Name: Cryo-scanning Electron mikroskop ile görselleştirilen Woody bitkilerde xylem su dağılımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Öğrenin, odunsu bitkilerde kriyostat ve kriyotaramalı elektron mikroskop kullanarak ksilim su dağılımını yüksek çözünürlüklü görüntüleme yöntemini. Bu teknik, örnekleme sırasında yapay boşluk oluşumunu önleyerek bitki fizyolojisi araştırmalarında güvenilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma JSPS KAKENHI tarafından desteklenmektedir (No. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)

Not: bu protokolün şematik şeması Şekil 1' de gösterilir.
1. örnekleme: xylem boru su sütun içinde gerginlik gevşeme
Not: aşağıdaki gerilim rahatlama tedavisi, LN2 uygulamasından önce, hem donma hem de gerginlik kaynaklı eserler ile xylem su dağıtımında önlemek için önerilir.
<ol><li>Bir şube içine ve siyah plastik bir torba ile örnekleme için yaprakları xylem arasında su potansiyelini doğrultma ve örnekleme önce iki saatten fazla yaprakları.</li>
	<li>Bir basınç odası veya bir psychrometer kullanarak numunenin en az iki yaprakları su potansiyelini belirleyin. Su potansiyelinin daha 0,5 yüksek olduğu zaman-MPa (yani, Hayır veya çok düşük gerginlik var), bir numune dondurulduktan sonra hasat edilebilir (bkz. Bölüm 2: donma sabitleme). Su potansiyeli − 0,5 MPa 'dan düşük olduğunda, aşağıda açıklandığı gibi dinlenmek için bir tedavi gereklidir.</li>
	<li>Su ile doldurulabilmesi için kök etrafında bir su geçirmez yaka düzeltin. Alt olmadan bir plastik bardak su geçirmez yaka olarak hizmet verebilir. Bakım, daha sonra kullanılan sıvı medyanın sızıntısını önlemek için yapışkan bir bant kullanarak kök ve yaka arasındaki boşlukları sıkıca mühürlemek için alınmalıdır. Esnek hasat için ince dalları veya twigs gibi kaynaklanıyor, kök eğilerek bir su dolu kova içine bir kesme bölümü batırın. Su yüzeyinin altında budama makasları veya testere kullanarak keser. Kesme ucunu havaya indirgemek için, numuneyi mümkün olduğunca çabuk su başka bir kabına aktarın.</li>
	<li>Numunenin kesme ucunu su altında tutun. Genişletilen türler için, SEM için bir Cryo-numunenin hasat edilen kökü kesme kenarına elde edileceği noktadan gelen uzunluğun, Cryo numunesi içindeki gerginlik kaynaklı eserleri önlemek için numunelerin maksimum gemi uzunluğundan daha uzun olmasını sağlayın.</li>
	<li>Transpirasyon azaltmak için siyah plastik torba ile yaprakları içeren örnek kapak. Su numunenin kesme ucunu tutun ve xylem gerginlik dinlenmek için yaklaşık 30 dakika için bu durumu korumak. Kaviteli kanallar12olası suni dolum nedeniyle daha uzun rahatlama süresi (> 1 saat) kaçının.</li>
	<li>Xylem gerginliğinin (yaklaşık 0 MPa) dinlendiğini onaylamak için su potansiyelini tekrar ölçün. Not: numune almadan önce, hedef türlerin maksimum damar uzunluğu, hava enjeksiyon yöntemiyle benzer örneklerle araştırılmalıdır veya belirlenmelidir. Büyük bir ağaç veya büyük bir dal örneklemesinde, yukarıda açıklanan gerginlik-rahatlama prosedürlerini yürütmek zordur. Bu nedenle, büyük ağaçlardan numuneler, xylem su potansiyeli daha yüksek olduğunda Predawn döneminde toplanmalıdır.</li>
</ol>2. LN2 Ile Dondurma sabitleme
<ol><li>Kesme ve makas veya bir yardımcı bıçak ile bir su geçirmez yaka bir tarafı açın. Diyaframı yatay olarak tutarken, yaka gövdeye yapışkan bir bant ile sıkıca takın.</li>
	<li>İzolasyonlu eldiven/mitten, ama2 ' deki şişesi güvenli bir şekilde tutun ve 2 ' si ile doldurmak için at2 ' ye gir. Tamamen xylem su dondurmak için LN2 ekleyerek dolu tutun. Donma için gereken süre örnek boyutuna bağlıdır; 1 dk dökülme sonra atladıktan LN2 durdu küçük bir dal veya fide için yeterlidir, daha fazla 20 dakika daha büyük bir ağaç kök için gerekli20. LN 2 ve ortam sıcaklıkları arasındaki büyük sıcaklık farklılıkları nedeniyle hızlı bir şekilde buharlaşır gibi donma sırasında SÜREKLI olarak LNiki ekleyin.</li>
	<li>LN2 ' nin yeterli dondurmadan sonra kaldırılabilmesi için, yakalı numunenin dondurulmuş kısmından ayırın. Yaka ayırma nedeniyle potansiyel LN2 dökülmeleri ile temas önlemek için yalıtım eldiven giymek emin olun.</li>
	<li>Numuneyi hemen ince bir el testeresi ile topla.</li>
	<li>Dondurulmuş numuneyi alüminyum folyo bir parça ile kapatın veya örnek bir tüp içine koyun, örneğin KIMLIK numaraları yazılır. Hasat edilen numuneyi LN2 veya Pack ile dolu bir konteynırı kuru buzla dolu yalıtılmış bir kutuya hızla yerleştirin.</li>
	<li>Örnekleri gözlem kadar derin bir dondurucu içinde saklayın. Tercih edilen depolama sıcaklığı, depolama sırasında buz süblimasyonu ve rerystallizasyonu önlemek amacıyla − 80 °C ' dir.</li>
</ol>3. numune hazırlama
Not: gözlem Için, bir örnek kesilmiş olmalıdır ve gözlem için yüzeyi içinde situ içinde onun xylem su dağılımı tutmak için Subzero sıcaklıkta planlanmış olmalıdır. Bir kriyostat sistemi ile biyolojik bir mikrotome (kriyostat) Cryo-SEM tarafından gözlem bu tür bir numune yüzeyi kırpma ve açığa çıkarmak için idealdir.
<ol><li>Kriyostat numune odasının sıcaklığını − 30 °C ' ye ayarlayın, bu da çoğu bitkinin koklem SAP durumunu dondurulmuş bir durumda tutmak için genellikle yeterince soğuktur.</li>
	<li>Bir numuneyi küçük bir parçaya kırpın (< CA. yükseklik ve < CA. 1 cm genişliğinde veya çapı), bir Cryo-SEM numune tutucusuna ayarlanabilir. keskin bir bıçak ya da numunede buzu kırmasını önlemek için ince dişli testere kullanın. Bir bıçak ile kesilmiş olamaz büyük bir örnek durumunda, hızlı bir dondurucu kutusunda soğutulmuş testere ile önceden kesilmiş.</li>
	<li>Kırpılmış parçayı, Cryo-bölümleme için bir doku dondurucu gömme Orta (örn. OCT bileşik) üzerine monte ederek, bir kriyostat için bir tutucu olan bir Chuck 'a takın. Sonra, kriyostat bir mikrotome bir numune tutucusuna Chuck takın.</li>
	<li>Kalınlığı 5 – 7 μm bölümlerle tekrar tekrar tıraş ederek yüzeyi kırpın. 1.000 ' den fazla 2.000 μm ' den fazla kesme ile kırpma, örnek toplama sırasında ilk yüzeyden toplam derinlikte, bir bıçağla ön kesme veya adım 3,2 ' de açıklandığı gibi testere ile kaynaklanan numunenin hasarlı kısmını ortadan kaldırmak için yararlıdır.</li>
	<li>Numunenin bir yüzeyini kabaca kırptıktan sonra, mikrotome bıçağının kullanılmayan bir kısmını numunenin yüzeyinin üzerinde ayarlayın. Bıçağın, kalınlık ayarını aşan örneğe dokunmasına izin verme.</li>
	<li>Kullanılmayan Blade bölümünün ilk kesmeden önce, numune ve bıçak yüzeyi arasındaki mesafeyi hafifçe genişletin.</li>
	<li>Numunenin yüzeyini sadece bir veya iki kez keser. Dahası, numunenin yüzeyinde kullanılmayan bir bıçak parçasının ayarlanması için bıçağı tekrar kaydırın.</li>
	<li>3,6 ve 3,7 üç veya dört kez adımları yineleyin. Bu, "bıçak izleri" olmadan açık bir yüzey elde etmek için önemlidir (Şekil 4).</li>
	<li>Son Kesme işleminden sonra, tozun numunenin üzerine yapışmasını önlemek için bıçağın konumunu örnekten uzağa ayarlayın.</li>
	<li>Fırfırını numune tutucusuna ayırın ve dondurulmuş gömme ortamını keskin bir bıçakla kaldırarak numuneyi aynadan ayırın. Numunenin, rendeli yüzeyini Don tozundan önlemek için kriyostat odasına yerleştirildiğinden emin olun.</li>
	<li>Numuneyi, kriyostat odasına bir doku donma gömme orta ile Cryo-SEM numune tutucusuna takın.</li>
</ol>4. Cryo-SEM numune odasına transfer
Not: yüzey – hazırlanmış numune, kriyostat odasından Cryo-SEM numune odasındaki gözlem aşamasına transfer sırasında sıcaklık veya Don birikiminin artması ile korunmalıdır.
<ol><li>Ekipman kullanım kılavuzuna göre LN2 ile Cryo-SEM numune odasındaki soğuk aşama sıcaklığını – 120 °c ' den daha düşük olarak koruyun.</li>
	<li>Numune tutucusunu hazırlanmış numuneye, kriyostat odasında LN2 ile dolu bir yalıtım konteynerine yerleştirin.</li>
	<li>Numune tutucusunu LN2' nin altında bir numune değişimi çubuğu ile tutun. Numune tutucusunun mümkün olduğunda havaya maruz kalmaması.</li>
	<li>Numune tutucuyu, tahliye öncesi odanın tahliyesini başlatarak Cryo-SEM numune odasının ön tahliye odasına hızlıca ayarlayın. Ardından, hava tamamen boşaltıldıktan sonra numune tutucusunu soğuk aşamaya yerleştirin. Biraz Don birikimi kaçınılmaz olmasına rağmen, "Freeze-etching" prosedürü (adım 6) kaldırabilirsiniz.</li>
</ol>5. SEM ayarı
Not: gözlem için tipik ayar aşağıda açıklanmıştır. Vakum durumuna veya elektron ışınına bağlı olarak bazı değişiklikler gereklidir.
<ol><li>İzleme için SEM parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: Hızlanma voltajı: 3 – 5 kV Numune aşamasının sıcaklığı: < − 120 °C Dedektör: Ikincil emisyon</li>
</ol>6. dondurma-gravür
Not: Freeze-etching hafif buz kristal süblimasyon ile örnek hücre duvarları kenarı vurgulamak için prosedürdür. Freeze-etching ayrıca yüzey Don tozları kaldırma içerir.
<ol><li>Donma-etching sırasında elektrik tabancası ivme voltajı açın. Numuneyi gözlemlerken donma-Etleme yapmak daha iyidir.</li>
	<li>Numune aşamasının sıcaklığını − 100 °C ' ye yükseltin.</li>
	<li>Don tozu çıkarılıncaya kadar birkaç dakika bekleyin ve xylem hücrelerinde buzun yüzey seviyesi hücre duvarlarına kıyasla biraz azalmıştır.</li>
	<li>Numune aşamasının sıcaklığını − 120 °C ' ye indirin. Not: numune aşaması için yüklü Sıcaklık kumandası yoksa, numuneyi değişim çubuğunu kullanarak tutun ve birkaç dakika için numune aşamasından ayırın. Numunenin süblimasyon durumunu doğrulamak için bu donma-aşındırma işlemi sırasında numuneyi birkaç kez izleyin.</li>
</ol>7. metal kaplama (opsiyonel)
Not: SEM enstrüman ve görüntü işleme son iyileştirmeler metal kaplama olmadan elektrik yalıtım numunelerin yüksek kaliteli görüntüler sağlayabilir. Ancak, biyolojik malzemeler gibi iletken olmayan örnekler, bazen şarj edilir; elektronlar birikimi nedeniyle numunenin belirli pozisyonlarında daha yüksek parlaklık ("şarj"). Numunenin daha uzun bir süre veya yüksek büyütme için elektron ışınlarının açığa çıkması, şarj efektlerini arttırır. Numunenin yüzeyini Elektrik iletkenli metal malzemeyle kaplama, şarj işleminin oluşmasını önler. Numune sıcaklığının kaplama sırasında artması için Cryo-SEM ünitesi içinde yüklü olan vakum kaplama sistemini kullanın.
<ol><li>Kaplama malzemesi kaplama sisteminin belirlenmiş bir evaporatör kafası yüklü olduğundan emin olun.</li>
	<li>Kaplama sistemindeki soğuk aşamanın sıcaklığını − 170 °C ' ye kadar koruyun.</li>
	<li>Numune tutucuyu, yeterli donma-Etleme işleminden sonra kaplama sisteminin soğuk aşamasına yerleştirin.</li>
	<li>Soğuk sahne ve Evaporatör kafası arasında bir bölme açın.</li>
	<li>Geçerli değeri ve buharlaştırıcı kafasının voltaj değerini sırasıyla 30 mA ve CA. 5 V olarak ayarlayın.</li>
	<li>Numunenin yüzeyini kat etmek için 30 s ısı için kaplama malzemesi Buharlık.</li>
	<li>Evaporatör kafasının geçerli ve voltaj değerlerinin her ikisini de sıfır olarak ayarlayın ve bölümü kapatın.</li>
	<li>Numune tutucuyu numune odasının soğuk aşamasına, gözlem için yerleştirin.</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Bu yazıda sunulan Cryo-SEM gözlem yöntemleri, hücresel ölçekte su dağıtımını açıkça görselleştirmeye yönelik pratiktir. Bu yöntem sayesinde, xylem içinde su dağılımı değişiklikleri keşfetmek potansiyel abiyotik stres (su sıkıntısı veya donma) veya biyotik stres (ağaç hastalığı) ağaç türlerinin toleransı mekanizması açıklığa kavuşturmaya yardımcı olabilir.
Bu yöntemde en önemli adım, numune toplama ve sonraki numune hazırlama sırasında yerel su durumunun su dağılımı özelliğini korumaktır. Uzun ...

Su kaynaklarının kullanılabilirliği (yani, yağış, toprak suyu içeriği) kesinlikle bitki türlerinin mortalite ve coğrafi dağılımını belirler, çünkü topraktan su absorbe etmek ve fotosentetik üretim için yaprakları taşımak gerekir. Bitkiler su taşıma sistemini dalgalanan su kaynakları altında tutmalıdır. Özellikle, odunsu bitkiler, bazı durumlarda, onların taç daha ~ 100 m zemin üzerinde tutmak gerekir gibi transpirasyon akışları boyunca kendi kanallarında yüksek gerginlik üretir. Bu kadar yüksek negatif basınç altında su sütunları korumak için, xylem kanallar sert ve hidrofobik-lignified hücre duvarları ile tübüler hücrelerin bir süreklilik oluşur1. Her türün xylem boru disfonksiyonunun xylem bozukluğu için güvenlik açığı, dalgalanan su kaynağı altında türlerin hayatta kalmasının iyi bir belirleyici olduğunu2. Buna ek olarak, xylem kanallarının su durumunun incelenmesi, Abiotik veya biyotik gerilmelere maruz kalan ayrı ağaçların sağlık durumunun değerlendirilmesi için önemlidir. SAP akışını veya su potansiyelini ölçmek, xylem kanallarının Entegre hidrolik fonksiyonu nedeniyle odunsu bir bitkinin suyun durumunun tahminlerini sağlayabilir. Ayrıca, xylem hücrelerinde suyun dağılımını görselleştirerek xylem Hidrolik sisteminin bireysel bileşenlerinin durumunu açıklığa kavuşturabilirsiniz.
Xylem kanallarının su durumunu görselleştirmeye yarayan çeşitli teknikler var3. Ahşap doku su yolları gözlemleme için klasik ve yararlı yöntemler bir boya içine kesim dalları uçları daldırarak veya ayakta ağaca bir boya enjekte ederek su sütunu boyama içerir4kaynaklanıyor. Soft x-ışını fotoğrafçılığı, xylem5,6' da nem diferansiyel x-ışını emilimi yoğunluğu nedeniyle dilimlenmiş ahşap diskler su dağılımı görselleştirme sağlar. Bu yöntemler, ancak, sadece su hareketi parçaları sağlamak veya su makroskopik dağılımları göstermek. Son zamanlarda, mikro odaklama X-Ray bilgisayarlı tomografi (μct)7,8,9,10ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG)11 gibi tahribatsız gözlem teknikleri, 12, önemli ölçüde sağlam fidanlar içinde xylem kanallar su gözlem sağlamak için geliştirilmiştir. Bu yıkıcı olmayan yöntemler biz yapay kesme efektleri olmadan xylem su durumunu gözlemlemek ve biz ardışık görüntüleme veya bir kontrast Ajan10tanıtmak su akışı dinamikleri izleyebilirsiniz büyük avantajları vardır. Ancak, hücresel düzeyde su içeriğini tanımlayabilen görüntüleri elde etmek için bitki görüntüleme veya Synchrotron tabanlı μCT için özel bir tesis için özelleştirilmiş bir MRI kullanmanız gerekir. Buna ek olarak, Synchrotron tabanlı μct sistemi, ışık mikroskobu7,8,9ile karşılaştırılabilir yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip ince görüntüler elde etmek için etkin olsa da, yaşam hücreleri tarafından yaralanabilir yüksek enerji X-ışını13,14radyasyon. Hangi Cryo-birimleri yüklü bir tarama elektron mikroskop istihdam (Cryo-SEM) tam bir hücresel düzeyde xylem su bulmak için çok yararlı bir yöntemdir, bu yıkıcı gözlem için örnek hasat gerektirir rağmen. Xylem kanalları su düzeltmek için, (yani, dallar, dalları veya kaynaklanıyor) kaynaklanan bir kısmı sıvı nitrojen (LN2) tarafından situ dondurulmuş. Cryo-SEM tarafından kesilmiş, dondurulmuş numunelerin yüzeyinin gözlemleri, biz buz olarak xylem kanallarının su tanımlayabilir hangi xylem yapısının yüksek büyütülmüş görüntüler sağlar. Bu yöntemin önemli bir sınırlama, aynı numune içinde su taşınabilirlik sıralı gözlem imkansız olmasıdır. Ancak, bu aletler taşınabilir olmadığından bir alanda yaşayan ağaçların sıralı gözlem için μCT veya MRI uygulaması son derece zordur. Buna karşılık, Cryo-SEM açık bir şekilde sadece hücresel düzeyde değil, aynı zamanda daha ince bir yapı düzeyinde su içeriğini görselleştirmek için alan deneylerinde büyük ağaçlar bu tekniği kullanarak bir potansiyele sahiptir, örneğin, intervasküler çukurlarda su15, su içinde hücre içi alanlar16, veya su sütununda Bubbles17.
Cryo-SEM tarafından xylem su gözlem birçok çalışmalar bildirilmiştir 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi ve ark. (1996) başlangıçta bir konteyner içine kök21üzerine set içine LN2 doldurma yoluyla bir yaşam gövdesinin dondurma-fiksasyonu ile situ içinde xylem gözlem için protokol kuruldu. Numune toplama sırasında ve Cryo-SEM hazırlığı sırasında, kıt kanallarının içindeki buzu erime önlemek amacıyla, numunenin sıcaklığı-20 °C ' nin altında tutulur. Bu yöntem, değişen su rejimi11,12,24,25,26, altında su dağılımı açıklığa kavuşturmak için xylem su gözlemlemek için kullanılmıştır 27,28, su dağıtımı mevsimsel varyasyonu21,29,30, Freeze-çözülme döngüleri etkisi17,31, 32, ıslak ahşaptan su dağılımı5, diri odun 'dan kalp ağacından20' ye geçiş sırasında su dağıtımında değişiklikler, cambial aktivite ve damarları33farklılaşma mevsimsel zaman ders, ve kavitasyon bazı biyotik gerilimler tarafından indüklenen23,34. Hidrolik iletkenlik ve boruları kavitasyon için güvenlik açığı da Cryo-SEM35,36kullanılarak doğrulandı. Enerji Dispersif X-ışını spektrometresi (EDX veya EDS) ile donatılmış Cryo-SEM, su37içeren bir numunenin yüzeyi üzerinde eleman dağılımını incelemek için kullanılmıştır.
Yüksek hidrolik gerginlik altında kanallar içeren bir yaşam gövdesinin donma-fiktasyonu bazen Cryo-SEM ' i hangi boru hatlarının lümeninde kırık buz kristalleri tarafından gözlenen yapay kavimlere neden olur38,39. Özellikle, daha uzun ve daha geniş kanallara sahip geniş türler, su3,40altında yürütülse bile, numune kesiminin neden olduğu kavitasyon gibi gerginlik kaynaklı eserler için savunmasız. Kavitasyon eserler bir nirengi ağacının örnekleme sonra göze çarpan olur (yani, gün boyunca örnekleme) veya şiddetli kuraklık koşulları altında ve kavitasyon oluşumu bir aşırı tahmin yanıltabilir3,38, 39. Bu nedenle, borular içinde çalışan gerginlik artifaktüel kavitasyon önlemek için serbest bırakılmalıdır3,12,39.
Bir numune odasına takılı bir bıçağı kullanan donma-kırılma tekniği genellikle Cryo-SEM gözlem için numune yüzeyini açığa çıkarmak için kullanılmaktadır. Ancak, odunsu bitki dokularının Freeze-kırık uçaklar, ikincil xylem özellikle enine bölümleri, doku6anatomik özellikleri ve suyu açıkça gözlemlemek için çok kaba. Bir numunenin kırpması için bir kriyostat uygulaması, örnek yüzeylerin hızlı ve yüksek kalitede hazırlanması20,23sağlar. Bu yöntemin genel hedefi, numune alma oluşumları olmadan situ 'daki çeşitli Ksilem hücrelerinde su dağılımının Elektron Mikroskopisi çözünürlüğüne sahip kanıt sağlar. Biz ilk kabul beri sürekli olarak geliştirilmiş olan güncel prosedürü tanıtmak, örnekleme ile ilgili, kırpma ve yüksek kaliteli elektron MİKROGRAFİ elde etmek için numune yüzeyi Temizleme xylem Cryo-sabit numuneler.

<table><tbody><tr><td>kaplama malzemesi</td><td>JOEL Ltd., Japonya</td><td>Altın tel, 0.50 &times; 1000 mm, 99.99 %, Parça No. 125000499&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>kriyo taramalı elektron mikroskobu</td><td>JOEL Ltd., Japonya</td><td>JSM-6510, MP-Z09085T / MP-51020ALS</td><td></td></tr><tr><td>kriyostat</td><td>ile kuruldu Thermo Scientific</td><td>CryoStar NX70</td><td></td></tr><tr><td>mikrotom bıçağı</td><td>Thermo Scientific</td><td>HP35 ULTRA Tek Kullanımlık Mikrotom Bıçakları, 3153735</td><td></td></tr><tr><td>doku dondurma gömme ortamı</td><td>Thermo Scientific</td><td>Shandon Cryomatrix gömme reçinesi, </td><td></td>6769006</tr></tbody></table>

cryo-scanning electron mikroskop ile görselleştirilen woody bitkilerde xylem su dağılımı

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

Bir tarama elektron mikroskop yüklü Kriyo-birimi (Cryo-SEM) Subzero sıcaklıklarda numune gözlem sağlar ve sıvı nitrojen kullanarak dondurma fiktasyon teknikleri ile birlikte bitki dokularında su dağıtımı keşfetmek için kullanılmıştır (LN 2). odunsu türler için, ancak, xylem enine kesme yüzeyi gözlem hazırlıkları ahşap liflerin oryantasyonu nedeniyle bazı zorluklar içerir. Ayrıca, xylem kanallarının su sütununda daha yüksek gerilim, özellikle örnek fiktasyon ve toplama sırasında su dağıtımında artifaktüel değişikliklere neden olabilir. Bu çalışmada, bir kriyostat ve Cryo-SEM kullanarak situ 'daki odunsu bitkilerin xylem içerisindeki suyun dağılımını gözlemlemek için etkili bir prosedür sergiliyoruz. İlk başta, numune toplama sırasında, xylem su potansiyelinin ölçülmesi, xylem kanalında yüksek gerilimin bulunup bulunmadığını belirlemelisiniz. Xylem su potansiyeli düşükken (< CA. − 0,5 MPa), numune dondurulması sırasında xylem kanallarında su durumunun daha iyi korunmasını kolaylaştırmak için bir gerginlik rahatlama prosedürü gereklidir. Sonra, bir su geçirmez yaka ağaç kökü etrafında eklenir ve LN ile dolu2 xylem su durumunun donması için sabitleme. Hasat sonrası, örnek gözlem için numune hazırlama prosedürlerini tamamlarken numunenin donmuş şekilde korunduğundan emin olmak için bakım alınmalıdır. Xylem enine kesilmiş yüzeyi açıkça açığa çıkarmak için bir kriyostat kullanılmaktadır. Cryo-SEM gözlemlerde, donma-aşındırma için zaman ayarlaması, Frost tozunu kaldırmak ve izleme yüzeyinde hücre duvarlarının kenarını vurgulamak için gereklidir. Sonuçlarımız, hücresel ve hücre altı seviyelerinde xylem içinde su dağılımı gözlem için Cryo-SEM tekniklerinin uygulanabilirliğini göstermektedir. Cryo-SEM ile tahribatsız in situ gözlem teknikleri ile kombinasyonu derin odunsu bitki suyu akış dinamiklerinin keşfi geliştirmek olacaktır.

Cryo-SEM tarafından gözlenen, iğne kesimli ve yaylı ağaç xylem 'in Transverse kesilmiş yüzeylerinin temsili görüntüleri Şekil 2' de gösterilir. Düşük büyütmede, görüntüdeki siyah alan, suyun tamamen veya kısmen kaybolacağı boşlukları gösterir ve gri alan Ksil hücresi duvarları, sitoplazması ve suyu gösterir (Şekil 2A). Yüksek büyütme, bu su tamamen üç tracheids Lumina kayıp değildir belirgindir, kıt içinde situ S...

Körte su dağılımının gözlemlenmesi, odunsu bitkilerde suyun akış dinamikleri ile ilgili önemli bilgiler sağlar. Bu çalışmada, örnek hazırlama sırasında su durumundaki artifaktüel değişiklikleri ortadan kaldıran bir kriyostat ve Cryo-SEM kullanarak situ 'da xylem su dağıtımını gözlemlemek için pratik bir yaklaşım gösteririz.

Cryo-scanning Electron mikroskop ile görselleştirilen Woody bitkilerde xylem su dağılımı

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...

Bu protokolün genel amacı, çeşitli ksilem hücrelerinde su dağılımının elektromikroskobu çözünürlüğü sağlamaktır. Bu yöntem, su dağılımını ve değişen su rejimlerini, su dağılımının mevsimsel değişimini, donma/çözülme döngülerinin etkisini, ıslak odunlarda suyun dağılımını ve bazı biyotik streslerin neden olduğu kavitasyonu netleştirmek için ksilemdeki suyu gözlemlemek için kullanılmıştır. Yüksek hidrolik gerilimler altında yaşayan bir gövdenin donma fiksasyonu bazen kondüblülüde yırtık buz kristalleri olarak kriyo-SEM tarafından gözlenen yapay kavitasyonlara neden olur.Bu güncelleştirilmiş prosedür örnekleme prosedüründe artifakı olmadan ksilemin yüksek kaliteli aerotom mikrograflarını elde etmeye odaklanır. Kolayca açıklanamayan bir dizi önemli ayrıntı olduğundan, uygun gösteri çok önemlidir. Aynı zamanda, eğitim almak kolay değildir, çünkü dünya çapında sadece birkaç laboratuvar bu yöntemi uygular.Bu yordamı başlatmak için, bir dal içine ve ksilem arasındaki su potansiyelini dengelemek için siyah bir plastik torba ile örnekleme için yaprakları ve örnekleme iki saatten fazla bırakır. Bir basınç odası kullanarak, örnekten en az iki yaprağın su potansiyelini belirleyin. Su potansiyeli yaklaşık eksi 0,5 megapascal'dan yüksek olduğunda, bir numune dondurulduktan sonra hasat edilebilir.Su potansiyeli eksi 0,5 megapascal'dan daha düşük olduğunda, rahatlama tedavisine devam edin. Su ile doldurulacak kök etrafında bir su geçirmez yaka düzeltmek. Budama makası veya testere kullanarak, su yüzeyinin altındaki sapı kesin ve numunenin kesme ucunu su altında tutun.Kesme ucunu nisasına en aza indirmek için numuneyi mümkün olan en kısa sürede başka bir su kabına aktarın. Geniş türler için, SEM için kriyo numunesinin elde edeceği noktadan hasat sapının kesme kenarına kadar olan uzunluğun, crysoample içinde gerilime bağlı objeleri önlemek için numunenin maksimum damar uzunluğundan daha uzun olduğundan emin olun. Daha sonra, transpirasyonu azaltmak için numuneyi siyah plastik bir torbaile kaplayın.Numunenin kesme ucunu suda tutun ve ksilem gerilimini rahatlatmak için bu durumu yaklaşık 30 dakika koruyun. Bundan sonra, ksilem geriliminin gevşemesini onaylamak için su potansiyelini tekrar ölçün. İlk olarak, su geçirmez bir yakanın bir tarafını kesip açmak için makas veya yardımcı bıçak kullanın.Diyafram açıklığını yatay olarak tutarken, tasmayı yapışkan bantla sapın etrafına sıkıca takın. Yalıtım eldivenleri takın ve sıvı nitrojen damarını güvenli bir şekilde tutun. Tam olana kadar yaka içine sıvı nitrojen çalıştırın ve tamamen ksilem su dondurmak için sürekli ek sıvı nitrojen ekleyerek dolu tutmak.Yeterli donma süresinden sonra, sıvı nitrojeni çıkarmak için yakayı numunenin donmuş kısmından ayırın. Hemen örnek hasat için ince bir el testere kullanın. Daha sonra dondurulmuş numuneyi bir parça alüminyum folyo ile kaplayın veya numune tüpüne geri koyun.Hasat edilen numuneyi sıvı nitrojen dolu bir kap içine hızla yerleştirin. Gözlemi yapmaya hazır olana kadar örnekleri eksi 80 derecede saklayın. Başlamak için, kriyostat numune odasının sıcaklığını eksi 30 santigrat dereceye ayarlayın, ki bu genellikle çoğu bitkinin ksilem özsuyunu donmuş durumda tutacak kadar soğuktur.Numuneyi kriyo-SEM numune tutucusu için ayarlanabilen küçük bir parçaya börmek için keskin bir bıçak veya ince dişli testere kullanın. Kesilmiş parçayı bir chuck'a, bir kriyostat tutucuya, doku dondurucu katıştırma ortamına monte edin. Chuck'ı kriyostat bir mikrotomun numune tutucuya takın.Beş ila yedi mikrometre kalınlığındaki bölümleri tekrar tekrar tıraş ederek yüzeyi kırpın. İlk yüzeye toplam derinliği 1,000 ila 2,000 mikrometreden fazla kesmek, numunenin ön kesimden kaynaklanan hasarlı kısmının elmininatating için yararlıdır. Numunenin yüzeyini kabaca kestikten sonra, mikrotom bıçağının kullanılmayan bir kısmını numunenin yüzeyinin üzerinde ayarlayın.Numunenin yüzeyi ile bıçak arasındaki mesafeyi biraz genişletin. Ve yüzeyi sadece bir ya da iki kez kesin. Daha sonra bıçağı tekrar kaydırın ve bıçağın kullanılmayan bir kısmını numune yüzeyine yerleştirin.Bıçak izi olmadan net bir yüzey elde etmek için bu kesme işlemini 3-4 kez tekrarlayın. Son kesimden sonra, tozun numuneye yapışmasını önlemek için bıçağın konumunu numuneden çok uzak bir şekilde ayarlayın. Ve chuck'ı mikrotomdan ayır.Daha sonra, örneği kriyostat haznesinde doku dondurucu katıştırma ortamına sahip bir kriyo-SEM numune tutucuya takın. İlk olarak, ekipman kullanım kılavuzuna göre kriyo-SEM numune odasında eksi 120 santigrat derecenin altında bir sıcaklık korumak için sıvı nitrojen kullanın. Daha sonra, hazırlanan numune ile numune tutucuyu kriyostat haznesinde sıvı nitrojenle dolu bir yalıtım kabına yerleştirin.Numune tutucuyu sıvı nitrojenin altında tutmak için numune alışverişi çubuğu kullanın. Numune tutucuyu, tahliye öncesi odanın tahliyesine başlar başlamaz kriyo-SEM numune odasının ön tahliye odasına hızla aktarın. Başlamak için, elektrik tabancasının hızlanma gerilimini açın.Daha sonra, numune aşamasının sıcaklığını eksi 100 dereceye yükseltin. Don tozunun temizlenmesi ve ksilem hücrelerindeki buzun yüzey seviyesinin hücre duvarlarına göre biraz düşmesi için birkaç dakika bekleyin. Daha sonra, speiumen sahnesıcaklığını eksi 120 santigrat dereceye düşürün.Bu çalışmada, kriyo-SEM gözlem yöntemleri hücresel ölçekte su dağılımını açıkça görselleştirmek için kullanılmaktadır. Düşük büyütmede, görüntülerdeki siyah alan suyun tamamen veya kısmen kaybolduğu boşlukları gösterirken, gri alan ksilem hücre duvarlarını, sitoplazmayı ve suyu gösterir. Yüksek büyütme de, su tamamen üç tracheids lumina kayıp olmadığı belirgin hale gelir, yerinde ksilem sap makro kabarcıklar oluşumunu gösteren.Geniş-terk türler ile ilgili olarak, kavitasyon oluşumu damarlar içinde kolayca tespit edilir, su varlığı lifler içinde ayırt etmek zor iken, özellikle düşük büyütme. Sitoplazma ve parankim hücreleri buz düzlemi dokular aracılığıyla tracheids veya kaplar içinde sudan ayırt edilebilir. Sıcaklığın donma-gravür işlemi üzerindeki etkisinin analizi, don tozunun kademeli olarak süblimhale geldiğini ve endotracehid pit membranlarının artan sıcaklıkla süblimleşmenin ilerlemesi ile daha net hale geldiğini ortaya koymaktadır.Kalan büyük don tozu parçacıkları daha fazla donma-gravür ile ortadan kaldırılabilir. Ama bu, ksilem kanallarındaki buzun yüzey seviyesini gereksiz yere düşürtteği için sorunlu olabilir. Yüksek kaliteli gözlem, büyük ölçüde doğru numune hazırlama ile elde edilir.Mikrotomun keskin bıçağı ile yüzeyin düzitilmesi özellikle önemlidir. Kullanılmış bir bıçak tarafından yetersiz yumuşatma bazen bıçak işaretleri benzer pürüzlü bir yüzey oluşturabilir, ya da kesikler toz çok sayıda oluşumlar oluşturabilirsiniz. Negatif su sütunu basıncıgevşemeden numune dondurma ksilem kanallarında kavitasyon artifif indüksiyon neden olacaktır.Kümelenmiş buz kristalleri, numunenin rahat olmadığı numune kaplarında görülür. Buna karşılık, benzer su potansiyeline sahip rahat numune örneklerinde kümelenmiş buz kristalleri gözlenmez. Kuraklık çeken transpiring canlı bitkileriçin donma fiksasyon uygulaması kümelenmiş buz kristalleri gibi sonuç tabanlı eserler neden olabilir.Bu eserler ksilem kanalındaki su durumunun yanlış yorumlanmasına yol açar. Bu nedenle, öncelikle donma fiksasyonundan önce numunelerin su potansiyelini doğrulamak önemlidir. Bu yordam, ksilem kanalının durumunun bir görüntüsünü sağlasa da, gözlem için yaşayan bir ağacın yok edilmesi gerekir.MRG veya mikro-BT gibi diğer non-invaziv gözlem yöntemlerinin yan düzey görüntü gözlemiyle birleştirilmesi, su taşıma ve kullanım arasındaki doğa anlayışımızı derinleştirecektir. Bu kağıt tarafından tanıtılan su durumunun gözlemi de hücrelerde karışık su ilişkisi ve abiyotik veya biyotik strese diğer anatomik tepkiler için bir yöntem sağlayacaktır. Cryo-SEM enerji dağılımlı x-ışını spektroskopisi veya üst sim ile donatılmış su içeren bir numunenin yüzeyinde element dağılımı çalışma için kullanılmıştır.Elementanalizi ve bu prosedürü benzer çerçevede birleştirmek bize su durumu ile ilgili ksilem hücre davranışı hakkında derin bilgi verebilir. Bir odada numunelerin dondurulması için sıvı nitrojen kullanırken, oksijen eksikliğini önlemek için odayı havalandırmayı unutmayın.

xylem-water-distribution-woody-plants-visualized-with-cryo-scanning

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Yüksek çözünürlüklü x-ışını bilgisayarlı tomografi (YRBT) 3D bitki damar yapısını ve işlevini incelemek için kullanılabilecek bir tahribatsız tanısal görüntüleme tekniğidir. Biz bitki dokuları ve türlerin geniş bir yelpazesinde ksilem ağlarının keşif nasıl kolaylaştırdığını YRBT göstermektedir.

Bitki damarları ve Üç Boyutlu Yapı ve Fonksiyon Visualize&#39;a Yüksek Çözünürlüklü Bilgisayarlı Tomografi Kullanımı

Bitki hücre duvarı bileşimi doku tipleri arasında farklılık gösterir ve lignin, selüloz, hemiselülozlar ve pektin içerebilir. Hücre tipi düzeyindeki farklılıkları görselleştirmek için çeşitli boyama teknikleri geliştirilmiştir. Bu makale, yaygın olarak kullanılan hücre duvarı boyama tekniklerinin bir derlemesidir.

Histokimyasal boyama<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Ortaöğretim Hücre Duvar Elemanları

Burada, büyüme yapılarının genel değerlendirmesi için ahşap örneklerin nasıl örnekleneceğini özetleyen bir protokol sunuyoruz. İyi çoğaltılmış ve yüksek oranda çözülmüş ahşap anatomik ve dendroekolojik veri seti oluşturmak için gerekli makro ve mikroskobik hazırlama ve görselleştirme teknikleri açıklanır.

Modern Ağaç halkası Araştırma A Teknik Perspektif - Dendroekolojik ve Ahşap Anatomik Zorluklar Üstesinden Nasıl

Burada donarak kırılmış bitki dokularını incelemek için bir prosedürü açıklıyoruz. Yüksek basınçlı donmuş yaprak numuneleri, dondurularak kırılır ve çift katmanlı kaplanır, bu da minimum ışın hasarı ile yüksek büyütmelerde kriyo-taramalı elektron mikroskobu kullanılarak görüntülenen iyi korunmuş donmuş hidratlı numuneler verir.

Cryo-tarama elektron mikroskobu tarafından Freeze-kırık Yaprak Dokular içinde Fotosentez Membranlarının Supramoleküler organizasyonu incelenmesi

Biz x-ışını soğurma kontrast Mısır doku sıradan microcomputed tomografi taramak için uygun geliştirmek için yeni bir yöntem sağlar. CT görüntüleri baz alınarak, biz görüntü işleme iş akışları için etkili bir şekilde Mısır Vaskular demetleri mikroskobik fenotipleri ayıklamak farklı Mısır malzeme bir dizi tanıtmak.

X-ışını Microcomputed tomografi üzerinde dayalı Mısır Vaskular demetleri mikron çaplı fenotipleme teknikleri

Bu protokolü nasıl görüntü yaşamak ve sürgün apikal sürgen confocal mikroskobu tarama lazer kullanarak farklı bitki türü üzerinden analiz sunuyor.

Sürgün apikal sürgen farklı bitki türü üzerinden confocal canlı görüntüleme

Burada, kriyo yumuşak X-ışını tomografisinde (SXT) kriyo-korunmuş hücrelerin ultrayapısını 25 nm yarım perde çözünürlükte görüntülemek için gerekli numune hazırlama ve veri toplama adımlarını açıklayan bir protokol sunulmaktadır.

Cryo Soft X-ray Tomografisi ile Hücrenin 3D Kartografik Açıklaması

Mikro-BT, bitki yapılarını üç boyutlu olarak analiz edebilen tahribatsız bir araçtır. Mevcut protokol, parazitik bitki yapısını ve işlevini analiz etmek için mikro-BT'den yararlanmak için numune hazırlamayı açıklamaktadır. Belirli preparatlarla birleştirildiğinde bu yöntemin avantajlarını vurgulamak için farklı türler kullanılır.

Parazitik bitki-konakçı etkileşimlerini analiz etmek için mikro-BT taramasından yararlanma

Mevcut protokol, Plasmodiophora brassicae tarafından indüklenen safra kesesi histolojik gözlemi için optimize edilmiş bir yöntemi tanımlamaktadır. Hipokotillerin vibratom kesitleri, hastalığın ilerlemesi sırasında transkripsiyon faktörlerinin ve fitohormonların tutulumunu incelemek için floresan görüntülemeden önce temizlenir. Bu protokol, reçine gömme sınırlamalarının üstesinden gelerek floresan proteinlerinin planta görselleştirmesini sağlar.

Gen İfadesindeki Değişiklikleri ve Plasmodiophora brassicae'ye Fizyolojik Yanıtları Görselleştirmek için Temizleme ve Floresan Mikroskopisinin Birleştirilmesi

Burada, bir X-ışını bilgisayarlı tomografi araç zinciri ile ağaç çekirdeklerinin nasıl işleneceğini gösteriyoruz. Bazı amaçlar için kimyasal ekstraksiyon dışında, daha fazla fiziksel laboratuvar tedavisine gerek yoktur. Araç zinciri, biyokütle tahminleri, MXD/ağaç halkası genişliği verilerinin elde edilmesi ve kantitatif ahşap anatomisi verilerinin elde edilmesi için kullanılabilir.

X-ray Bilgisayarlı Tomografi ile Ağaç Çekirdeği Analizi

Öğrenin, odunsu bitkilerde kriyostat ve kriyotaramalı elektron mikroskop kullanarak ksilim su dağılımını yüksek çözünürlüklü görüntüleme yöntemini. Bu teknik, örnekleme sırasında yapay boşluk oluşumunu önleyerek bitki fizyolojisi araştırmalarında güvenilir sonuçlar sağlar.

Cryo-scanning Electron mikroskop ile görselleştirilen Woody bitkilerde xylem su dağılımı

Daha fazla video keşfet