Name: In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Öğrenin, C. elegans vücut duvar kaslarında canlı kalsiyum görüntüleme için immobilizasyon tekniklerini. Optogenetik ve genetik sensörlerle kas hücrelerindeki kalsiyum homeostazını inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar ZX1659 için Dr Alexander Gottschalk teşekkür, RCaMP ve kanalrhodopsin solucan suşu içeren, Dr Hongkyun Kim slo-1 (örneğin142) solucan suşu için, ve Sca-1 (tm5339) solucan suşu için Ulusal Biyokaynak Projesi.

1. Mikroskop kurulumu
<ol><li>Floresan yetenekleri ile bileşik bir mikroskop kullanın. Bu çalışma için veriler, uyarma için LED'lerle donatılmış dik bir mikroskop(Malzeme Tablosu)üzerinde toplanmıştır.</li>
	<li>Vücut duvarı kaslarındaki floresan değişikliklerini doğru bir şekilde görselleştirmek için yüksek büyütme hedefi kullanın.<ol>
<li>Parçalanmış preparatlar için 60x NA 1.0 su daldırma hedefi(Malzeme Tablosu)kullanın.</li>
		<li>Nanoboncuklar kullanarak hazırlıklar için, 60x NA 1.4 yağ daldırma hedefi(Tablo Malzemeler)kullanın. Bu büyütme, kasların kamera sensörüne yeterli çözünürlüğü sağlar.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalsiyum seviyelerindeki hızlı değişimleri izlemek için yüksek kare hızında görüntü yakalamak için mikroskoba bağlı yüksek hassasiyetli bir kamera kullanın. Bu çalışmada, 100 Hz'de tam kare görüntüleme yapabilen bir sCMOS sistemi(Tablo)ile görüntü, Ca2+ sinyallerinin yükselme süreleri onlarca milisaniye kadar hızlı olabilir.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına göre ImageJ10'da çalışan bir mikro-manager yazılımı ile kamera edinimi ve LED floresan uyarma kontrol edin(Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Floresan uyarma kontrol etmek için harici zamanlama darbeleri yönetmek için harici bir açık kaynak mikrodenetleyici kurulu(Malzeme Tablosu)bağlayan bir açık kaynak elektronik platform eklentisi kullanın. NOT: Dijital çıkışlar, 0'dan 5'e çıkış biti sağlayan 8-13 dijital pinlerden edinilebilir. Bunlar 1, 10, 100, vb temel 2 değerleri olarak ele alınabilir. Seri bağlantı noktası ayarları Tablo 1'de belirtilir ve mikro yönetici web sitesinden(Malzeme Tablosu)ulaşılabilir. Mikrodenetleyici kurulu için Firmware benzer şekilde bu web sitesinde mevcuttur.</li>
	<li>Zamanlama mantığını kontrol etmek için, yazılımdaki micromanager satın alma protokolünü üreticinin talimatlarına(Malzeme Tablosu)göre etkinleştirin. NOT: Bu aynı anda önceden ayarlanmış bir kamera çerçevesi süresi ve aktive edilecek çerçeve sayısının yanı sıra floresan uyarma için mantıksal deklanşör ve önceden ayarlanmış kehribar LED'i başlatır. Bu durumda, kehribar LED katı hal anahtarı mikrodenetleyici bit 1 çıkışı ile pin 9 ile kontrol edilir. Kamera, TTL'yi (arka plaka çıkış 3 konektör) çerçeveler bir uyarıcıyı tetikler. Bu tam kez görüntüleme dizisinin aktivasyonu aşağıdaki belirli bir zamanda channelrhodopsin aktivasyonu için mavi ışık LED aktivasyonu.</li>
	<li>Mavi ışık ile channelrhodopsin uyarmak ve RCaMP değişiklikleri kaydetmek için, iki LED kullanın. 470 nm maksimum emisyon dalga boyuna ve bir bandpass filtresine (455-490 nm) sahip bir LED ile channelrhodopsin'i etkinleştirin ve 594 nm'lik en yüksek emisyon dalga boyuna ve bandpass filtresine (570-600 nm) sahip bir LED ile RCaMP'yi heyecanlandırın.</li>
	<li>Aynı anda channelrhodopsin etkinleştirmek ve RCaMP floresan düzeylerinde değişiklikleri yakalamak için, her iki LED'leri birlikte aydınlatın ve bir dikroik ışın birlatör kullanarak aynı optik yola ışığı iletin.</li>
	<li>TTL sinyalleri (maksimum anma açma süresi, 1 ms, 0,3 ms: 0 ila %90 açma ve < 100 μs' lik açma süresi) tarafından kontrol edilen katı hal anahtarları(Malzeme Tablosu)ile LED aydınlatmanın zamanlamasını kontrol edin.</li>
	<li>LED yoğunluğunu, geçerli kontrollü düşük gürültülü doğrusal güç kaynakları(Malzeme Tablosu)ile ayarlayın.</li>
	<li>Mavi ışık LED'inin kesin zamanlamasını sağlamak için, doğrudan TTL darbe ile bir uyarıcıdan katı hal rölesine etkinleştirin. Mavi ışık stimülasyon protokolünü, görüntü ediniminin başlangıcından mavi LED aydınlatmasına kadar hassas bir zamanlayıcı görevi gören bir uyarıcıya(Malzeme Tablosu)programlayın. Bu deneyde, sadece RCaMP floresan yakalama 2 s sonra mavi ışık stimülasyon açın ve 50 ms interpulse aralıkları ile 50 ms mavi ışık darbeleri bir tren kullanın kanaloiddopsin etkinleştirmek için. NOT: Mavi ışık darbelerinden önceki gecikme, mavi ışık darbelerinin süresi, darbeler arasındaki süre ve trendeki darbe sayısı bu noktada ayarlanabilir ve deneysel ilginin belirli parametrelerini yansıtmalıdır.</li>
</ol>2. C. elegans örnek hazırlama ve veri toplama
<ol><li>Optik presinaptik nöronlar uyarmak için, uyarıcı kolinerjik nöronlarda channelrhodopsin ifade hayvanlar elde, unc-17 promotör bölgesi ile tahrik, ve RCaMP myo-3 organizatörü ile tahrik tüm vücut duvarı kasları ifade bölge2. NOT: İlgili hücre tiplerindeki değişken ifade veri toplamanın güvenilirliğini etkileyebileceğinden, yalnızca entegre transgenlere ve sağlam floresan seviyelerine sahip hayvanların kullanılması önerilir.</li>
	<li>100 mM'lik son konsantrasyonu oluşturmak ve -20 °C'de depolamak için retina tozunu(Malzeme Tablosu)etanolde seyrelterek tümtrans retinal bir çalışma stoku yapın. Bu çalışma stoku yaklaşık bir yıl boyunca istikrarlı olacaktır.</li>
	<li>OP50 E. colibir stok oluşturun , LB medyada yetiştirilen, 80 μM son konsantrasyonda, adım 2.2 yapılan çalışma stokundan tümtrans retinal ile desteklenmektedir. OP50+retinal stok için kullanılan hacim deney için gerekli plaka sayısına bağlı olacaktır.</li>
	<li>OP50+retinasi stokunun yaklaşık 300°L'sine sahip tohum nematod büyüme ortamı (NGM) plakaları, plakaların karanlıkta oda sıcaklığında bir gecede kurumasını sağlar.</li>
	<li>20 °C'de OP50+retinal NGM plakalarında karanlıkta istenilen yaşa kadar c. elegans suşları büyütün. Bu deney için yetişkin solucanlar kullanın.<ol>
<li>Diseksiyonlu preparatı kullanan deney için, sadece gravid yetişkin solucanları kullanın, daha genç, küçük hayvanlar üzerinde diseksiyonu yapmak son derece zordur. Etkili bir kanalrodopsin aktivasyonu için en az 3 gün op50 retinal plakalar üzerinde hayvanları bırakın.</li>
	</ol></li>
	<li>Eğer diseksiyonlu preparat8,11 ( Şekil1A)kullanıyorsanız, düşük ışıkta diseksiyonlar yapın.<ol>
<li>150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2, 4 mM MgCl2, 10 mM glikoz, 5 mM sakkaroz ve 15 mM HEPES 'den oluşan silikon kaplı kapak lı taban ile hayvanları bir diseksiyon kabına yerleştirin (pH 7.3 , -340 Osm).</li>
		<li>Solucanın sırt tarafı boyunca mavi boyama ile sıvı topikal deri yapıştırıcı kullanarak hayvanları aşağı tutkal ve cam iğneler kullanarak tutkal / solucan arayüzü boyunca yanal bir miğfer kesi yapmak.</li>
		<li>Solucan boşluğundan iç vissera temizlemek için bir ağız pipet kullanın.</li>
		<li>Hayvanın miğfer kapağını aşağı yapıştırarak ventral medial vücut duvar kaslarını görüntüleme için ortaya çıkar.</li>
	</ol></li>
	<li>Nanoboncuk hazırlığı kullanıyorsanız (Şekil 1B)<ol>
<li>100 mL son hacmi ne ddH2O kullanarak erimiş% 5 agarose çözeltisi olun.</li>
		<li>Pasteur pipeti kullanarak, bir cam slayt üzerine erimiş agarose çözeltisi bir damla yerleştirin ve hemen üst üzerinde ikinci bir cam slayt yerleştirin, ilk dik, eşit bir agarose ped oluşturmak için nazik basınç kullanarak. Kullanmadan önce üst teki slaydı kaldırın.</li>
		<li>Agarose pedin ortasına yaklaşık 4 μL polistiren nanoboncuk(Malzeme Tablosu)ekleyin.</li>
		<li>Düşük ışıkta, nanoboncuk çözeltisi içine 4-6 C elegans seçin, hayvanların üst üste yatmayın emin olun, ve dikkatlice üstüne bir coverslip yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Hazırlanan slayt veya diseksiyon kabını mikroskoba yerleştirin ve 10x büyütme ve loş parlak alan aydınlatması kullanarak bir solucanı bulup odaklanın.</li>
	<li>Vulva'nın ön ve doğru odak düzleminde olan ventromedial vücut duvar kasını tanımlamak için 60x büyütme ve RCaMP floresan uyarma ile geçiş edin. NOT: Vulvanın ön ön kasları elektrofizyoloji deneylerinde yaygın olarak uyarılan kasları yansıttığı için seçilir.</li>
	<li>Geçişi çekerek ve veri toplama yazılımı(Tablo Malzemeler)içinde Live'ı tıklatarak görüntü yolunu göz parçasından kameraya değiştirin. NOT: Bu noktada, kanaloidopunun görüntüleri yakalamadan önce etkinleştirilmediğinden emin olmak için mavi ışık stimülasyon yolunun kapalı olduğundan emin olun.</li>
	<li>Mikroskop ince odak kullanarak veri toplama yazılımı içinde görüntü odaklanın.</li>
	<li>Kas net bir şekilde odaklandıktan sonra Live düğmesine tıklamayı bırakarak canlı görüntüyü kapatın.</li>
	<li>Veri toplama yazılımındaki YG düğmesini tıklatın ve odaklanılan kasın etrafında bir kutu oluşturun.</li>
	<li>Uyarıcıda, daha önce adım 1.10'da programlanmış olan mavi ışık stimülasyon yolunu açın.</li>
	<li>Görüntüyü CMOS kameradan yakalamak için görüntüleme yazılımında Edinme'yi tıklatın. Bunu yapmak için, 1.000 kare ve 2x binning ile 10 s pozlama süresini ayarlayın.</li>
</ol>3. Veri analizi
<ol><li>Görüntüleme yazılımındaki(Malzeme Tablosu)veri dosyasını açın ve Çokgen Aracı'nıkullanarak ilgi kaslarını ana hatlarını belirtin. Bu yatırım getirisi.</li>
	<li>Görüntüye Git | Yığınlar | Z ekseni profilini çizin ve elde edilen veri noktalarını elektronik tablo yazılımına(Malzeme Tablosu)aktarın. Bu işlev, YG seçimini zaman noktasına göre ortalama değeri çizer.</li>
	<li>3.2'de belirtilen adımları kullanarak bir arka plan floresan ölçümü almak için hayvanın dışında Polygon aracı ile oluşturulan kas RoI taşıyın. Elde edilen verileri elektronik tablo çalışma kitabına aktarın.</li>
	<li>Elektronik tablo çalışma kitabında, her zaman noktasında arka plan floresan değerlerini kas floresan değerlerinden çıkarın. Bu arka plan çıkarılan floresan sinyal sağlar.</li>
	<li>Veri noktalarının ilk 2'si için arka plan çıkarılan floresan ortalaması. Bu temel floresan ölçümü, F verecektir.</li>
	<li>Her zaman noktasında normalleştirilmiş floresan düzeyini hesaplamak için temel floresan ölçümlerini kullanın. Bunu yapmak için (ΔF/F)+1 denklemini kullanın. ΔF, F(t)'nin herhangi bir zaman noktasında floresan ölçümü, F'nin ise temel değer olduğu (F(t)-F'yi temsil eder. +1 y ekseni ofset olarak eklenir.</li>
	<li>Toplanan her kas görüntüsü için 3.2-3.6 adımlarını tekrarlayın. Görüntü başına tek veya birden fazla kas hücresi kullanmak araştırmacının takdirine bağlıdır. Deneyin n'si bir güç analizi yaparak belirlenebilir.</li>
	<li>3.2-3.6 adımlarından alınan işlenmiş verileri kullanarak grafik yazılımındaki floresan değerlerin üreticinin talimatlarına(Tablo Of Materials)göre iz lenebilir.</li>
	<li>Bu izden, üreticinin talimatlarına göre grafik yazılımında sağlanan araçları kullanarak, en yüksek zamana ve yarı bozunma süresine yükselmek gibi kalsiyum geçicisinin kinetiklerini ölçün.</li>
</ol>

<ol><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca2%2B+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+Activation+of+Channelrhodopsin-2+in+Excitable+Cells+of+Caenorhabditis+elegans+Triggers+Rapid+Behavioral+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses.</a> Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li>
<li>Liewald, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+analysis+of+synaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic analysis of synaptic function.</a> Nature Methods. 5 (10), 895-902 (2008).</li>
<li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Laser Microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biology. 107, 177-206 (2012).</li>
<li>Lewis, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+Receptor+Mutants+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).</li>
<li>Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+levamisole+resistance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).</li>
<li>Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+GABA+and+two+acetylcholine+receptors+function+at+the+C.+elegans+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction.</a> Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).</li>
<li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Imaging+of+Caenorhabditis+elegans+Using+Nanoparticle-Mediated+Immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization.</a> PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+umanager%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using umanager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).</li>
<li>Richmond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+and+Recording+from+The+C.+Elegans+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction.</a> Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).</li>
<li>Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+isoforms+of+sarco%2Fendoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+%28SERCA%29+are+essential+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 261, 211-219 (2000).</li>
<li>Zwaal, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sarco-Endoplasmic+Reticulum+Ca2%2B+ATPase+Is+Required+for+Development+and+Muscle+Function+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).</li>
<li>Stammers, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+sarco%28endo%29plasmic+reticulum+calcium-ATPases+%28SERCA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA).</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).</li>
<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium Signaling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li>
<li>Hovnanian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serca+pumps+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Calcium+Signalling+and+Disease%3A+Molecular+Pathology+of+Calcium%22%5BJournal%5D)">Serca pumps and human diseases.</a> Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).</li>
<li>Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERCA+pump+isoforms%3A+Their+role+in+calcium+transport+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+and+Nerve%22%5BJournal%5D)">SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease.</a> Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).</li>
<li>Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-Dependent+Regulations+and+Signaling+in+Skeletal+Muscle%3A+From+Electro-Mechanical+Coupling+to+Adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).</li>
<li>Martin, A. A., Richmond, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sarco%28endo%29plasmic+reticulum+calcium+ATPase+SCA-1+regulates+the+Caenorhabditis+elegans+nicotinic+acetylcholine+receptor+ACR-16%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16.</a> Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).</li>
<li>Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLO-1+Potassium+Channels+Control+Quantal+Content+of+Neurotransmitter+Release+at+the+C.+elegans+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction.</a> Neuron. 32, 867-881 (2001).</li>
<li>Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Alpha-Catulin+Homologue+Controls+Neuromuscular+Function+through+Localization+of+the+Dystrophin+Complex+and+BK+Channels+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).</li>
<li>Gourgou, E., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+induced+oxidative+stress+affects+ASH+neuronal+function+and+behavior+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans.</a> Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).</li>
<li>Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+differentially+modulates+Ca2%2B+transients+and+depolarization+in+a+C.+elegans+nociceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).</li>
<li>Kerr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+calcium+transients+in+neurons+and+pharyngeal+muscle+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans.</a> Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).</li>
<li>Nekimken, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumatic+stimulation+of+C.+elegans+mechanoreceptor+neurons+in+a+microfluidic+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap.</a> Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).</li>
<li>Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Neuronal+Calcium+Imaging+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).</li>
<li>Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., Ségalat, L., Allard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L-type+voltage-dependent+Ca2%2Bchannel+EGL-19+controls+body+wall+muscle+function+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).</li>
<li>Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+All-Optical+Analysis+of+Synaptic+Transmission+and+Synaptic+Vesicle+Recycling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. , 1-26 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

GECIs C. elegans nörobiyoloji güçlü bir araçtır. Önceki çalışmalarda, duyusal ve davranışsal tepkiler de dahil olmak üzere, hem nöronlarda hem de kas hücrelerinde çeşitli fonksiyonlar ve çeşitli stimülasyon yöntemleri ile incelemek için kalsiyum görüntüleme teknikleri kullanılmıştır. Bazı çalışmalar da duyusal ASH nöronlarda kalsiyum geçici tetiklemek için kimyasal uyaranlar kullandık22,23 veya faringeal kaslarda kalsiyum dalgaları neden<sup class="xref"...

Bu yazıda optogenetik nöronal stimülasyon kullanarak C. elegans vücut duvarı kaslarının in vivo kalsiyum görüntüleme yöntemleri sunmaktadır. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum indikatörü (GECI) ile mavi ışık la eşleşen bir kasın eşleşmesi nöronal depolarizasyonu tetikler ve uyarılmış postsinaptik kalsiyum geçicilerini net bir şekilde gözlemleyen bir sistem sağlar. Bu, postinaptik kalsiyum dinamiklerini etkileyen mutantların non-invaziv analizini sağlayarak elektriksel stimülasyonkullanımını önler.
GCaMP gibi tek floroforem GECIs, C-terminus'ta n-terminal ucunda ve calmodulin (CaM) miyozin ışık zinciri kimyazının M13 etki alanına erimiş tek bir floresan protein molekülü kullanır. Kalsiyum bağlanması üzerine, kalsiyum afiniteyüksek olan CaM etki alanı, floresan protein sonraki konformasyonel değişim indükleyen bir konformasyonel değişim uğrarfloresanyoğunluğu nda bir artışa yol açan 1 . GCaMP floresan 488 nm heyecanlı, channelrhodopsin ile birlikte kullanılmak üzere uygun hale, hangi benzer bir uyarma dalga boyu vardır 473 nm. Bu nedenle, kalsiyum ölçümlerini kanaloidsin stimülasyonu ile çifte ayırmak için, GCaMP'ın yeşil floresan proteininin kırmızı floresan proteini mRuby (RCaMP) ile değiştirilmesi gerekir. Kas ifade RCaMP kullanarak, channelrhodopsin kolinerjik motor nöron ekspresyonu ile birlikte, aynı hayvan içinde optogenetik ve fonksiyonel görüntüleme eşzamanlı kullanımı ile solucan nöromüsküler kavşak (NMJ) çalışmaları izin verir 2 .
Channelrhodopsin kullanımı C. elegansnöromüsküler kavşaklar depolarize etmek için elektrikstimülasyon ihtiyacını atlar , sadece diseksiyon preparatları elde edilebilir, böylece bu tekniği hem daha kolay istihdam ve daha hassas hale belirli dokuları hedef alırken. Örneğin, channelrhodopsin daha önce C. elegans geri belirli nöronları etkinleştirmek için kullanılmıştır, uyarıcı veya inhibitör nöronların ya sağlam aktivasyonu yolaçan 3,4. Işık uyarılmış depolarizasyon kullanımı da doğrudan elektriksel stimülasyon nedeniyle nöronal hasar sorunu atlatMaktadır. Bu postsinaptik kalsiyumdinamikleri4, sürekli ve tekrarlanan stimülasyonlar da dahil olmak üzere birçok farklı stimülasyon protokolleri, etkilerini incelemek için bir fırsat sağlar.
C. elegans şeffaf doğası floresan görüntüleme fonksiyonel analiz için ideal hale getirir. Ancak, NMJ de uyarıcı asetilkolin nöronlar uyarıcı, hayvanların ani bir kas kasılması ile yanıt bekleniyor4, ayrık kalsiyum değişiklikleri görselleştirme solucanların immobilizasyon kritik hale. Geleneksel olarak, farmakolojik ajanlar hayvanları felç etmek için kullanılmıştır. Kullanılan böyle bir ilaç levamisole, bir kolinerjik asetilkolin reseptör agonist5,6,7. Levamisole uyarıcı kas reseptörlerinin bir alt tipinin kalıcı aktivasyonuna yol açtığından, bu reaktif kas kalsiyum dinamiğinin incelenmesi için uygun değildir. Levamisole eylem postsinaptik depolarizasyon neden olur, sitosolik kalsiyum yükselterek, ve presinaptik stimülasyon aşağıdaki gözlemler oklüt. Felç edici ilaçların kullanılmasını önlemek için C. elegans'ıetkisiz hale getirmek için iki alternatif yöntem irdeledik. Hayvanlar ya yapıştırılmış ve daha sonra vücut duvar kasları ortaya çıkarmak için açık, mevcut C. elegans NMJ elektrofizyoloji yöntemi8benzer, ya da nanoboncuklar bozulmamış hayvanları hareketsiz leştirmek için kullanılmıştır9. Her iki prosedür kolayca ölçülebilir olan istirahat ve uyarılmış kas kalsiyum geçici tekrarlanabilir ölçümler için izin verdi.
Bu yazıda yöntemler Temel sitosolik kalsiyum düzeyleri ve Geçici olarak m. eleganspostsinaptik vücut duvarı kas hücrelerinde ölçmek için kullanılabilir. İki farklı immobilizasyon tekniğini kullanan veri örnekleri verilmiştir. Her iki teknik elektriksel stimülasyon kullanmadan kas hücrelerini depolarize etmek için optogenetik yararlanmak. Bu örnekler, solucanlarda postinaptik kalsiyum kullanımını etkileyen mutasyonların değerlendirilmesinde bu yöntemin fizibilitesini göstermekte ve iki immobilizasyon yaklaşımının artılarını ve eksilerini göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>all-trans retinal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2500</td><td>Kanal rodopsinin uyarılması için gerekli</td></tr><tr><td>Amber LED</td><td></td><td></td><td>RCaMP aydınlatma</td></tr><tr><td>Arduino UNO</td><td>Mouser</td><td>782-A000066</td><td>Floresan aydınlatmasını kontrol eder</td></tr><tr><td>Mavi LED</td><td></td><td></td><td>channelrhodopsin aydınlatması</td></tr><tr><td>BX51WI mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td>Sabit durumlu bileşik mikroskop</td></tr><tr><td>Akım kontrollü düşük gürültülü doğrusal güç kaynağı</td><td>Ametek</td><td>Sorenson</td><td>LED yoğunluğunu kontrol eder</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>Wavemetrics</td><td>Wavemetrics.com</td><td>Grafik yazılımı</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>imagej.nih.gov</td><td>Görüntü işleme yazılımı</td></tr><tr><td>LUMFLN 60x su NA 1.4</td><td>Olympus</td><td></td><td>Suya daldırma hedefi diseksiyon preparasyonu</td></tr><tr><td>Master-8 Stimülatör</td><td>A.M.P.I</td><td></td><td>Görüntü alma ve LED aydınlatma için ana zamanlayıcı</td></tr><tr><td>Micro-Manager</td><td></td><td>micro-manager.org</td><td>Kontroller kamera alımı ve LED uyarımı</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td> Elektronik <td>Tablo yazılımı</td></tr><tr><td>pco.edge 4.2 CMOS kamera</td><td>pco.</td><td>4.2</td><td>Yüksek hızlı kamera</td></tr><tr><td>PlanApo N 60x yağ NA 1.4</td><td>Olympus</td><td></td><td>Nanoboncuk hazırlama için yağa daldırma hedefi</td></tr><tr><td>Polybead mikro küreler</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>00876-15</td><td>Solucan immobilizasyonu için</td></tr><tr><td>katı hal anahtarları</td><td>Sensata Technologies</td><td>Crydom CMX100D6</td><td>LED aydınlatmanın zamanlamasını kontrol eder</td></tr><tr><td>Transgenik gerinim, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]</td><td>Richmond Lab</td><td>SY1627</td><td>SERCA mutant aleli</td></tr><tr><td>Transgenik suş, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]</td><td>Richmond Lab</td><td></td><td>Kalsiyumla aktive edilmiş BK potasyum kanalı mutant aleli</td></tr><tr><td>Transgeneik suş, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]</td><td>Gottschalk Lab</td><td>ZX1659</td><td>Uyarıcı nöronal channelrhodopsin ve vücut duvarı kası RCaMP ifade eden solucan hattı</td></tr></tbody></table>

in vivo kalsiyum görüntüleme c. elegans vücut duvar kasları

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

Model organizma C. elegans in vivo kalsiyum görüntüleme gerçekleştirmek için mükemmel bir sistem sağlar. Şeffaf gövdesi ve genetik manipulability genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri hedefli ifade sağlar. Bu protokol, hedeflenen hücrelerde kalsiyum dinamiklerinin in vivo görüntüleme için bu sensörlerin kullanımını özetliyor, özellikle solucanların vücut duvarı kasları. Presinaptik kanalrodopsin inko-ekspresyonu kullanılarak, uyarıcı motor nöronlardan asetilkolin salınımının uyarılması mavi ışık darbeleri kullanılarak indüklenebilir, kas depolarizasyonu ve sitoplazmik kalsiyumda tekrarlanabilir değişikliklerle sonuçlanabilir. Düzey. İki solucan immobilizasyon teknikleri zorluk değişen düzeylerde tartışılmıştır. Bu tekniklerin karşılaştırılması, her iki yaklaşımın da nöromüsküler kavşak fizyolojisini koruduğunu ve kalsiyum geçicilerinin tekrarlanabilir nicelifikasyonuna olanak sağladığını göstermektedir. Optogenetik ve fonksiyonel kalsiyum görüntüleme ile postsinaptik kalsiyum kullanımı ve homeostazdaki değişiklikler çeşitli mutant arka planlarda değerlendirilebilir. Sunulan veriler hem immobilizasyon tekniklerini doğrular hem de özellikle C. elegans sarco(endo)plazmik retiküler kalsiyum ATPaz ve vücut duvarı kas kalsiyum regülasyonundaki kalsiyum aktive Edilmiş BK potasyum kanalının rollerini inceler.

Bu teknik, kalsiyum işleme veya kas depolarizasyonunu etkilediği düşünülen mutantlardaki değişiklikleri değerlendirmiştir. Bazal floresan düzeyleri ve floresan geçiciler görselleştirildi ve kas içinde sitosolik kalsiyum ve kalsiyum kinetik dinlendirildi. Hayvanların retinanın başarılı bir şekilde birleşmesini sağlamak için en az üç gün boyunca all-trans retinal olarak yetiştirilmesi ve daha sonra kanaloidin aktive edilmesi önemlidir(Şekil 2A).</strong...

Bu yöntem çift optogenetik ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri görüntü bazal sitosolik kalsiyum düzeyleri ve model organizma C. elegansvücut duvarı kasları uyarılmış kalsiyum geçici değişiklikler için bir yol sağlar.

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Bu protokol, C.Elegans'ı vücut duvarı kaslarının in vivo kalsiyum görüntülemesini gerçekleştirmek için seferber etmek için iki yöntem sağlar. Bu yöntem kalsiyum homeostaz ve kalsiyum kullanımı ile ilgili soruların cevaplandırılmasına yardımcı olabilir, ve genetik olarak izlenebilir organizmada erişilebilir bir sinaps. Bu teknik kas kalsiyum homeostaz düzenleyen mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir, ve bu nedenle, kalsiyum bisiklet yanlış düzenleme yoluyla uyarma daralma kaplin etkisi koşulları veya moleküler yolların belirlenmesinde önemli olabilir.Bu yöntemler, nörobiyoloji, gelişim biyolojisi ve hücre biyolojisi de dahil olmak üzere, ancak sınırlı olmamak üzere araştırma alanları hakkında bilgi sağlayabilir. Bu teknikler çeşitli hücre tipleri ve C.elegans, diğer ilgili nematodlar ve filsafat larvaları incelemek için uyarlanabilir. Deneycinin diseksiyon tekniğini anlayabilmesi ve düzgün hareketsiz hayvanlardan kalsiyum geçicilerini doğru bir şekilde değerlendirebilmesi için bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir.Floresan görüntüleme için mikroskobu kurarak başlayın. Kalsiyum seviyelerindeki hızlı değişimleri izlemek için 100 hertz'de tam kare görüntüleme yeteneği

in-vivo-calcium-imaging-in-c-elegans-body-wall-muscles

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video, kalsiyum görüntülemenin arkasındaki kavramları tanıtır ve kalıplanmış agaroz kuyularında bulunan solucanların hızlandırılmış görüntülemesi için örnek bir protokol içerir.

Kalsiyum Görüntüleme: Canlı C. elegans'ta Nöral Aktiviteyi Görselleştirmek İçin Bir Yöntem

Bu video, genetik olarak kodlanmış floresan raportör proteinleri kullanarak Caenorhabditis elegans gibi davranan bireysel nöronlarda kalsiyum görüntüleme tekniğini göstermektedir. Hücre içi kalsiyum seviyelerini nöronal aktivite ve yumurtlama sırasındaki davranış değişiklikleri ile ilişkilendirmek için solucan hareketinin görüntülenmesinde ve nöronlardan gelen raportör floresan oranlarının ölçülmesinde yer alan adımları ana hatlarıyla belirtir.

Caenorhabditis elegans'ta Yumurtlama Davranışını Düzenleyen Bireysel Nöronlarda Kalsiyum Görüntüleme

Kaynak: Doser, R., et al. Nöronal Kalsiyum İşleminin In Vivo Hücre Altı Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2023)Bu video, transgenik Caenorhabditis elegans suşlarının ventral sinir kordonu nöronlarındaki hücre altı kalsiyum akışının in vivo görüntülemesini göstermektedir. İki farklı kalsiyum indikatörü kullanılır: bir suşta bir sitoplazmik indikatör ve diğerinde bir mitokondriyal indikatör kullanılır. Nöronlar, nöronal sitoplazma ve mitokondri içindeki floresan yoğunluğundaki gerçek zamanlı...

Caenorhabditis elegans Nöronlarında Hücre Altı Kalsiyum Dinamiğinin Görüntülenmesi

Onun küçük şeffaf gövde, iyi belgelenmiş nöroanatomi ve müsait genetik teknikler ve reaktiflerin bir dizi...

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

Hayvanın hareketsiz hale getirilmeden uzun zaman ölçeklerinde davranışı ve nöral aktiviteyi görüntülemek, davranışı anlamak için bir ön koşuldur. Agaroz mikroakışkan odacıkların görüntülenmesi (), Caenorhabditis elegans'ın tüm yaşam evreleri için nöral aktivite ve davranışı görüntülemek için kullanılabilir.

Uzun süreli Kalsiyum Görüntüleme için Agaroz microchambers<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Bu iletişim kuralı Caenorhabditis elegans solucanlar davranışlar içinde sinirsel aktivite içinde genetik olarak kodlanmış Ca2 + gazetecilere kayıt değişiklikleri açıklar.

Ratiometric kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis Elegans davranışlar içinde bireysel nöronların

Burada bir protokol için tek tek hücre tiplerinin fare nöromusküler kavşakta nüfus sinyal görüntü kalsiyum mevcut.

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

Burada iyi kontrol edilen, lokalize olmayan titreşime sahip serbestçe davranan Caenorhabditis elegans'ta kalsiyum görüntüleme için bir sistem bildirilmiştir. Bu sistem, araştırmacıların nano ölçekli yer değiştirmede iyi kontrol edilen özelliklere sahip lokalize olmayan titreşimleri uyandırmalarını ve C. elegans'ın titreşimlere tepkileri sırasında kalsiyum akımlarını ölçmelerini sağlar.

İyi Kontrollü, Lokalize Olmayan Titreşimli Serbest Davranan Caenorhabditis elegans'ta Kalsiyum Görüntüleme

Dendritik dikenler sinir sisteminin önemli hücresel özellikleridir. Burada C. elegans'ta dendritik dikenlerin yapısını ve işlevini değerlendirmek için canlı görüntüleme yöntemleri tanımlanmıştır. Bu yaklaşımlar, dendritik omurga şeklini veya işlevini tanımlayan genler için mutant ekranların geliştirilmesini desteklemektedir.

Caenorhabditis elegans'ta Dendritik Dikenleri Görüntüleme

Mevcut yöntemler, kolayca bulunabilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak Caenorhabditis elegans'ta in vivo olarak yüksek çözünürlüklü, sub-kompartmanlı kalsiyum görüntüleme için orantılı olmayan bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Burada, model nematod C. elegans'ın germ hattında eksprese edilen genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum raportörü kullanarak döllenme ve erken embriyogenez sırasında kalsiyumu görselleştirmek için protokoller ve araçlar sunuyoruz.

C. elegans'ta Döllenme ve Erken Gelişim Sırasında Kalsiyum Geçişlerinin İn Vivo Olarak Görüntülenmesi

Öğrenin, C. elegans vücut duvar kaslarında canlı kalsiyum görüntüleme için immobilizasyon tekniklerini. Optogenetik ve genetik sensörlerle kas hücrelerindeki kalsiyum homeostazını inceleyin.

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

Daha fazla video keşfet