Name: Yüksek işlem hacmi Siderophore filtreleme dışında çevre örnekleri: bitki doku, toplu topraklar ve rizosferde topraklar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Keşfedin yüksek verimli siderofor tarama yöntemini bitki dokusu, toplu toprak ve rizosfer örnekleri için. Bu teknik, mikrobiyal topluluk içinde demir biyoyararlanımını hızla değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Kalyani Muhunthan Laboratuvar yordamları, Lee Opdahl genotip buğday hasat için Washington State Concord üzüm Araştırma Konseyi ve Washington State Üniversitesi Merkezi tarım sürdürülmesi için yardım için teşekkür etmek istiyorum ve Doğal kaynakların bir BIOAg için bu çalışmalarına destek vermek. Ek finansman USDA/NIFA kapağı projesi 1014527 yoluyla tarafından sağlandı.

Not: Yer alan sitenin: Washington State Üniversitesi, bitki patoloji çiftlik (46 ° 46'38.0 "N 117 ° 04'57.4" W). Tohumlar mekanik bir çiftlik 19 Ekim 2017 üzerinde kullanarak ekili. Her buğday genotip kök sistemi örtüşen önlemek için headrows içinde yaklaşık 1 metre arayla yerleştirilmişti. Bitki ve toprak örnekleri 9 Ağustos 2018, ne zaman bitkiler hasat için hazırdılar üzerinde toplanmıştır. Örnekleri üç dört buğday genotip çoğaltır toplanan: PI561727, PI561725, Madsen, Lewjain.
1. değiştirilmiş M9 orta hazırlanması
<ol><li>Kullanım Na2PO4∙7H2O (12,8 g/200 mL), KH2PO4 (0.3 g/200 mL), M9 tuz solüsyonu hazırlamak için NaCl (0.5 g/200 mL) ve NH4Cl (1 g/20 mL) reaktifler.</li>
	<li>MgSO4∙7H2O 18 g 0,75 M MgSO4∙7H2O. hazırlamak için 100 mL Çift Kişilik deiyonize su (GKD2O) kullanın</li>
	<li>1 M CaCl2∙2H2O CaCl2∙2H2O 14.7 g GKD2O. 100 mL ile ekleyerek yapmak</li>
	<li>Arabellek çözüm borular 6,048 g GKD2O karıştırma ile 156 mL içine çözülerek hazırlayın. PH 6.8 ile 5 M NaOH için ayarlayın.</li>
	<li>GKD2O. 100 mL 20 g glikoz çözülerek % 20 glikoz (dekstroz monohidrat) hazırlamak</li>
	<li>Çözümler ve ayrı ayrı basınçlı kap tüm ama glikoz hazırlayın. Filtre sterilize M9 ortama eklenmesinden sonra ısıyla (0,22 µm) için glikoz çözüm.</li>
	<li>Değiştirilmiş M9 orta borular arabellek çözüm, 40 mL M9 tuz çözeltisi, 20 μL CaCl2·2H2O çözüm 156 mL, MgSO4·7H2O 266 μL ve 4 mL % 20 glikoz çözümleri birlikte Biyogüvenlik karıştırarak hazırlayın dolap, kullanma steril tekniği.</li>
	<li>Değiştirilmiş M9 korunması için konteyner mühür, UV koruyun ve 4 ° C'de yerleştirmek için alüminyum folyo ile kapatın</li>
</ol>2. ca-Fe-Agar orta hazırlanması
<ol><li>Asit yıkama 100 mM HCl/100 mm HNO3 en az 2 h CAS tahlil dosyasında önce tüm cam.</li>
	<li>Laboratuvar notu kumla dolu bir alüminyum pişirme pan hazırlamak ve alüminyum folyo ile kapatın. Otoklav 30 dk ve kenara için 121 ° C'de.</li>
	<li>20 mL GKD2için O 0.0365 g ekleyerek HDTMA (hexadecyltrimethylammonium bromür) hazırlamak ve 37 ° C solubilization tanıtmak için çözüm yerleştirin.</li>
	<li>10 mM HCl hazırlamak ve 1 mM FeCl3·6H2O 10 mM HCl solvent kullanarak oluşturmak. CA'ların 0.0302 g GKD2O için 25 mL olan steril manyetik heyecan çubuk hafifçe karıştırarak ekleyin. Sonra yavaşça (koyu kırmızımsı siyah renk çözüm dönüşür) karıştırmaya devam ederken 1 mm FeCl3·6H2O (10 mM HCl) CA çözüm 25 ml 5 mL ekleyin.</li>
	<li>Yavaş yavaş HDTMA çözüm 20 mL yavaşça, (Bu bir koyu mavi çözüm verir) Fe-CAS çözüm içine karıştırarak ekleyin.</li>
	<li>Arabellek çözüm borular 15.12 g GKD2O, nazik karıştırma ile 375 mL içine çözülerek hazırlayın. PH 6.8 ile 5 M NaOH için ayarlayın. Birim için 450 mL getirmek için su ekleyin. Özel 5 g ekleyin. Otoklav boruları arabellek çözüm ve CAS-Fe çözüm, 121 ° c 30 dk için.</li>
	<li>Dikkatle her biri autoclaved sonra CAS-Fe çözüm tamamını Biyogüvenlik kabini borular arabellekte tamamını ekleyin.</li>
	<li>Yer karışık bir su banyosu 50 ° C'de çözümde Not: Her tahlil önce CAS-Fe-Agar ortamında tüm reaktifler 50 ° C sonuçlara yağış katılaşmış orta CAS-Fe karmaşık ve soğutma sonuçlar uzun süreli depolama olarak taze hazırlayın.</li>
	<li>Biyogüvenlik kabini steril kum ve ısı ile 50 ° c steril reaktif tekne yeri CAS-Fe-Agar tekne, daha sonra açık, düz dipli, steril 96-şey Mikroplaka her kuyuya için hızlı bir şekilde aliquot 100 µL aktarın.</li>
</ol>3. Pyoverdine/EDTA standart hazırlama
<ol><li>Pyoverdine hazırlık<ol>
<li>800 mikron pyoverdine standart hazırlamak (süksinik asit, 2-Hidroksi glutaramide ve pyoverdine-succinaminde formları karışımı Malzemeler tablobakınız), önceden hazırlanmış değiştirilmiş M9 orta.</li>
		<li>Bu çözümde 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 ve 6.25 mikron çözümleri oranında seyreltin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>EDTA standart hazırlama<ol>
<li>0.594 g disodyum ethylenediaminetetraacetic asit ekleyin (EDTA: C10H14N2Na2O8.2H2O), 3200 mikron EDTA standart hazırlamak için önceden hazırlanmış değiştirilmiş M9 orta 500 ml.</li>
		<li>Bu çözüm 1600, seyreltik 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 ve 6.25 mikron çözümleri.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Standart eğri üretimi<ol>
<li>Her konsantrasyon pyoverdine ve CAS-Fe Agar orta 100 μL içeren bir 96-şey Mikroplaka kuyu ayırmak için EDTA 100 μL ekleyin. Her konsantrasyon yinelenen teknik çoğaltmalar olun. Ayrıca, boş wells sadece M9 ile eklemek (EDTA veya pyoverdine).</li>
		<li>Mikroplaka Okuyucu kullanarak, absorbans ölçmek (420, nm ve 665 nm) 22 ° C ve kullanım absorbans ölçümleri standart eğriler oluşturmak için 1, 6 ve 24 h kuluçka sonra. Not: 420 nm ölçülerini absorbans absorbans pyoverdine veya EDTA içeren wells gelen boşlukları çıkarma. İçin 665 nm, pyoverdine veya boşlukları absorbans kuyulardan içeren EDTA absorbans çıkarma. Sonra günlük10(µM pyoverdine veya EDTA) karşı absorbans ölçümleri geriledi. Örnek sonuçlarını yorumlama kolaylığı, absorbans x ekseni kullanın ve10(µM pyoverdine veya EDTA) y ekseni oturum.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. çevre örnekleri toplanması: toprak ve bitki dokularında
<ol><li>Örnekleme donanımları (kürek ve makas) 0.22 µm filtre GKD%270 etanol tarafından takip O ile yıkama ve çapraz bulaşma örnekleme öncesi ve steril tekniği korumak ve azaltmak için örnekleri arasında kağıt havlu ile silin.</li>
	<li>Dan tesisleri alanında bitki doku (tahıl ve sürgünler) tüketim ve yer onları içinde istenen toprak ve kök örnekleri köklerinden sökülürken kolaylaştırmak için yeterli ateş anız bırakarak bir etiketli plastik saklama çantası.</li>
	<li>Bir küçük kök topu yaklaşık 15 cm derin ve 23 cm genişliğinde kazı ve numune hazırlama laboratuvar ortamında için ayrı, etiketli plastik torbaya koyun. McPherson ve ark.27yöntemleri için benzer bir adımdır.</li>
	<li>Tüm örnekleri (tahıl, sürgünler, toplu toprak ve kök topları ayrı torbalarda) doğrudan buza koyun ve örnekleri siderophore üretim tahlil için işleninceye kadar 4 ° C'de tutmak.</li>
	<li>İlişkili kök toprak örnekleri toplu, gevşek bağlı rizosferde toprak ve sıkı bir şekilde bağlı rizosferde toprak ayırmak.<ol>
<li>Kök topları çanta dışında al. Kök topu topraktan kapalı yavaşça salla. Toprak off sarsıldı toprak ile birlikte sol çantada "toplu" toprak oluşur.</li>
		<li>Bir lastik tokmak daha fazla toprak kök topun kaldırmak için kullanın. Bu gevşek bağlı rizosferde topraktır.</li>
		<li>Sıkı bir şekilde bağlı rizosferde toprak kökleri ile sıkı bir şekilde bağlı örnek alarak ve onları bir santrifüj tüpü koyarak oluşturmak. GKD2O ve girdap 30 mL ekleyin Bu 2-3 dakika. Kökleri sıkıca bağlı rizosferde toprak Bulamaç seyreltme almak için kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. siderophore zenginleştirme kültürler ve CAS-Fe siderophore üretim tahlil hazırlanması
Not: Tüm cam asit deneyleri başlamadan önce yıkanmış olması gerekir.
<ol><li>Toprak numune hazırlama (için her üç toprak örnek türü)<ol>
<li>Toprak örnekleri örnek torba içinde karıştırma ve toprak çanta açmadan mümkün olduğu kadar çevirerek lunaparkçı. Not: Bu doğal toprak kayma değişkenliği azaltmak yardımcı olur ve normal toprak örnekleme prosedürleri ile hizalar. Diğer yöntemleri çevre örnekleri, uygun ve bağlı olarak deneysel tasarım homojenize için yararlı.</li>
		<li>Her örnek oldu iyice karışık, aliquot ve her toprak 2.0 g 20 mL değiştirilmiş M9 orta askıya sonra 10-3 20 mL steril 50 mL santrifüj tüpü havalandırma izin vermek için bir steril köpük fiş ile toplam hacmiyle oranında seyreltin.</li>
		<li>Sıkı bir şekilde bağlı rizosferde örnekleri, rizosferde toprak Bulamaç 2 mL değiştirilmiş M9 orta 20 mL ekleyin, sonra 20 mL steril 50 mL santrifüj tüpü havalandırma izin vermek için bir steril köpük fiş ile toplam hacmiyle 10-3 oranında seyreltin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Doku örneği (kök, ateş ve tahıl) hazırlık<ol>
<li>Yüzey örnek % 70 etanol ile sterilize. Bir blender yüksek üzerinde 30 saniye kullanarak değiştirilmiş M9 orta 20 ml taze doku 2.0 g macerate. Örnek bir steril 50 mL santrifüj tüpü, daha sonra 20 mL steril 50 mL santrifüj tüpü havalandırma izin vermek için bir steril köpük fiş ile toplam hacmiyle 10-3 oranında seyreltin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Siderophore üretim Fe sınırlama ile zenginleştirme<ol>
<li>50 mL santrifüj tüpleri, oda sıcaklığında kuluçkaya ve 160 rpm'de sallamak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. CAS-Fe agar deneyleri siderophore üretim çevre örneklerinde algılanması için
<ol><li>24, 48 ve zenginleştirme kültür başlatılması sonra 72 h 1 mL subsamples steril tekniği ve santrifüj de 10.000 x g 1 min 2 mL santrifüj tüpleri için hücreleri pelletize kullanmayı zenginleştirme tüpler kaldırın.</li>
	<li>Ayrılmış süpernatant toplamak. Steril tekniği kullanarak, CA-Fe-Agar 100 μL çözüm yinelenen veya Mikroplaka nüsha süpernatant ile 100 μL ekleyin. Ayrıca steril M9 orta 100 µL (boşluk olarak) ekleyin. 28 ° C'de plaka kuluçkaya</li>
	<li>Kalan süpernatant ve Pelet (microtiter plakasına eklenmez) her örnek için kendi, steril 2 mL santrifüj tüpüne askıya alma. Steril gliserol 400 μL örnek süpernatant her tüpün içine ekleyin ve gliserol hisse oluşturmak için Pelet resuspend. Stok daha sonraki analizler için-80 ° C'de dondurmak. Not: Bu adım gliserol stokları göre herhangi bir tercih edilen şirket içi iletişim kuralı oluşturmak için değiştirilebilir.</li>
	<li>6, 24, 48 ve 420 nm dalga boyu, 72 h absorbans ölçmek.</li>
	<li>Standart eğrileri pyoverdine veya EDTA oluşturulan örnek absorbans ölçümleri açısından pyoverdine eşdeğerleri yorumlamak için kullanın. Not: EDTA ile karşılaştırıldığında üstün standart Pyoverdine tespit edilmiştir (infra vide), EDTA çalışmada sonuçlar yorumlamak için kullanılan değildi bu yüzden.</li>
</ol>

<ol><li>Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siderophore+cheating+and+cheating+resistance+shape+competition+for+iron+in+soil+and+freshwater+Pseudomonas+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li>
<li>Ghirardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Traits+Shared+by+Rhizosphere-Competent+Strains+of+Fluorescent+Pseudomonads%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads.</a> Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).</li>
<li>Hider, R. C., Kong, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+biology+of+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemistry and biology of siderophores.</a> Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).</li>
<li>Saha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+siderophores+and+their+potential+applications%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Pollution+Research%22%5BJournal%5D)">Microbial siderophores and their potential applications: a review.</a> Environmental Science and Pollution Research. 23 (5), 3984-3999 (2016).</li>
<li>Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+growth-promoting+rhizobacteria+%28PGPR%29%3A+emergence+in+agriculture%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Microbiology%2C+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture.</a> World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28 (4), 1327-1350 (2012).</li>
<li>Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetics%2C+Siderophore+Production%2C+and+Iron+Scavenging+Potential+of+Root+Zone+Soil+Bacteria+Isolated+from+%27Concord%27+Grape+Vineyards%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from 'Concord' Grape Vineyards.</a> Microbial Ecology. , Accepted (2018).</li>
<li>Li, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+opportunistic+human+fungal+pathogen+Candida+albicans+promotes+the+growth+and+proliferation+of+commensal+Escherichia+coli+through+an+iron-responsive+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Research%22%5BJournal%5D)">The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway.</a> Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).</li>
<li>Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity%2C+Abundance%2C+and+Localization+of+Quorum+Sensing+Receptors+in+Vibrio+harveyi%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi.</a> Frontiers in Microbiology. 8, (2017).</li>
<li>O'Brien, S., Fothergill, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+multispecies+social+interactions+in+shaping+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenicity+in+the+cystic+fibrosis+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Fems+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung.</a> Fems Microbiology Letters. 364 (15), (2017).</li>
<li>Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cheating+on+Cheaters+Stabilizes+Cooperation+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa.</a> Current Biology. 28 (13), (2018).</li>
<li>Popat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+modification+via+a+quorum+sensing+molecule+influences+the+social+landscape+of+siderophore+production%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B-Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production.</a> Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284 (1852), (2017).</li>
<li>Schwyn, B., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+chemical+assay+for+the+detection+and+determination+of+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores.</a> Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).</li>
<li>Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siderophore+production+of+African+dust+microorganisms+over+Trinidad+and+Tobago%5BTitle%5D)+AND+%22Aerobiologia%22%5BJournal%5D)">Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago.</a> Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).</li>
<li>Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+the+siderophore+aerobactin+by+a+halophilic+Pseudomonad%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad.</a> Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).</li>
<li>Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((O-CAS%2C+a+fast+and+universal+method+for+siderophore+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection.</a> Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).</li>
<li>Nakouti, I., Hobbs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+studying+ion+uptake+by+actinomycetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Basic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A new approach to studying ion uptake by actinomycetes.</a> Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).</li>
<li>Wang, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diisonitrile+Natural+Product+SF2768+Functions+As+a+Chalkophore+That+Mediates+Copper+Acquisition+in+Streptomyces+thioluteus%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus.</a> Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).</li>
<li>Retamal-Morales, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+arsenic-binding+siderophores+in+arsenic-tolerating+Actinobacteria+by+a+modified+CAS+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).</li>
<li>Desai, A., Archana, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDesai%2C+A+%22Role+of+Siderophores+in+Crop+Improvement%22">Role of Siderophores in Crop Improvement</a>. , (2011).</li>
<li>Dertz, E. A., Raymond, K. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDertz%2C+EA+%22Comprehensive+coordination+chemistry+II%22">Comprehensive coordination chemistry II</a>. Que, L., Tolman, W. B. 8, Elsevier, Ltd. (2003).</li>
<li>Arora, N. K., Verma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+microplate+method+for+rapid+and+efficient+estimation+of+siderophore+produced+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%223+Biotech%22%5BJournal%5D)">Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria.</a> 3 Biotech. 7, 9(2017).</li>
<li>Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+plant+and+rhizospheric+microbiota+as+stable+interactomes%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes.</a> Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).</li>
<li>Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+transcriptome+analysis+of+Arabidopsis+thaliana+exposed+to+beneficial+Bacillus+subtilis+FB17+rhizobacteria+revealed+genes+for+bacterial+recruitment+and+plant+defense+independent+of+malate+efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux.</a> Planta. 238 (4), 657-668 (2013).</li>
<li>Sasaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wheat+gene+encoding+an+aluminum-activated+malate+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter.</a> The Plant Journal. 37 (5), 645-653 (2004).</li>
<li>Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+Structure%2C+Species+Variation%2C+and+Potential+Functions+of+Rhizosphere-Associated+Bacteria+of+Different+Winter+Wheat+%28Triticum+aestivum%29+Cultivars%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).</li>
<li>Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+analysis+of+sticky+chromosomes+in+aluminum+tolerant+and+susceptible+wheat+lines+grown+in+soils+of+differing+aluminum+saturation%5BTitle%5D)+AND+%22Euphytica%22%5BJournal%5D)">Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation.</a> Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).</li>
<li>McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Analysis+of+Microbial+Communities+in+Soil%2C+Rhizosphere%2C+and+Roots+in+Perennial+Grass+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), 57932(2018).</li>
<li>Mirleau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+in+soil+and+rhizosphere+of+Pseudomonas+fluorescens+C7R12+compared+with+a+C7R12+mutant+affected+in+pyoverdine+synthesis+and+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake.</a> FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).</li>
<li>Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine+siderophores%3A+from+biogenesis+to+biosignificance%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance.</a> Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).</li>
<li>Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Blue+Agar+CAS+Assay+for+Siderophore+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection.</a> Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Bu eser birincil sonucu kantitatif siderophore üretim/etkinlik çevre örnek ölçme sırasında mikroplar üreten siderophore için hızla zenginleştirmek için kullanılabilir yeni bir metodoloji yapımıdır. Metodoloji hızlı, basit ve düşük maliyetlidir ve ne kadar karmaşık ve yeni örnek türleri aktivitesinden siderophore algılamak için kullanılabilir sonuçlar gösterir (e.g., toprak ve bitki dokusu). Protokol aynı zamanda sonuçlar gliserol stokları zenginleştirme kültürlerin üretiminde hangi kolayca zaman içinde mikrobiya...

Siderophores önemli biomolecules öncelikle demir şelasyon bioavailability, ancak ek amaçlı olarak karasal ve sucul ekosistemler, mikrobiyal bitki-ana bilgisayarlara sinyal algılama mikrobiyal çekirdek arasında değişen geniş bir dizi daha yer vardır, bitki büyüme promosyon, işbirliği ve rekabet içinde karmaşık mikrobiyal topluluklar1,2. Siderophores genel olarak sınıflandırılabilir etkin sitelere ve yapısal özellikleri, göre dört temel türleri oluşturma: karboksilat, hydroxamate, catecholate ve karışık tip3,4. Birçok mikroorganizmalar siderophores1daha da geniş bir çeşitlilik alımını sağlamak için membran reseptörleri birden fazla türü siderophore5 ve karmaşık topluluklar, organizmalar biosynthesize büyük bir çoğunluğu excreting yeteneğine sahip, 6. Son çalışma topluluk düzeyinde ve hatta arası Krallık iletişim ve biyojeokimyasal transferler7,8,9,10 siderophores özellikle önemli olduğunu gösterir ,11.
Krom azurol Sülfonat (CAS) şelat bir ajan olarak 30 yıldan fazla demir (Fe) bağlamak için böyle bir şekilde ligandlar (yani siderophores) eklenmesi CAS-Fe kompleks bir kolayca tanımlanabilen renk değişikliği ortamda oluşturma ayrışma sonuçlanabilir kullanılmıştır 12. ne zaman CAS Fe ile ilişkili, boya koyu mavi bir renk görüntülenir ve CAS-Fe karmaşık ayrışıp, orta renk Fe13kayıt atmak için kullanılan ligand türüne göre değişir. Schwyn ve Neilands tarafından 1987 yılında kurulan ilk, sıvı tabanlı orta mikrobiyal hedefleri14, büyüme alışkanlıkları ve sınırlamalarını15yanı sıra metaller Fe, yanı sıra çeşitli değiştirme karşılamak için birçok şekilde modifiye edilmiştir dahil olmak üzere Alüminyum, manganez, kobalt, nikel kadmiyum, Lityum, çinko16, bakır17ve hatta arsenik18.
Birçok insan patojenleri de bitki büyüme teşvik mikroorganizmalar (PGPM) olarak tespit edilmiştir siderophore üreten organizmalar3,19,20ve önemli rizosferde ve sık sık test endophytic PGPM siderophore-üretim4için olumlu. Geleneksel Fe tabanlı sıvı yöntemi microtiter siderophore üretim21ekimi yalıtır test edilmesi için adapte edilmiştir. Ancak, bu teknikler mikrobiyal toplum önemini bir bütün (microbiome) olarak, işbirliği ve potansiyel, düzenleme, toprak ve bitki sistemleri22siderophore üretim tanımak için başarısız. Bu nedenle, biz bir yüksek-den geçerek toplum düzeyinde değerlendirmesine dayalı geleneksel CAS tahlil, ama çoğaltma, ölçüm, güvenilirlik ve tekrarlanabilirlik bir Mikroplaka kolaylığı ile belirli bir ortamda üretiminden siderophore geliştirdik tahlil.
Bu çalışmada, siderophore üretim algılamak için bir düşük maliyetli, yüksek üretilen iş CAS-Fe tahlil karmaşık örnekleri (yani, toprak ve bitki dokusu homogenates) üretiminden siderophore zenginleştirme değerlendirmek için sunulmuştur. Tahıl, ateş ve dört ayrı buğday (Triticum soğanı L.) genotip dokulardan kök ile birlikte elde edilen toplu, gevşek bağlı ve sıkı bir şekilde bağlı rizosferde toprak (açısından nasıl toprak kök dizinine bağlı): Lewjain, Madsen, PI561725, ve PI561727. Buğday genotip temel farklılıklarla topluluklar üreten siderophore seçimi ve işe alımı farklılıklar neden olabilir ki onaylanmadığına karar. Özel ilgi ile alüminyum ALMT1 (alüminyum-harekete geçirmek Malate ışınlama 1) sahiptir çünkü alüminyum hoşgörülü olduğunu, PI561725 isogenic çizgi ile ilişkili mikrobiyal topluluklar arasındaki farkı karşılaştırılır gene, almt123,24,25,26alüminyum duyarlı şeklinde sahip hassas PI561727 isogenic hattı. Çalışma baş amacı kantitatif kültürler gelecekte yapılacak çalışmalar için koruma sırasında siderophore üretim siderophore zenginleştirme kültürlerde karmaşık örnek türleri değerlendirirken, bir basit, hızlı yöntem geliştirmekti.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Apex</td><td>LF451320014</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum Fırın Tepsisi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum Folyo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amonyum klorür, granül</td><td>Fiesher Scientific</td><td>152315A</td><td></td></tr><tr><td>Otoklav ve Sterilizatör</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat</td><td>Fiesher Scientific</td><td>171428</td><td></td></tr><tr><td>CAS (Krom Azurol S)</td> <td>Chem-Impex Int'l Inc)</td> <td>000331-27168</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroz Monohidrat (glikoz), kristal toz</td><td>Fiesher Scientific</td><td>1521754</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, disodyum tuzu, dihidrat, Kristal</td><td>J.T.Baker</td><td>JI2476</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol,</td><td>Susuz Baker Analiz Edildi</td><td>C22634</td><td></td></tr><tr><td>HDTMA (Setiltrimetilamonyum Bromür</td><td>Reaktif Dünyası</td><td>FZ0941</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorür asit</td><td>ACROS Organik</td><td>B0756767</td><td></td></tr><tr><td>Sonsuz M200 PRO plaka okuyucu</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Demir (III) klorür hekzahidrat, %99</td> <td>ACROS Organik</td><td>A0342179</td><td></td></tr><tr><td>Laboratuvarı Çeker ocak</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratuvar İnkübatörü</td><td>VWR Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Sülfat</td><td>Fiesher Scientific</td><td>27855</td><td></td></tr><tr><td>Nirik Asit, (69-70)%</td><td>J.T.Baker</td><td>72287</td><td></td></tr><tr><td>BORULAR tamponu, %98,5</td> <td>ACROS Organik</td><td>A0338723</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat, dibaisc, toz</td><td>J.T.Baker</td><td>J48594</td><td></td></tr><tr><td>Pyoverdine</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>078M4094V</td><td></td></tr><tr><td>Kum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SI-600R Çalkalayıcı</td><td>Laboratuvar Arkadaşı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür, granül</td><td>Fiesher Scientific</td><td>136539</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit, peletler</td><td>J.T.Baker</td><td>G48K53</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat, dibazik heptahidrat, %99</td> <td>ACROS Organik</td><td>A0371705</td><td></td></tr></tbody></table>

yüksek işlem hacmi siderophore filtreleme dışında çevre örnekleri: bitki doku, toplu topraklar ve rizosferde topraklar

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Siderophores (düşük moleküler ağırlığı metal bileşikleri Şelat) demir (Fe) biyojeokimyasal topraklarda patojen rekabet, bitki büyüme promosyon ve çapraz-Krallık sinyal Bisiklete binme üzerinden arasında değişen çeşitli ekolojik fenomen önemlidir. Ayrıca, siderophores da bioleaching ve bioweathering metal taşıyıcı mineral ve madenler ticari ilgi vardır. Kantitatif değerlendirilmesi siderophore üretim yapılan karmaşık bir hızlı, uygun maliyetli ve güçlü araç ekolojik etkileri de dahil olmak üzere, roman siderophore mikroplar üreten siderophore aktivitesinin önemli yönlerini tanımlayan anahtardır. Burada sunulan Yöntem inceliğini microbiome topluluklarda toprak veya bitki doku gibi çevre örnekleri siderophore etkinliğini değerlendirmek için geliştirilmiştir. Örnekleri homojenize ve (olmadan Fe) değiştirilmiş bir M9 ortamda seyreltilmiş ve zenginleştirme kültürler 3 gün boyunca inkübe. Siderophore üretim bir roman 96-şey Mikroplaka CAS (Krom azurol sülfonat) kullanarak 24, 48 ve 72 saat (s) örneklerinde değerlendirildi-Fe agar tahlil, siderophore değerlendirilmesi, geleneksel olarak ve zaman alıcı sıkıcı kolorimetrik yöntemi bir uyarlaması bireysel ekili mikrobiyal yalıtır üzerinde gerçekleştirilen aktivitedir. Biz Lewjain, Madsen ve PI561725 ve iç Pacific Northwest yaygın olarak yetiştirilen PI561727 de dahil olmak üzere 4 farklı genotip/satır buğday (Triticum soğanı L.), bizim yöntem uygulanır. Siderophore üretim açıkça genotip buğday ve bitki dokularında gözlenen belirli türleri tarafından etkilenebilir. Biz başarıyla bizim hızla bitki genotip etkisi siderophore üretim, karasal ve sucul ekosistemler önemli bir işlev için ekran için kullanılan yöntem. Biz birçok teknik çoğaltır, çok güvenilir istatistiksel farklar toprak ve bitki doku içinde verimli üretti. Önemlisi, sonuçlar önerilen yöntem hızla güvenilirlik, özellikleri ve işlevsel genleri belirlemek daha sonra iş için korunmuş gibi topluluklar sağlar bir şekilde yüksek derecesi ile karmaşık örnekleri üretimde siderophore incelemek için kullanılan gösterir.

Bir pyoverdine karışımı uzarlar Pseudomonas fluorescens tarafından standart olarak yorumlamak ve absorbans ölçmek için kullanılan (420, nm) açısından µM. pyoverdine eşdeğerleri örnekleri Şekil 1 absorbans (420 arasındaki ilişkiyi gösterir Nm) ve pyoverdine (günlük10 derişim µM olarak) konsantrasyon başlayarak. Çünkü pyoverdine ve R2 ile ulaşılabilir olduğundan sergilenen büyük absorbans ölçümleri yapıldı örnekleri (<strong class...

Biz mikro besin bioavailability ve ciro karasal sistemlerinde katkıda bulunan siderophore olası çevresel örneklerin hızlı tarama için bir iletişim kuralı mevcut.

Yüksek işlem hacmi Siderophore filtreleme dışında çevre örnekleri: bitki doku, toplu topraklar ve rizosferde topraklar

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

Sideroforlar düşük molekül ağırlıklıdır, metal şelatlı biyomoleküller çevrede demir bisikletdahil. Bu protokol, toprak ve bitki numunelerinde siderofor aktivitesinin hızlı bir şekilde yüksek iş elde değerlendirmesine olanak sağlar. Sideroforre algılama için önceki yöntemler mikrobiyal toplumun önemli ortamı ortadan kaldırmış.Tekniğimiz, nispeten bozulmamış mikrobiyal topluluk ve içinde bulunduğu yaşam alanı içinde tespit sağlar. Demir kullanılabilirliği tarım verimliliği için çok önemli olduğundan, bu protokolde bitkilere demir kullanılabilirliğini modüle mikropların rolünü araştırmak için kullanılabilir. Ayrıca, bu yöntem toprak sağlığı ve siderofor üreten topluluklar üzerinde çiftlik yönetimi uygulamalarının etkisini değerlendirmek için yanı sıra zaman içinde bu toplulukların gelişimi için kullanılabilir.Başlangıç olarak, asit cas talimi kullanımından önce en az iki saat boyunca 100 milimolar hidroklorik 100 milimolar nitrik asit tüm cam yıkama. Laboratuvar sınıfı kum ile dolu bir alüminyum fırın tepsisi hazırlayın ve alüminyum folyo ile kaplayın. Otoklav 121 santigrat derecede 30 dakika boyunca ve bir kenara koyun.20 mililitre çift deiyonize suya 0365 gram ekleyerek HDTMA'yı hazırlayın ve çözeltiyi 37 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirerek çözünürlüğü teşvik edin. Steril manyetik karıştırma çubuğuyla hafifçe karıştırırken 25 mililitre çift deiyonize suya 0302 gram CAS ekleyin. Daha sonra 25 mililitre CAS çözeltisine beş mililitre azılı demir klorür heksahidit ekleyip hafifçe karıştırmaya devam edin.Şimdi, yavaşça yavaşça karıştırArak demir CAS karmaşık çözüm içine HDTMA çözeltisi 20 mililitre ekleyin. Tampon çözeltisini 15,12 gram BORU'yu 375 mililitre çift deiyonize suya hafifçe karıştırarak eriterek hazırlayın. Beş molar sodyum hidroksit ile pH'ı 6.8'e ayarlayın.Sonra 450 mililitre hacmi getirmek için su ekleyin. Şimdi çözeltiye beş gram agarose ekleyin. BORU tampon çözeltisini ve demir CAS karmaşık çözeltisini 121 derecede 30 dakika boyunca otomatik olarak tonulayın.Her biri otoklavlandıktan sonra biyogüvenlik kabinindeki BORU tamponunun tamamına demir CAS karmaşık çözeltisinin tamamını dikkatlice ekleyin. 50 santigrat derecede bir su banyosunda karışık çözelti yerleştirin. Şimdi steril bir reaktif tekne steril kum içinde biyogüvenlik kabine ve ısı 50 santigrat derece yerleştirin.Demir CAS kompleksi agar'ı tekneye aktarın, ardından 100 mikrolitreyi her kuyuya düz dipli steril 96 kuyulu bir mikroplakaya hızlıca aktarın. Önceden hazırlanmış modifiye M9 ortamda 800 mikromolar piroverdine standart hazırlayın. Çözeltiyi 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 ve 6,25 mikromolar çözeltiler halinde seyreltin.3.2 milimolar EDTA standardını hazırlamak için önceden hazırlanmış modifiye M9 ortamının 500 mililitresine EDTA ekleyin. Bu çözeltiyi 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 ve 6,25 mikromolar çözeltilere seyreltin. Standart bir eğri oluşturmak için, 100 mikrolitre demir CAS kompleks agar orta içeren 96 kuyulu bir mikroplaka kuyuları ayırmak için pyoverdine ve EDTA her konsantrasyon100 mikrolitre ekleyin.Her konsantrasyonun yinelenen teknik kopyalarını yapın. Ayrıca sadece M9 ile boş kuyular ekleyin. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, bir, altı ve 24 saat kuluçka dan sonra 22 santigrat derece absorbans ölçmek ve standart eğrileri oluşturmak için emici ölçümler kullanın. Örnekleme ekipmanını 22 mikron filtre çift deiyonize su ile yıkayın ve ardından %70 etanol ve kağıt havlu ile silin.Steril tekniği korumak ve çapraz kontaminasyonu azaltmak için numunelerden önce ve numuneler arasında yıkamayı gerçekleştirin. Bitki dokuları excising ve alanında bitkilerden küçük bir kök topu kazma sonra, laboratuvar ortamında örnek ayırma için ayrı bir etiketli plastik torba içinde kök topu yerleştirin. Tüm numuneleri doğrudan buzun üzerine yerleştirin ve siderofor üretim testini için numuneler işlenene kadar dört derece santigrat derecede tutun.Toplu, gevşek bağlı rizosfer toprak ve sıkıca bağlı rizosfer toprak içine ayrı kök ilişkili toprak örnekleri. Bunu yapmak için, çanta kök topları almak ve yavaşça kök topu toprak sallamak. Torbada kalan toprakla birlikte topraktan sarsılan toprak, büyük toprağı oluşturur.Bu gevşek bağlı rizosfer toprağı. Sıkıca bağlanmış numune ile kökleri alarak ve bir santrifüj tüpü koyarak sıkıca bağlı rhizopshere toprak oluşturun. 2-3 dakika çift deiyonize su ve girdap 30 mililitre ekleyin.Sıkıca bağlı rizosfer toprak bulamaç seyreltme almak için kökleri çıkarın. Numune torbası içindeki her bir toprak örneğini, torbayı açmadan mümkün olduğunca karıştırıp çevirerek homojenize edin. Her örnek iyice karıştırıldıktan sonra, steril 50 mililitrelik santrifüj tüp içinde modifiye M9 orta 20 mililitre her toprak numunesi iki gram aliquot ve askıya.Numuneyi seyreltin ve havalandırmaya izin vermek için tüpü steril bir köpük fişi ile kapatın. Sıkıca bağlanmış rizosfer örnekleri için, steril 50 mililitrelik bir santrifüj tüp içinde modifiye M9 orta 20 mililitre rizosfer toprak bulamaç iki mililitre ekleyin. Numuneyi seyreltin ve havalandırmaya izin vermek için tüpü steril bir köpük fişi ile kapatın.Doku örneğini hazırlamak için yüzey kök, ateş ve tahıl% 70 etanol ile sterilize. 30 saniye boyunca yüksek bir blender kullanarak modifiye M9 orta 20 mililitre taze doku Macerate iki gram. Daha sonra, numuneyi steril 50 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın, seyreltin ve tüpü steril köpük fişi ile kapatın.Demir sınırlaması ile siderofor üretimini zenginleştirmek için oda sıcaklığında 50 mililitrelik santrifüj tüpler inkübed ve 160 RPM de sallayın. Zenginleştirme kültürünü başlattıktan 72 saat sonra 24, 48 ve 72 saat sonra steril tekniği kullanarak zenginleştirme tüplerinden bir mililitre alt numune çıkarın. Hücreleri peletize etmek için iki mililitrelik santrifüj tüpleri bir dakika için 10, 000 kez G'de alt örnekleri santrifüj edin.Steril tekniği kullanarak, mikroplaka içinde yinelenen veya triplicate demir CAS karmaşık agar 100 mikrolitre çözeltisi için supernatant 100 mikrolitre ekleyin. Ayrıca 100 mikrolitre steril M9 ortamını boşluk olarak ekleyin. Sonra plakayı 28 derecede kuluçkaya yatırın.Her tabak, kuvöze yerleştirilmeden önce folyo ile kaplanmış ve kapatılmalıdır. Kendi steril iki mililitre santrifüj tüp içine her örnek için kalan supernatant ve pelet askıya alın. Her örnek supernatant tüp içine steril gliserol 400 mikrolitre ekleyin ve gliserol stokları oluşturmak için pelet yeniden askıya.Daha sonra analiz için eksi 80 santigrat derece stok dondurun. Emiciliği 6, 24, 48 ve 72 saat 420 nanometre dalga boyunda ölçün. Pseudomonas fluorescens tarafından biyosentezedilen bir piralyin karışımı mikromolar piralyin eşdeğerliği örneklerinde numunelerin absorbe sini yorumlamak ve ölçmek için standart olarak kullanılmıştır.420 nanometrede absorbans ile pioverdine başlangıç konsantrasyonu arasındaki ilişki burada gösterilmiştir. 72 saatlik zenginleştirmenin siderofor aktivitesi, siderofor izolasyonu üzerindeki genotip ve örnek tipinin etkisini belirlemek için 48 saatlik kuluçka da değerlendirildi. Dökme toprak örneklerinde siderofor aktivitesi nispeten düşüktü ve dökme toprağın örneklendiği buğday genotipi arasında farklılıklar yoktu.Ancak, 725 genotip izole gevşek bağlı toprak zenginleştirmemadsen ve 727 gevşek bağlı toprak ama Lewjain gelen göre daha fazla siderofor üretimi sergiledi. Tam tersine, sıkıca bağlanmış topraktan elde edilen zenginleştirmelerde siderofor üretimi genotipten yoğun olarak etkilenmedi. Tahıl dokusunun zenginleştirme kültürleri, genotipne bakılmaksızın nispeten düşük siderofor üretimi ne olursa olsun veremilmiştir.Lewjain sürgün dokusunun zenginleştirmeleri diğer genotiplere göre önemli ölçüde daha düşük siderofor üretimine sahipti ve 725 sürgün doku kültürü daha değişken siderofor üretimine neden oldu. 725'in diğer tüm genotiplere göre %200 daha fazla siderofor aktivitesine sahip olduğu kök doku zenginleştirme kültürlerinde siderofor aktivitesinde en büyük fark gözlendi. Protokolün yürütülmesinin en yorucu yönlerinden biri, CAS demir agar mikroplakası oluşturmak için birçok adımı tamamlarken aseptik koşulları korumak ve siderofor aktivitesi için numuneleri test etmektir.Kromatografik kültür tabanlı veya DNA tabanlı teknikler geniş bir yelpazede ya gerçek mikrotiter iyi ya da daha fazla biyokimyasal testler veya genetik karakterizasyon ve metabolik modelleme için gliserol korunmuş kültür uygulanabilir. Bu protokolü kullanarak siderophore aktivitesi daha sonra belirli organizmalar bu faaliyet sorumlu veya daha sonra daha büyük ekolojik etkiler için bir mekanizma olarak hedeflenmiş bağlantılı olabilir. Bu protokol, hava, su ve tortular gibi diğer çevresel bölmelerden elde edilen numunelerden elde edilen zenginleştirme kültürlerinde siderofor üretimini değerlendirmek için kolayca değiştirilebilir.

high-throughput-siderophore-screening-from-environmental-samples

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Bakteriler kendi mikrobiyal komşularının fizyolojisini etkileme potansiyeline sahip salgılanan bileşikler üretirler. Burada katı ortam üzerinde Bacillus subtilis flüoresan raportör transkripsiyon suşlar ile toprak mikrop karıştırılarak gibi kimyasal olarak aracılık edilen türler arası etkileşimlerin saptanmasına imkan veren bir kokültürü ekran tarif eder.

Kimyasal Dolayımlı Türler arası etkileşimleri tespit etmek Coculture kullanma

Burkholderia sartisoli RP037-mChe ile bir bütün hücre bioreporter deney, bir su doymamış model sisteminde hava dolu gözenekler köprü misel aktif taşıma sonra bakteriyel indirgenmesi için uygun bir organik kirlilik (örneğin, floren) fraksiyonları tespit etmek için geliştirilmiştir.

A Whole Hücre Bioreporter Yaklaşımı Su Doymamış Sistemleri Organik Kontaminantların Taşıma ve Biyoyararlanımını Değerlendirmek için

Enzim taraması için yüksek verimli bir test tanımlanmıştır. Bu çoğullanmış kullanıma hazır tahlil kiti, önceden seçilmiş Chrömer, Polymer, Hydrogel (CPH) substratları ve kompleks I, çözünmez Chromojenik Biyokütle (ICB) substratlarından oluşur. Hedef enzimler polisakkarit parçalayıcı endo-enzimler ve proteazlardır.

Yeni çözünmez Kromojenik altyapı deneyiyle kitleri kullanılarak karbonhidrat parçalayıcı Enzimlerin yüksek verimli tarama

Bu iletişim kuralı tek bir üretim için doğal organik madde ve mikrobiyal proteomik farklı ekosistemleri içinde tam olarak eşleştirilmiş karakterizasyonu sonuçlanan tamamlayıcı analitik ve omics teknikleri açıklar. Bu yaklaşım sağlam karşılaştırmalar metabolik yollar ve sera gazı üretim tanımlamak ve çevresel değişimin yanıt tahmin için önemli dönüşümleri tanımlamak için izin verir.

Karmaşık doğal organik madde karışımları karakterize için tek işlem hacmi tamamlayıcı yüksek çözünürlüklü analitik teknikler

Bu protokolde sunulan ortak kültür etkileşimi tahlilleri ucuz, yüksek iş ortası ve basittir. Bu tahliller, ortak kültürdeki mikrobiyal etkileşimleri gözlemlemek, etkileşim kalıplarını belirlemek ve insan ve çevresel patojenlere karşı mikrobiyal bir ilgi nin önleyici potansiyelini karakterize etmek için kullanılabilir.

Mikrobiyal Etkileşimlerin İncelemi için Yüksek İş-İş Ortağı Tahlilleri

Bu protokol, kütle spektrometresi görüntüleme ile birlikte ince filmlerdeki (DGT) difüzif gradyanlar kullanılarak birden fazla labile inorganik besin ve kirletici çözünür türünün mm altı 2D görselleştirilmesi için bir iş akışı sunar. Karasal bitkilerin rizosferinde solutların nicel haritalandırılması için çözünür örnekleme ve yüksek çözünürlüklü kimyasal analiz ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Topraktaki Labile, Inorganik Bitki Besinleri ve Kirleticilerin İki Boyutlu Görselleştirilmesi ve Nicelleştirilmesi

Burada, inatçı materyallerin parçalanmasında rol oynayan mantar suşlarını aramak için toprak biyoçeşitliliğini taramak için bir protokol sunuyoruz. İlk olarak, hümik asitler veya lignoselüloz üzerinde büyüyebilen mantar suşları izole edilir. Aktiviteleri daha sonra hem enzimatik testlerde hem de hidrokarbonlar ve plastikler gibi kirleticiler üzerinde test edilir.

İnatçı Malzemelerin Parçalanmasında Rol Oynayan Mantarlar için Toprak Biyoçeşitliliğinden İzolasyon ve Tarama

Ağır metale dayanıklı mikropların jeotermal kaynaklardan izole edilmesi, biyoremediasyon ve çevresel izleme biyosistemlerinin geliştirilmesi için sıcak bir konudur. Bu çalışma, kaplıcalardan ağır metal toleranslı bakterilerin izole edilmesi ve tanımlanması için metodolojik bir yaklaşım sunmaktadır.

Çevre Kirliliğini Ele Almak için Ekstremofilik Mikroorganizmaların Biyoprospektifi

Bu protokol, Pseudomonas aeruginosa'dan toplam sideroforlar, pyoverdin ve pyochelin'in hem kalitatif hem de kantitatif analizlerini sağlar.

Pseudomonas aeruginosa'dan Siderofor Üretiminin Kalitatif ve Kantitatif Analizi

Bu protokol, aynı örnekte bitki iyon sızıntısı, peroksidaz aktivitesi ve kallos üretimini değerlendirmek için yüksek verimli bir yaklaşımı tanımlar.

Mikrobiyal İkincil Metabolitlere Yaprak Yanıtlarının Yüksek Verimlilikli Bir Formatla Değerlendirilmesi

Bu protokol, endüstriyel mikroorganizmalar için standart yüksek verimli tarama iş akışı sunar. ARTP mutagenezi yoluyla mutant bir kütüphane oluşturmayı, otomatik mikrofluidiklerle pozitif damla taraması yapılmasını ve ardından sonuçların doğrulanmasını içerir. İş akışının güvenilirliği, yüksek verimli B. coagulans suşlarının taramasıyla doğrulandı.

L-laktik asit aşırı üreten Bacillus coagulans mutantlarının yüksek verimli taraması otomatik damla mikrofluidik platform kullanılarak

Keşfedin yüksek verimli siderofor tarama yöntemini bitki dokusu, toplu toprak ve rizosfer örnekleri için. Bu teknik, mikrobiyal topluluk içinde demir biyoyararlanımını hızla değerlendirir.

Yüksek işlem hacmi Siderophore filtreleme dışında çevre örnekleri: bitki doku, toplu topraklar ve rizosferde topraklar

Daha fazla video keşfet