Name: Hücre dışı veziküller çekme--dan tüm doku (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Öğrenin, beyin ve akciğer tümörleri de dahil olmak üzere çeşitli dokulardan yüksek saflıkta hücre dışı vezikül izolasyonu için bu protokolü. Bu yöntem, interstisyel veziküllerin morfolojik ve immünofenotipik karakterizasyonunu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Dr Richard Nowakowski ve sağlayan ve bu iletişim kuralı, saygıyla geliştirmek için kullanılan hayvanlar için bakım için Florida Devlet Üniversitesi laboratuvar hayvan kaynakları teşekkür ederiz. Biz aşağı akım vezikül karakterizasyonu yanı sıra FSU biyolojik bilim görüntüleme kaynak tesis için kullanılan kütle spektrometresi çalışma ile Xia Liu, Dr Rakesh Singh ve Florida Devlet Üniversitesi translasyonel bilim laboratuvarı yardım için teşekkür Transmisyon Elektron mikroskobu bu çalışmanın kullanımı. Son olarak, Dr Mandip Sachdeva (Florida A & M Üniversitesi) Bu yöntem geliştirmede kullanılan tümör örneklerin bağış için teşekkürler. Bu çalışmada Florida Bölümü Sağlık Ed ve Ethel Moore Alzheimer hastalığı araştırma D.G.M. ve J.M.O (6AZ11) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası altında Ulusal Kanser Enstitüsü için ödül programı gelen hibe tarafından desteklenmiştir D.G.M. için verilen R01CA204621

Bütün beyin bakım Komitesi (IACUC) Florida State University ve kurumsal hayvan kullanım onayı ile elde edilmiştir. On iki fare beyni toplam (her yaş grubundan 3 beyin: 2, 4, 6 ve 8 ay) C57BL/6 J arka plan için EV çekimi, yukarıda açıklanan16olarak kullanılmıştır. Akciğer tümörü numuneler cömertçe Florida tarım ve mekanik Üniversitesi IACUC onay altında Dr Mandip Sachdeva tarafından bağışlandı. Akciğer tümörleri insan adenokarsinom hücre kültürünü immünyetmezligi Balb/c nu/nu Çıplak fareler içinde yetiştirilen H1975 elde edilmiştir. İki temsilcisi tümör çoğaltır verilerden Bu çalışmada vurgulanmıştır.
Not: Vezikül yalıtım ve arıtma yönteminin şematik bir bakış Şekil 1' de verilmiştir.
1. doku ayrılma ve diferansiyel Santrifüjü
<ol><li>Ayrılma arabellek (papain 10 mg; 5.5 mM L-sistein; 1,1 mM EDTA 67 µM 2-mercaptoethanol) 10 mL başına yaklaşık 0,4 1,0 hazırda beklet-E ortamda hazırlamak g doku. EV zenginleştirme ve arıtma için kullanılan tüm çözümler ultrasaf süzülmüş suda seyreltilmiş unutmayın.</li>
	<li>50 mL konik tüp arabellekte ayrılma bütün taze veya dondurulmuş doku eklemek ve kuluçkaya ılık suda banyo 20 dk. doku için 37 ° C'de kuluçka önce küçük parçalara gerekirse kesilebilir.</li>
	<li>Kuluçka fosfataz ve proteaz inhibitörleri Son 1 x konsantrasyon için doku içeren ayrılma arabelleğe ekleyin.</li>
	<li>Doku gevşek-fit Dounce homogenizer içeren solüsyonu dökün ve yavaşça örnek başına yaklaşık 30 yavaş vuruş kullanarak doku ayırmak. Vuruş sayısı bağlı doku tutarlılık olarak ayarlanabilir.</li>
	<li>50 mL konik tüp ve 4 ° C'de hücreler ve kalan fibröz veya uyumlu doku parçaları cips için 5 min için 500 x g , santrifüj arabelleğe ayrışmış transferi doku.</li>
	<li>Transfer süpernatant temiz 50 mL konik tüp ve 2.000 x g , santrifüj 4 ° C'de cips ve büyük hücresel enkaz atmak için 10 dakika.</li>
	<li>Süpernatant tekrar temiz 50 mL konik tüp ve 4 ° C'de istenmeyen daha büyük veziküller veya küçük apoptotik organları cips için 40 min için 10.000 x g , santrifüj aktarmak. Not: Daha büyük veziküller ek çalışma için bu pelet istenirse kaydedilebilmesi için.</li>
	<li>Süpernatant 0,45 µm filtreden temiz 12 mL ultrasantrifüj tüpüne dikkatle boşaltmak. Not: Yoğun fibrotik doku örneklerini kolayca göre filtre uygulanabilir değil. Bu örnekler bir 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre sonra seri olarak daha küçük iğne (18 G, 20 G, 22 G) ile 0,45 µm filtreden filtre uygulamadan önce geçti.</li>
	<li>100.000 x g 4 ° C'de küçük EVs cips için 2 h için de örnek ultracentrifuge.</li>
	<li>Süpernatant dikkatle boşaltmak ve 5-10 dk, tüpler tarafında kalan sıvı kaldırmak için sık sık dokunarak için ters ultrasantrifüj tüpler bırakın. Kalan sıvı da alıyorum bir vakum pipet kullanarak Aspire.</li>
	<li>EV pelet 1,5 mL 0.25 M Sükroz arabellek (10 mM Tris, pH 7,4) yeniden askıya alma. Bu adımda Pelet tam re-süspansiyon emin olmak önemlidir. Bunu yapmak için parafilm vortexing EVs çözüm içine önce ile tüplerin kapak. 15-20 dk önce son girdap karışımı oda sıcaklığında ultracentrifuge tüpler rock.</li>
	<li>Kısaca alt kısmındaki tüp sıvı süspansiyon kurtarmak için bir hız fazla 1000 x g , tüpler santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Degrade arıtma merdiven aşağı devam etmek veya gerekirse, EV süspansiyon 4 ° C'de gecede saklayabilirsiniz.</li>
</ol>2. yoğunluk Gradient arıtma
<ol><li>% 60 iodixanol (su içinde stok çözelti) 1,5 mL % 30 iodixanol içeren son bir çözüm oluşturmak için EVs içeren 1,5 mL sukroz/Tris arabelleğe ekleyin. Pipet yukarı ve çözüm iyice karıştırmak için birkaç kez aşağı. Yüksek iodixanol konsantrasyonu çok viskoz olduğu gibi pipet ucu, çözümde kaybetmemek için dikkatli olun.</li>
	<li>EVs 5.5 mL ultrasantrifüj tüp altına içeren % 30 iodixanol arabellek çözüm aktarın.</li>
	<li>En az 1,5 mL % 60 iodixanol hisse senedi çözümden Ultrasaf Su örnek başına % 20 ve % 10 iodixanol çözümleri hazırlayın.</li>
	<li>1.3 mL % 20 iodixanol ve dikkatli bir şırınga ve bir 18 G iğne kullanarak alt degrade katman üzerine katman ölçmek. Katmanların yoğunluğu arayüz karıştırma önlemek için iğne ile temas hemen üstünde menisküs ultrasantrifüj tüp içine eğimi tutmak ve çözüm dropwise ekleyin.</li>
	<li>1.2 mL % 10 iodixanol çözeltisi yukarıdaki gibi aynı teknikle % 20 iodixanol katman üzerine katman.</li>
	<li>Dikkatle denge ve ultrasantrifüj tüpler rotor kovalar ve santrifüj 50 dk 4 ° C'de bir salıncak-kova Open End-268,000 x g de yüklemek Santrifüj hızlanma ve yavaşlama hızı yoğunluğu tabakalarının bozulma önlemek için izin verilen en düşük oranları ayarlayın.</li>
	<li>On 1.5 mL microcentrifuge tüpler yoğunluğu geçişin kesirler için 1'den 10 karşılık gelecek şekilde her örnek için etiket. Kesir 1 kesir 10 son kaldırıldı alt kısmı ise ilk, kaldırılacak olan en üstteki fraksiyonu belirlenmiştir.</li>
	<li>Degrade ultrasantrifüj tamamladıktan sonra yavaşça tüpler rotor kova çıkarın ve istikrarlı bir tutucuya yerleştirin. Veziküller görünür bir grup kez faiz kısmını görülecektir. Geçişin üstten 490 µL on seri kesirler ilgili tüpler içine pipet. Sıvı bulaşıcı proteinlerin büyük olasılıkla içeren tüp alt kısmında kalan küçük bir miktar olacaktır. Bu örnek, atılan veya isterseniz bir olarak kesir 11 korudu.</li>
	<li>Bir Refraktometre kullanarak kesirler Kırılma endeksi ölçmek. Bu da örnek korunması gerekli ise paralel olarak çalıştır denetim degrade ile gerçekleştirilir. Refraktometre yüzeyine iodixanol içeren her kesir 20-30 µL pipette ve yoğunluğu bilinen iodixanol yoğunlukları için kırılma endeksi karşılaştırarak tahmin ediyoruz. Kesirler gecede iodixanol içeren çözüm sonraki ultrasantrifüj yıkama adıma devam etmeden önce gerekli saklanabilir olduğunu unutmayın.</li>
	<li>Her kesir bir temiz 12 mL ultrasantrifüj tüp aktarın. 1 fosfat tamponlu tuz (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) x 5 mL tüp için yukarı ve aşağı yavaş yavaş pipetting tarafından ekleyip karıştırın. Not: PBS için örnekleri eklendi steril PBS 0,22 µm filtresi filtre ve tuz yağış önlemek için oda sıcaklığında saklanması tarafından parçacık bırakmayan, olmalıdır.</li>
	<li>1 x PBS bir ek 6 mL dön tekrar ve dikkatlice karıştırın.</li>
	<li>Ultracentrifuge tüpler 100.000 x g 4 ° C'de küçük veziküller yeniden cips için 2 h için de. Süpernatant dikkatle boşaltmak ve veziküller protein analizi (adım 3) için lizis veya re-süspansiyon EVs morfolojik analiz (adım 5) için önce kuru tüpler dokunun.</li>
</ol>3. lizis ve EV proteinlerin Immunoblot onay
Not: Morfolojik karakterizasyonu veya biyolojik aktivitesi için tüm veziküller korunması isteniyorsa, araştırmacılar doğrudan adım 5'e geçebilirsiniz. İlk deneylerde veya kütle spektrometresi analiz önce kurtarılan tüm kesirler kesirler EV proteinler ile onaylamak için immunoblot tarafından analiz edilmelidir.
<ol><li>EVs protein analizi için koşullar EV Pelet ultracentrifuge tüp için güçlü lizis arabellek (%5 SDS, 10 mM EDTA, 120 mM Tris-HCl pH 6.8, %2.5 2-mercaptoethanol, 8 M üre) 40 µL proteaz inhibitörü ilavesi ile ekleyin. Not: Proteinler antikor tespiti için koşullar sigara azaltmak isterseniz, 2-mercaptoethanol güçlü lizis arabelleği için ultrasaf su yerine.</li>
	<li>Pelet tam re-süspansiyon ve EVs lizis arabelleği ultrasantrifüj parafilm yerleştirerek olun Tüp, vortexing şiddetle, son bir girdap önce oda sıcaklığında 20 dk için sallanan.</li>
	<li>Kısa bir süre için tüm örnek birimi kurtarmak için 30-60 s 1000 x g de santrifüj kapasitesi. Örnek bir yeni 1.5 mL microcentrifuge tüp ve mağaza-80 ° c-20 ° C'de daha fazla işleme kadar aktarın.</li>
	<li>Saf lysates immunoblot analiz için hazırlamak için 1 x son bir konsantrasyon örnekleri için 5 x Laemmli örnek arabellek (% 10 SDS, 250 mM Tris pH 6.8, 1 mg/mL bromophenol mavi, 0,5 M DTT, % 50 gliserol, %5 2-mercaptoethanol) ekleyin. Not: Koşullar sigara azaltmak isterseniz, DTT ve 2-mercaptoethanol Ultrasaf Su ile değiştirin.</li>
	<li>Bütün doku homogenate denetimleri istenen, parçalayıcı Eğer üre-içeren güçlü dokusunda lizis arabellek proteaz inhibitörü ile yukarıda ayrıntılı, 10.000 x g kalan hücre dışı matriks, tüm hücreler, atmak 10 dk de santrifüj kapasitesi veya sağlam hücresel enkaz. 5 x Laemmli örnek arabellek doku homogenate 1 x son bir konsantrasyon için ekleyin.</li>
	<li>95 ° c 5-10dk için EV veya doku homogenate örnekleri içeren örnek arabellek kaynatın, sonra yük eşit birim (0,1-0,3 denk gelen doku malzeme başlayan g; 1-2 µg arıtılmış EV protein), kesirler 1-%10 10 SDS-sayfa jel içine. Eşit kitle doku homogenate yükleyin. Örnekleri daha fazla hacim algılaması için daha az duyarlı antikorlar tarafından gerekli olabilir.</li>
	<li>Jel Elektroforez ve Western blot analizi ile arıtılmış lysates EV proteinler onaylamak ve göreli EV bereket kesirler karşılaştırmak için daha önce detaylı21 olarak devam edin. Not: Bir kez EV protein tekrarlanarak tutarlı kesirler gösterdi, adım 2.12 içinde açıklanan son ultrasantrifüj yıkama faiz degrade kesirler için sınırlı olabilir.</li>
</ol>4. EV Protein miktar
<ol><li>EV proteinlerin hassas miktar daha ayrıntılı bir çözümleme için isterseniz floresans tabanlı bir deterjan ve üre uyumlu tahlil kullanın (bkz. Tablo malzeme). Floresans tabanlı bazı deneyleri bromophenol mavi EV Pelet (içinde adım 2.12) doğrudan lizis bu arabellekte tercih Eğer kolaylaştırılması Laemmli örnek, arabelleğindeki ile uyumlu olduğunu unutmayın.</li>
	<li>Anılan floresans tabanlı protein miktar kiti kullanılıyorsa, nokta 1 µL örnek veya standardında en az sağlanan filtre kağıt üzerinde çoğaltın ve protein miktar üreticinin yönergelerine uygun devam.</li>
</ol>5. EV morfoloji karakterizasyonu
<ol><li>Son Santrifüjü yıkadıktan sonra adım 2.12 bütün veziküller incelemek, iyice EV Pelet parçacık ücretsiz 1 x PBS yeniden askıya alabiliriz. Mağaza EVs donma-çözülme döngüsü önlemek için artık işleme kadar bir hafta daha 4 ° C'de. Not: Daha önce sürekli kesirler ilgi için morfolojik analiz sınırlamak için immunoblot Analizi tarafından zenginleştirilmiş EV protein içeren kesirleri doğruladı faydalıdır.</li>
	<li>Nanopartikül konsantrasyonu ve müstahzarları, veziküller boyutunu daha önce ayrıntılı22olarak belirlemek için tüm EV örnekleri üzerinde izleme çözümlemesi gerçekleştirin.</li>
	<li>EV kara delik karakterize ve boyut ölçüleri veziküller, elektron mikroskobu tarafından istenirse onaylayın. EM ızgaralar adım 5.123takip vezikül süspansiyonlar hazırlanan veya alternatif olarak blok hazırlıkları24 kimden adım 2.12 takip granül olarak işlenebilir.</li>
</ol>6. içinde-arıtma ve tripsin sindirim kütle spektrometresi analiz için jel
<ol><li>EV proteomes kütle spektrometresi tarafından karakterizasyonu isterseniz, eşit kesirler EVs bir önceden döküm polyacrylamide ayırmak ve proteinler arındırmak için jel içeren kütlesi (en az 10 µg protein) yükleyin. Üretici tarafından sağlanan önceden döküm jelleri örnekleri tanıtılıyor proteinler (örneğin, keratin) kirletici potansiyeli düzeyde azaltmak için tercih edilmektedir.</li>
	<li>Polyacrylamide jel protein arıtma, örnek en az 0,5 inç girmek sonra tamir ve Coomassie boya, daha önce ayrıntılı25içinde açıklandığı gibi leke.</li>
	<li>Şerit 1 mm3 küpler olarak daha önce ayrıntılı19,26tripsin sindirim için kesilmiş.</li>
	<li>Ayrıntı16' belirtilen parametrelere göre kütle spektrometresi tarafından sindirilmiş peptid örneği 5 µL LC-MS/MS enstrüman ayrılması analitik sütun ve daha sonraki analiz için yüklemek.</li>
</ol>

<ol><li>Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+secretion%3A+molecular+mechanisms+and+roles+in+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses.</a> Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).</li>
<li>Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+composition%2C+biogenesis+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li>
<li>Howitt, J., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+the+Pathology+of+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).</li>
<li>Sardar Sinha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+pathology+propagation+by+exosomes+containing+toxic+amyloid-beta+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers.</a> Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).</li>
<li>Meckes, D. G., Raab-Traub, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+and+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Microvesicles and viral infection.</a> Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).</li>
<li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+communication+goes+viral%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Exosomal communication goes viral.</a> Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).</li>
<li>Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions.</a> EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+cancer%3A+small+particle%2C+big+player%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+Oncology%22%5BJournal%5D)">Exosomes in cancer: small particle, big player.</a> Journal of Hematology Oncology. 8, 83(2015).</li>
<li>Janas, A. M., Sapoń, K., Janas, T., Stowell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+neural+cells+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).</li>
<li>Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+Their+Role+in+the+Life+Cycle+and+Pathogenesis+of+RNA+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses.</a> Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).</li>
<li>Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+modulators+of+cell-to-cell+communication+in+the+healthy+and+diseased+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).</li>
<li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li>
<li>Katsiougiannis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+Evolving+Contributors+in+Autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Forum+on+immunopathological+diseases+and+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity.</a> Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).</li>
<li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li>
<li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li>
<li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+enrichment+of+whole+brain-derived+extracellular+vesicles+reveals+insight+into+neurodegenerative+processes+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).</li>
<li>Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exosome+secretory+pathway+transports+amyloid+precursor+protein+carboxyl-terminal+fragments+from+the+cell+into+the+brain+extracellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).</li>
<li>Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Adaptable+Polyethylene+Glycol-Based+Workflow+for+Proteomic+Analysis+of+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).</li>
<li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).</li>
<li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD63+Regulates+Epstein-Barr+Virus+LMP1+Exosomal+Packaging%2C+Enhancement+of+Vesicle+Production%2C+and+Noncanonical+NF-.%CE%BAB+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.κB Signaling.</a> Journal of Virology. 91 (5), (2017).</li>
<li>Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+analysis+sheds+budding+insights+into+genetic+drivers+of+extracellular+vesicle+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295(2016).</li>
<li>Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3037(2012).</li>
<li>Jung, M. K., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Preparation+and+Imaging+of+Exosomes+by+Transmission+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).</li>
<li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+combined+with+mass+spectrometry+to+identify+herpes+simplex+virus+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).</li>
<li>Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExtraPEG%3A+A+Polyethylene+Glycol-Based+Method+for+Enrichment+of+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 6, 23978(2016).</li>
<li>Lötvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions%3A+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913(2014).</li>
<li>Thakur, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+DNA+in+exosomes%3A+a+novel+biomarker+in+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection.</a> Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).</li>
<li>Balaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+microvesicles+contain+retrotransposon+elements+and+amplified+oncogene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences.</a> Nature Communications. 2, 180(2011).</li>
<li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li>
<li>Zijlstra, A., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+matters+in+nanoscale+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Size matters in nanoscale communication.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).</li>
<li>Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncosomes+-+large+and+small%3A+what+are+they%2C+where+they+came+from%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Oncosomes - large and small: what are they, where they came from.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109(2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Çok bilimsel ilgi küçük EVs tümör microenvironment yanı sıra organ gelişimi, olgunlaşma ve işlev oynamak rolleri açısından oluşturuldu. Genel olarak, bu çalışmada olduğu gibi EVs çekme--dan tüm beyin veya tümör numuneler için en iyi duruma getirilmiş bir iş akışı sağlar. Burada biz sadece tümör kaynaklı akciğer EVs bu tekniğe uygulanabilirliği göstermek iken, bu yöntem kolayca daha fazla ex vivo karakterizasyonu olan küçük salgılanan veziküller dinleyicilere diğer sağlam dokular üzerinde çalışmak için adapte olabilir gen...

Küçük hücre dışı veziküller (EVs) endosomal elde edilen exosomes ve geniş Biyomedikal ilgi vardır küçük membran-döken microvesicles içerir. Küçük EVs 50-250 nm membran bağlı veziküller biyolojik olarak aktif proteinler, lipidler ve topluca hastalığı işlemleri çok sayıda önemli rol oynarlar inanılıyor nükleik asitler içeren türdeş olmayan nüfusu oluşur. Araştırma ilerleyen özellikle bu veziküller nörodejeneratif ve prion hastalıkları, bulaşıcı süreçleri, otoimmün veya enflamatuar ve tümör büyümesini ve metastaz1,2,3 karıştığı , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Biyomedikal araştırma EVs önemini hastalık patogenezinde içine hızla yalıtım ve bu veziküller arınma için tekrarlanabilir ve titiz yöntemleri gelişmekte olan paralel faiz oluşturulan.
EV karakterizasyonu tarihsel ve güncel mücadelesine küçük EV altgrupları tamamen ayırmak için yetersizlik olmuştur. Bu büyük ölçüde farklı veziküller Biyogenez yöneten farklı moleküler mekanizmaları bizim sınırlı anlayış nedeniyle mücadeledir. Boyutu, yoğunluk ve biyolojik kargo daha fazla altgrupları arasında örtüşen bu farklılıklar convolutes. Bu sınama bir parçası da yaygın olarak zenginleştirme teknikleri farklı laboratuvarlar arasında tutarsızlık izole veziküller aşağı akım analizi sağlayan ve kategorik EV nüfus aydınlatmak için küresel çaba zayıflatmayı kullanımı olmuştur.
Bu EV karakterizasyonu çoğunluğu veziküller hayvan veya insan vücut sıvıları, plazma, idrar da dahil olmak üzere gelen yalıtmak için teknikleri açıklayan daha yeni içinde vivo çalışmalar ile hücre kültürü süpernatant, tüp bebek koleksiyonundan gerçekleştirildikten dikkati çekiyor ve tükürük. EVs büyük miktarlarda dolaşımda iken, aynı zamanda bu veziküller hücre hücre iletişim olaylarda önemli rol oynarlar ve hücresel doku interstitium içinde bulunan tanıdı. Kanser bağlamında, interstisyel EVs tümör microenvironment tohum kanser hücresi ve metastatik büyüme14,15için modüle özellikle önemli olabilir. Sonuç olarak, geliştirme ve optimizasyon teknikleri veziküller sağlam doku örnekleri ayıklamak için değeri vardır. Bu yöntemleri doğrudan organ - okumak için bir yol sağlar veya tümör küçük biyopsi ve kısmi veya tam organ rezeksiyonu da dahil olmak üzere Klinik numune--dan hasat EVs türetilmiş.
Bu çalışmada ve bizim laboratuvar16tarafından yayımlanan bir önceki rapor, biz birkaç önemli Şu anki endişelerini EV zenginleştirme yöntembilim amacı: 1) yalıtmak ve şu anda en yüksek standartlarda EVs arındırmak için bir tekrarlanabilir tekniğini tanımlamak için alanını kabul; 2) son derece endosomal elde edilen exosomes zenginleştirilmiş küçük EV altgrupları yalıtmak girişimi için; ve 3) bir iletişim kuralı üzerinden sağlam doku örnekleri daha fazla karakterizasyonu amacıyla bu veziküller çıkarma için sağlamak için.
Son zamanlarda, Kowal ve meslektaşları ayırmak ve EV altgrupları karşılaştırılabilir sükroz yoğunluk gradyanlar17daha büyük etkinlik ile arındırmak için nispeten küçük ölçekli iodixanol yoğunluğu degrade nitelendirdi. Atıf çalışmada, dendritik hücre kaynaklı EVs esir nispeten hafif yoğunluk kesir, 1.1 g/mL, bir yoğunluk ile tutarlı olarak son derece exosomes bu mevcut yüksek bir oran ile en tutarlı olduğuna inanılan endosomal proteinler zenginleştirilmiş kesir. Yazarlara göre bu "iyi niyetli" exosomal proteinler tümör duyarlılık gen 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 ve birkaç annexin proteinler17dahil. Daha sonra doku ayrılma Perez-Gonzalez ve ark18 ve bütün beyin kaynaklı EVs16izole etmek için bir sonraki fark Santrifüjü protokol tarafından açıklanan yöntemin başarılı olması için bu tekniği uyarlanmış. Biz de bu yöntemin aşağı akım nicel ve karşılaştırmalı kütle spektrometresi veziküler protein, daha önce bizim laboratuvar19tarafından açıklanan için sıralı bir protokol birleştirerek EV proteomes karakterize içinde gösterdi. Bu eser bu hangi beyin20frontal korteks EVs zenginleştirilmiş Hill laboratuvarından paralellik.
Bu çalışmada bu tekniği ayrıntılı ve son zamanlarda EVs izolasyonu sağlam akciğer tümörleri için bizim laboratuardan yayınlanan Protokolü uygulamayı genişletebilir. Bilgimizi, bu EVs üzerinden ex vivo tümör numuneler zenginleştirmek için iletişim kuralı tanımlamak için ilk çalışmadır. Yeni tanı Biyomarkörler ve tumorigenesis içindeki rollerine EVs yaygın ilgi göz önüne alındığında, bu yöntem büyük olasılıkla bilimsel araştırmacılar, giderek artan sayıda için değerli olacağını. Klinik bir bakış açısından, interstisyel EVs büyük tanı değeri, özellikle numuneler histolojik değerlendirme sınırlı nerede liman. Burada özetlenen Yöntem hastalığın patogenezinde önemli roller bunlar küçük ortaya çıkarmak yapılacak çalışmalar için önünü taze veya dondurulmuş hayvan veya insan cerrahi numuneler, üzerinden EVs hasat tekrarlanabilir bir tekniği için bir temel sağlayacaktır bizim umudumuz veziküller oynayabilir.

<table><tbody><tr><td>0.45 ve mikro; m filtre</td><td>VWR</td><td>28145-505</td><td></td></tr><tr><td>12 mL ultrasantrifüj tüpleri</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>5.5 mL ultrasantrifüj tüpleri</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>anti-Alix antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7129</td><td></td></tr><tr><td>anti-Calnexin antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-11397</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD63 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab59479</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD81 antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9158</td><td></td></tr><tr><td>anti-Flotilin 2 antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-25507</td><td></td></tr><tr><td>anti-HSC70 antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7298</td><td></td></tr><tr><td>anti-Syntenin-1 antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-100336</td><td></td></tr><tr><td>anti-TSG101 antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7964</td><td></td></tr><tr><td>EZQ protein miktar tayin kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R33200</td><td></td></tr><tr><td>FA-45-6-30 rotor ve nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5820715006</td><td></td></tr><tr><td>FEI CM120 Elektron Mikroskobu</td><td>TSS Mikroskobu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>keçi anti-tavşan IgG (Fab parçası)</td><td>Genetex</td><td>27171</td><td></td></tr><tr><td>HALT fosfataz inhibitörü (100x çözelti)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>HALT proteaz inhibitörü (100x çözelti)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78438</td><td></td></tr><tr><td>Hazırda Bekletme E ortamı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1247601</td><td></td></tr><tr><td>MLS-50 sallanan kova rotoru</td><td>Beckman Coulter</td><td>367280</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-XP Masaüstü Ultrasantrifüj ve nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-100 ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94516</td><td></td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td>steril su çözeltisinde% 60 iyodiksanol</td></tr><tr><td>Q Exactive HF Kütle Spektrometresi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tavşan keçi önleyici IgG</td><td>Genetex</td><td>26741</td><td></td></tr><tr><td>tavşan anti-fare IgG</td><td>Genetex</td><td>26728</td><td></td></tr><tr><td>Refracto 30PX (refraktometre)</td><td>Mettler Toledo</td><td>51324650</td><td></td></tr><tr><td>S-4-104 rotor</td><td>Eppendorf</td><td>5820759003</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti sallanan kova Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>333790</td><td></td></tr><tr><td>Masaüstü 5804R santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>22623508</td><td></td></tr></tbody></table>

hücre dışı veziküller çekme--dan tüm doku

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Dolaşımdaki ve interstisyel küçük membran bağlı hücre dışı veziküller (EVs) roman tanılama ya da prognostik biyomarker deneyleri geliştirilmesi için umut verici hedefleri temsil ve büyük olasılıkla a geniş tayf-in ilerleme önemli oyuncular olarak hizmet hastalıklar. EVs rolünü ateş, inflamasyon ve kanser gibi koşullardan patogenezinde daha iyi doku türlerini anlamak ve mevcut araştırma birden çok hücreden salgılanan veziküller karakterizasyonu üzerine odaklanmıştır. Ancak, genel olarak tutarlı ve tekrarlanabilir teknikleri yalıtmak ve veziküller arındırmak için devam eden kalır. Ayrıca, sağlam doku ex vivo EVs, çıkarılması için yöntem pek açıklanmıştır. Burada, biz daha fazla karakterizasyonu için beyin ve tümör örnekleri de dahil olmak üzere bütün taze veya dondurulmuş dokular, ilgi küçük EVs çıkarma için detaylı bir protokol sağlar. Elektron mikroskobu ve veziküller immunophenotypic karakterizasyonu, hem de nicel kütle spektrometresi EV proteinlerin de dahil olmak üzere birden çok aşağı akım analizleri için bu yöntemin uyum göstermektedir.

Doku ayrılma, farklı aralıklarla ve veziküller degrade arıtma şematik bir bakış Şekil 1' de görüntülenir. Degrade saf EVs morfolojik ve immunophenotypic onay Şekil 2' de vurgulanır. Tekrarlanabilir yoğunlukları ultrasantrifüj % 10-30 iodixanol geçişin aşağıdaki diyagram, yukarı doğru kesir 2 (açık EVs) ve kesir 5 (yoğun EVs), geçiş iki ayrı vezikül nüfus ile doku türü bağımlı gösterilir. Degrade kesirler temsilcisi immunoblots ve...

Burada, küçük hücre dışı veziküller (EVs) tüm dokular, beyin ve tümör örnekleri de dahil olmak üzere gelen yalıtmak için detaylı bir protokol sağlar. Bu yöntem daha da aşağı akım analizleri için sağlam doku EVs ayıklamak için tekrarlanabilir bir teknik sunar.

Hücre dışı veziküller çekme--dan tüm doku

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Bu protokol, alt akım ex-vivo analizleri için tüm doku örneklerinden küçük hücre dışı veziküllerin çıkarılması ve izolasyonu için titiz ve tekrarlanabilir bir teknik sağlar. Şu anda ulaşılabilir saflık en yüksek düzeyleri arasında, Bu yöntem tümörler de dahil olmak üzere çeşitli doku örnekleri içine salgılanan interstisyel veziküller doğrudan morfolojik, immünohenotipic ve derin karakterizasyon kolaylaştırır. Burada, doku EVs beyin ve akciğer tümör örneklerinden izolasyon göstermek.Ancak, bu teknik çeşitli kullanarak çalışmalara uygulanabilir, iyi huylu, veya diğer tümör örnekleri de. Başlamak için, her 0,4 ila 1,0 gram doku için Hazırda Bekletme-E ortamda 10 mililitre ayrışma tamponu hazırlayın. 50 mililitrelik bir tüp tampon için tüm taze veya dondurulmuş doku ekleyin ve 20 dakika boyunca 37 derece santigrat sıcak su banyosunda kuluçka.Bundan sonra, dissosiasyon tampon son 1x konsantrasyonu için proteaz ve fosfataz inhibitörleri ekleyin. Gevşek bir uyum homogenizer içine doku ile çözelti dökün. Dokuyu hafifçe ayrıştırmak için numune başına yaklaşık 30 yavaş vuruş kullanın.Daha sonra, 50 mililitrelik konik tüp için ayrışmış doku ve tampon çözeltisi aktarın. 500x g ve dört derece santigrat beş dakika hücre ve kalan lifler veya uyumlu doku parçaları pelet için santrifüj. Süpernatant'ı temiz bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın ve 2, 000x g'de ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca büyük hücresel enkazı atın.Temiz bir 50 mililitre konik tüp bu supernatant aktarın, ve santrifüj 10, 000x g ve dört derece santigrat 40 dakika herhangi bir istenmeyen büyük veziküller veya küçük apoptotik organları pelet. Süpernatant'ı 0,45 mikrometrelik bir filtreden temiz 12 mililitrelik ultrasantrifüj tüpüne boşaltın. Daha sonra, ultracentrifuge örnek 100, 000x g ve dört derece santigrat iki saat boyunca, küçük EVs pelet.Supernatant decant ve ultracentrifugation tüpleri beş ila 10 dakika ters bırakın, tüplerin yanlarında herhangi bir kalıntı sıvı kaldırmak için sık sık dokunarak. Daha sonra, 0,25 molar sakaroz tampon 1,5 mililitre EV pelet resuspend. Tüpleri Parafilm ile kapatın ve evs'i çözeltiye sokun.Oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika ultracentrifuge tüpleri sallayın. Ve sonra girdap bir kez daha. Kısaca tüpleri 1,000x g'den daha düşük bir hızda santrifüj edin ve tüpün altındaki sıvı süspansiyonu geri edin.Gerekirse, süspansiyonu bir gecede dört derece saklayın. İlk olarak, % 30 iodixanol içeren nihai bir çözüm oluşturmak için EVs içeren sakaroz tris tampon 1.5 mililitre% 60 iodixanol 1.5 mililitre ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı birkaç kez iyice çözelti karıştırmak için.Bu çözeltiyi 5,5 mililitrelik ultrasantrifüj tüpünün dibine aktarın. Daha sonra, ultra saf su ile % 60 iodixanol stok karıştırın hem% 20 ve% 10 iodixanol çözeltisi en az 1,5 mililitre hazırlamak için. Bir şırınga ve 18 gauge iğne kullanarak, ölçü 1.3 mililitre 20%iodixanol çözeltisi ve dikkatle alt degrade üstüne katman.İğnenin yamacını tüpün içiyle temas halinde tutun, menisküsün hemen üzerinde ve yoğunluk arabirimindeki katmanları karıştırmamak için çözelti yitirme yi ekleyin. Daha sonra, katman 1.2 mililitre 10% iodixanol çözeltisi% 20 tabaka üstüne, aynı tekniği kullanarak. Ultracentrifugation tüplerini rotor kovalarına dikkatlice dengeleyin ve yükleyin.Bir salıncak kovarotorunun hızlanma ve yavaşlama hızlarını minimum hızlara ayarlayın ve santrifüjü 268, 000x g ve 4 derece santigrat derecede 50 dakika ayarlayın. Örnek santrifüj edilirken, yoğunluk degradesinin 1'den 10'una kadar kesirlerle karşılık gelecek her numune için 10 mililitrelik mikrosantrifüj tüpleri etiketle. Santrifüj tamamlandıktan sonra, tüpleri rotor kovalarından hafifçe çıkarın ve sabit bir tutucuya yerleştirin.Pipet 10 seri fraksiyonları 490 mikrolitre degrade nin üstünden ilgili tüplere. Bir refraktometre kullanarak, kesirlerin kırılma indekslerini ölçün. Sonra, temiz bir 12 mililitre ultracentrifugation tüp her kesir aktarın.Her tüp ve pipet yukarı ve aşağı yavaş yavaş karıştırmak için beş mililitre 1x PBS ekleyin. Tüpün üst kısmında 1x PBS ek altı mililitre ekleyin ve dikkatlice tekrar karıştırın. Ultracentrifuge tüpler 100, 000x g ve dört derece santigrat küçük veziküller yeniden pelet.Protein analizi için vezikülleri eritmeden veya morfolojik analiz için EVs'leri yeniden sumadan önce süpernatantı dekantın ve tüpleri kurutun. EVs protein analizi için lyse için, EV peletproteaz inhibitörü içeren güçlü lysis tampon 40 mikrolitre ekleyin. Parafilm'i her tüpün üzerine yerleştirin ve girdap ları şiddetle yerleştirin.Sonra, tekrar oda sıcaklığında ve girdap 20 dakika tüpleri sallayın. Numunenin tamamını kurtarmak için numuneyi 30 ila 60 saniye boyunca 1,000x g'de kısaca santrifüj edin. Her numuneyi yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve daha fazla işleme hazır olana kadar 20 ila 80 santigrat derece arasında bir sıcaklıkta saklayın.İmmünoblot analizi için saflaştırılmış lysates hazırlamak için, 1x son konsantrasyon için numunelere 5x Laemmli örnek tampon ekleyin. Numuneyi 95 derecede 5-10 dakika kaynatın. Daha sonra, 10% SDS sayfa jel içine kesirler 1 ile 10 eşit hacimli yükleyin.Eşit miktarda doku homojenate yükleyin. Saflaştırılmış lizatlarda EV proteinlerini doğrulamak ve kesirlerde göreceli EV bolluğunu karşılaştırmak için elektroforez ve Batı leke analizi yapın. Bu çalışmada, ekstrasellüler ayıklanır ve tüm dokudan saflaştırılır.%10-30 iodixanol degradesinin ultrasantrifüjünün ardından, ışık lı EV popülasyonunun ikinci kesire kadar göç etmesi görülürken, doku tipine bağlı olarak yoğun EV popülasyonunun beş kesire kadar göç yaptığı görülebilir. Degrade fraksiyonlarının temsili immünoblots fraksiyonu 5 küçük tümör türemiş EVs verimli ayırma ve saflaştırma sergiler. Özellikle, akciğer tümörü örnekleri daha önce tüm beyin dokusundan hasat edildi ışık EVs ile karşılaştırıldığında yoğun EVs zenginleştirilmiş görünür.Temsili nano partikül izleme analizi ve fraksiyon içeren baskın vezikül doku kaynaklı veziküllerin elektron mikroskobu tüm veziküllerin zenginleşmesini ve korunmasını göstermektedir. Küçük EV'lerin bilinen boyutu ve yapısıyla tutarlıdır. Interstisyel EVs yeni tanı veya prognostik biyomarker tahlilleri gelişimi için umut verici hedefleri temsil eder.Bu teknik, araştırmacılara veziküllerin aşağı akım için çıkarılması ve saflaştırılması için araçlar sağlar. Tüm veya lysed doku EVs çıkarılmasından sonra, proteomik dahil veziküllerin geniş karakterizasyonu, genomik, ve lipidomik analizler yapılabilir. Ayrıca, örnekler daha hedefli yaklaşımlar için kullanılabilir.Doğrudan doku örneklerinden izole edilen veziküller, tümör oluşumu da dahil olmak üzere hastalık mekanizmaları hakkında daha fazla bilgi sağlayabilir ve gelecekte önemli tanısal veya prognostik araçlar sağlayabilir.

extraction-of-extracellular-vesicles-from-whole-tissue

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu videoda, taze veya donmuş dokulardan hücre dışı veziküllerin çıkarılması tekniği açıklanmaktadır. İzole edilen hücre dışı veziküller, hastalık patogenezindeki önemli rollerini ortaya çıkarmak için daha ileri analizler için kullanılabilir.

Hücre Dışı Vezikül Ekstraksiyonu: Diferansiyel Santrifüjleme Kullanarak Tüm Doku Örneklerinden Hücre Dışı Vezikülleri İzole Etme Tekniği

Bu video, karakterizasyon çalışmaları için uygun hücre dışı veziküllerin alt popülasyonlarını izole etmek için yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjleme tabanlı saflaştırma yöntemini göstermektedir.

Hücre Dışı Veziküllerin Alt Popülasyonlarının Saflaştırılması: Yoğunluk Gradyanlı Ultrasantrifüjleme Kullanarak Hücre Dışı Veziküllerin Alt Popülasyonlarını Saflaştırma Tekniği

Bu karaciğerden doku ekstrasellüler (EVs) izole etmek için bir protokoldür. Protokol, kollajenaz perfüzyonunu içeren iki aşamalı bir süreci ve ardından karaciğer dokusu EVs'lerini izole etmek için diferansiyel ultrasantrifüji tanımlıyor.

Karaciğerden Doku Ekstrasellüler İzoles İzolasyon

Bu protokol, ev çökeltme, yoğunluk gradyan ultracentrifugation ve parçacık yakalama birleştirerek yüksek verimlilik ve verim ile virions uzak hücre dışı veziküller (EVs) izole aerodinamik bir iş akışı ve başlangıç bir azalma sağlamak için tüm EV araştırmalarında kullanılmak üzere tekrarlanabilir preparatlar ile sonuçlanan hacim gereksinimleri.

Yüksek Verim Ekstrasellüler Vezikül Preparatlarının Virüsten Uzaklaştırılması

Buradaki protokol, hücre dışı veziküllerin, boyut dışlama kromatografisi kullanılarak şartlandırılmış hücre kültürü ortamından yeterince ayrılabileceğini göstermektedir.

Hücre Dışı Vezikülleri Şartlandırılmış Hücre Kültürü Ortamından Ayırmak için Boyut Dışlama Kromatografisi

Bu protokol, periferik kan ve katı dokulardan hücre dışı veziküllerin çıkarılması ve daha sonra yüzey antijenlerinin ve protein kargolarının profillenmesi için bir yöntem tanımlamaktadır.

Plazma ve Solid Dokulardan İzlenebilir ve İşlevselleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzlenmesi ve Analizi

Mevcut protokol, temsili EV'leri (eksozomlar ve mikro-parçacıklar) kültürlü insan MSC'lerinden izole etmek ve karakterize etmek için diferansiyel santrifüjlemeyi açıklamaktadır. Bu EV'lerin diğer uygulamaları da bu makalede açıklanmaktadır.

Kültürlenmiş İnsan Mezenkimal Kök Hücrelerinden Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Terapötik Uygulaması

Burada, karaciğer kanseri dokusundan elde edilen küçük hücre dışı veziküllerin optimize edilmiş bir diferansiyel ultrasantrifüjleme yöntemi ile zenginleştirilmesini açıklıyoruz.

Karaciğer Kanseri Dokusundan Elde Edilen Küçük Hücre Dışı Veziküller İçin Bir Zenginleştirme Yöntemi

Burada, kollajenaz tip I ile sindirim ve ultrasantrifüjlemenin bir kombinasyonunu kullanarak fare dalağından türetilmiş eksozomları izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Fare Dalak Dokularından Elde Edilen Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Bu protokol, enzimatik sindirim ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak morin iskelet kası ve kemik iliğinden küçük ekstrasellüler veziküllerin izole edilmesini açıklar; böylece yapısal olarak karmaşık, düşük verimli dokulardan vezikülle zenginleştirilmiş fraksiyonların tekrarlanabilir şekilde geri kazanılmasını mümkün kılarak sonraki moleküler analiz için mümkün olur.

Boyut Dışlama Kromatografisi ile Küçük Ekstrasellüler Veziküllerin Fare, İskelet Kası ve Kemik Iliğinden İzole Edilmesi

Öğrenin, beyin ve akciğer tümörleri de dahil olmak üzere çeşitli dokulardan yüksek saflıkta hücre dışı vezikül izolasyonu için bu protokolü. Bu yöntem, interstisyel veziküllerin morfolojik ve immünofenotipik karakterizasyonunu sağlar.

Hücre dışı veziküller çekme--dan tüm doku

Daha fazla video keşfet