Name: Gene aktive CRISPR kullanarak uzun kodlamayan RNAların overexpressing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Keşfedin CRISPR teknolojisiyle uzun kodlamayan RNA izoformlarının overekspresyonu için güvenilir bir yöntem. Bu teknik endojen gen-splicing mekanizmasını kullanarak hücrelerde doğal izoformların ifadesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C.P. RO1 DK60729 ve P30 DK 41301-26 tarafından desteklenir. D.P. bir Crohn & kolit Vakfı (CCFA) kariyer geliştirme Ödülü tarafından tedavi desteklenmektedir: sindirim hastalıkları Araştırma Merkezi (DDRC) DK41301 ve UCLA klinik ve çevirim Bilim Enstitüsü (CTSI) UL1TR0001881. UCLA Viroloji çekirdek Merkezi, AIDS Araştırma (CFAR tarafından) finanse edildi 5 P 30 AI028697 verin. UCLA entegre moleküler çekirdek tedavi/P30 tarafından desteklenen teknolojilerin DK041301 verin. Bu eser de UCLA AIDS Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

Not: Bu protokol çoğaltma-eksik lentiviruses kullandığını unutmamak gerekir. Uygun laboratuvar güvenlik eğitimi sonra viral işleme gerçekleştirin. Tüm öğeleri ve işleme sonra en az 10 dk canlı virüs temas yüzeyleri çamaşır suyu. Kullanım tek kullanımlık laboratuvar mont ve yüz/göz koruma yanı sıra çift eldiven, her zaman. Biyogüvenlik seviye 2 + laboratuarlar viral sertifika ile Virus görevi gerçekleştirin. Doku kültürü davlumbaz ve kuluçka viral çalışmaya adamak.
1. vektör Tasarım ve üretimi
Not: GRNA serileri tanımlamak için en iyi yolu online tasarım araçları (örneğin, http://crispr-era.stanford.edu) kullanmaktır (tamamlayıcı şekil 1: gRNA tasarım). Eşlik eden temsilcisi deneme için bir şirket tasarlanmış ve oluşturulan temsilcisi deneyde kullanılan gRNA vektörel çizimler. DCas9 plazmid Ayrıca online satın alınmıştır.
<ol><li>GRNA sıra akıntıya karşı nükleotid dizisi "NGG", "N" aynı zamanda 100 base-çift içinde transkripsiyon başlangıç sitenin herhangi bir nükleotit nerede, yer alır. Orada benzer dizileri ile genom yok diğer site emin olmak için gRNA sırası için genetik veritabanları BLAT (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) gibi arama (tamamlayıcı Şekil 2: BLAT). Bu gRNA sıra faiz (GOI) gen için benzersiz olduğundan emin olun.</li>
	<li>4 ° C'de bakteri taslakları olarak gelir gRNA ve dCas9 plazmid depolamak Escherichia coli dışarı çizgi üzerinde suyu (LB) agar Ampisilin ile (ek tablo 1) plaka ve bakteri 37 ° C'de gecede büyümek bir Luria</li>
	<li>Bir koloni almak ve şiddetle plaka 37 ° C kuluçka makinesine sallayarak bakteri LB 5 ml ile Ampisilin (ek tablo 1) bir gecede büyümek. Ertesi gün, 2 mL ekleyin bakteri LB 200 ml Ampisilin ile büyümek şiddetle 37 ° C kuluçka gecede şişeye sallayarak bir 2 L şişesi.</li>
	<li>Spin aşağı yeri buzda bakteri içeren tüp ve bakteri 3,724 x g 20 dk. Kaldır medya için de.</li>
	<li>
Bakteriyel DNA bir plazmid arıtma kit başına üreticinin iletişim kuralı kullanarak arındırmak. Not: özel resuspension tampon, lizis arabellek, yıkama arabellek, denge arabellek ve elüsyon tampon plazmid arıtma setleri içerir.<ol>
<li>Resuspension arabellek 10 mL teçhizat--dan bakteri ve damlalıklı bakteri çözüm içine ekleyin. Sonra 10 mL lizis arabellek Seti'nden resuspended bakteri ve onları tüp ters çevirme karıştırın. Bakterileri parçalayıcı için 5 dakika bekleyin; sonra buz gibi nötralizasyon arabellek 10 mL Seti'nden lysed bakteri ve onları tüp ters çevirme karıştırın.</li>
		<li>Kit 5 dk. örnekleri DNA sütuna filtre ve filtre üzerinden geçmek çözüm izin dökmek için denge arabellek 10 mL ile DNA sütundan equilibrate.</li>
		<li>Örnekleri 2 yıkama x 30 mL ile yıkama arabellek ve sonra DNA ile 15 mL konik tüp arabellekte elüsyon 30 mL elute. Yavaş yavaş isopropanol eluted DNA üzerine oda sıcaklığında 10.5 mL katman, tüp ters çevir ve hemen 16,200 x g 4 ° C'de 30 dk için de spin</li>
		<li>Süpernatant çıkarın ve 1 mL % 70 etanol DNA Pelet ekleyin. Pelet tüp flicking tarafından resuspend. 16,200 x g 4 ° C'de 10 dakika için de sıralayacağız ve 200 μL damlalıklı bahşiş etanol çoğunu kaldırmak için kullanın. 5 min için Pelet kurumasına ve su 200 μL içinde resuspend ve DNA-20 ° C'de depolayın Beklenen konsantrasyonu olacak > 1 μg/μL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. virüs üretimi ve parçacık sayısı
<ol><li>DCAS9 içeren lentivirus oluşturmak hazır olduğunuzda 100 mm doku kültürü yemekleri ile 5 mL % 0,01 Poli-L-lizin (ek tablo 1) de kat. Aşırı sıvı iyice plakalar kaldır ve onlara bir kaç dakika içinde bir biyogüvenlik kabini için air-dry.</li>
	<li>Yemeğin tam Dulbecco'nın 10 ml başına plaka 5 x 106 HEK 293T hücre kartal orta (DMEM) (ek tablo 1) değiştirilebilir ve onları gecede %5 CO237 ° C'de kuluçkaya. Ertesi gün, orta HEK 293T yemeklerini kaldırmak ve tam DMEM 10 mL ekleyin.</li>
	<li>Plazmid pMDLg/pRRE gag/pol (virüs bileşenleri), içeren Mix 6.5 μg VSV-G (virüsün bileşeni), içeren plazmid pMDG2.G 3,5 μg plazmid pRSV-Rev içeren 2,5 µg Rev (virüsün bileşeni), bir uzun terminal tekrar (10 μg LTR)-vektör gRNA vektör veya LTR içeren bir dCas9 içeren ve bir toplam 450 μL birime su ekleyin. Karışım 0.2 µm filtre bir şırıngaya bağlı bahşiş aracılığıyla filtre.</li>
	<li>2.5 M CaCl2 (ek tablo 1) 50 µL DNA her transfection örneği ekleyin ve karışımı yavaşça. Kalsiyum/DNA karışımı 0.2 µm filtre bir şırıngaya bağlı bahşiş aracılığıyla filtre. Damlalıklı 500 µL 5 mL polistren tüp içine 2 x HBS (ek tablo 1). 500 µL DNA/CaCl2 mix dropwise ve yavaşça girdap ekleyin. 3 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>Yavaş yavaş DNA/CaCl2/HBS süspansiyon 1 mL her yemek için ekleyin. Hemen içeriği eşit dağıtmak için yemekler girdap. Her yemeğin 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka geceleme kuluçkaya</li>
	<li>Günde 3, yavaş yavaş kaldırmak ve bulaşıkları medyadan atın. Dikkatli bir şekilde hücreleri 1 yıkama x fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile. Tam DMEM 20 mM HEPES ve 10 mM sodyum bütrat ile 6 mL ekleyin. 5-6 h 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka için hücreleri kuluçkaya</li>
	<li>Hücreleri 1 yıkama x PBS ile ve 5 mL 20 mM HEPES ile tam DMEM de HEK 293T hücrelere ekleme. 12 h 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka geceleme için kuluçkaya</li>
	<li>Günde 4, HEK 293T hücre supernatants toplamak ve süpernatant filtre. 1 mL aliquots-80 ° C'de dondurmak</li>
	<li>Hazır olduğunuzda virüs kullanmak, bir aliquot (açıklandığı adım 2.8 olarak depolanan) klimalı ortamları buzda içeren viral parçacık çözülme. Tüm reaktifler oda sıcaklığına getirmek.</li>
	<li>
P24 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) kiti mililitre başına viral parçacıkların sayısı ölçmek için kullanın.
	<ol>
<li>Yıkama konsantresi Takımı'ndan 19 bölümleri deiyonize distile su ekleyerek sulandırmak. Takımı'ndan olumlu denetim 200 ng/ml seyreltik, RMPI 1640 eritici ve yapmak kullanarak dilutions 1,5 ml standart eğri için tüpler göre p24 ELISA seyreltme tablosu (ek tablo 2).</li>
		<li>%5 20 μL eklemek belgili tanımlık substrate boş dışında bütün wells için Triton X-100. RPMI 1640 200 μL negatif kontrol wells için ekleyin. Her standardında (yinelenen) 200 μL belirlenen wells için ekleyin.</li>
		<li>Bir Spektrofotometre kullanarak, standart bir eğri kullanarak örnekleri içinde virüs konsantrasyonu ölçmek. 1:1,000, Numune dilüsyonu başlatmak ve birimin standart eğri aralığı içinde olmak için gerektiği gibi değiştirin. Triton X-100 son konsantrasyonu % 0,5 örnekleriyle sulandırmak ve her örneğinin 200 μL RPMI 1640 yılında belirlenen wells için ekleyin. Plaka mühür ve 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya</li>
		<li>6 tabak yıkama x 1 şey başına yıkama arabellek x 300 μL ile. Herhangi bir aşırı sıvı plaka ters çevirme ve kağıt havlu üzerinde dokunarak çıkarın. Dedektör antikor 100 μL teçhizat--dan belgili tanımlık substrate boş dışında bütün wells ekleyin. Plaka mühür ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya Plaka yıkama ve ardından plaka ters çevirme ve kağıt havlu üzerinde dokunarak tarafından herhangi bir aşırı sıvı kaldırın.</li>
		<li>Dedektör antikor ölçmek amacıyla streptavidin horseradish peroksidaz (SA-HRP) kullanım 15 dakika içinde hazır olun. SA-HRP 1: 100 ile SA-HRP seyreltici, seyreltik. Seyreltilmiş SA-HRP iyice karıştırın ve boş dışında bütün wells 100 μL ekleyin. Mühür ve oda sıcaklığında 30 dk plaka kuluçkaya.</li>
		<li>1 yıkama arabellek x ile tabak yıkama ve uzak adım 2.10.4 olduğu gibi herhangi bir aşırı sıvı dokunun. Kemiluminesan, hazırlık 15 dk içinde üretmek için gerekli yüzeylerde peroksidaz sağlar ortho-boya (OPD) substrat çözeltisi kullanın. Bir OPD tablet 11 mL substrat Dilüent için her plaka için kullanın.</li>
		<li>Girdap OPD çözüm şiddetle tamamen erimesi ve ışıktan korumak için. 100 μL OPD substrat çözeltisi, boş da dahil olmak üzere tüm wells için ekleyin. 450 Absorbans okumak bir Spektrofotometre kullanarak nm hemen, bu 10 x 1 s aralıklarla tekrarlayın ve ortalama ölçüm almak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. dCas9 -VP64 iletim
<ol><li>Kültür Jurkat T hücreleri bir T75 şişesi yoğunluklu medya 15 mL 2 x 106 hücrelerinin içinde tam DMEM. 37 ° C kuluçka %5 CO2hücre kültür.</li>
	<li>Spin aşağı vasıl 233 x g 5 min için hücreleri ve sonra onları indirimli serum medya 10 mL resuspend. Bir hemasitometre veya bir otomatik hücre sayaç içeren hücreleri saymak.</li>
	<li>Resuspend ve polybrene (ek tablo 1) bir T75 şişesi ile indirimli serum medya 5 mL 1 x 106 Jurkat hücrelerde plakası. 1 x 106 dCas9 içeren viral parçacıkların içeren HEK 293T klimalı ortam ekleyin. Viral parçacıkların sayısı p24 kabaca hesaplanabilir ELISA 1 μg/mL p24 1 x 107 viral parçacıkların eşittir çünkü. 37 ° C kuluçka %5 CO2şişe koymak.</li>
</ol>4. seçim ve klon oluşturma
<ol><li>Üç gün sonrası enfeksiyon, 233 x g 5 min için de hücreleri aşağı spin ve onları puromisindir (ek tablo 1) ile tam DMEM 10 ml resuspend. T75 şişeler hücrelerde plaka ve onları %5 CO237 ° C'de kültür. 9 günlük bir süre için üçüncü her gün vasıl 233 x g 5 min için hücreleri aşağı spin ve ortamı ile puromisindir tam DMEM ile değiştirin.</li>
	<li>Bir hemasitometre veya bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak. Doku kültürü ile tedavi bir 96-şey plaka üzerinde tam DMEM 100 μL plaka 10.000 hücrelerde ilk puromisindir ile 1:1 tam DMEM puromisindir ile aşağıdaki Wells'le içeriğini de ve seri olarak sulandırmak. 24 dilutions gerçekleştirmek ve bu 4 x plaka başına bir şey başına hücre sayısı yeterli olduğundan emin olmak için yineleyin. %5 CO237 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
	<li>Klonal hücreleri iki 24-şey tabak, sonra 6-şey plaka içine ve sonunda bir T75 şişesi içine genişletin. Üç klonların, plaka 2 x 106 hücre, bir 6-şey tabak iyi üç klonların başına odaklanmak için. Diğer üç kuyu nontransduced Jurkat hücrelerle denetimleri plaka. Hücreleri gecede bir hücre kültür kuluçka makinesine koy.</li>
	<li>RNA ayıklama için piyasada bulunan bir RNA izolasyon kit kullanın. Spin aşağı vasıl 233 x g oda sıcaklığında 5 min için hücreleri ve medyayı çıkarın. 1 mL damlalıklı ipucu lizis arabelleği 350 μL hücrelerde resuspend için kullanın. 350 μL % 70 etanol lysed hücrelere ekleme, 1 mL damlalıklı ile iyice karıştırın ve örnek RNA sütuna aktarmak.</li>
	<li>Lysates 10.000 x g 1 dk. için de spin, akışı aracılığıyla kaldırın ve düşük-sıkılık yıkama arabelleği 700 μL seti için sütun ekleyin. Lysates 10.000 x g 1 dk. için de spin, akışı aracılığıyla kaldırın ve Dnaz 80 µL ekleyin ben çözüm Takımı'ndan sütun; 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya örnekleri ver.</li>
	<li>Lysates 10.000 x g 1 dk. için de spin, akışı aracılığıyla kaldırın ve yüksek-sıkılık yıkama arabelleği 700 µL seti için sütun ekleyin. Lysates 10.000 x g 1 dk. için de spin, akışı sayesinde kaldırmak ve 700 µL düşük-sıkılık yıkama arabelleği sütun ekleyin.</li>
	<li>Ve yeni bir koleksiyon tüp transfer sütun koleksiyon tüpünden çıkarın. Lysates 10.000 x g 1 dk. için de spin ve ardından RNA sütun bir 1,5 mL tüp aktarın. Sütun ve 10.000 x g 1 dk. için spin 50 µL su ekleyin.</li>
	<li>Bir Spektrofotometre RNA konsantrasyonunu ölçmek için kullanın. 100-500 ng/µL, 1.9-2.1 arasında 260/280 Absorbans ile arasında olmak için konsantrasyon bekliyoruz. RNA-80 ° C'de depolayın</li>
	<li>250 µL tüpler, RNA, tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezi arabelleği 4 µL, ters transkriptaz 1 µL 1 µg ekleyin ve son hacmi 20 µL. su hiçbir ters transkriptaz denetimleri içerir. Bir termal cycler içinde cDNA 30 dk 42 ° C'de ve ters transkriptaz devre dışı bırakabilirsiniz 5 min için 95 ° C'de sentez. CDNA 60 µL su ile sonra sentez sulandırmak.</li>
	<li>Polimeraz zincir reaksiyonları (PCR) içeren SYBR yeşil 5 µL, cDNA 4 µL, 0.5 µL ileri astar (10 µM) ve ters astar (10 µM) 0.5 µL hazırlayın. PCR aşağıdaki gibi çalıştırın: 1 = 95 ° C 3 min için adım, 2 = 95 ° C için 10 adım s, adım 3 = 60 ° C 10 s ve o zaman, tekrar adım 2 ve 3 30 x için. Not: DCas9 ileri astar için sıra 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA ve dCas9 ters astar için sıra 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT. Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) için ileriye doğru astar 5'-GACCAGTCAACAGGGGACAT ve ters astar 5'-GCTTGCGACCTTGACCATCT.</li>
</ol>5. gRNA iletim, seçimi, klon oluşturma ve tarama
<ol><li>Doğrulanmış Jurkat-dCas9 hücreleri ile virüs gRNA içeren madde 3 te belirtildiği gibi retransduce. Hücreleri DMEM içinde 10 gün boyunca hygromycin ile (ek tablo 1) seçin. Hücreleri aşağı spin ve medya 3 günde değiştirin.</li>
	<li>Bir seri seyreltme hücre (4.2 adımda anlatıldığı gibi) gerçekleştirmek ve bireysel koloniler (4.3 adımda anlatıldığı gibi) genişletin. RNA kolonilerden tam olarak 4.5 adımda anlatıldığı gibi arındırmak ve 4,9 adımda anlatıldığı gibi cDNA sentez gerçekleştirin. GOI karşı gerçek zamanlı PCR gerçekleştirmek ve HPRT1 veya bir uygun temizlik gene aynı şekilde PCR ile 4.10, adımda anlatılan bu durumda, adım 3 sonra kuyu her döngüsü görüntü hariç.</li>
	<li>GOI8kat değişiklik belirlemek için karşılaştırmalı döngüsü eşik (Ct) yöntemini kullanın. Kısaca, göreli transkript düzeyleri (RTLs) hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın: 2-(GOI Ct ortalama-Ct temizlik gen ortalama). O zaman, denetimlerin ortalama RTL hesaplamak ve tüm RTL değerleri ortalama denetim kontrol örnekleri karşılaştırıldığında bir kat değişiklik oluşturmak için RTL bölün.</li>
</ol>

<ol><li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+of+long+noncoding+RNA+research+from+2007+to+2016%3A+a+bibliometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis.</a> Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).</li>
<li>Derrien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GENCODE+v7+catalog+of+human+long+noncoding+RNAs%3A+analysis+of+their+gene+structure%2C+evolution%2C+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression.</a> Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).</li>
<li>Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+conservation+of+long+non-coding+RNAs%3B+sequence%2C+structure%2C+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).</li>
<li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Maeder, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+RNA-guided+activation+of+endogenous+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes.</a> Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).</li>
<li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Gomez, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NeST+long+ncRNA+controls+microbial+susceptibility+and+epigenetic+activation+of+the+interferon-gamma+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus.</a> Cell. 152 (4), 743-754 (2013).</li>
<li>Padua, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long+noncoding+RNA+signature+for+ulcerative+colitis+identifies+IFNG-AS1+as+an+enhancer+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).</li>
<li>Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+Th1+genomic+locus+from+Ifng+through+Tmevpg1+by+T-bet%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet.</a> Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).</li>
<li>Kotake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNA+ANRIL+is+required+for+the+PRC2+recruitment+to+and+silencing+of+p15%28INK4B%29+tumor+suppressor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene.</a> Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Scale+CRISPR-Mediated+Control+of+Gene+Repression+and+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li>
<li>Cheng, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+activation+of+endogenous+genes+by+CRISPR-on%2C+an+RNA-guided+transcriptional+activator+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.</a> Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).</li>
<li>Matouskova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+genes+for+real-time+PCR+quantification+of+messenger+RNAs+and+microRNAs+in+mouse+model+of+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity.</a> PLoS One. 9 (1), e86033(2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu el yazması CRISPR aktive lncRNAs tüp bebek overexpress kullanmak için bir protokol sunar. Transcriptomic ürün işlevsel birim olduğu gibi uzun kodlamayan RNA'ların okurken bu özellikle önemli bir tekniktir. Overexpression sonra araştırmacı, bu hücreler bağlama ortakları okurken sinyal-gürültü oranı artırmak ve bile lncRNAs, daha yüksek düzeyde hücresel sonuçlarını ölçmek için kullanabilirsiniz. Ayrıca, lncRNAs sık sık CIS-genler üzerinde hareket gibi bu endojen overexpression teknik eğitimi11<su...

En Biyomedikal Araştırma protein kodlayıcı transkript üzerinde odaklanmıştır iken, kopya etmek genler çoğunluğu aslında kodlamayan RNA'ların (Ensembl yayın 93) oluşur. Mevcut araştırma lncRNAs katlanarak 2007 2017 ve1arasında yükselen hastalığı süreçlerde yayın numarasıyla bu alanı keşfetmeye başlıyor. Bu yayınların birçok lncRNAs hastalığı ile ilişkili olduğunu gösterir. Ancak, bu lncRNAs moleküler mekanizmaları ile karşılaştırıldığında mRNA'ların farklı işlevleri nedeniyle çalışma zordur. LncRNAs hastalığında rolünün anlaşılması sorunu bileşik, lncRNAs çoğunlukla RNA'ların2kodlama daha alt seviyelerde ifade edilir. Ayrıca, lncRNAs kötü, hangi insan-cep-satır-tabanlı teknikleri3fonksiyonel çalışmalar sınırlar korunmuş. Roman bu genlerin mekanizması çalışmaya bir yöntem endogenously onları kültürlü hücrelerde overexpress sağlamaktır. Overexpression çalışmaları belirli genler işlevi hakkında önemli bilgileri sağlar ve araştırmacılar anahtar moleküler yolları incelemek için etkinleştirin.
LncRNA genlerin transkripsiyon etkinleştirmek için yeni bir yöntem başlangıçta Gersbach laboratuvar4tarafından geliştirilen CRISPR teknolojileri temel alır. Bu iletişim kuralı kullanmak üzere lncRNA Biyoloji ve diğer model sistemleri bu genlerin ifade için adapte edilmiştir. Teknik overexpressing CRISPR içinde CRISPR ilişkili protein 9 (Cas9) adı verilen bir protein DNA dizisi ile Cas9 tarafından tanınan bir antianlamlı gRNA doğru yönlendirilmiş olabilirsiniz. Normalde, Cas9 DNA bölünme neden; Ancak, daha önce için overexpression tekniği, gelişmiş değil Cas9, mutasyonların bu adım5devre dışı bırakın. Ne zaman bir transkripsiyon harekete geçirmek için bir "ölü" Cas9 erimiş (dCas9) ve hücre satır içine transduced, elde4,6lncRNAs endojen overexpression olabilir. GRNA için bağlamak ek transkripsiyon faktörleri etkinleştirme gRNA, ek değişiklikler ek dCas9 gen harekete geçirmek sistem etkinliği arttı 10 kat7. Önemlisi, yakın bir konumda istemek transkripsiyon harekete geçirmek gösterilmiştir (< 200 bp) transkripsiyon için site genler, belirli bir upregulation gen zengini alanları7etkinleştirme başlatın. CRISPR nakavt teknolojileri farklı olarak, dCas9 ve gRNA kaset hücreler bir overexpression birden fazla kuşaklara korumak için izin vermek için genom entegre edilecek gerek. Bunu başarmak için bir yöntem lentiviruses dCas9 ve gRNA içeren kaset tümleştirmek için kullanmaktır. Entegrasyon sonra lncRNA gen ekspresyonu belirlenebilir.
Bu makalede, lncRNA overexpression Jurkat T-hücre modeli için bir protokol gösterilecektir. Adım adım bir yordam gösterilir ve aynı zamanda yapisan hücrelerine adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Ampisilin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>cDNA sentez kiti (iScript)</td><td>BioRad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>dCas9 ileri astar</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>n/a</td><td>5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA&nbsp;</td></tr><tr><td>dCas9 ters astar</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>n/a</td><td>5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT</td></tr><tr><td>dCas9 vektör</td><td>Addgene</td><td>50918</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10013CM</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Acros Organics</td><td>61509-0010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>gRNA plazmid</td><td>Vektör Oluşturucu</td><td>VB180119-1195qxv</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T hücreleri</td><td>ATCC&</td><td>nbsp; CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HPRT1 ileri astar</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>n/a</td><td>GACCAGTCAACAGGGGACAT&nbsp;</td></tr><tr><td>HPRT1 ters astar</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>n/a</td><td>GCTTGCGACCTTGACCATCT</td></tr><tr><td>Higromisin B</td><td>Corning</td><td>MT3024CR</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618-500</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat hücreleri</td><td>ATCC&</td><td>nbsp; TIB-152</td><td>klonu E6-1</td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Corning</td><td>25005Cl</td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-500</td><td></td></tr><tr><td>LB et suyu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-2</td><td></td></tr><tr><td>Maxi-hazırlık kiti (Plazmid Saflaştırma Kiti)</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>NIST2186II</tr><tr><td>Optimem I serum ortamını azalttı&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>p24 elisa</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEK050B</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CMR</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin ve streptomisin</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>pMDG2.G</td><td>Addgene & nbsp;</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Ekle&nbsp;</td><td># 60488</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lizin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-4832</td><td></td></tr><tr><td>Polibren</td><td>EMD Millipore</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-REV</td><td>Addgene</td> <td># 12253</td><td></td></tr><tr><td>Puromisin dihidroklorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>RNA saflaştırma kiti (Aurum RNA mini)</td> <td>BioRad</td><td>7326820</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Butirat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>SYBR yeşil (iTaq evrensel)</td><td>BioRad</td><td>1725122</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

gene aktive crispr kullanarak uzun kodlamayan rna'ların overexpressing

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Uzun kodlamayan RNA (lncRNA) Biyoloji Araştırma yayınları 2007 yılından bu yana katlanarak büyüyen bu alandan sayısı ile yeni ve heyecan verici bir alandır. Bu çalışmalar lncRNAs hemen hemen tüm hastalıklarda değişmiş doğruladı. Ancak, lncRNAs hastalığı bağlamında için işlevsel roller eğitim eksikliği protein ürünleri, doku özgü ifade, düşük ifade düzeyleri, splice formları karmaşıklığı ve türler arasında koruma eksikliği nedeniyle zor kalır. Species-specific ifade göz önüne alındığında, lncRNA çalışmalar genellikle hastalık süreçleri okurken insan araştırma bağlamları için kısıtlanır. LncRNAs moleküler düzeyde işlev beri lncRNA Biyoloji incelemek için bir yol lncRNA kaldırmak veya lncRNA ve ölçü hücresel etkileri overexpress etmektir. Bu makalede, lncRNAs tüp bebek overexpress için bir yazılı ve görüntülenmeyecektir protokol sunulmuştur. Temsil edici bir deney olarak, inflamatuvar barsak hastalığı, Interferon gama Antisens 1 (IFNG-AS1) ile ilişkili bir lncRNA bir Jurkat T-hücre modeli overexpressed gösterildi. Bunu yapmak için aktive kümelenmiş düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) tekniği overexpression endojen genomik loci, etkinleştirmek için kullanılır. Aktive CRISPR tekniği transkripsiyon faktörleri lncRNA splice yükseltgen sağlam bir overexpression sağlayan bir gen transkripsiyon başlangıç siteye birtakım hedefler. Bu yordamı üç adım, yani (i) Kılavuzu RNA (gRNA) tasarım ve vektör inşaat, (ii) virüs üretimi ve iletimi ve (III) koloni tarama overexpression için içine bölünmüş. Temsilcisi bu deneme için bir IFNG-AS1 Jurkat T hücrelerinde 20-fold geliştirme gözlendi büyüktür.

LncRNA IFNG-AS1 overexpress için bir ikili vektör sistemi LncRNA IFNG-AS19ifade Jurkat T-hücre modeli sistemi overexpression bu el yazması olarak örnek deneydir. IFNG-AS1 Interferon gama10düzenleyen görülen iltihabi bağırsak hastalığı ile ilişkili bir lncRNA var. IFNG-AS1 gene aynı transkripsiyon başlangıç site (şekil 1A) hepimize üç ek yeri değişik içerir. Bu nedenle, 10 ve 100 bp transkrips...

Geleneksel overexpression cDNA tabanlı teknikleri sınırlı uygulanabilirliği için potansiyel işlevselliği ile birden çok ek yeri formlarını nedeniyle uzun kodlamayan RNA'ların overexpression var. Bu inceleme birden çok ek yeri değişik-in uzun kodlamayan RNA overexpress için CRISPR teknolojisini kullanan bir iletişim kuralı bildirir.

Gene aktive CRISPR kullanarak uzun kodlamayan RNA'ların overexpressing

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Kodlamayan RNA'larda genellikle birden çok isoform olur. In vitro aşırı ekspresyon çalışmalarında, tüm bu ifade edilmiş isoformları incelemek genellikle zordur. Bu teknik, kullanıcıların doğrudan genomdan ifade elde etmelerini ve hücrelerin kodlamayan belirli bir RNA için endojen İzoformları ifade etmelerini sağlar.Bu güçlü teknik, kullanıcının genomdaki herhangi bir genin ifadesini doğruluk ve doğrulukla özellikle yönlendirmesini sağlar. Belirli genlere kılavuz RNA'lar tasarlayarak, belirli bir hücredeki doğal isoformları ifade etmek için endojen gen birleştirme makinelerini kullanabilmek mümkündür. Prosedürü gösteren Robert Rankin, benim laboratuvarımdan bir post-doc olacaktır.Transkripsiyonel başlangıç sitesinin 100 baz çifti içinde yer alan kılavuz RNA dizisini tasarlamak için, kılavuz RNA'nın ilgi genine özgü olduğundan emin olmak için BLAT gibi genetik veritabanlarını kullanın. Kılavuz RNA'yı ve devre dışı bırakılmış Cas9 plazmidlerini dört santigrat derecede saklayın. Ampicillin ile luria suyu agar plaka üzerinde E.coli dışarı Çizgi ve 37 santigrat derece bir gecede bakteri büyümek.Ertesi gün, bir koloni seçin ve bir gecede ampisilin ile LB beş mililitre bakteri büyümek, şiddetle 37 derecelik santigrat kuvöz tüp sallayarak. Ertesi gün, iki litrelik bir şişe de ampisilin ile LB 200 mililitre bakteri iki mililitre ekleyin, şiddetle 37 derecelik santigrat kuvöz de bir gecede şişe sallayarak. Bakterileri 3, 724 kez 20 dakika boyunca aşağı doğru çevirin ve DNA arınmaya devam edin.dCas9 içeren lentivirüs oluşturmak için, ilk kat 100 mililitre doku kültürü yemekleri ile beş mililitre ile 0.01% Poli-L-L-Lizin ve plaka beş milyon HEK293T hücreleri çanak başına tam Dulbecco's Modifiye Eagles Orta 10 mililitre, sonra bir LTR içeren kılavuz RNA vektör veya bir LTR içeren Cas9 içeren vektör plasmids bileşenleri içeren bileşenleri içeren 10 mikrogram karıştırarak DNA transfeksiyon örnekleri hazırlamak. Toplam hacmi 450 mikrolitre ye su ekleyin ve karışımı şırıngaya bağlı 0,2 mikronluk bir filtre ucuyla filtreleyin. Daha sonra, DNA'nın her transfeksiyon örneğine 50 mikrolitre 2,5 molar kalsiyum diklorür ekleyin ve hafifçe karıştırın.Kalsiyum-DNA karışımını şırıngaya bağlı 0,2 mikronluk bir filtre ucuyla filtreleyin. Pipet 500 mikrolitre 2X HBS beş mililitre polistiren tüp içine. Kalsiyum-DNA karışımı damla ve yavaşça girdap 500 mikrolitre ekleyin.Üç dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat. Her HEK293T içeren doku kültürü çanak dna-kalsiyum HBS süspansiyon bir mililitre ekleyin ve bir gecede 37 derece santigrat derecede% 5 karbondioksit kuluçka onları kuluçka. Üçüncü gün, yavaşça kaldırın ve bulaşıklardan medya atın.Hücreleri pbs ile dikkatlice yıkayın. 20 milimolar HEPES ve 10 milimolar sodyum bütirat ile takviye tam DMEM altı mililitre ekleyin. Sonra hücreleri %5 karbondioksit kuvözde 37 derecede 5-6 saat kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra hücreleri bir kez PBS ile yıkayın ve HEK293T hücrelerine 20 milimolar HEPES ile beş mililitre tam DMEM ekleyin. Hücreleri %5 karbondioksit kuvözde 37 derecede 12 saat kuluçkaya yatırın. Dördüncü gün, HEK293T hücre supernatants toplamak ve virüs içeren supernatant filtre.Viral partikül sayılarına başlamak için, önce p24 ELISA kitinden yıkama konsantresini 19 parça distile, deiyonize su ekleyerek seyreltin. Daha sonra, seyreltici olarak RPMI 1640 kullanarak mililitre başına 200 nanogram bu kiti pozitif kontrol seyreltmek ve P24 ELISA seyreltme tablosuna göre 1.5 mililitrelik tüpler standart bir eğri için seyreltme yapmak. Numuneler içindeki virüsün konsantrasyonunun ölçülmesi için numune seyreltmelerini 1:1000'den başlayan 96 kuyuluk bir plakanın belirlenmiş kuyularına ekleyin ve standart eğrinin menzilinde olmak için hacmi gerektiği gibi değiştirin.Daha sonra triton X-100 ile numuneleri %0,5'lik son konsantrasyona seyreltin ve belirlenen kuyulara her numunenin 200 mikrolitresini ve RPMI 1640'ı ekleyin. Plakayı kapatın ve 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın. 1X yıkama tamponunun kuyubaşına 300 mikrolitre ile plakayı yıkayın.Plaka ters çevirerek ve bir kağıt havlu üzerine dokunarak herhangi bir fazla sıvı çıkarın. Daha sonra 100 mikrolitre dedektör antikor ekleyin kiti boş substrat hariç tüm kuyulara. Plakayı kapatın ve 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın.Plakayı yıkayın ve sonra plaka ters çevirerek ve bir kağıt havlu üzerine dokunarak herhangi bir fazla sıvı çıkarın. Dedektör antikor ölçmek için, SA-HRP seyreltici ile 1:100 seyreltme streptavidin horseradish peroksidaz seyreltmek. Seyreltilmiş SA-HRP iyice karıştırın ve boş hariç tüm kuyulara 100 mikrolitre ekleyin.30 dakika oda sıcaklığında plaka mühür ve kuluçka. Daha sonra, 1X yıkama tampon ile plaka yıkayın ve herhangi bir fazla sıvı uzak dokunun. Bir tabak için yeterli substrat çözeltisi yapmak için substrat diluent 11 mililitre bir orto-fenilenediamin tablet bırakın.Vortex OPD çözeltisi şiddetle tamamen eritmek ve ışıktan korumak için. Boş dahil olmak üzere tüm kuyulara 100 mikrolitre OPD substrat çözeltisi ekleyin. Spektrofotometre kullanarak, emmeyi hemen 450 nanometrede okuyun.Bir saniyelik aralıklarla 10 kez tekrarlayın ve ortalama ölçümü alın. Resuspend ve kültür Jurkat T-hücreleri polibren ile azaltılmış serum media beş mililitre bir milyon hücre yoğunluğu ile bir T75 şişesinde. Ardından, bir milyon dCas9 içeren viral partikül içeren HEK293T klimalı ortam ekleyin.Hücreleri %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın. Üç gün sonra enfeksiyon, beş dakika için 233 zaman g hücreleri aşağı spin ve tam DMEM 10 mililitre püromisin ile takviye onları yeniden askıya. Kültür T75 şişeleri hücreleri ve% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece onları kuluçka.Dokuz günlük bir süre için her üç günde bir, hücreleri 233 kez g beş dakika boyunca aşağı spin ve puromisin ile takviye tam DMEM ile medya değiştirin. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. Daha sonra, doku kültürü tedavi doku ile 96-iyi plaka üzerinde, ilk kuyuda püromisin ile desteklenen tam DMEM 100 mikrolitre 10.000 hücreleri ekleyin.Puromisin ile desteklenen tam DMEM ile aşağıdaki kuyuların içeriğinin 1:1 seri seyreltme olun. Hücreleri %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın. Klonal hücreleri iki 24 kuyuplakaya genişletin, sonra klonların üçü için altı kuyulu bir plakanın kuyusu başına iki milyon hücreyi kapatın.Kontrol olarak transeme olmayan Jurkat hücreleri ile diğer üç kuyu plaka. Son olarak, hücreleri bir T75 şişesine koyun ve hücreleri bir gece boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine koyun. Gen ekspresyonunu ölçmek için kantitatif PCR'ye başlamak için, ilk olarak bir mikrogram RNA, dört mikrolitre cDNA sentez tamponu ve bir mikrolitre ters transkriptaz ile 250 mikrolitrelik son hacmine su ekleyerek tamamlayıcı DNA sentezleyin.Daha sonra, 42 santigrat derecede 30 dakika ve 95 santigrat derecede bir termal döngücünü kullanarak ters transkriptazı inaktive edin. Sentezden sonra 60 mikrolitre su ile cDNA seyreltin. 10 mikromolar, beş mikrolitre SYBR yeşili ve dört mikrolitre cDNA konsantrasyonunda her bir ileri ve ters astarın 0,5 mikrolitresini içeren tüpler için polimeraz zincir reaksiyonları çalıştırın.Son olarak 10 gün boyunca Hygromisin B ile desteklenen DMEM'deki Jurkat-dCas9 hücrelerini seçin. Hücreleri aşağı çevirin ve her üç günde bir ortamı değiştirin. RNAse'yi arındırın ve RT-qPCR'ye ilerleyin.Bu çalışmada, transkripsiyonel başlangıç sitesinden 10 ila 100 baz çifti uzaklıkta bulunan GRNA dizileri, cas9 aktive kompleksini inflamatuar barsak hastalığı ile ilişkili uzun bir kodlamayan RNA olan IFNG-AS1'in transkripsiyonel lokusuna yönlendirmek için kullanılmıştır. Çift transeksif hücrelerin seçimini sağlamak için, iki plazmid sistemi hücrelere dCas9 veya gRNAAse arttırıcıları nakletmek için kullanılmıştır. Burada MS2 proteinleri IFNG-AS1 aşırı ekspresyonu artırmak.Cas9 ifadesi her iki klon için de doğrulandı. HPRT1'e karşı astarlar, transeneden olmayan hücrelerde RNA varlığını doğrulamak için kullanıldı. mRNA ekspresyonu cDNA reaksiyonundan ters transkriptaz atlayarak doğrulandı.IFNG-AS1'in üç splice varyantı, transkripte özgü astar kümeleri veya bilinen tüm IFNG-AS1 transkriptlerine karşı bir astar seti ile tespit edilebilir. Tüm floresan eğrileri, kontrol ve IFNG-AS1 gRNA ifade eden hücreler arasında yarım döngü içinde üstel faza ulaşan HPRT1 temizlik geni HPRT1 ile üstel olarak elde edildi. Bilinen tüm IFNG-AS1 transkriptlerine karşı astarlar deneyler arasında en çok saptanabilen ler olup, IFNG-AS1 ekspresyonunda 20 kat artış lar yapıldı.Ancak IFNG-AS1'in üçüncü transkripti IFNG-AS1 düzeylerinde beş ila 10 kat anlamlı bir artış gösterdi. İstediğiniz geni aktif olarak aşırı eksprese etmek için, 2.1. Ayrıca, kaliteli viral parçacıkların üretimi protokol bileşenlerisağlam bir ifade sağlayacaktır.İstenilen gen aşırı eksprese edildikten sonra gen mekanizmalarını araştırmak için fonksiyonel çalışmalar yapılabilir. Örneğimizde, ilgi genimizin aşırı ekspresyonu sonrasında sitokin üretimine bakmayı seçtik. Bu teknik ilk olarak 2013 yılında Griesbach Grubu tarafından geliştirilmiş ve diğer gruplar tarafından geniş ölçüde uygulanmış ve ayrıntılı olarak geliştirilmiştir.Bu tekniği, belirli işlevlerini keşfetmek için uzun kodsuz RNA'lara uygulayacak ları için heyecanlıyorduk. Replikasyon kusurlu lentivirüsler viral çalışma için onaylanmış bir laboratuvarda ele alınmalıdır. Ayrıca, insan hücre hatları ve E.coli bakterileri biyolojik olarak tehlikeli olarak kabul edilir.Son olarak, rekombinant DNA plazmidleri eğitimli personel tarafından ele alınmalıdır.

overexpressing-long-noncoding-rnas-using-gene-activating-crispr

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Geliştirici aktivitenin deneysel doğrulamasına en iyi fonksiyon kaybı analizi ile yaklaşılır. Burada, hibrit bir genom (Mus musculus129 x Mus castaneus) içeren F1 ES hücrelerinde gen transkripsiyonunun alele özgü regülasyonunu incelemek için CRISPR/Cas9 aracılı delesyon kullanan etkili bir protokol sunulmaktadır.

Yaratma CRISPR / Cas9 aracılığı monoallelik Delesyonlar Fare Embriyonik Kök Hücreleri Artırıcı Fonksiyonu Eğitim için

CRISPR / Cas9 sistemi bilimsel topluluk hedeflenen genom düzenleme erişilebilir ve uygun fiyatlı hale getirmek için potansiyel sunmaktadır. Bu protokol CRISPR / Cas9 sistemi kullanılarak ilgilenilen geni nakavt, sonra yetişkin fare beyninin içine stereotaxically onları enjekte edecektir virüsleri oluşturmak için nasıl göstermek için tasarlanmıştır.

Tasarımı, Ambalaj ve Yüksek Titre CRISPR Retro ve Lentivirüslerden teslimi Stereotaksik enjeksiyon yoluyla

Kromatin döngü gen düzenlemesi içinde önemli bir rol oynar; Ancak, kromatin döngüler seçici ve tersinir değişikliği için izin hiçbir teknolojik gelişmeler olmuştur. Burada biz kromatin döngü yeniden yapılanma için güçlü bir sistemi tarif CRISPR-dCas9 (CLOuD9), seçmeli olarak ve geri dönülebilir olarak gen ekspresyonu, modüle gösterdi kullanarak hedef loci.

Kromatin döngü yapısı yeniden yapılanma CRISPR-aracılı

Bu iletişim kuralını tasarlayın ve çoğaltılmış arttırıcılar deactivating füzyon protein SID4X-dCas9-KRAB, olarak da bilinen artırıcı girişim (Enhancer-i) ile hedefleme gerçekleştirmek için gereken adımları açıklar. Bu iletişim kuralı gen ekspresyonu düzenleyen arttırıcılar tanımlaması sağlar ve ortak bir hedef geni düzenleyen arttırıcılar arasındaki ilişkileri diseksiyon kolaylaştırır.

Diseksiyon artırıcı işlevi hücre hatlarında Multiplex artırıcı CRISPR tabanlı girişim kullanma

Önceden monte edilmiş Cas9/guide RNA ribonükleoprotein komplekslerinin doğrudan teslimi hematopoetik hücrelerde genom düzenleme için hızlı ve etkili bir araçtır. Burada, bir RUNX1 intronic susturucu silmek ve OCI-AML3 lökemik hücrelerde transkripsiyonel yanıtları incelemek için bu yaklaşımı kullanır.

Akut Miyeloid Lösemi Hücrelerinde CRISPR/Cas9 Ribonükleoprotein ile RUNX1 Intronic Susturucunun Transkripsiyonel Rolünün İncelendirin

Burada, shield-1 adlı küçük molekül altında düzenli olarak kümelenmiş kısa palindromik tekrar- (CRISPR-) ilişkili protein 9'un (Cas9) zamansal ve koşullu stabilizasyonuna dayanan bir genom düzenleme aracı tarif ediyoruz. Yöntem kültürlü hücreler ve hayvan modelleri için kullanılabilir.

Koşullu Cas9 Stabilizasyonunu Kullanarak Gen fonksiyonlarını değerlendirmek için Yeni Bir Araç Seti

Burada, yüksek, uzun vadeli, kararlı, hedefe yönelik susturma verimliliğine ve düşük genom çapında, hedef dışı aktiviteye sahip tasarlanmış transkripsiyonel baskılayıcıların (ETR'ler) in vitro seçimi için bir protokol sunuyoruz. Bu iş akışı, aday ETR'lerin başlangıçtaki karmaşık repertuarını, terapötik olarak ilgili ortamlarda daha fazla değerlendirme için uygun olan kısa bir listeye indirgemeye olanak tanır.

In Vitro Hedeflenen Epigenetik Susturma için Tasarlanmış Transkripsiyonel Baskılayıcıların Seçimi

CRISPR-Cas sistemleri ve anti-CRISPR proteinleri, Saccharomyces cerevisiae'deki Boole kapılarının şemasına entegre edildi. Yeni küçük mantık devreleri iyi performans gösterdi ve hem dCas9 / dCas12a tabanlı transkripsiyon faktörlerinin hem de anti-CRISPR proteinlerinin özelliklerinin anlaşılmasını derinleştirdi.

CRISPR-Cas Sistemlerine ve Anti-CRISPR Proteinlerine Dayalı Gen Dijital Devreleri

Bu çalışma, melanom hücrelerinde uzun kodlamayan RNA'ları hedefleyen ikili bir CRISPRi sistemi sunmaktadır. Potansiyel terapötik stratejiler için kansere özgü lncRNA etkileşimlerini belirleyerek kombinatoryal gen yıkımı ve sentetik ölümcül taramayı mümkün kılar.

Kanser Hücrelerinde Kodlamayan RNA'lar Arasındaki Sentetik Ölümcül Etkileşimleri Hedeflemek için Çift CRISPR-Girişim Stratejisi

Genom çapında bir CRISPR / Cas9 tarama yönteminin uygulanması yoluyla dirençli ve hassas radyasyon genlerini seçmek için titiz ve yapılandırılmış bir yaklaşım verilmiştir. Bu protokol aynı zamanda klinik olarak uygulanan kimyasal ilaçlara direnç mekanizmalarını araştıran diğer araştırma çabaları için çok yönlü bir çerçeve olarak hizmet etme potansiyeline sahiptir.

Radyosensitif ve radyodirençli genleri ortaya çıkarmak için genom çapında CRISPR ekranı

Keşfedin CRISPR teknolojisiyle uzun kodlamayan RNA izoformlarının overekspresyonu için güvenilir bir yöntem. Bu teknik endojen gen-splicing mekanizmasını kullanarak hücrelerde doğal izoformların ifadesini sağlar.

Gene aktive CRISPR kullanarak uzun kodlamayan RNA'ların overexpressing

Daha fazla video keşfet