Üç boyutlu kemik hücre dışı matriks modeli osteosarkom için
April 12th, 2019
Kemik hücre dışı Matriks (BEM) modeli osteosarkom (OS) için de kurulan ve gösterilen işte. Bu uygun bir iskele birincil tümör büyüme vitro taklit ve OS histolojik ve cytogenic heterojenlik eğitim için ideal bir model sağlamak için kullanılabilir.
Bu yöntem kemik tümörü araştırma için fonksiyonel iskelehazırlamak için etkili bir strateji sağlar. Kemik ekstraselüller matriks desellize, osteosarkom hücrelerinin sağkalım ve faaliyetleri için değişken seropatigösterdi. Bu tekniğin en büyük avantajı kemik kaynaklı matriks osteosarkom hücrelerinin klinik osteosarkom histopatolojisine benzer yüksek heterojen morfoloji göstermesidir.
Bu yöntem osteosarkom, Ewing sarkomu ve diğer malign tümörlerin kemiğe metastazı gibi kemik tümörlerinin ilaç hassasiyetlerinin gelişimini, ilerlemesini araştırmak için ideal bir model sağlar. Başlamak için, steril cerrahi makas kullanarak bir fare ötenazi sonra, dört ila altı haftalık BALB / c fareler elde, taze fibula kesti, tibia, ve bir arka ekstremite uyluk uyluk. Cımbız yardımıyla, epitel doku soyma, ve sonra mümkün olduğunca yumuşak doku kadar kaldırmak.
Altı santimetrelik bir tabaktaki kanı çıkarmak için bacak kemiklerini steril 10 mM PBS solüsyonu yla iki kez durulayın. Kemikleri üç dakika boyunca %75 etanol ile bir tabağa batırın ve iki kez PBS ile durulayın. Temiz kemikleri steril 50 mililitrelik santrifüj tüpünde steril PBS tüpü yle 80 santigrat derecede saklayın.
Donmuş kemikleri oda sıcaklığında eritin ve bir saat boyunca 80 derecede tekrar dondurun. Kemikleri hücre likisi ve doku bozulması için ikiden fazla donma-çözülme döngüsüne tabi tart.rölanti. Sonra, steril bir 50 mililitre santrifüj tüp 0.5 normal HCl ile dolu kemikleri yerleştirin ve kemiklerin tam ve eşit kapsama sağlamak için nazik sallayarak bir yörünge shaker oda sıcaklığında gece boyunca kuluçka.
Kireçlenmeden sonra hidroklorik asit çözeltisini tamamen decantın ve akan suyun altındaki kemikleri bir saat durulayın. Daha sonra, orbital shaker üzerinde yıkama başına 15 dakika boyunca iki kez kemikleri yıkamak için distile su kullanın. Çözeltiyi tamamen dekant.
Demineralize kemiklerde lipidler ayıklamak için, metanol ve kloroform 1:1 karışımı ile 50 mililitrelik santrifüj tüp kemikleri yerleştirin. Kloroform ayrışmayı önlemek için ışığı önlemek için tüpü folyo ile sarın. Ve tüpü bir saat boyunca orbital shaker'a koy.
Sonra, 30 dakika kalay folyo ile metanol başka bir tüp içine kemikleri aktarmak için cımbız kullanın. Metanol tamamen çıkarın ve bir orbital shaker üzerinde 15 dakika boyunca iki kez distile su ile yıkayın. Decant son yıkama suyu ve steril koşullar altında devam edin.
Kemikleri altı santimetrelik bir tabakta steril PBS ile üç dakika durulayın. 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne 40 mililitre steril %0,05 TE çözeltisi ekleyin ve 37 santigrat derecede karbondioksit kuvözde 23 saat boyunca inkübasyon kemikleri. TE çözeltisini atın ve 90 g/mL ampisilin ve 90 g/mL kanamisin ile desteklenen steril PBS ile iki kez iki kez orbital shaker'da 15'er dakika boyunca durulayın.
Son yıkama tamamen decanting sonra, antibiyotikler ile steril PBS 40 mililitre ile tekrar yeniler. Gözenekli alanların etkili sterilizasyonunu sağlamak için hafif sallayarak oda sıcaklığında 24 saat boyunca iyice yıkayın. Sonra, antibiyotikler ile steril PBS ile dolu bir 50 mililitrelik santrifüj tüp içine kemikleri aktarın.
Hazırlanan Kemik Ekstrasellüler Matris iki ay boyunca dört santigrat derecede saklanabilir. BEM'i bir tabağa %75 etanol batırın ve 30 saniye boyunca yavaşça elle sallayın. Sonra PBS ile 30 saniye, iki kez durulayın.
BEM'i temiz bir altı kuyulu hücre kültür plakasına aktarın. Her kuyuya iki mililitre tam kültür ortamı ekleyin. BEM'i bir gecede karbondioksit kuvözde 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Gösterge fenol kırmızısı içeren önceden ısıtılmış PBS 100 mikrolitre insan işletim sistemi hücre hatları elde edin. 5 yaklaşık konsantrasyonu 1 kez 10 ile 5 os hücreleri askıya almak için bir pipet kullanın. BEM tamamen orta batırılmış sonra, proksimal veya distal epifiz, BEM medüller kavite için iğne delmek ve BEM içine işletim sistemi hücreleri enjekte.
Enjekte edilen hücrelerin BEM'e sıkıca yapışmasını sağlamak için OS-BEM modelini 37 santigrat derecede nemlendirilmiş %5 karbondioksit atmosferinde en az iki saat kuluçkaya yatırın. Sonra, kuvözden tabağı çıkar. Tabağa bir mililitrelik kültür ortamı ekleyin ve BEM kültürünün yüzeyini tamamen kaplamak için bir gece boyunca kuvözde saklayın.
OS-BEM modelini steril bir cızırdayan altı kuyunun yeni bir kuyusuna yavaşça aktarın ve bir mililitrelik taze kültür ortamını yeniden besleyin. Kültür kuvözde 14 gün boyunca model. 14 günlük kuluçka süresi boyunca orta renkleri izlemeye devam edin.
Ortam turuncuya, hatta sarıya dönerse, eski ortamın yarısını atarak ve işletim sistemi hücreleri için sağlıklı bir ortam sağlamak için yeni bir ortam ekleyerek ortamı hemen yenileyin. Ters floresan mikroskobu altında hücre durumunu izlemeye devam edin. İşletim sistemi hücreleri tabağa genişlettiğinde, OS-BEM modelini steril cımbızlı yeni bir kuyuya nazikçe aktarın.
14 günlük kültürden sonra, kültür ortamını kaldırmak için OS-BEM modelini PBS ile hafifçe durulayın. Sonra 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve histolojik tanımlamayı düzeltmek için %10 tamponlu formalin ekleyin. Demineralizasyon ve desellülerizasyondan sonra BEM, yerli fare kemiğine göre daha güçlü esneklik ve azmi ile yarı saydam görüner.
Medüller kavite alanında biraz kas kalıntısı açıkça görülebilir. Yerli kemik ve hücredışı BEM parlak alan görüntüleme, hücre çekirdeklerinin tam olarak çıkarılmasını gösterir. Kollajen ağ düzenlemesindeki doğal gözenekli yapı, hücredışı BEM'de iyi korunmuştür.
Ayrıca, Kollajen I ve Kollajen IV için immünohistokimyasal boyama ekstrasellüler matriks ana bileşenleri decellularization sonra fare tibia korunur gösterir. 14 günlük kültür boyunca, hem periost hem de endosteum işletim sistemi hücrelerinin genişlemesi ile sızmış. Hücreselloz BEM'deki OS hücreleri, os kesitinin sitopatolojik özelliklerine benzer yüksek heterojen morfoloji gösterir.
BEM modelinde 14 gün boyunca kültürlendikten sonra yapılan immünohistokimyasal analizler uzun süreli kültürlerde büyük avantajlar göstermektedir. Ayrıca, işletim sistemi hücreleri ve BEM kültürü, yüksek ekspres kemik matris glikoprotein, osteoid matriks için özel olan. Bu in vitro's üç boyutlu modeli bir henotypik heterojenlik ve başarı ile osteosarkom dedifferentiation düzenleyici bir mekanizma göstermek için kullanılmıştır.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Osteosarkom (OS) için kemik hücre dışı matris (KHD) modeli, in vitro primer tümör büyümesini taklit etmek için uygun bir iskele olarak kurulmuştur. Bu model, OS'nin histolojik ve sitojenik heterojenliğini incelemede yardımcı olur.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kemik tümörü araştırması
- Osteosarkom
- Histopatoloji
Arka Plan
- KHD modeli, osteosarkomu anlamak için kritik öneme sahiptir.
- Hücre dışı kemik matrisi değişik serokompatibilite gösterir.
- Osteosarkom hücreleri bu modelde heterojen morfoloji sergiler.
- Bu model klinik osteosarkom histopatolojisini yansıtır.
Çalışmanın Amacı
- Kemik tümörlerinin gelişimini ve ilerleyişini araştırmak.
- Osteosarkoma ve ilgili tümörlerde ilaç duyarlılıklarını değerlendirmek.
- In vitro çalışmalar için fonksiyonel bir iskele sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Hücre dışı kemik matrisinin hazırlanması.
- Osteosarkom hücrelerinin kemik kaynaklı matris içinde kültürü.
- Kemik örnekleri elde etmek için BALB/c farelerinin kullanımı.
- Dokunun hazırlanması için cerrahi teknikler.
Ana Sonuçlar
- KHD modelinde kültürlenen osteosarkom hücreleri heterojen morfoloji gösterir.
- Model, osteosarkomun klinik histopatolojisini taklit eder.
- Değişken serokompatibilite, hücrenin hayatta kalmasını ve aktivitesini destekler.
- İlaç duyarlılıkları ve tümör ilerlemesi hakkında içgörüler sağlar.
Sonuçlar
- KHD modeli, osteosarkomu incelemek için etkilidir.
- In vitro araştırma için gerçekçi bir ortam sunar.
- Bu yöntem, kemik tümörü biyolojisini anlamayı geliştirir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
The three-dimensional bone extracellular matrix (BEM) model provides a physiologically relevant scaffold for osteosarcoma (OS) research, enabling the study of tumor heterogeneity and phenotypic plasticity in vitro. By preserving the native bone microenvironment, this model supports mechanistic de-risking in target validation and preclinical evaluation of bone-tumor therapeutics. It offers translational continuity from discovery to lead identification by recapitulating clinical histopathology and genetic regulatory mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through phenotypic heterogeneity that mirrors clinical OS specimens.
- Operational Value: Supports biological de-risking by maintaining extracellular matrix components critical for tumor-stroma interactions.
- Predictive Value: Enhances target confidence by linking morphological diversity to genetic alterations and regulatory mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible 3D culture system for consistent compound screening across OS phenotypes.
- Operational Value: Enables quantitative readouts via immunohistochemical staining for collagen I/IV and bone matrix glycoprotein to assess matrix deposition and osteoid formation.
- Scalability: Compatible with multi-well plate formats and long-term culture (14 days) for dose-response and time-course studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Maintains disease-relevant system fidelity by recapitulating the histologic complexity of human OS.
- Preclinical Continuity: Supports risk-adjusted advancement decisions by modeling OS cell infiltration into periosteal and endosteal compartments.
- Mechanistic De-risking: Allows visualization of dedifferentiation pathways and association with underlying regulatory networks.
Pipeline & Workflow Integration
The BEM model functions as a discovery-phase tool that bridges target validation and lead identification by providing a disease-relevant system for phenotypic screening and mechanistic interrogation of OS.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on tumor-stroma interactions and phenotypic plasticity in a native bone-derived matrix.
- Screening: Delivers assay-ready scaffolds with quantitative outputs for evaluating drug sensitivities and tumor progression.
- Analytics: Enables comparative analysis through immunohistochemical staining and bright-field imaging of morphological and molecular phenotypes.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by preserving collagen network architecture and supporting long-term OS cell culture.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform for studying primary bone tumors and bone metastases across multiple oncology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through recapitulation of OS histopathology and heterogeneous morphology.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via decellularized bone matrix with preserved extracellular matrix composition.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing biological ambiguity in bone-tumor models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on phenotypic response in a clinically relevant 3D system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue decellularization, sterile cell culture, and histological processing.
- Dependent on access to animal bone sources and equipment for freeze-thaw cycles, decalcification, and lipid extraction.
- Necessitates cross-team standardization for BEM preparation, sterilization, and OS cell seeding protocols.
- Adaptation considerations include variability in bone source quality and potential residual marrow components affecting consistency.
- Practical limitations include the 24-hour antibiotic wash requirement and two-month storage constraint at 4°C.
