblast Biyoenerjetik Teknolojilerini İzlemek için Gerçek Zamanlı Hücre Metabolik Akı Analizörünü Kullanma

Oksijen tüketim hızı (OCR), mitokondriyal fonksiyon için yaygın bir vekildir ve farklı hastalık modellerini incelemek için kullanılabilir. Yetişkin farelerden akut striatal dilimlerdeki OCR'yi doğrudan ölçmek için bir Seahorse XF analizörü kullanarak yeni bir yöntem geliştirdik ve bu da fizyolojik olarak diğer yöntemlerden daha alakalı.

Yetişkin Farelerden Akut Striatal Dilimlerde Oksijen Tüketim Hızının Ölçülmesi

İnsan retinal pigment epitel hücrelerinin (H-RPE) metabolik durumu, sağlıklarını ve işlevlerini yansıtır. Burada, yüksek çözünürlüklü respirometri kullanarak H-RPE'nin gerçek zamanlı metabolik akısını incelemek için optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır.

Primer İnsan Retinal Pigment Epitel Hücrelerinde Yüksek Çözünürlüklü Respirometri Kullanılarak Biyoenerjetik Biyoenerjetik Analizinin Gerçek Zamanlı Analizi

Metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanarak fare ve insan nötrofillerinin ve HL60 hücrelerinin mitokondriyal solunumunu ölçen kademeli protokolleri açıklıyoruz.

Nötrofillerin mitokondriyal biyoenerjetik profilinin gerçek zamanlı ölçümü

Burada, kemik iliği, dalak ve enfarktüslü kalpten makrofajların çıkarılması ve ardından canlı hücrelerdeki metabolik akışın değerlendirilmesi için yöntemleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Dalak ve Kardiyak Makrofajlarda ve Kemik İliği Monositlerinde Ex Vivo Metabolik Akının Analizi

Plazma zarını seçici olarak geçirimli hale getiren bir protokol sunuyoruz; böylece kültürlenmiş hücrelerde mitokondriyal oksidatif fosforilasyonu (OXPHOS) değerlendirmek için substratlar ve inhibitörlerin hedefli şekilde teslim edilmesini sağlıyoruz ve genellikle bu tür analizleri engelleyen plazma zarı taşıma engellerini aşıyoruz. Bu teknikle, OXPHOS fonksiyonunun muskarinik agonistler ve antagonistler tarafından nasıl modüle edildiğini gösterdik.

Digitonin-permeabilize BE(2)-C nöroblastom hücrelerinde oksidatif fosforilasyon bağlanmasının kolinergik ligand-bağımlı modülasyonu

Bu makalede, ex vivo yetişkin zebrafish ventriküllerinin oksijen tüketim oranı ve hücre dışı asitlenme oranını niceltmek için ayrıntılı bir protokol tanımlıyoruz; böylece oksidatif ve glikolitik metabolik kapasitelerini karakterize ediyoruz.

Tüm yenilenen zebrafish ventriküllerinin metabolik aktivitesinin ex vivo olarak değerlendirilmesi ve ekstraselüler akı testi kullanılarak

Öğrenin, hücre dışı akı analizörü kullanarak yeni doğan fare kardiyomiyositlerinde oksijen tüketim oranını nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem, mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için güvenilir bir çerçeve sunar.

Oksijen tüketim oranını bir hücre dışı akı Analyzer kullanarak birincil kültürlü fare yenidoğan Cardiomyocytes içinde analiz

Daha fazla video keşfet