Bariyer geçişleri patojenler veya ilaçlar ve onların etkileşim beyin ile çalışmak için bir insan kan-beyin arabirim modeli
9 Nisan 2019
Burada bir içinde cellulo BBB (kan beyin bariyerini) ayarını açıklayan bir iletişim kuralı mevcut-Minibrain polyester geçirgen membran kültür taşıma biomolecules veya enfeksiyöz ajanlar arasında bir insan BBB değerlendirmek için sistem eklemek ve onların komşu beyin hücreleri üzerinde fizyolojik etkisi.
Bu insan kan-beyin arayüz modeli nöro sisteme moleküllerin transferi çalışma için yararlıdır. Yanı sıra mikropların incelenmesi için enfekte bir beyin ağrısı tümörü ulaşmak. Bu kan beyin bariyeri veya BBB modeline mini beyin eklenmesi bbb beyinde tedavi neden bizim patojenler ve moleküllerin çalışma sağlar.
Prosedürü bozan Florian Bakao, laboratuvarımdaki doktora öğrencileri olacak. BBB mini beyin polyester membran kültür ekleme cihazı kurmak için, hücreleri kesici konsantrasyon uncomplete endotel hücre ortası başına beş kez 10 dördüncü hücrelere seyreltin ve her polyester membran kültür eklemek için uygun hacim eklemek 12 iyi plaka. Daha sonra, hücreler %100 biraraya gelene kadar kesici uçları ve hücre kültürünü kuluçkaya yatırın.
Oda sıcaklığında dört saat boyunca poli-D-lizin onu iyi bir mililitre ile 12 iyi plaka tutun. Bir gecede bir mililitre laminin takip ediyor. Laminayı %5 fetal sığır serumu veya FBS ile takviye edilmiş bir mililitre endotel hücreli orta ile değiştirin.
Bir saat için bir kuvöz de yer. Mini tahılı hazırlamak için CHME'deki insan nöronlarını beş hücreklonlayın. Hücre peletlerini tam endotel hücreli ortamla ilişkilendirin.
3.6 kez 10 beşinci nöronlar ve astrositler için 0.4 kez 10 beşinci CHME klon beş hücre sayma sonra iyi bir 12 iyi plaka var. Ve 12 kuyu tabağı tohum. Tohumlamadan 24 saat sonra BBB mini beyin oluşturmak için kullanılan ortamı taze komple endotel hücreli ortamla değiştirin ve serebral mikro vasküler endotel hücre kaplı polyester membran kültürünü mini beyin hücrelerinin üzerine yerleştirin.
Sonra, BBB birçok beyin cihazını kuvöze yerleştirin. BBB mini beyin endotel geçirgenliğini doğrulamak için yeni bir 12 kuyu plakası için kuyu başına 1.5 mililitre taşıma tamponu ekleyin. Ve endotel hücre bariyerini etkilemeden ortamı dikkatlice çıkarmak için her filtreyi ters çevirin.
Her filtreyi taşıma tampondolu plakanın bir kuyuya yerleştirin ve her kuyuya 0,5 mililitre Lucifer sarısı ekleyin. Daha sonra 12 kuyu plakadolu yeni bir taşıma tampon içine filtreler aktarmadan önce 10 dakika boyunca kuvöz içine plaka yerleştirin. Gösterildiği gibi bir BBB birçok beyin cihazı kurduktan sonra, sarı humma virüsü seyreltilmiş Fransız nörotrofik virüs suş 3500 platforming birimleri ve 50 mikrolitre ekleyin 2% FPS endotel hücre liyakat ortamı, çok dikkatli, luminal bölmesi üstüne.
Kontrol BBB mini beyin ile aşılamak 50 mikrolitre 2% FBS endotel hücreli orta virüs olmadan. Sonra virüsü niçin 24 saat boyunca kuvözde bbb birçok beyin cihazı maruz yerleştirin. Ertesi gün, endotel hücre geçirgenliğini ve bir arkadaşı belirlemek için ekler kaldırmak gibi gösterildiği gibi.
Orta bölmedeki virüs titresini belirlemek için her kuyudan bir mililitre numune sakçekin. Luminal bölmenin abluminal bölmelere sızmasını önlemek için kesici nizin altında nazikçe. Kan beyin bariyeri boyunca biyomoleküler hedefleyen bir nöron taşıma çalışma için, ekler ilgi biyo molekül ekleyin ve hücre kültürü kuluçka plaka dönmek.
24 saat sonra uzaktan ekler ve endotel geçirgenliğini belirlemek. Sonra mini beyin içinde ilgi biyo molekülün varlığını tespit etmek için uygun antikor ile birçok beyin hücreleri leke. İnsan serebral mikro vasküler endotel hücreleri, biyolojik işlevleri için önemli proteinler olan rececptors, Efflux taşıyıcılar veya taşıyıcıların tüm alt kümelerini ifade eder.
Sarı humma virüsübazı Fransız nöro tropik virüs türü 24 saat kan beyin bariyerini geçebilir. Virüsler daha sonra beyin hücrelerinin içinde virüs çoğalması ile önümüzdeki iki gün boyunca yükseltmek. Ayrıca, bu nöro invaziv viral popülasyon seri mini beyin hücreleri üzerinde geçit ve kesinlikle viral yük ile ilişkili olduğunda belirli viral biyobelirteçlerin ekspresyonu uyarılır.
Kompartıman hücre penetran molekül Neuro-Tag Neurovita sınırına eklendikten sonra kan beyin bariyerini geçer ve insan nöronlar hedef yapabiliyor. Hücre delici molekül nöro etiket Delta neurovita endotel hücre bariyerini geçer, ama daha az verimli insan nöronlar hedefler. Küçük orta bölmeye eklendikten sonra, hücre delici molekül Neuro-Tag Neurovita kan beyin bariyerini geçer ve insan nöronaksonlarını yenilemek mümkün, yaralandıktan sonra.
Hücre penetran molekülNeuro-Tag Neurovita Delta aksine, Neurovita inaktif formu. Akson çizilme hücre delici molekül Neuro-Tag Neurovita sonra uygulandığında yaralı nöronların nöro koruma ve x zonal rejenerasyon tetikler. Sadece uygulamaların iyiliği için.
i-hücre pasajları üzerinde kullanmayın. Orta ve bölgelerde bazı benzerlik korumaya çalışın ve mikoplazma yokluğu kontrol edin. Mini beyin ve ilaçlar arasındaki etkileşimler ilgi mikropları daha bu veya klasik biyoloji kimyasallaştırmak transkript tarafından incelenebilir teknikleri denir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, biyomoleküllerin ve enfeksiyöz ajanların merkezi sinir sistemine taşınımını incelemek amacıyla, polyester gözenekli membran kültür insertleri kullanılarak bir insan kan-beyin bariyeri (KBB) minibeyin modelinin oluşturulmasını özetlemektedir. Çalışma, komşu beyin hücreleri üzerindeki fizyolojik etkileri değerlendirmeyi amaçlayarak, KBB ile çeşitli patojenler arasındaki etkileşimlere dair bilgiler sunmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Bulaşıcı Hastalıklar
Arka Plan
- Kan-beyin bariyeri, beyni korumak için hayati öneme sahipken, aynı zamanda ilaç iletimi ve patojen erişimi için zorluklar oluşturmaktadır.
- Minibeyin modeli, insan nöronları ile kan-beyin bariyeri arasındaki etkileşimleri kolaylaştırır.
- Bu yaklaşım, çeşitli moleküllerin geçirgenliğinin ve fizyolojik etkilerinin değerlendirilmesine olanak tanır.
Çalışmanın Amacı
- Biyomoleküllerin ve virüslerin KKB üzerinden taşınımını değerlendirmek.
- Patojenlerin nöronal hücreler üzerindeki etkilerini anlamak.
- Gelecekteki ilaç testleri ve nörobiyolojik çalışmalar için güvenilir bir model geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Çalışmada, 12 kuyucuklu bir plaka içerisinde polyester membran insertler içeren bir hücre kültürü sistemi kullanılmıştır.
- Biyolojik model, insan serebral mikrovasküler endotel hücrelerinin insan nöronları ve astrositleri ile birlikte kullanımını içermektedir.
- Kritik aşamalar arasında hücrelerin konfluense ulaşana kadar kültüre edilmesi, viral ajanların uygulanması ve endotel geçirgenliğinin ölçülmesi yer almaktadır.
- Kurulum inkübe edilmiş ve sonuçları değerlendirmek için belirli aralıklarla çeşitli analizler gerçekleştirilmiştir.
Ana Sonuçlar
- Çalışma, belirli virüslerin KKB'yi geçebildiğini ve beyin hücreleri içinde çoğalabildiğini doğrulamıştır.
- Hücreye nüfuz eden moleküllerin aksonları yenileme ve nöroproteksiyonu destekleme yeteneğine sahip olduğu gösterilmiştir.
- Doğrulama deneyleri, viral yük ile spesifik biyobelirteç ekspresyonu arasında doğrudan bir korelasyon olduğunu ortaya koymuştur.
Sonuçlar
- Bu çalışma, KKB dinamiğinin ve patojenlerle olan etkileşimlerin daha iyi anlaşılmasını sağlar.
- Bulgular, nörovasküler arayüzü hedefleyen terapötik stratejilerin geliştirilmesini desteklemektedir.
- Çıkarımlar, beyni etkileyen hastalıklar için potansiyel müdahalelere kadar uzanmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektör Alakasını
BBB-Minibrain modeli, kan-beyin bariyeri geçirgenliğinin ve hedef etkileşiminin öngörülü değerlendirmesine olanak tanıyarak, erken aşama nöroterapötik geliştirme sürecindeki kritik bir boşluğu doldurmaktadır. İnsanla uyumlu bu in cellulo sistem, ilaç adaylarının mekanistik risklerinin azaltılmasını ve patojen çalışmalarının in vivo testler öncesinde gerçekleştirilmesini destekleyerek, translasyonel güven ve hayvan kullanımının azaltılmasına yönelik endüstri öncelikleriyle uyum sağlar. Standart hücre kültürü iş akışlarıyla olan uyumluluğu, hedef doğrulama ve analiz geliştirme süreçleri için keşif hatlarına entegrasyonunu kolaylaştırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: MSS ilaç iletimi ve patojen-beyin etkileşimlerine ilişkin terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Hedef özgüllüğünün ve bariyer transport mekanizmalarının değerlendirilmesi için tekrarlanabilir, insan hücresi tabanlı bir sistem sağlar.
- Tahmin Değeri: Bariyer geçişini, nöroproteksiyon veya aksonal rejenerasyon gibi nöronlardaki fonksiyonel sonuçlarla ilişkilendirerek erken aşama devam/durdur kararlarını destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Bariyer boyunca gerçekleşen moleküler transport ve bunun sonucunda minibrain kompartmanında meydana gelen hücresel etkiler hakkında kantitatif veriler üretir.
- Operasyonel Değer: Analiz tutarlılığını ve ölçeklenebilirliğini sağlamak için standartlaştırılmış insertler ve iyi tanımlanmış geçirgenlik analizleri (örneğin, Lucifer yellow) kullanır.
- Tarama Hazırlığı: Nöroaktif bileşik kütüphanelerinin veya viral partiküllerin değerlendirilmesi için yüksek içerikli tarama formatlarıyla uyumludur.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translavyonel Süreklilik: İnsan nöronlarının, astrositlerinin ve mikroglial hücrelerinin fenotipik uygunluğunu koruyarak, nöroinvazyon veya nöroproteksiyonun biyobelirteçlerle uyumlu sonuçlarının alınmasını destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: Bariyer geçişi sonrası patojen amplifikasyonunun ve biyobelirteç ekspresyonunun gözlemlenmesine olanak tanıyarak, antiviral veya nöroprotektif adayların değerlendirilmesine temel oluşturur.
- Hastalıkla İlgili Sistem: Nörodejeneratif, enfeksiyöz ve nöroinflamatuar hastalık bağlamlarına uygulanabilir nörovasküler birim etkileşimlerini modeller.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
BBB-Minibrain, beyin maruziyetini ve hedef modülasyonunu değerlendirmek için insanla ilişkili bir platform sağlayarak, özellikle hedef tanımlamanın ardından ve öncü bileşik optimizasyonundan önce, erken keşif sürekliliğine uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Bariyer taşıma mekanizmaları ile ilaçların veya patojenlerin aşağı akış yönündeki nöronal etkileri üzerine hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Bileşiklerin veya virüslerin beyin hücrelerindeki penetrasyonunun, kantitatif aşağı akış okumalarıyla standartlaştırılmış bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır.
- Analitik: Endotelyal geçirgenlik, hücre içi birikim ve nöronlardaki fenotipik değişiklikler (örneğin, nörit rejenerasyonu, marker ekspresyonu) dahil olmak üzere ölçülebilir çıktılar sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Geçirgenlik verilerini fonksiyonel beyin hücresi yanıtlarıyla ilişkilendirerek biyobelirteç uyumunu ve etki mekanizması onayını destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Standartlaştırılmış hücre kültürü teknikleri ve kriyoprezerve edilmiş hücre hatları aracılığıyla projeler genelinde tekrarlı kullanıma uygun şekilde tasarlanmış olup yeniden doğrulama yükünü azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: İnsan bariyer-beyin etkileşimlerini modelleyerek, MSS ilaç iletimi ve hedef etkileşimi konusundaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Erişilebilir hücre kültürü tekniklerini ve standart laboratuvar ekipmanlarını kullanarak, uzmanlık eğitimine olan ihtiyacı minimize eder.
- Stratejik Değer: Erken aşama KKB penetrasyon taramalarında hayvan modellerine olan bağımlılığı azaltarak etik uyumu ve çalışma verimliliğini geliştirir.
- Portföy Etkisi: Doğrulanmış beyin iletimi ve hedefe özgü aktiviteye dayalı olarak, adayların riskle uyumlu önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Endotel, nöronal, astrosit ve mikroglial hücrelerin bakımı dahil olmak üzere insan hücre kültürü konusunda uzmanlık gerektirir.
- Polyester gözenekli membran insertlere ve inkübatörler ile görüntüleme sistemleriyle uyumlu standart 12 kuyucuklu plaka altyapısına bağlıdır.
- Hücre ekim yoğunluklarının, besiyeri formülasyonlarının ve geçirgenlik analizi zamanlamasının ekipler arasında standardize edilmesini gerektirir.
- Alternatif hastalık modellerine adaptasyon, uzun süreli kültür boyunca hücre fenotip stabilitesinin ve bariyer bütünlüğünün doğrulanmasını gerektirebilir.
- Pratik sınırlamalar arasında, primer hücre kaynaklarındaki potansiyel değişkenlik ve veri güvenilirliğini sağlamak için rutin mikoplazma testi ihtiyacı yer alır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Title
0:36
Human Cerebral Microvascular Endothelial Cell (hCMEC)/D3 Insert Coating and Blood Brain Barrier (BBB) Preparation
2:48
BBB-Minibrain Endothelial Permeability Validation
3:38
BBB Crossing and Multiplication of Yellow Fever Viruses in the Minibrain and Biomolecule BBB Crossing and Brain Cell Targeting
5:22
Results: Representative BBB-Minibrain Testing of Neuroinvasive Variants and Biomolecule Properties
7:19
Conclusion
