İlk 3D hücre küme denetimi içinde a Hybrid jel küp aygıt için tekrarlanabilir model oluşumları
March 21st, 2019
Biz bir tekrarlanabilir model formasyonu elde etmek için 3D bir hücre dışı matriks ilk hücre kümesi şeklinde kontrol etmek için bir yordam mevcut. İki farklı hydrogels içeren bir küp aygıtı doku Desen oluşumu için çok yönlü görüntüleme elde etmek için istihdam edilmektedir.
Bu protokol, herhangi bir özel ekipman kullanmadan bir 3B hücre kültürü modelinin güvenilirliğini artırmak için basit bir yöntem kullanır. Bu tekniğin en büyük avantajı, kübik cihaz içindeki ilk kültür durumunu kontrol ederek tekrarlanabilir 3B kültür deneyi yapabilmemizdir. Beşe beş milimetrelik polikarbonat kübik çerçeve hazırladıktan sonra, çerçeveyi önceden soğutulmuş bir kaydırağa ve bir buz kutusuna yerleştirin ve kübik çerçevenin üst yüzeyinden önceden ısıtılmış 1,5%agarose 12 mikrolitre eklemek için bir pipet kullanın.
Düz bir yüzey elde etmek ve polimer tedavi etmek için izin agarose yayıldı. Çerçeveyi camın kenarına kaydırmak için cımbız kullanın ve çerçeveyi, çerçeveyi slayta geri yerleştirmeden önce açık tarafın aşağı bakacak şekilde döndürün. Çerçevenin sonraki iki yüzeyini daha agarose ile doldurduktan sonra, az önce gösterildiği gibi, agarose'u açık bir yüzden bir kap içine düşürerek dördüncü ve beşinci tarafta agarose bir duvar oluşturun.
Bir ilk hücre kümesi şekli kurmak için hibrid jel küp kültür alanı içine ilgi hücre kültürü için uygun bir hücre dışı matris enjekte ve küp üzerine bir fabrikasyon mikro kalıp ayarlayın. Sonra 37 santigrat derece 25 dakika boyunca bir karbondioksit kuluçka küpü yerleştirin. Hücre dışı matris tedavi edildiğinde, matrisin bozulmaması için mikro kalıbı dikkatlice kaldırın.
İstenilen kalıp şeklinde bir cep ekstrasellüler matris imal edilecektir. Hücreleri yüklemek için uygun deneysel hücre kültürü orta santrifüj sonra deneysel hücre süspansiyon konsantre ve ekstrasellüler matris içinde cebine hücreleri enjekte. 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca karbondioksit inkübatör içine küp yerleştirin hücrelerin hücre dışı matris cebine düşmesine izin vermek için, mikro kalıp tarafından oluşturulan alanı doldurarak.
Kuluçka sonunda, bir 24 kuyu plaka bir kuyu içine küp yerleştirin ve kuyuya uygun hücre kültürü orta 100 mikrolitre ekleyin. Cebi kapatmak için ekstra hücre dışı matris enjekte edin ve küpü 25 dakika boyunca kuvöze geri verin. Hücre dışı matriks tedavi edildiğinde yüzeyi kapatmak ve 37 santigrat derece 10 ila 20 dakika boyunca damla tedavi küp üst yüzeye yaklaşık 10 mikrolitre 20 santigrat damla.
Sonra küp içinde hücrelere beslenme transferini kolaylaştırmak için ozmotik basınç teşvik etmek için taze orta ile tüm küp kapağı. Çok yönlü gözlem ile noninvaziv 3D şekil tanıma için, bir mikroskop aşamasıüzerine plaka yerleştirin ve parlak alan veya faz kontrast mikroskobu ile küpher iki tarafında görüntüleri elde, yakalar arasında görüntülenecek küp hizmeti döndürmek için cımbız kullanarak. Çok yönlü gözlem ile immünofloresan görüntüleme için, ilk küp içeren kuyudan supernatant aspire ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit küp düzeltmek.
Fiksasyon sonunda, yıkama başına 10 dakika pbs ile iki kez küp yıkayın. Küpü %0,5 triton x-100 ve PBS ile 10 dakika boyunca dört santigrat derecede geçirgenleştirin. Daha sonra, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca keçi serumu ve immünofloresan tampon ile herhangi bir nonspesifik yapıştırma engellemeden önce, yıkama başına 10 dakika PBS üç kez küp yıkayın.
Daha sonra standart antikor boyama protokollerine göre uygun birincil antikor ile hücreleri lekeleyin. Daha sonra küpün altı tarafını lazer veya floresan mikroskobun üzerinde görüntüleyin. Bu temsili deneyde, normal insan bronşiyal epitel hücreleri ile kültürlendirilen melez jel küplerinin çok yönlü görüntülemesi, faz kontrastı ve kültürlerin immünororesan görüntülemesi ile ilk silindirik veya prizma şeklindeki hücre kültürünün oluşumunu göstermektedir.
Burada normal insan epitel hücrelerinin immün boyanması başlangıçta hibrid jel küp silindirik bir şekle kontrol, bronşiyal ağaç nesil sonra gösterilir. Dallar silindirik eksene dik gösterir, çok boyutlu görüntüleme ile ortaya. Hücre dışı matris cebine yüksek yoğunlukta hücre enjekte etmek önemlidir, çünkü hücrelerin düşük yoğunluğu kuluçkadan sonra hücre kalitesinin bozulmasına neden olabilir.
Bu yöntem deseni, çanak geliştirme mekanizmasını incelemek için çok yönlü görüntüleme ile nicel ölçüm ile 3Boyutlu hücresel desenin tekrarlanabilir oluşumudur.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, 3D hücre dışı matrisinde hücre kümelerinin başlangıç şeklini kontrol etmek için bir yöntem sunar ve tekrarlanabilir desen oluşumunu sağlar. İki farklı hidrojel ile kare bir cihaz kullanarak, bu teknik doku desen oluşumunda çok yönlü görüntüleme sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Doku Mühendisliği
Arka Plan
- 3D hücre kültürü modelleri, doku gelişimini incelemek için gereklidir.
- İlk kültür koşullarının kontrolü, deneysel güvenilirliği artırabilir.
- Hidrojeller, biyouyumlulukları nedeniyle doku mühendisliğinde yaygın olarak kullanılır.
- Çok yönlü görüntüleme, doku oluşumu hakkında kapsamlı bilgiler sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Özel ekipman olmadan 3D hücre kültürü için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- Hücre kümelerinde tutarlı desen oluşumu sağlamak.
- Artırılmış görüntüleme yetenekleri için kare bir cihaz kullanmak.
Kullanılan Yöntemler
- Hücre kültürü için polikarbonat kare çerçeve hazırlanması.
- Düz bir yüzey oluşturmak için ön ısıtılmış agaroz uygulaması.
- Kare çerçeveyi duvar oluşturmak için agaroz ile sıralı olarak doldurma.
- Çerçevenin hassas manipülasyonu için forseps kullanımı.
Ana Sonuçlar
- Kararlı bir 3D hücre kültürü ortamının başarılı bir şekilde oluşturulması.
- Hücre kümelerinde gözlemlenen tekrarlanabilir desen oluşumu.
- Çok yönlü görüntüleme için hidrojellerin etkili kullanımı.
- Doku çalışmalarında deneysel sonuçların güvenilirliğinin artırılması.
Sonuçlar
- Bu yöntem, 3D hücre kültürü için basit bir yaklaşım sağlar.
- İlk koşulların kontrolü, tekrarlanabilirlik için kritik öneme sahiptir.
- Bu teknik, çeşitli doku mühendisliği uygulamalarında uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Reliable 3D cell culture models are critical for early discovery and mechanistic de-risking in biopharma R&D, yet reproducibility remains a major barrier. This hybrid gel cube device enables precise control of initial cell cluster shape and density, directly addressing variability in pattern formation and supporting robust hypothesis testing. Enhanced repeatability in 3D cultures strengthens predictive confidence and informs portfolio triage at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of self-organization mechanisms by minimizing initial condition variability.
- Supports functional target validation through repeatable 3D pattern formation.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing controlled manipulation of cell cluster geometry.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized 3D biological systems for downstream screening workflows.
- Improves assay reproducibility by controlling cell density and spatial distribution in ECM.
- Enables quantitative imaging outputs for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro models with disease-relevant tissue architecture for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by providing robust, repeatable preclinical data.
- Facilitates biomarker discovery through high-resolution, multi-directional imaging.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and assay development, providing a foundation for lead identification and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Reduces experimental noise in hypothesis testing and pathway analysis by standardizing initial 3D culture conditions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts suitable for high-content analysis.
- Analytics: Enables multi-directional imaging and quantitative measurement of 3D pattern formation.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by replicating tissue-like structures.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, adaptable platform for diverse cell types and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in 3D culture studies.
- Operational Value: Standardizes workflows and enhances reproducibility across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing experimental variability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture and ECM handling.
- Needs access to basic cell culture and imaging instrumentation.
- Demands cross-team standardization of cell density and mold fabrication protocols.
- Adaptable to various cell types and ECM compositions with protocol optimization.
- Dependent on high cell density for optimal pattern fidelity and viability.
