Name: Actinia equina (cnidaria), harmothoe Sp. (Annelida) ve xenoturbella japonica (xenacoelomorpha) Microfocus X-Ray CT (MicroCT) görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Öğrenin, deniz omurgasızlarının morfolojik çeşitliliğini incelemek için microCT görüntüleme protokolünü. Actinia equina, Harmothoe sp. ve Xenoturbella japonica örneklerinde iç yapıların 3D analizi için esnek montaj tekniklerini keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Toshihiko Shiroishi 'ye yardım için ve bu çalışmada araştırma ortamının sağlanması için teşekkür etmek istiyoruz. Biz bir. equinatavsiye Için Kensuke Yanagi ve Takato Izumi için minnettar ve harmothoe Sp. numune üzerinde tavsiye için masaatsu Tanaka. Shimoda Marine Research Center, Tsukuba Üniversitesi ve Misaki Marine biyolojik Istasyonu, Tokyo Üniversitesi 'nde, örnek koleksiyonlarında yardım almak için personele teşekkür etmek istiyoruz. Biz Ingilizce dil düzenleme için Editage (www.editage.jp) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, genç bilim adamları için JSPS Grant-ın-Aid (A) (JP26711022) ile HN ve JAMBıO, Japon Deniz Biyolojisi Derneği tarafından destekleniyordu.

1. sabitleme
<ol><li>Actinia equinaiçin, oda sıcaklığında yaklaşık 15 dakika için% 10 MgCl2 deniz suyu içinde hayvanları rahatlayın. Transfer 70% etanol ve oda sıcaklığında mağaza.</li>
	<li>Harmothoe SP için, yaklaşık 15 dakika boyunca buz-soğuk deniz suyuna yerleştirerek hayvanları anestezize. deniz suyuyla% 10 (v/v) formalin çözeltisi ile Oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>Xenoturbella japonicaiçin, tatlısu içinde% 7 MgCl2 kullanarak hayvanı rahatlayın. Filtrelenmiş deniz suyunda% 4 civarında formaldehite (PFA) bir gecede düzeltin. 4 °C% 70 etanol ve mağaza yerleştirin. DIKKAT: PFA tehlikelidir ve dikkatle ele alınmalıdır.</li>
</ol>2. boyama
<ol><li>Örnekleri transfer% 50 Etanol ve oda sıcaklığında mağaza için 15 h.% 25 etanol ile% 50 Etanol ve oda sıcaklığında 2 h için mağaza değiştirin. Not: Bu, Harmothoe Sp. numune için deniz suyu ile% 10 (v/v) formalin çözeltisi için gerekli değildir.</li>
	<li>Solüsyonu distile su (DW) ile değiştirin ve DW 'deki numuneleri 2 saat boyunca oda sıcaklığında saklayın. bu adımı üç kez tekrarlayın.</li>
	<li>Hazırlama 25% Lugol çözüm (aşağıda)% 25 DW ile stok solüsyonu seyreltilerek. Stok çözümü (100% Lugol solüsyonu), DW ile 100 mL 'ye ayarlanmış 10 g ı ve 5 g ı2içerir. Not: Lugol solüsyonu ışığa duyarlıdır, bu nedenle ışıktan korunan çözümü saklayın ve ele alın. İyot elleçleme ve atık imha için her ülke ve kurum yönetmeliklerine uyun.</li>
	<li>DW örneklerden decant ve% 25 Lugol çözüm dökün. Oda sıcaklığında 24 saat için leke.</li>
</ol>3. aşama montajı
<ol><li>Hazırlamak 0,5% agaroz tarafından çözülerek 500 mg agaroz içinde 100 ml DW bir mikrodalga içinde bir 250 ml konik Flask (800 W, yaklaşık 1-3 dk). Oda sıcaklığında tutarak yaklaşık 30-40 °C ' ye kadar serin. Dikkat: agaroz 'nin kaynatılmasına engel olmak için ısıtırken Flask 'ın aşırı ısınması veya tamamen mühürlenmesi gerekmez.</li>
	<li>50 mL tüp kullanarak a. equina gibi büyük örnekleri bağlayın. Not: 50 mL tüpler, bir 1.000 μL micropipet ' mavi ' ucu sığmayan büyük örnekleri montaj için kullanın.<ol>
<li>Yüzeyden aşırı boyama çözeltisi yıkamak için DW ile bir 60-mm çanak lekeli örnek yerleştirin.</li>
		<li>Hafifçe 50 ml tüp içine% 0,5 agaroz 5 ml dökün ve buzda agaroz sertleşmesine. Agarose kabarcıkları yapmak için dikkatli olun.</li>
		<li>Yavaşça 50 ml tüp için 0,5% agaroz 20 ml ekleyin ve agaroz sertleşmeye başlar kadar buz üzerine yerleştirin. Numuneyi forseps kullanarak% 0,5 agaroz içine yerleştirin. Agarose kabarcıkları yapmak için dikkatli olun.</li>
		<li>Numunenin konumunu ve yönünü forseps ile ayarlayın ve buzda agaroz 'ı sertleştir.</li>
		<li>Mikroct montaj aşamasında kil yerleştirin ve kil üzerinde 50 mL tüp ayarlayın (Şekil 2A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.000 μL micropipet ' Blue ' ucu kullanarak Harmothoe Sp. ve X. japonica gibi küçük örnekleri monte edin. Not: küçük örnekler Için 200 μL mikropipet ' sarı ' ucu kullanılabilir. Bu durumda, fiş için 30 μL agaroz kullanın ve 200 μL agaroz veya distile su ekleyin.<ol>
<li>1.000 μL micropipet ' Blue ' ucuyla% 0,5 agaroz 100 μL çekin ve ucu buz üzerine tutarak agaroz 'i sertleştir (Şekil 2B-a).</li>
		<li>Forseps kullanmadan bir 60-mm çanak içine lekeli numune decant.</li>
		<li>Hafifçe yüzey dan aşırı boyama solüsyonu yıkamak için DW ile başka bir 60-mm çanak içine halka Cımbız kullanarak örnek aktarın.</li>
		<li>0,5% agaroz ya da DW 1.000 μL, bir mikropipet kullanarak takılı ucu (adım 3.3.1) içine ekleyin. Not:% 0,5 agaroz kullanımı önerilir, ancak agaroz kaçınılmalıdır kırılgan veya değerli örnekler için DW kullanın.</li>
		<li>Örnek olarak 60-mm çanak gelen numuneyi, halka Cımbız kullanarak takılı ucunun agaroz veya DW 'ye hafifçe aktarın.</li>
		<li>Numunenin konumunu ve yönünü, petiolat iğne veya hassas cımbız ile nazikçe ayarlayın. Montaj ortamında kabarcıklar yapmak için dikkatli olun. DW montaj ortamı olarak kullanıldığında, numunenin ucunun duvarları arasında kararlı olduğundan emin olun (Şekil 2D-b). Montaj ortamı olarak kullanılırsa agaroz 'ı Sertleşmek için ucu buzun üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Yeni 1.000 μL micropipet ' Blue ' ucu (Şekil 2b-b, c) ve takılı ucunun ucunu yeni ucun içine takın.</li>
		<li>Mikroct montaj aşamasında kil yerleştirin ve kil (Şekil 2C, D) içinde numune ile ipuçları ayarlayın. Not: boyama çözümü DW yerleştirilir kez örnek yıkamak başlar, bu yüzden hemen bir sonraki tarama adıma geçin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. MicroCT tarama
<ol><li>80 kV, 100 μA cinsinden X-ışını ışını açın.</li>
	<li>Ekran merkezinde X-ışını iletim görüntüsünü gözlemlerken (Şekil 3a), tüm numunenin x ve Z ekseni düğmelerini (Şekil 3a) tıklayarak görülebilmesi için sahne alanı hareket ettirin ve el ile montaj aşamasında Y ekseni düğmesini ayarlayın (Şekil 3B). Kontrast koşullarını ayarlayarak iç yapıların izlenebilmek için görüntünün karşıtlığını ayarlayın (Şekil 3A: görüntü kontrastı).</li>
	<li>Kil içindeki tüp/uç açısını değiştirerek numunenin yönünü ayarlayın (Şekil 2a). Rotasyon eksenini (Şekil 3a) 90 ve göreli hareket düğmesine tıklayarak aşama 90 ° döndürün (Şekil 3a). Tam rotasyonu tamamlamak için aynı manevrası dört kez gerçekleştirin. Not: sistem otomatik olarak kapatmadığı sürece, örnek kapı her açıldığında X ışını ışınını El Ile kapatın.</li>
	<li>Örnek, Z ekseni düğmesine (Şekil 3A) tıklayarak ve montaj aşamasında Y ekseni düğmesini elle ayarlayarak (Şekil 3B) görünümün ortasında olması için aşamayı taşıyın. 90 ° tarafından sahne çevirin ve aynı şeyi. Aşama 360 ° çevirin ve örnek tüm yönlerden görünümün merkezinde olup olmadığını kontrol edin.</li>
	<li>X ekseninin üzerine doğru x ekseni düğmesine tıklayarak (Şekil 3A), numuneyi büyütmek ve sadece görünüme sığar (Şekil 3C) için gerektiği gibi ayarlamak için sahne alanı 'nı x-ışın ışını kaynağına yöneltir.</li>
	<li>Aşama 360 ° çevirin ve örnek tüm yönlerden görünüme sığar böylece gerektiği gibi ayarlayın.</li>
	<li>Tablo 1' de gösterildiği gibi tarama koşullarını ayarlayın.</li>
	<li>Taramayı Başlat; yaklaşık 10 dakika sürer.</li>
</ol>5. görüntü yeniden yapılanma
<ol><li>MicroCT sisteminin aksesuar yazılımını başlatın ( malzeme tablosunabakın) ve taranan verileri açın.</li>
	<li>Otomatik vardiya değeri hesaplama düğmesine tıklayarak tarama sırasında numunenin döndürme eksenindeki farklılıkları ayarlayın (Şekil 4A: yeşil kutu).</li>
	<li>Turuncu okları çevirerek görüntünün yönünü ayarlayın (Şekil 4B). Oryantasyon değiştirilmişse, 5,2 adımını yineleyin.</li>
	<li>Alan sekmesine tıklayın (Şekil 4c: Macenta kutusu) ve numunelerin mevcut olmadığı alanları kırpın (Şekil 4c: sarı kutu).</li>
	<li>Yeniden yapılandırma sekmesine tıklayın (Şekil 4D: kırmızı kutu) ve gürültüyü kaldırmak için filtreleri aşağıdaki gibi ayarlayın. Ring artifakı azaltma filtresi: Median filtre-3; Gürültü eliminasyon filtresi: ortalama filtre-1.</li>
	<li>Yeniden yapılandırma düğmesine tıklayarak yeniden yapılandırma gerçekleştirin (Şekil 4D: yeşil kutu).</li>
	<li>Siyah ve beyaz değerleri siyah değer 0, beyaz değer 250 (Şekil 4D: mavi kutu) olarak ayarlayarak görüntü parlaklığını ve kontrastı ayarlayın.</li>
	<li>Yeniden oluşturulan TIFF görüntü veri kümesini, Kaydet düğmesini tıklatarak 8 bit TIFF olarak kaydedin. TIFF dosyalarını aşağıdaki gibi yeniden adlandırın: Date_sample_resolution (μm) _number. TIFF. Not: Bu çalışmada orijinal microCT veri kümeleri Figshare deposunda mevcuttur, doi: 10.6084/M9. figshare. 767083736.</li>
</ol>6. veri analizleri
<ol><li>Veri çözümleme yazılımını başlatın ( malzeme tablosunabakın) ve VERITABANı simgesine tıklayarak TIFF dosyalarının alınmasını etkinleştirin (Şekil 5A: kırmızı kutu) ve Şekil 5B'de gösterilen kutuyu kapatın.</li>
	<li>İçe aktar simgesine tıklayın (Şekil 5C: kırmızı kutu), Bölüm 5 ' te kaydedilmiş veri kümesini seçin ve Aç'ı tıklatın.</li>
	<li>Bağlantıları Kopyala düğmesine tıklayın (Şekil 5D) verileri almak için.</li>
	<li>2B Görüntüleyici simgesine tıklayarak 2D kesit görüntüsünü görüntüleyin (Şekil 5C: mavi kutu).</li>
	<li>3B görüntüleyici sekmesine tıklayarak veri kümesini kalibre edin (Şekil 5E: kırmızı kutu) ve tarama sırasında çözünürlük değerini girerek (Bu çalışmada 0,018 oldu [Şekil 5F]).</li>
	<li>Parlaklık/kontrast simgesine tıklayın (Şekil 5E yeşil kutu). İmleci görüntülenen 2B görüntünün içine taşıyarak ve pencere seviyesini ve pencere genişliğini değiştirerek parlaklığı ve kontrastı ayarlayın (Şekil 5G).</li>
	<li>Kaydırma çubuğunu taşıyarak diğer kesit görüntülerini kontrol edin (Şekil 5G: kutu).</li>
	<li>Oryantasyon simgesine tıklayarak kesit yönünü değiştirin (Şekil 5E: mavi kutu) ve tüm oryantasyonlarda görüntüleri kontrol edin (Şekil 5H).</li>
	<li>Görüntülenen görüntüyü tıklatın ve çapraz kesit görüntülerini depolamak için dışa aktarma sekmesini seçin.</li>
</ol>

<ol><li>Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li>
<li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution%3A+toward+organism-level+systems+biology+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).</li>
<li>Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+of+fixed+tissue%3A+a+review+from+a+microscopist%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 081205(2016).</li>
<li>Greenbaum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+CLARITY%3A+clearing%2C+imaging%2C+and+computational+analysis+of+osteoprogenitors+within+intact+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bone CLARITY: clearing, imaging, and computational analysis of osteoprogenitors within intact bone marrow.</a> Science Translational Medicine. 9, (2017).</li>
<li>Konno, A., Okazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous-based+tissue+clearing+in+crustaceans%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Letters%22%5BJournal%5D)">Aqueous-based tissue clearing in crustaceans.</a> Zoological Letters. 4, 13(2018).</li>
<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+for+comparative+morphology%3A+simple+staining+methods+allow+high-contrast+3D+imaging+of+diverse+non-mineralized+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiology%22%5BJournal%5D)">MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues.</a> BMC Physiology. 9, 11(2009).</li>
<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+for+developmental+biology%3A+a+versatile+tool+for+high-contrast+3D+imaging+at+histological+resolutions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions.</a> Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).</li>
<li>Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+3D+phenotyping+of+cardiovascular+development+in+mouse+embryos+by+micro-CT+with+iodine+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Cardiovascular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining.</a> Circulation Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).</li>
<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+microtomographic+imaging+of+intact+vertebrate+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">X-ray microtomographic imaging of intact vertebrate embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 12, 1462-1471 (2011).</li>
<li>Boistel, R., Swoger, J., Kržič, U., Fernandez, V., Gillet, B., Reynaud, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+three-dimensional+microscopic+imaging+in+marine+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology%22%5BJournal%5D)">The future of three-dimensional microscopic imaging in marine biology.</a> Marine Ecology. 32, 438-452 (2011).</li>
<li>Mizutani, R., Suzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+microtomography+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">X-ray microtomography in biology.</a> Micron. 43, 104-115 (2012).</li>
<li>Merkle, A. P., Gelb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ascent+of+3D+X-ray+microscopy+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Today%22%5BJournal%5D)">The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory.</a> Microscopy Today. 21, 10-15 (2013).</li>
<li>Ziegler, A., Menze, B. H. Accelerated acquisition, visualization, and analysis of zooanatomical data. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZiegler%2C+A+%22Computation+for+humanity.+Information+technology+to+advance+society%22">Computation for humanity. Information technology to advance society</a>. Zander, J., Mosterman, P. J. , CRC Press. Boca Raton, USA. 233-260 (2013).</li>
<li>Gignac, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusible+iodine-based+contrast-enhanced+computed+tomography+%28diceCT%29%3A+an+emerging+tool+for+rapid%2C+high-resolution%2C+3-D+imaging+of+metazoan+soft+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues.</a> Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).</li>
<li>du Plessis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., le Roux, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+x-ray+micro-computed+tomography%3A+a+user+guideline+for+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22GigaScience%22%5BJournal%5D)">Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples.</a> GigaScience. 6 (6), 1-11 (2017).</li>
<li>Faulwetter, S., Vasileiadou, A., Kouratoras, M., Dailianis, T., Arvanitidis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-computed+tomography%3A+Introducing+new+dimensions+in+taxonomy%5BTitle%5D)+AND+%22ZooKeys%22%5BJournal%5D)">Micro-computed tomography: Introducing new dimensions in taxonomy.</a> ZooKeys. 263, 1-45 (2013).</li>
<li>Staedler, Y. M., Masson, D., Schonenberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+tissues+in+3D+via+X-ray+tomography%3A+simple+contrasting+methods+allow+high+resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging.</a> PLoS One. 8 (9), 75295(2013).</li>
<li>Fernández, R., Kvist, S., Lenihan, J., Giribet, G., Ziegler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sine+Systemate+Chaos%3F+A+Versatile+Tool+for+Earthworm+Taxonomy%3A+Non-Destructive+Imaging+of+Freshly+Fixed+and+Museum+Specimens+Using+Micro-Computed+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sine Systemate Chaos? A Versatile Tool for Earthworm Taxonomy: Non-Destructive Imaging of Freshly Fixed and Museum Specimens Using Micro-Computed Tomography.</a> PLoS One. 9 (5), 96617(2014).</li>
<li>Paterson, G. L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+using+micro-computed+tomography+in+gross+and+microanatomical+assessments+of+polychaetous+annelids%5BTitle%5D)+AND+%22Memoirs+of+Museum+Victoria%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of using micro-computed tomography in gross and microanatomical assessments of polychaetous annelids.</a> Memoirs of Museum Victoria. 71, 237-246 (2014).</li>
<li>Faulwetter, S., Dailianis, T., Vasileiadou, K., Kouratoras, M., Arvanitidis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+micro-CT+become+an+essential+tool+for+the+21st+century+taxonomist%3F+An+evaluation+using+marine+polychaetes%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">Can micro-CT become an essential tool for the 21st century taxonomist? An evaluation using marine polychaetes.</a> Microscopy and Analysis. 28, 9-11 (2014).</li>
<li>Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+and+limitations+of+X-ray+micro-computed+tomography+in+arthropod+neuroanatomy%3A+a+methodological+and+comparative+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Potential and limitations of X-ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey.</a> Journal of Comparative Neurology. 523, 1281-1295 (2015).</li>
<li>Landschoff, J., Plessis, A., Griffiths, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dataset+describing+brooding+in+three+species+of+South+African+brittle+stars%2C+comprising+seven+high-resolution%2C+micro+X-ray+computed+tomography+scans%5BTitle%5D)+AND+%22GigaScience%22%5BJournal%5D)">A dataset describing brooding in three species of South African brittle stars, comprising seven high-resolution, micro X-ray computed tomography scans.</a> GigaScience. 4 (1), 52(2015).</li>
<li>Keiler, J., Richter, S., Wirkner, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomy+of+the+king+crab+Hapalogaster+mertensii+Brandt%2C+1850+%28Anomura%3A+Paguroidea%3A+Hapalogastridae%29+-+new+insights+into+the+evolutionary+transformation+of+hermit+crabs+into+king+crabs%5BTitle%5D)+AND+%22Contributions+to+Zoology%22%5BJournal%5D)">The anatomy of the king crab Hapalogaster mertensii Brandt, 1850 (Anomura: Paguroidea: Hapalogastridae) - new insights into the evolutionary transformation of hermit crabs into king crabs.</a> Contributions to Zoology. 84 (2), 149-165 (2015).</li>
<li>Holst, S., Michalik, P., Noske, M., Krieger, J., Sötje, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+X-ray+micro-computed+tomography+for+soft-bodied+and+gelatinous+cnidarians+with+emphasis+on+scyphozoan+and+cubozoan+statoliths%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plankton+Research%22%5BJournal%5D)">Potential of X-ray micro-computed tomography for soft-bodied and gelatinous cnidarians with emphasis on scyphozoan and cubozoan statoliths.</a> Journal of Plankton Research. 38, 1225-1242 (2016).</li>
<li>Moles, J., Wägele, H., Ballesteros, M., Pujals, Á, Uhl, G., Avila, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+End+of+the+Cold+Loneliness%3A+3D+Comparison+between+Doto+antarctica+and+a+New+Sympatric+Species+of+Doto+%28Heterobranchia%3A+Nudibranchia%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The End of the Cold Loneliness: 3D Comparison between Doto antarctica and a New Sympatric Species of Doto (Heterobranchia: Nudibranchia).</a> PLoS One. 11 (7), 0157941(2016).</li>
<li>Nakano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+species+of+Xenoturbella+from+the+western+Pacific+Ocean+and+the+evolution+of+Xenoturbella%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella.</a> BMC Evolutionary Biology. 17, 245(2017).</li>
<li>Tsuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KNOTTED1+Cofactors%2C+BLH12+and+BLH14%2C+Regulate+Internode+Patterning+and+Vein+Anastomosis+in+Maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">KNOTTED1 Cofactors, BLH12 and BLH14, Regulate Internode Patterning and Vein Anastomosis in Maize.</a> Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).</li>
<li>Parapar, J., Candás, M., Cunha-Veira, X., Moreira, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+annelid+anatomy+using+micro-computed+tomography%3A+A+taxonomic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Zoologischer+Anzeiger%22%5BJournal%5D)">Exploring annelid anatomy using micro-computed tomography: A taxonomic approach.</a> Zoologischer Anzeiger. 270, 19-42 (2017).</li>
<li>Akkari, N., Ganske, A. S., Komerički, A., Metscher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+avatars+for+Myriapods%3A+Complete+3D+morphology+of+type+specimens+transcends+conventional+species+description+%28Myriapoda%2C+Chilopoda%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">New avatars for Myriapods: Complete 3D morphology of type specimens transcends conventional species description (Myriapoda, Chilopoda).</a> PLoS One. 13 (7), 0200158(2018).</li>
<li>Gusmao, L. C., Grajales, A., Rodriguez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+anemones+through+X-rays%3A+visualization+of+two+species+of+Diadumene+%28Cnidaria%2C+Actiniaria%29+using+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22American+Museum+Novitates%22%5BJournal%5D)">Sea anemones through X-rays: visualization of two species of Diadumene (Cnidaria, Actiniaria) using micro-CT.</a> American Museum Novitates. 3907, (2018).</li>
<li>Landschoff, J., Komai, T., du Plessis, A., Gouws, G., Griffiths, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+imaging+applied+to+description+of+a+new+species+of+Pagurus+Fabricius%2C+1775+%28Crustacea%3A+Decapoda%3A+Anomura%3A+Paguridae%29%2C+with+selection+of+three-dimensional+type+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroCT imaging applied to description of a new species of Pagurus Fabricius, 1775 (Crustacea: Decapoda: Anomura: Paguridae), with selection of three-dimensional type data.</a> PLoS One. 13 (9), 0203107(2018).</li>
<li>Machado, F. M., Passos, F. D., Giribet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+micro-computed+tomography+as+a+minimally+invasive+tool+for+anatomical+study+of+bivalves+%28Mollusca%3A+Bivalvia%29%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Journal+of+the+Linnean+Society%22%5BJournal%5D)">The use of micro-computed tomography as a minimally invasive tool for anatomical study of bivalves (Mollusca: Bivalvia).</a> Zoological Journal of the Linnean Society. , (2018).</li>
<li>Sasaki, T., et al. 3D visualization of calcified and non-calcified molluscan tissues using computed tomography. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSasaki%2C+T+%22Biomineralization%22">Biomineralization</a>. Endo, K., Kogure, T., Nagasawa, H. , Springer. Singapore. 83-93 (2018).</li>
<li>Maeno, A., Tsuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-computed+Tomography+to+Visualize+Vascular+Networks+in+Maize+Stems%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Micro-computed Tomography to Visualize Vascular Networks in Maize Stems.</a> Bio-protocol. 8 (1), 2682(2018).</li>
<li>Nakano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+to%3A+A+new+species+of+Xenoturbella+from+the+western+Pacific+Ocean+and+the+evolution+of+Xenoturbella%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Correction to: A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella.</a> BMC Evolutionary Biology. 18, 83(2018).</li>
<li>Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+files+from+%27Microfocus+X-ray+computed+tomography+%28microCT%29+imaging+of+Actinia+equina+%28Cnidaria%29%2C+Harmothoe+sp.+%28Annelida%29%2C+and+Xenoturbella+japonica+%28Xenacoelomorpha%29%27%5BTitle%5D)+AND+%22figshare%22%5BJournal%5D)">MicroCT files from 'Microfocus X-ray computed tomography (microCT) imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)'.</a> figshare. , (2019).</li>
<li>Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration-dependent+specimen+shrinkage+in+iodine-enhanced+microCT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT.</a> Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).</li>
<li>Buytaert, J., Goyens, J., De Greef, D., Aerts, P., Dirckx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+shrinkage+of+bone%2C+brain+and+muscle+tissue+in+sample+preparation+for+micro-CT+and+light+sheet+fluorescence+microscopy+%28LSFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Volume shrinkage of bone, brain and muscle tissue in sample preparation for micro-CT and light sheet fluorescence microscopy (LSFM).</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1208-1217 (2014).</li>
<li>Sasov, A., Liu, X., Salmon, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensation+of+mechanical+inaccuracies+in+micro-CT+and+nano-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+SPIE%22%5BJournal%5D)">Compensation of mechanical inaccuracies in micro-CT and nano-CT.</a> Proceedings of SPIE. 7078, 70781(2008).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Bu çalışmada kullanılan deniz suyunda% 10 (v/v) formalin çözeltisi gibi formalin kullanan fixatives, çeşitli deniz omurgasınları morfolojisi korumak için bilinen ve genellikle MicroCT görüntüleme için kullanılan18,24,25 ,26,28,30,33. Ancak, bu kimyasalların kullanımı üzerindeki kısıtlamalar...

Biyolojik araştırmacılar genellikle ince bölümler yapmak ve opak organizmaların iç yapılarını araştırmak için ışık veya elektron mikroskobu ile gözlem yapmak zorunda kaldılar. Ancak bu yöntemler nadir veya değerli örneklere uygulandığında yıkıcı ve sorunlu olmaktadır. Ayrıca, katıştırma ve bölümleme gibi yöntemdeki birkaç adım zaman alıcı ve protokole bağlı olarak bir örnek gözlemlemek için birkaç gün sürebilir. Dahası, çok sayıda bölümlerin işlenirken, her zaman zarar veya bazı bölümler kaybetme olasılığı vardır. Doku Temizleme teknikleri bazı numuneler için kullanılabilir1,2,3,4,5 ama henüz birçok hayvan türleri için geçerli değildir.
Bu sorunların üstesinden gelmek için bazı biyologlar microfocus X-Ray bilgisayarlı tomografi (MicroCT) görüntüleme6,7,8,9,10,11, kullanarak başladı 12,13,14,15. X-Ray CT 'de, numunenin etrafında hareket eden bir X-ışını kaynağından oluşturulan çeşitli açılardan X-ışınları ile radyasyon ışınlanmış ve iletilen X-ışınları da örnek etrafında hareket eden bir dedektör tarafından izlenir. Elde edilen X-ışını iletim verisi, numunenin çapraz kesit görüntülerini yeniden inşa etmek için analiz edilir. Bu yöntem, örnek imha olmadan iç yapıları gözlem sağlar. Onun güvenliği ve kolaylığı nedeniyle, yaygın tıbbi ve diş uygulamalarında kullanılır, ve CT sistemleri hastane ve diş merkezlerinde dünya çapında bulunabilir. Ayrıca endüstriyel X-Ray CT, endüstriyel alanda muayene ve Metroloji için tıbbi olmayan numuneleri gözlemlemek için sıklıkla kullanılır. X-Ray kaynağının ve dedektörlerin mobil olduğu tıbbi CT 'nin aksine, iki parça endüstriyel CT 'de sabitlenir, örneğin tarama sırasında döner. Endüstriyel CT genellikle tıbbi CT 'den daha yüksek çözünürlüklü görüntüler üretir ve microCT (mikrometre düzeyinde çözünürlük) veya Naneki (nanometre seviyesi çözünürlüğü) olarak adlandırılır. Son zamanlarda, mikroct kullanarak araştırma hızla biyoloji çeşitli alanlarda arttı14,15,16,17,18,19, 20 tane , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ' dan fazla , 31 , 32 , 33 , 34.
CT kullanan biyolojik çalışmalar, esas olarak kemik gibi sert dokudan oluşan iç yapıları hedefleyen. Çeşitli kimyasal maddeleri kullanarak boyama tekniklerindeki gelişmeler çeşitli organizmalarda yumuşak dokularda görselleştirmeyi sağladı6,7,8,9,14,15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 tane , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ' dan fazla , 31 , 32 , 33 , 34. bu reaktiflerin, iyot bazlı kontrast maddeleri nispeten güvenli, ucuz ve çeşitli organizmalarda yumuşak dokularda görselleştirme için kullanılabilir7,14. Deniz omurgasızlar ile ilgili olarak, MicroCT yaygın olarak yumuşakçalar gibi hayvanlar üzerinde kullanılmıştır6,25,32,33, annelids18,19, 20 tane , 28ve arthoropods21,23,29,31. Ancak, diğer hayvan phyla hakkında birkaç rapor olmuştur, bryozoalar6gibi, xenacoelomorphs26, ve cnidarians24,30. Genel olarak, Mikroct kullanarak daha az çalışma olmuştur deniz omurgasızlar üzerinde bu omurgalarından daha. Deniz omurgasızlar bu sınırlı kullanım için büyük bir nedeni bu hayvanların gözlenen büyük çeşitlilik olduğunu. Çeşitli boyutları, morfolojileri ve fizyolojik nedeniyle, her tür farklı deneysel prosedürler için değişik tepki verir. Bu nedenle, en uygun sabitleme ve boyama reakajını seçmek için numune hazırlama sırasında ve her tür için ayarlanan her adımda koşulları ayarlamak için çok önemlidir. Benzer şekilde, her örnek için uygun şekilde montaj yöntemi, voltaj, akım, mekanik Büyüteç hızı ve boşluk çözünürlüğü gücü gibi tarama konfigürasyonlarını ayarlamak da gereklidir. Bu sorunun üstesinden gelmek için, gerekli tüm adımları kapsayan basit ve anlaşılabilir bir manuel, her bir adımın örneğe bağlı olarak nasıl ayarlanacağını açıklıyor ve birden fazla örnekten ayrıntılı örnekler esastır.
Bu çalışmada, üç deniz omurgasız türler kullanarak numune sabitleme veri analizinden, Mikroct görüntüleme Protokolü adım adım açıklanmaktadır. Deniz anemon Actinia equina (anthozoa, Cnidaria) örnekleri Tokyo Üniversitesi Misaki deniz biyolojik İstasyonu yakınında toplandı. Bunlar yaklaşık 2 cm çapında (Şekil 1a-C) küresel, yumuşak bir gövdeye sahipti. Harmothoe Sp. (Polychaeta, annelida) örnekleri de Misaki Marine biyolojik İstasyonu yakınında toplandı. Onlar yaklaşık 1,5 cm uzunluğunda olan ince solucanlar vardı, sert chaetae tüm vücut boyunca mevcut ile (Şekil 1D). A Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) NUMUNESI, 13. Jambıo kıyı organizması ortak araştırması sırasında Tsukuba Üniversitesi Shimoda deniz araştırma merkezi yakınlarında toplandı. Bu yaklaşık 0,8 cm uzunluğunda bir yumuşak gövdeli solucan oldu (Şekil 1E). Her numunenin koşullar ve konfigürasyonları için yapılan ayarlamalar ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bizim çalışma nasıl deniz omurgasızlar üzerinde microCT görüntüleme gerçekleştirmek için çeşitli öneriler sağlar, ve biz onun araştırma için bu protokol kullanmak için biyologlar ilham olacağını umuyoruz.

<table><tbody><tr><td>250 ml Erlenmeyer şişesi</td><td>Corning</td><td>CLS430183</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Numune alma tüpü ST-500</td><td>BIO-BIK</td><td>103010</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Polipropilen tüp</td><td>Greiner Bio One International</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>60 mm İşlenmemiş Çanak</td><td>IWAKI</td><td>1010-060</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>Ekolojik sınıf uç (mavi) 1000 ve mikro; l</td><td>BMBio</td><td>BIO1000RF</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Wako Saf Kimya Endüstrileri</td><td>057-00451</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Wako Saf Kimya Endüstrileri</td><td>061-00416</td><td></td></tr><tr><td>İyot</td><td>Wako Saf Kimya Endüstrileri</td><td>094-05421</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür heksahidrat</td><td>Wako Saf Kimya Endüstrileri</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>OsiriX DICOM Görüntüleyici</td><td>Pixmeo SARL</td><td>OsiriX MD v10.0</td><td>https://www.osirix-viewer.com</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Wako Saf Kimya Endüstrileri</td><td>163-25983</td><td></td></tr><tr><td>Saplı iğne</td><td>AS ONE</td><td>2-013-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P200 Mikropipet</td><td>GILSON</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P1000 Mikropipet</td><td>GILSON</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum iyodür</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>166-03971</td><td></td></tr><tr><td>Hassas cımbız 5</td><td>DUMONT</td><td>0302-5-PS</td><td></td></tr><tr><td>QuickRack MultI fit uç (sarı) 200 ul</td><td>Sorenson</td><td>10660</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş bıçakları</td><td>Tüy</td><td>FA-10</td><td></td></tr><tr><td>Halka cımbız</td><td>NAPOX</td><td>A-26</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskopik mikroskop</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>X-ışını Mikro-CT görüntüleme sistemi</td><td>Comscantechno</td><td>ScanXmate-E090S105</td><td></td></tr></tbody></table>

actinia equina (cnidaria), harmothoe sp. (annelida) ve xenoturbella japonica (xenacoelomorpha) microfocus x-ray ct (microct) görüntüleme

Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Geleneksel olarak, biyologlar opak organizmaların iç yapılarını araştırmak için kesitleme gibi yıkıcı yöntemlerle güvenmek zorunda kaldılar. Tahribatsız microfocus X-Ray bilgisayarlı tomografi (microCT) görüntüleme, Mikroct donanımında örnek boyama yöntemleri ve yenilikleri, bilgisayar işleme ve veri teknolojisinde teknolojik gelişmeler nedeniyle biyoloji alanında güçlü ve gelişmekte olan bir protokol haline gelmiştir. analiz yazılımı. Ancak, bu protokol yaygın olarak kullanılmaz, tıbbi ve endüstriyel alanlarda olduğu gibi. Bu sınırlı kullanım nedenlerinden biri, tüm gerekli adımları kapsayan basit ve anlaşılabilir bir manuel eksikliği: örnek toplama, sabitleme, boyama, montaj, tarama, ve veri analizleri. Başka bir nedeni de metazoanların geniş çeşitliliği, özellikle deniz omurgasızlar. Deniz omurgasızlar ' farklı boyutlarda, morfolojiler ve fizyolojik nedeniyle, örnek bağlı olarak, her adımda deneysel koşullar ve donanım yapılandırmaları ayarlamak için çok önemlidir. Burada, microCT görüntüleme yöntemleri üç filogenetik olarak çeşitli deniz omurgasızlar kullanarak ayrıntılı olarak açıklanmıştır: Actinia equina (anthozoa, Cnidaria), harmothoe Sp. (Polychaeta, annelida), ve xenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Çeşitli hayvanlarda microCT görüntülemenin gerçekleştirilmesi konusunda öneriler de sağlanmaktadır.

Bir. equina (anthozoa, Cnidaria), harmothoe Sp. (Polychaeta, Annelida) ve X. japonica (Xenoturbellida, xenacoelomorpha) üzerinde% 25 Lugol çözeltisi Ile numuneleri boyayan MicroCT görüntüleme gerçekleştirdik. Boyama, dahili yumuşak dokuların gözlemlerini sağlayarak tüm örneklerde iç yapıların kontrastı başarıyla geliştirildi (Şekil 6). Geçmiş raporlarla birlikte6,7,16...

Burada, üç deniz omurgasız hayvanın microfocus X-ışını bilgisayarlı tomografi (microCT) görüntülenmesi için protokoller ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu çalışmada örnek fiktasyon, boyama, montaj, tarama, görüntü yeniden yapılanma ve veri analizleri gibi adımlar açıklanmaktadır. Protokolün farklı örnekler için nasıl ayarlanacağı konusunda öneriler de sağlanmıştır.

Actinia equina (cnidaria), harmothoe Sp. (Annelida) ve xenoturbella japonica (xenacoelomorpha) Microfocus X-Ray CT (MicroCT) görüntüleme

Traditionally, biologists have had to rely on destructive methods such as sectioning in order to investigate the internal structures of opaque organisms. ...

Mikro BT morfolojisindeki çeşitliliknedeniyle deniz omurgasızlarına yaygın olarak uygulanmamıştır. Yöntemimiz, morfolojisine uygun herhangi bir açıda numunelerin kolay montajını sağlar. Su, kil ve tüpler gibi ortak malzemelerle ve varsa uzun bir solucandan yuvarlak topa kadar çeşitli şekillerdeki numunelere yapılabilir.Prosedürü gösteren Akiteru Maeno, Ulusal Genetik Enstitüsü, Japonya'da bir teknisyen olacaktır. Başlamak için, 250 mililitrelik konik bir şişede 100 mililitre distile su içinde 500 miligram agarose eriterek %0.5 agarose hazırlayın ve şişeyi 800 watt gücünde mikrodalgafırına yerleştirin ve yaklaşık 1-3 dakika ısıtın. Şişeyi oda sıcaklığında soğutun.A.equina gibi 1000 mikrolitrelik mikropipet mavi ucuna sığmayan büyük numuneleri monte etmek için, lekeli numuneyi ilk olarak yüzeyden aşırı boyama çözeltisini temizlemek için 60 milimetrelik distile su içeren bir tabağa yerleştirin. 50 mililitrelik bir tüpte, kabarcıkyapmadan %0,5 agarose beş mililitre dökün. Agarose sertleştirmek için buz üzerinde tüp yerleştirin.Daha sonra tüpe 20 mililitre %0.5 agarose ekleyin, agarose sertleşmeye başlayana kadar buzüzerine yerleştirin ve numuneyi agarose'un içine yerleştirmek için terpler kullanın. Numunenin konumunu gövde ekseninin dikey olması için ayarlayın. Buz üzerinde agarose sertleştirmek.MikroCT montaj aşamasında kil yerleştirin ve kil üzerinde 50 mililitrelik tüp ayarlayın. Harmothoe sp. ve X.japonica gibi 1000 mikrolitrelik mikropipet mavi ucuna sığan küçük numuneleri takmak için, lekeli numuneyi forseps kullanmadan 60 milimetrelik bir tabağa ayırın.Halka cımbızile, numuneleri yüzeyden aşırı boyama çözeltisini temizlemek için distile suyla dolu 60 milimetrelik başka bir tabağa nazikçe aktarın. Daha sonra, 1000 mikrolitrelik mikropipet mavi ucuna %0,5 agarose 100 mikrolitre çizin ve sertleşmek için buz üzerine yerleştirin. Harmothoe sp.ucu agarose fişe % 0.5 agarose 1000 mikrolitre ekleyin. Harmothoe sp.'yi 60 milimetrelik çanaktan uçtaki agarose çözeltisine nazikçe aktarmak için ring cımbızını kullanın.Petiolate iğne veya hassas cımbız ile, chaetae doğal olmayan bükülmüş değildir, böylece Harmothoe sp konumunu ve yönünü ayarlayın. Hiçbir kabarcıklar mevcut olduğundan emin olun ve sonra agarose sertleştirmek için buz üzerine ucu yerleştirin.X.japonica gibi kırılgan örnekleri işlerken, sertleştirilmiş agarose fişi ile mavi ucuna 1000 mikrolitre distile su eklemek için bir mikropipet kullanın. X.Japonica'yı distile suya yerleştirin, böylece ucun duvarları arasında sabit tir. Daha küçük numuneler için 200 mikrolitrelik mikropipet sarı ucu kullanılabilir.Bu durumda, fiş için agarose 30 mikrolitre kullanın ve agarose veya distile su 200 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, yeni, 1000 mikrolitrelik mikropipet mavi ucu nu kesin ve takılı ucun ucunu yeni ucuna takın. MikroCT montaj aşamasında kil yerleştirin ve kil üzerinde örnek içinde ipuçları ayarlayın.Numuneleri monte ettikten hemen sonra, x-ışını ışınını 80 kilovolt ve 100 mikroamda açın. X-ışını iletim görüntüsünü gözlemlerken, x ve z ekseni düğmelerine tıklayarak ve montaj aşamasında y ekseni düğmesini el ile ayarlayarak tüm numunenin görülebileceği şekilde sahneyi hareket ettirin. İç yapıların gözlemlenebilmeleri için görüntünün kontrast koşullarını ayarlayın.Çamurdaki tüpün açısını değiştirerek numunenin yönünü ayarlayın. Döndürme eksenini 90 dereceye ayarlayarak ve Göreli Hareket düğmesini tıklatarak aşamayı 90 derece döndürün. Tam bir rotasyonu tamamlamak için aynı manevrayı dört kez gerçekleştirin.Sistem otomatik olarak kapanmadığı sürece, örnek kapı her açıldığında x-ışını ışınını manuel olarak kapatın. Şimdi z ekseni düğmesine tıklayın ve numunegörünümün merkezinde olacak şekilde montaj aşamasını taşımak için y ekseni düğmesini el ile ayarlayın. Sahneyi 90 derece çevirin ve örneği tekrar merkeze ayarlayın.Aşamayı 90 dereceyi üç kez daha çevirin ve numunenin her yönden görünümün merkezinde olduğundan emin olmak için gerektiği gibi ayarlayın. Ardından, x ekseni boyunca sahneyi x-ışını kaynağına doğru hareket ettirip örneği büyütmek için x ekseni düğmesine tıklayın ve görünümün görünümüne sığacak şekilde gerektiği gibi ayarlayın. Sahneyi çevirin ve numunenin her yönden görünüme uyduğundan emin olmak için gerektiği gibi ayarlayın.Tarama koşullarını ayarlayın ve ardından taramaya başlayın. Bu deneyde% 25 Lugol çözeltisi ile boyama sonra Actinia ekina, Harmothoe sp. ve Xenoturbella japonica üzerinde mikroCT görüntüleme yapıldı.Boyama başarıyla tüm örneklerde iç yapıların kontrast geliştirilmiş, iç yumuşak dokuların gözlemler sağlayan. Bu yöntem, x.japonica örneğinden de görülebileceği gibi, dış hasarlı kırılgan numuneler için de geçerlidir. Harmothoe sp için bütün bir numunenin tek bir yüksek çözünürlüklü veri seti yeniden oluşturuldu.ve X.japonica, numunenin farklı ama çakışan kısımlarında yapılan birden fazla taramadan elde edilmiştir. Numuneyi tüpe veya uca ayarladıklarından ve tarama sırasında hareket etmesin diye tüpü veya ucu mikroCT'ye monte edin. Bu yordamdan elde edilen veriler, araştırmacının numunenin hem iç hem de dış morfolojisini tam olarak anlamasını sağlayan 3-B görüntü rekonstrüksiyonları için kullanılabilir.Tüm microCT sistemleri x-ışınları kullanır, ancak özellikleri bir sistemden diğerine farklı olabilir, bu nedenle her sistemin talimatlarına yakından uyduğunuzdan emin olun.

microfocus-x-ray-ct-microct-imaging-actinia-equina-cnidaria-harmothoe

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Biz non-invaziv 0.7μm piksel çözünürlüğe sahip 3D tomografik veri setleri üretmek için Avrupa Sinkrotron Radyasyon Tesisi (ESRF) sinkrotron X-ışını tomografisi kullanılır. Volume rendering yazılımı kullanarak, bu histolojik kesit tarafından üretilen eserler olmadan kendi doğal devlet iç yapıları yeniden inşası sağlar.

Sinkrotron-X-ray tomografi Sub-mikron Çözünürlük ile Non-invaziv 3D Görselleştirme

MicroCT tarafından Kontrastlı küçük hayvan damar görüntüleme seri için hızlı, düşük maliyetli ve yüksek verimli...

Kontrast Geliştirilmiş Gemi Görüntüleme MicroCT kullanarak

Tahribatsız ses görselleştirme sadece x-ray mikro bilgisayarlı tomografi (BT) en verimli olduğu tomografi teknikleri ile elde edilebilir.

Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntüleme Ex-Vivo Biyolojik örnekler Micro CT

Kaynak: Choi, J. P.  ve diğerleri.  Fare Modelinde Serebral Kavernöz Malformasyonların İndüksiyonu ve Mikro-BT Görüntülemesi. J. Vis. Uzm.  ( 2017)Bu video, bir fare beynindeki serebral kavernöz malformasyon (CCM) lezyonlarını görselleştirmek için mikro-BT görüntülemenin kullanımını göstermektedir. Beyin dokusundaki CCM lezyonlarının yoğunluğunu ve yerini değerlendirmek için numune hazırlama, görüntüleme ve 3D görüntü rekonstrüksiyonu adımlarını detaylandırır.

Bir Fare Beyninde Serebral Kavernöz Malformasyon Lezyonlarının Kontrastlı Mikro-BT Görüntülemesi

Bu kağıt mekansal ilişkili kimyasal, yapısal ve nanoindentation kullanarak Atractosteus spatula katmanlı ölçeği (A. spatula) mekanik özelliklerinin incelenmesi için kullanılan yöntemler sunar, Fourier dönüşümü kızılötesi (FTIR) spektroskopisi, taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve X- ışını tomografi (X-ışını BT) bilgisayarlı. Deney sonuçları, koruyucu, biyolojik malzemelerin tasarım ilkelerini araştırmak için kullanılmıştır.

Çok katmanlı Balık Ölçekler (Of Karakterizasyonu<em&gt; Atractosteus spatula</em&gt;) Nanoindentation, X-ray CT, FTIR ve SEM kullanma

Görüntüleme tekniklerinin entegre bir takımdır Karayip mercan Montastraea annularis ve M. polip morfolojisi ve doku yapısını belirlemek için uygulanan olmuştur faveolata. Floresan, seri blok yüz ve iki foton odaklı lazer tarama mikroskopisi lobate yapısı, polip duvarlar ve tahmini chromatophore ve zooxanthellae yoğunluklarını ve dağılımlarını belirledik.

Modlu Optik Mikroskopi Yöntemleri Caribbean Reef Yapı Mercanlar içinde Polip Doku Morfoloji ve Yapı Göstermektedir

Bir tüp kurdunun, Hydroides elegans'ın kalsifikasyonunu gözlemlemenin yanı sıra ilk kalsifiye materyalin yerini belirlemede ve karakterize etmede yararlı olan çeşitli mikroskopi yöntemlerinin kullanımını gösteriyoruz. Canlı mikroskopi ve elektron mikroskobu, biyomineralizasyonun incelenmesinde önemli olan fonksiyonel ve materyal bilgileri sağlamak için birlikte kullanılır.

Bir Deniz Tubeworm Canlı Optik ve Elektron Mikroskobu Teknikleri Kullanılarak kalsifikasyon Olaylar Karakterizasyonu

Biz protokolleri geliştirilen ve milimetre-ölçek örnekleri katıştırma etkinleştirmek için özel bir aparat tasarlanmış. Biz örnek hazırlama yordamları akrilik reçine ve katı immobilizasyon ve uzun süreli depolama örneklerin doku mimarisi ve hücre morfolojisi sorgulama için mikro-CT tarafından elde etmek için boru polimid gömme bir vurgu ile...

Katı, sabit ve lekeli, genel olarak, milimetre ölçekli örnekler için bölüm ücretsiz 3D Histoloji mikro bilgisayarlı tomografi tarafından katıştırma

Hızlı tekrarlama hızı florometresi (FRRf), fotosistem II fotofizyolojisini ve birincil üretkenliği ölçmek için faydalı bir yöntemdir. Burada, küvet tipi FRRf kullanarak substrat zooplankton üzerindeki epizoik alglerin, Colacium sp.'nin PSII fotofizyolojisini ölçmek için bir protokol tarif ediyoruz.

Colacium sp.'nin Bağlı Aşamasının Fotofizyolojisinin Küvet Tipi Hızlı Tekrarlama Hızı Florometresi ile Ölçülmesi

Mikro-BT, bitki yapılarını üç boyutlu olarak analiz edebilen tahribatsız bir araçtır. Mevcut protokol, parazitik bitki yapısını ve işlevini analiz etmek için mikro-BT'den yararlanmak için numune hazırlamayı açıklamaktadır. Belirli preparatlarla birleştirildiğinde bu yöntemin avantajlarını vurgulamak için farklı türler kullanılır.

Parazitik bitki-konakçı etkileşimlerini analiz etmek için mikro-BT taramasından yararlanma

Öğrenin, deniz omurgasızlarının morfolojik çeşitliliğini incelemek için microCT görüntüleme protokolünü. Actinia equina, Harmothoe sp. ve Xenoturbella japonica örneklerinde iç yapıların 3D analizi için esnek montaj tekniklerini keşfedin.

Actinia equina (cnidaria), harmothoe Sp. (Annelida) ve xenoturbella japonica (xenacoelomorpha) Microfocus X-Ray CT (MicroCT) görüntüleme (Video) | JoVE Journal

Actinia equina (cnidaria), harmothoe Sp. (Annelida) ve xenoturbella japonica (xenacoelomorpha) Microfocus X-Ray CT (MicroCT) görüntüleme

Daha fazla video keşfet