Actinia equina (cnidaria), harmothoe Sp. (Annelida) ve xenoturbella japonica (xenacoelomorpha) Microfocus X-Ray CT (MicroCT) görüntüleme

Burada, üç deniz omurgasız hayvanın microfocus X-ışını bilgisayarlı tomografi (microCT) görüntülenmesi için protokoller ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu çalışmada örnek fiktasyon, boyama, montaj, tarama, görüntü yeniden yapılanma ve veri analizleri gibi adımlar açıklanmaktadır. Protokolün farklı örnekler için nasıl ayarlanacağı konusunda öneriler de sağlanmıştır.

Mikro BT morfolojisindeki çeşitliliknedeniyle deniz omurgasızlarına yaygın olarak uygulanmamıştır. Yöntemimiz, morfolojisine uygun herhangi bir açıda numunelerin kolay montajını sağlar. Su, kil ve tüpler gibi ortak malzemelerle ve varsa uzun bir solucandan yuvarlak topa kadar çeşitli şekillerdeki numunelere yapılabilir.

Prosedürü gösteren Akiteru Maeno, Ulusal Genetik Enstitüsü, Japonya'da bir teknisyen olacaktır. Başlamak için, 250 mililitrelik konik bir şişede 100 mililitre distile su içinde 500 miligram agarose eriterek %0.5 agarose hazırlayın ve şişeyi 800 watt gücünde mikrodalgafırına yerleştirin ve yaklaşık 1-3 dakika ısıtın. Şişeyi oda sıcaklığında soğutun.

A.equina gibi 1000 mikrolitrelik mikropipet mavi ucuna sığmayan büyük numuneleri monte etmek için, lekeli numuneyi ilk olarak yüzeyden aşırı boyama çözeltisini temizlemek için 60 milimetrelik distile su içeren bir tabağa yerleştirin. 50 mililitrelik bir tüpte, kabarcıkyapmadan %0,5 agarose beş mililitre dökün. Agarose sertleştirmek için buz üzerinde tüp yerleştirin.

Daha sonra tüpe 20 mililitre %0.5 agarose ekleyin, agarose sertleşmeye başlayana kadar buzüzerine yerleştirin ve numuneyi agarose'un içine yerleştirmek için terpler kullanın. Numunenin konumunu gövde ekseninin dikey olması için ayarlayın. Buz üzerinde agarose sertleştirmek.

MikroCT montaj aşamasında kil yerleştirin ve kil üzerinde 50 mililitrelik tüp ayarlayın. Harmothoe sp. ve X.japonica gibi 1000 mikrolitrelik mikropipet mavi ucuna sığan küçük numuneleri takmak için, lekeli numuneyi forseps kullanmadan 60 milimetrelik bir tabağa ayırın.

Halka cımbızile, numuneleri yüzeyden aşırı boyama çözeltisini temizlemek için distile suyla dolu 60 milimetrelik başka bir tabağa nazikçe aktarın. Daha sonra, 1000 mikrolitrelik mikropipet mavi ucuna %0,5 agarose 100 mikrolitre çizin ve sertleşmek için buz üzerine yerleştirin. Harmothoe sp.

ucu agarose fişe % 0.5 agarose 1000 mikrolitre ekleyin. Harmothoe sp.'yi 60 milimetrelik çanaktan uçtaki agarose çözeltisine nazikçe aktarmak için ring cımbızını kullanın.

Petiolate iğne veya hassas cımbız ile, chaetae doğal olmayan bükülmüş değildir, böylece Harmothoe sp konumunu ve yönünü ayarlayın. Hiçbir kabarcıklar mevcut olduğundan emin olun ve sonra agarose sertleştirmek için buz üzerine ucu yerleştirin.

X.japonica gibi kırılgan örnekleri işlerken, sertleştirilmiş agarose fişi ile mavi ucuna 1000 mikrolitre distile su eklemek için bir mikropipet kullanın. X.Japonica'yı distile suya yerleştirin, böylece ucun duvarları arasında sabit tir. Daha küçük numuneler için 200 mikrolitrelik mikropipet sarı ucu kullanılabilir.

Bu durumda, fiş için agarose 30 mikrolitre kullanın ve agarose veya distile su 200 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, yeni, 1000 mikrolitrelik mikropipet mavi ucu nu kesin ve takılı ucun ucunu yeni ucuna takın. MikroCT montaj aşamasında kil yerleştirin ve kil üzerinde örnek içinde ipuçları ayarlayın.

Numuneleri monte ettikten hemen sonra, x-ışını ışınını 80 kilovolt ve 100 mikroamda açın. X-ışını iletim görüntüsünü gözlemlerken, x ve z ekseni düğmelerine tıklayarak ve montaj aşamasında y ekseni düğmesini el ile ayarlayarak tüm numunenin görülebileceği şekilde sahneyi hareket ettirin. İç yapıların gözlemlenebilmeleri için görüntünün kontrast koşullarını ayarlayın.

Çamurdaki tüpün açısını değiştirerek numunenin yönünü ayarlayın. Döndürme eksenini 90 dereceye ayarlayarak ve Göreli Hareket düğmesini tıklatarak aşamayı 90 derece döndürün. Tam bir rotasyonu tamamlamak için aynı manevrayı dört kez gerçekleştirin.

Sistem otomatik olarak kapanmadığı sürece, örnek kapı her açıldığında x-ışını ışınını manuel olarak kapatın. Şimdi z ekseni düğmesine tıklayın ve numunegörünümün merkezinde olacak şekilde montaj aşamasını taşımak için y ekseni düğmesini el ile ayarlayın. Sahneyi 90 derece çevirin ve örneği tekrar merkeze ayarlayın.

Aşamayı 90 dereceyi üç kez daha çevirin ve numunenin her yönden görünümün merkezinde olduğundan emin olmak için gerektiği gibi ayarlayın. Ardından, x ekseni boyunca sahneyi x-ışını kaynağına doğru hareket ettirip örneği büyütmek için x ekseni düğmesine tıklayın ve görünümün görünümüne sığacak şekilde gerektiği gibi ayarlayın. Sahneyi çevirin ve numunenin her yönden görünüme uyduğundan emin olmak için gerektiği gibi ayarlayın.

Tarama koşullarını ayarlayın ve ardından taramaya başlayın. Bu deneyde% 25 Lugol çözeltisi ile boyama sonra Actinia ekina, Harmothoe sp. ve Xenoturbella japonica üzerinde mikroCT görüntüleme yapıldı.

Boyama başarıyla tüm örneklerde iç yapıların kontrast geliştirilmiş, iç yumuşak dokuların gözlemler sağlayan. Bu yöntem, x.japonica örneğinden de görülebileceği gibi, dış hasarlı kırılgan numuneler için de geçerlidir. Harmothoe sp için bütün bir numunenin tek bir yüksek çözünürlüklü veri seti yeniden oluşturuldu.

ve X.japonica, numunenin farklı ama çakışan kısımlarında yapılan birden fazla taramadan elde edilmiştir. Numuneyi tüpe veya uca ayarladıklarından ve tarama sırasında hareket etmesin diye tüpü veya ucu mikroCT'ye monte edin. Bu yordamdan elde edilen veriler, araştırmacının numunenin hem iç hem de dış morfolojisini tam olarak anlamasını sağlayan 3-B görüntü rekonstrüksiyonları için kullanılabilir.

Tüm microCT sistemleri x-ışınları kullanır, ancak özellikleri bir sistemden diğerine farklı olabilir, bu nedenle her sistemin talimatlarına yakından uyduğunuzdan emin olun.