Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

Bu yöntem, bakterigen ekspresyonunun uzamsal desenlerini ve dokularda ortalama olarak tüm popülasyonda kaybolan doku mikro ortamlarına fizyolojik adaptasyon stratejilerini ortaya çıkarabilir. Bu teknik ile antivirülans veya antibakteriyel bileşikler tarafından hedef alınacak yeni bakteriyel yollar ve proteinler belirlenirken göz önünde bulundurulması gereken potansiyel heterojeniteler tespit edilebilir. Dondurulmuş bir gliserol stokundan kan agar plakaları üzerinde ilgi S.aureus suşları çizgili ve kırmızı kan hücreleri lyse ve net şeffaf bölgeler oluşturmak için yeteneklerini dayalı hemolitik fenotipleri onaylamak için 16 ila 24 saat boyunca 37 santigrat derece plakaları kuluçka ile başlayın.

Tek bir koloni, her bir suştan dört mililitre triptik soya suyu veya TSB'yi steril cam tüplerde izole edin ve tüpleri 37 derecede 16 ila 24 saat boyunca yaklaşık 70 derecelik bir açıve dakikada 70 dönüşle bir tüp silindirinde döndürün. Ertesi sabah bir spektrofotometre üzerinde kültürlerin 600 nanometre, ya da OD 600 optik yoğunluğu ölçmek ve 125 mililitre Delong şişelerde hacim oranına beş ila bir şişe de steril TSB 25 mililitre 0,05 bir OD 600 hücreleri seyreltmek. Dakikada 280 rotasyonlar 37 derece santigrat su banyosu kültürleri kuluçka ve üstel faz sırasında hücreleri hasat.

Santrifüj ile hücreleri pelet ve steril PBS eşit hacimde iki kez hücreleri yıkayın. Daha sonra taze PBS'deki hücreleri bir kere 10'dan sekizinci koloninin mililitre konsantrasyonu başına bir sonraki enjeksiyonu için alıcı bir hayvana yeniden attırın. Uygun deneysel bitiş noktasında, böbrek, kalp, karaciğer, akciğerler ve dalak hasat 15 mililitre polipropilen tüpler içeren 10% tamponlu formalin için 24-48 saat karanlıkta oda sıcaklığında nazik sallayarak veya rotasyon ile kuluçka.

Fiksasyon sonunda, eksi 80 santigrat derece depolama için açık doku dondurma ortamı na organları gömmek. 10 mikrometre kalınlığında doku bölümleri elde etmek ve DAPI ile takviye sert montaj ortamı uygulamadan önce karanlıkta 20 dakika boyunca ayrı önceden temizlenmiş şarjlı cam slaytlar üzerinde bölümleri kuru bir kriyostat kullanın. Daha sonra kapak fişleri uygulayın ve numuneleri dört santigrat derecede uzun süreli depolamaya aktarmadan önce slaytları bir gecede oda sıcaklığında iyileştirin.

Örneklerin içindeki lezyonları belirlemek için, lazer tarama konfokal mikroskobu n evresine bir slayt yerleştirin ve lezyonların görüntülerini elde etmek için tek tek hücreleri görselleştirmek için uygun bir amaç kullanın. Konfokal görüntülerdeki floresan yoğunlukları ölçmek için ImageJ'de bir görüntü açın ve lezyonun floresan sinyalini düzgün bir şekilde görselleştirmek için parlaklığı ve kontrastı ayarlayın. Çokgen seçim aracını kullanarak ilgi çekici bölge tanımlayın ve ImageJ'deki Düzenleme sekmesi altındaki YG yöneticisine YG'yi ekleyin.

Edit'i, ardından Seç'i ve son olarak Yöneticiye Ekle'yi seçin. Ardından, YG'yi yeniden adlandırın ve ilgili görüntüyü etiketleyin. Merkezim belirlemek için Analiz sekmesini açın ve Alan, Ortalama Gri Değeri, Centroid ve Eşik sınırı'nı seçin.

Centroid floresan yoğunluk değerini ayıklayın veya birim alan başına belirli bir lezyondaki ortalama floresan yoğunluğunu ölçün. Bu, alt ve üst floresan limitlerini gerektiği gibi ayarlamak için eşik işlevi kullanılarak elde edilebilir. Verileri bir Excel dosyasına dışa aktarın ve çevre ve çekirdek için birim alan başına ortalama floresan yoğunluğunu gösteren bir sütun hazırlayın.

Çevre ve çekirdekteki birim alan başına ortalama floresan yoğunluklarını hesaplamak için, eşik alt ve üst sınırlarını el ile tanımlayın. Staphylococcus aureus thermonuclease GFP füzyon floresan, füzyon genini taşıyan hücrelerde muhabir füzyonu taşımayan hücrelere göre ortalama olarak yaklaşık dokuz kat daha yüksektir. Benzer şekilde, tandem dimeric Domates füzyon floresan yaklaşık altı kat daha yüksek null muhabir kontrolü daha.

Muhabir faaliyetlerinin paterni doku homojenatları ile akış sitometrisi ile doğrulanabilir. Floresan kıvrım farklılıkları genellikle daha düşük olmasına rağmen. Floresan ölçümlerinde varyasyonlar muhabirlerin heterojen ifade nedeniyle olabilir.

Örneğin, bu temsili örneklerde bazı lezyonların aynı doku örneğinde yaklaşık 100 mikrometre mesafede ki muhabirlerden birini veya her ikisini ifade ettiği gözlenmiştir. Stafilokok alçaltMa topluluklarında tek bir hücre çözünürlüğü için muhabir aktivitesi incelenmesi güçlü DAPI boyama ile sınırlanmış apselerde staphylococcus aureus thermonuclease ekspresyonunun mekansal bir düzenleme ortaya koymaktadır, muhtemelen nötrofil ekstrasellüler tuzakların oluşumu ve salınımı ile ilişkili. Örneğin, stafilokok aurenükleaz GFP füzyon floresans stafilokok abcess topluluğunun iç çekirdeğinde, çevreye lokalize göre anlamlı olarak daha yüksek staphylococcus aureus thermonuclease gözlenmektedir.

Aynı abcess, tandem dimeric Domates füzyon floresan için desen ters gibi görünüyor. Ancak, bu deneydeki desen istatistiksel olarak anlamlı değildi. Bozulmamış kriyo gömülü diseksiyonlar elde floresan görüntü analizi için hayati önem taşımaktadır ve dikkatle yapılmalıdır.

RNA-Seq analizi ile birleştiğinde, füzyonu farklı boyutlara kadar ifade eden alt popülasyonları yakalamak için bakteri hücrelerinin sıralanması transkripsiyondaki genom geniş değişikliklerini aydınlatabilir. Bir karsin ve doğrudan maruz kalma üzerine cilt tahrişine neden olabilir gibi formalin ile çalışırken dikkat edin. Floresan muhabirleri taşıyan suşların mutant türevleri üretmek, gözlemlenen mekansal düzenleyici desenlerin genetik temelini ortaya çıkartabilir.