Name: Yalıtım, yayma ve insan diş Pulp kök hücrelerin Nöronal Farklılaşma sırasında Prion Protein ifade (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Keşfedin insan diş pulpası kök hücrelerinin izolasyonu ve nöronal farklılaşma sırasında prion protein ifadesi. Bu yöntem rejeneratif tıp ve biyobank araştırmaları için yüksek verimli bir kaynak sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser "Fondazione Varrone" ve Rieti Üniversitesi Hub Vincenzo Mattei için "Sabina Universitas" tarafından desteklendi.
Şekil 5 (A, B) Taylor & Francis Ltd yayımcı izni ile yayımlanmaktadır: rol Prion protein-EGFR multimolecular karmaşık insan diş hamuru elde edilen kök hücreleri Nöronal Farklılaşma sırasında. Martellucci, S., Manganelli V., Santacroce C., Santilli F., Piccoli L., Sorice M., Mattei V. deli dana. 2018 4 Mart. Taylor & Francis Ltd.

Üçüncü büyük azı dişleri çalışmada kullanılan hastalarda (13-19 yaş arası) uyuşturucu ya da alkol tüketimi önceki öyküsü, tüm sigara ve uygun ağız hijyeni ile eksize. Açıklama, bilim diş hekimliği bölümü ve "Sapienza" Roma Üniversitesi, Maxillofacial gününde aydınlatılmış onam hastalar veya veliler elde edildi. Aydınlatılmış onam dayalı etik kaygılar ve Etik Kurulu onayı alındı.
1. diş ve diş Pulp çıkarma
<ol><li>
Koruma veya ulaşım için uygun ortamı hazırlanması.
	<ol>
<li>Dulbecco'nın modifiye kartal orta düşük konsantrasyon glikoz (DMEM-L) L-glutamin (494.5 mL) ile hazırlayın.</li>
		<li>5 mL penisilin/streptomisin (% 1) ekleyin ve Amfoterisin (% 0,1) 0.5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Üçüncü molar hasta--dan hulâsa, hızlı bir şekilde PBS ile durulayın, orta ile 15 mL tüp bebek koymak ve az 2 h laboratuvarda aktarmak.</li>
	<li>Biohazard başlık altında dişin koronal kesme pass paralel ve teğet hamuru oda tavana bir kesici ile açın.</li>
	<li>Yavaşça hamuru ile küçük bir ekskavatör çıkarın ve bir test tüpü yerleştirin.</li>
	<li>PBS ile üç kez yıkayın ve 2500 x g 10 dk RT. az için santrifüj kapasitesi</li>
</ol>2. diş Pulp ve kök hücre yayın işleme
<ol><li>Süpernatant çıkarın, pelet Hank'in çözümde resuspend ve bir Petri kabına yerleştirin. %5 CO237 ° C'de 2 h için kuluçkaya.</li>
	<li>
IV collagenase eriyik hazırlığı yazın.
	<ol>
<li>DMEM-L. 0.8 mL hazırlamak</li>
		<li>Türü IV collagenase DMEM-L ve birkaç dakika için girdap 0.8 ml 1 mg eritebilir.</li>
		<li>DMEM-L eklemek son bir konsantrasyon olması 1 mL 1 mg/mL.</li>
		<li>Çözüm 0,22 µM filtre ile filtre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hank'in çözüm Santrifüjü 2500 x g RT, 10 min için de kaldırmak ve hamuru küçük dilimler halinde approximatively 1 mm her biri tek kullanımlık bir neşter ile ayırın.</li>
	<li>Hamuru dilimleri bir petri kabına yerleştirin ve tip IV collagenase %5 CO237 ° C'de 15 dakika 1 mL ile kuluçkaya.</li>
	<li>
Orta kültür hazırlama (500 mL).
	<ol>
<li>DMEM-l L-glutamin ile 445 mL için.</li>
		<li>50 mL Fetal sığır Serum (FBS) (%10) ekleyin.</li>
		<li>5 mL penisilin/streptomisin (% 1) ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2500 x g RT, 10 dk da örneğine santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak, pelet orta (Adım 2,5) ve T25 şişesi kök hücre için belirli kültüründe % 5 CO237 ° C'de resuspend.</li>
</ol>3. kök hücre kültür ve yayılma
<ol><li>Her gün kültür denetleyin ve büyüme 3 gün sonra balonun içindeki yapışık hücreleri farklı klonlar gözlemlemek.</li>
	<li>3 günde kültür orta değiştirin.</li>
	<li>Yapışık hücreleri ulaşmak izdiham sonra 7 ve 12 gün arasında onları tripsin-EDTA 3 dk. 37 ° c için 1 mL hücrelerle tedavi veya hafifçe bir hücre kazıyıcı kullanarak ayırabilirsiniz.</li>
	<li>4 ml (oranı 1:5) kültür tripsin eylemi durdurmak için orta (Adım 2.5) ekleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyon için 259 x gde 6 dk santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak ve hücreleri yaymak için bir T25 şişeye koyun. Not: 3 günde hücreleri izdiham ulaşmak.</li>
	<li>Hücreleri olmayan kök hücreler kültür gibi varlığı önlemek için 21-28 gün (yaklaşık 6-8 pasajlar) kadar yaymak.</li>
	<li>Tripsin-EDTA 3 dk. 37 ° C veya hafifçe kazıma için 1 mL hücrelerle bağlantısını kesin. Hücre süspansiyon için 259 x gde 6 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve test hücreleri cytofluorimetric analizi (adım 6) için.</li>
</ol>4. geçici PrPC Silencing siRNA tarafından
<ol><li>Kültür orta (Adım 2.5) için 24 h 2 mL ile hDPSCsin 6-şey plaka (2 x 105 hücre/mL) kültür.</li>
	<li>
Bir gün sonra siRNA PrP orta (400 µL) hazırlayın.
	<ol>
<li>Steril tüp bebek için 384 µL eklemek DMEM-L.</li>
		<li>DMEM-L için 5 son bir konsantrasyon olması siRNA PrP her türü için 1 µL eklemek nM (PrP kullanılan ve devirme verimlilik ≥70% güvence altına almak için tedarikçi tarafından doğrulanmadı 4 siRNA).</li>
		<li>Transfectionreagent 12 µL DMEM-L. için ekleyin</li>
		<li>Girdap karışımı ve RT transfection kompleksleri oluşumu izin vermek için 10 min için kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her örnek için 400 μL siRNA PrP orta ekleyin ve 37 ° C'de 6 h için kuluçkaya</li>
	<li>SiRNA PrP orta atarak olmadan, 1.6 mL (1-5 oranında) kültür orta (Adım 2.5) ekleyin.</li>
	<li>37 ° C'de 72 h için hücre bıraktığınızdan</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve 3 kez PBS RT., 2 mL ile yıkayın</li>
	<li>Nöronal kültür orta 2 mL 7/veya 14 gün (Adım 5.1) ekleyin.</li>
	<li>Nöronal kültür orta 3 günde değiştirin. Not: SiRNA PrP çözüm her zaman değiştir nöronal kültür orta yerine.</li>
	<li>Zaman sonunda, 3 kez PBS RT, 2 mL ile yıkama ve nöronal yüzey antijenleri için Western Blot analizi ile test.</li>
</ol>5. nöronal indüksiyon sürecinin hDPSCs
<ol><li>
Nöronal kültür orta hazırlık (500 mL).
	<ol>
<li>Bazal medya için nöronal hücre formüle 444.7 mL hazırlayın.</li>
		<li>Orta olarak embriyonik ve yetişkin nöron kök hücreleri (% 10) uzun vadeli canlılığı desteklemek için kullanılan serum ücretsiz ek 50 mL ekleyin.</li>
		<li>200 µL temel Fibroblast büyüme faktörü (bFGF) (son konsantrasyonu 40 ng/mL) ve 100 µL Epidermal büyüme faktörü (EGF), orta (son konsantrasyonu 20 ng/mL) ekleyin.</li>
		<li>5 mL penisilin/streptomisin (% 1) ekleyin Orta olarak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>6-şey plaka (2 x 105 hücre/mL) kültür hDPSCs için 28 gün hamuru ayrılması ve onları nöronal kültür orta 2 mL ile teşvik.</li>
	<li>3 günde süpernatant atmak, 3 kez PBS RT, 2 mL ile yıkayın ve 2 mL nöronal kültür orta yerine.</li>
	<li>7 ve/veya 14 gün sonra hücreleri tripsin-EDTA 3 dk. 37 ° c için 1 mL veya hafifçe bir kazıyıcı ile bağlantısını kesin.</li>
	<li>4 mL (oranı 1:5) kültür tripsin eylemi durdurmak için orta (Adım 2.5) ekleyin.</li>
	<li>Nöronal yüzey antijenleri (adım 6) varlığı veya prion protein deyim (7. adım) için Akış Sitometresi Analizi ile test.</li>
</ol>6. hDPSCs Akış Sitometresi tarafından karakterizasyonu
<ol><li>Mezenkimal stromal (MSC) seçin-özel veya nöronal yüzey antijenleri.</li>
	<li>6-şey plaka (2 x 105 hücre/mL) 2 mL kültür orta (Adım 2.5) ile hDPSCs kültür.</li>
	<li>HDPSCs, 28 gün diş pulp ayrılması veya 3 dk. 37 ° C veya hafifçe kazıyıcı için 1 mL tripsin-EDTA ile nöronal kültür ortamının (Adım 5.1) 14 gün sonra bağlantısını kesin.</li>
	<li>4 ml (oranı 1:5) kültür tripsin eylemi durdurmak için orta (Adım 2.5) ekleyin ve centrifugate 259 x g 6 dk RT. az için yıkama başka bir PBS 2 mL ile 2 kez RT.</li>
	<li>Tedavi edilmemiş veya tedavi hDPSCs 4 ° C'de 10 dakika için PBS içinde %4 paraformaldehyde ile saptamak</li>
	<li>HDPSCS %0,1 (v/v) iyonik olmayan yüzey aktif PBS içinde RT., ek 10 dk ile permeabilize</li>
	<li>PBS 1 ml RT. 1 h için %5 yağsız kuru süt ile engelleme gerçekleştirmek</li>
	<li>Yıkama PBS ile 3 kez 1 mL ve anti-CD105 hücrelerle kuluçkaya (1: 100 / 5 x 105 hücreleri), anti-CD44 (1: 100 / 5 x 105 hücreleri), anti-STRO-1 (1: 100 / 5 x 105 hücreleri), anti-CD90 (1: 100 / 5 x 105 hücreleri), anti-CD73 (1: 100 / 5 x 105 hücreleri), β3-tübülin anti (1: 100 / 5 x 105 hücreleri), anti-NFH (1: 100 / 5 x 105 hücreleri) ve anti-GAP43 (1: 100 / 5 x 105 hücreleri) mAb RT. 1 h için</li>
	<li>3 kez PBS 1 mL içeren hücreleri yıkama ve anti-fare PE (1:50 / 5 x 105 hücreleri) veya anti-tavşan CY5 ile kuluçkaya (1:50 / 5 x 105 hücreleri) mAb RT. ek 1 h için</li>
	<li>İkincil antikorlar (Anti-fare PE ya da anti-tavşan CY5 mAb) immunopositive hücreleri geçişi için kullanın ve bir Akış Sitometresi ile tüm örneklerini analiz ve en az 20.000 olaylar elde etmek.</li>
</ol>7. hDPSCs Akış Sitometresi Analizi tarafından ifadede PrPC değerlendirilmesi
<ol><li>Kültür orta (Adım 2.5) 2 mL ile hDPSCsin 6-şey plaka (2 x 105 hücre/mL) kültür.</li>
	<li>HDPSCs at 21 ve 28 gün diş pulp ayrılması ve nöronal kültür orta (Adım 5.1) ile 1 mL tripsin-EDTA ile 7 ve/veya 14 gün sonra bağlantısını kesin ve tripsin eylem 6.4 adımda anlatıldığı gibi durdurun. Numune 4 ° C'de 10 dakika için PBS içinde %4 paraformaldehyde ile saptamak</li>
	<li>%0,1 (v/v) non-iyonik surfactantin PBS 10 dakika dik kaldır at ile süpernatant permeabilize ve tavşan anti-PrP mAb EP1802Y hücrelerle (1:50 / 5 x 105 hücreleri) leke mAb Anti-tavşan CY5 ile dik Incubate (1:50 / 5 x 105 hücreleri), 1 h için mAb için RT ek 1 h</li>
	<li>Akış Sitometresi ile tüm örneklerini ve en az 20.000 olaylar elde etmek.</li>
</ol>

<ol><li>Robey, P. G., Kuznetsov, S. A., Riminucci, M., Bianco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cell+assays%3A+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cell assays: in vitro and in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 1130, 279-293 (2014).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adult+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.</a> Nature. 418, 1-49 (2002).</li>
<li>Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+mesenchymal+stem+cells+from+bone+marrow%2C+umbilical+cord+blood%2C+or+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue.</a> Stem Cells. 24, 1294-1301 (2006).</li>
<li>Zannettino, A. C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-potential+Human+adipose-derived+stromal+stem+cells+exhibit+a+perivascular+phenotype+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multi-potential Human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo.</a> Journal of Cellular Physiology. 214, 413-421 (2008).</li>
<li>Mattei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+lipid+rafts+in+neuronal+differentiation+of+dental+pulp-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Role of lipid rafts in neuronal differentiation of dental pulp-derived stem cells.</a> Experimental Cell Research. 339, 231-240 (2015).</li>
<li>Jansen, J., Hanks, S., Thompson, J. M., Dugan, M. J., Akard, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+from+the+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (1), 37-50 (2005).</li>
<li>Young, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+heterogeneity+in+the+neuronal+and+glial+differentiation+of+dental+pulp+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Clonal heterogeneity in the neuronal and glial differentiation of dental pulp stem/progenitor cells.</a> Stem Cells International. 2016, 1290561(2016).</li>
<li>Pisciotta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dental+pulp+stem+cells+%28hDPSCs%29%3A+isolation%2C+enrichment+and+comparative+differentiation+of+two+sub-populations%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Human dental pulp stem cells (hDPSCs): isolation, enrichment and comparative differentiation of two sub-populations.</a> BMC Developmental Biology. 15, 14(2015).</li>
<li>Atari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+of+the+third+molar%3A+a+new+source+of+pluripotent-like+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Dental pulp of the third molar: a new source of pluripotent-like stem cells.</a> Journal of Cell Science. 125, 3343-3356 (2012).</li>
<li>Koyama, N., Okubo, Y., Nakao, K., Bessho, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+pluripotency+in+human+dental+pulp+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+oral+and+maxillofacial+surgery%3A+official+journal+of+the+American+Association+of+Oral+and+Maxillofacial+Surgeons%22%5BJournal%5D)">Evaluation of pluripotency in human dental pulp cells.</a> Journal of oral and maxillofacial surgery: official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 67, 501-506 (2009).</li>
<li>Gronthos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+properties+of+human+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cell properties of human dental pulp stem cells.</a> Journal of Dental Research. 81, 531-535 (2002).</li>
<li>Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+dental+pulp+stem+cells+differentiate+toward+functionally+active+neurons+under+appropriate+environmental+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues.</a> Stem Cells. 7, 1787-1795 (2008).</li>
<li>Lee, Y. J., Baskakov, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+form+of+the+prion+protein+is+involved+in+controlling+cell+cycle+dynamics%2C+self-renewal%2C+and+the+fate+of+human+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">The cellular form of the prion protein is involved in controlling cell cycle dynamics, self-renewal, and the fate of human embryonic stem cell differentiation.</a> Journal of Neurochemistry. 124, 310-322 (2013).</li>
<li>Steele, A. D., Emsley, J. G., Ozdinler, P. H., Lindquist, S., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+protein+%28PrPc%29+positively+regulates+neural+precursor+proliferation+during+developmental+and+adult+mammalian+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prion protein (PrPc) positively regulates neural precursor proliferation during developmental and adult mammalian neurogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 3416-3421 (2006).</li>
<li>Wulf, M. A., Senatore, A., Aguzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+function+of+the+cellular+prion+protein%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">The biological function of the cellular prion protein: an update.</a> BMC Biology. 15, 34(2017).</li>
<li>Mattei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+cellular+prion+protein+to+mitochondrial+raft-like+microdomains+contributes+to+apoptosis+execution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Recruitment of cellular prion protein to mitochondrial raft-like microdomains contributes to apoptosis execution.</a> Molecular Biology of the Cell. 22, 4842-4853 (2011).</li>
<li>Linden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biological+Function+of+the+Prion+Protein%3A+A+Cell+Surface+Scaffold+of+Signaling+Modules%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Biological Function of the Prion Protein: A Cell Surface Scaffold of Signaling Modules.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 77(2017).</li>
<li>Garofalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mitochondrial+raft-like+microdomains+in+the+regulation+of+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Role of mitochondrial raft-like microdomains in the regulation of cell apoptosis.</a> Apoptosis. , 621-634 (2015).</li>
<li>Watt, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species-mediated+beta-cleavage+of+the+prion+protein+in+the+cellular+response+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species-mediated beta-cleavage of the prion protein in the cellular response to oxidative stress.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 35914-35921 (2005).</li>
<li>Mattei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+Withdrawal+Modifies+Prion+Protein+Expression+in+Rat+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Morphine Withdrawal Modifies Prion Protein Expression in Rat Hippocampus.</a> PLoS One. 12, 0169571(2017).</li>
<li>Hu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+proteins%3A+physiological+functions+and+role+in+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Prion proteins: physiological functions and role in neurological disorders.</a> Journal of the Neurological Sciences. 264, 1-8 (2008).</li>
<li>Sorice, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+PrPC+to+mitochondrial+raft-like+microdomains+during+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Trafficking of PrPC to mitochondrial raft-like microdomains during cell apoptosis.</a> Prion. 6, 354-358 (2012).</li>
<li>Martellucci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Prion+protein-EGFR+multimolecular+complex+during+neuronal+differentiation+of+human+dental+pulp-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Role of Prion protein-EGFR multimolecular complex during neuronal differentiation of human dental pulp-derived stem cells.</a> Prion. 12 (2), 117-126 (2018).</li>
<li>Lee, Y. J., Baskokov, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+form+of+the+prion+protein+guides+the+differentiation+of+human+embryonic+stem+cell+into+neuron-%2C+oligodendrocyte-+and+astrocyte-committed+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">The cellular form of the prion protein guides the differentiation of human embryonic stem cell into neuron-, oligodendrocyte- and astrocyte-committed lineages.</a> Prion. 8, 266-275 (2014).</li>
<li>Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+human+dental+pulp+cells%3A+various+isolation+methods+and+culturing+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments.</a> Cell and Tissue Research. 324, 225-236 (2006).</li>
<li>Suchanek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+stem+cells+and+their+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+papers+of+the+Medical+Faculty+of+the+University+Palack%C3%BD%22%5BJournal%5D)">Dental pulp stem cells and their characterization.</a> Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacký. 153, Olomouc, Czechoslovakia. 31-35 (2009).</li>
<li>Bressan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+age-related+biological+properties+of+human+dental+pulp+stem+cells+change+in+nanostructured+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Donor age-related biological properties of human dental pulp stem cells change in nanostructured scaffolds.</a> PLoS One. 7 (11), 49146(2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu çalışmada, yalıtım ve hDPSCs Nöronal Farklılaşma için metodoloji üzerinde duruldu; Ayrıca, PrPC bu süreçte rol değerlendirildi. Yalıtmak ve hDPSCs nöron benzeri hücreler ve kritik adımları işlemi sırasında ayırt etmek için birkaç yöntem vardır. hDPSCs chondroblasts, adipositler, dokusunu ve sinir hücreleri gibi birkaç soy ayırt edebiliyoruz. Bizim gazetede Nöronal Farklılaşma mekanizmaları ve PrPCvarlığı araştırıldı. Yukarıda da açıklandığı gibi bu hücreler CD44, CD90, CD105, CD73 ve vuruş-1<sup ...

Mezenkimal kök hücrelerin kemik iliği, göbek kordon kanı, insan diş pulp, yağ dokusu ve kan1,2,3,4,5 de dahil olmak üzere birkaç dokulardan izole edilmiştir , 6. çeşitli yazarlar tarafından bildirildiği gibi hDPSCs plastik bağlılık, tipik bir fibroblast benzeri Morfoloji göster. Bunlar farklı klonlar ve proliferatif ve farklılaştırıcı kapasitesi7,8farklılıkları ile son derece heterojen bir nüfusu temsil etmektedir. hDPSCs hızlı Mezenkimal Kök hücre (yani CD44, CD90, CD73, CD105, STRO-1) için belirli işaretleri, onlar bazı hematopoetik işaretleri (örneğin CD14 ve CD19) negatif ve yeteneğine sahip tüp bebek multilineage farklılaşma9/, 10,11.
Birden çok yazar bu hücreler NGF, bFGF, EGF12belirli medya ve takviyeleri7,ile birlikte ek içeren farklı protokolleri kullanarak nöron benzeri hücrelerine ayırt etmek mümkün olduğunu göstermiştir. Ayrıca, birçok protein Nöronal Farklılaşma işlemi sırasında söz konusu ve bunlar arasında bir ilgili rolü ve önemli ifade hücresel prion protein (PrPC), embriyonik ve yetişkin kök hücreleri13, her ikisi de birkaç belgelerini göster 14. PrPC temsil eden bir pleiotropic molekül hücrelere farklı işlevler bakır metabolizması, Apoptozis, sahip ve direnç oksidatif stres15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.
Bizim önceki kağıt23' te, biz PrPC hDPSCs Nöronal Farklılaşma sürecindeki rolü araştırdık. Aslında, hDPSCs tanımışlar PrPC hızlı ve Nöronal Farklılaşma sonra ek artış gözlemlemek mümkün. Diğer yazarlar PrPC kök hücrelerin Nöronal Farklılaşma süreçlerde olası bir rol olan. Nitekim, PrPC insan embriyonik kök hücre farklılaşma nöronlar, oligodendrocytes ve astrocytes24götürmek. Bu çalışmada kök hücre diş pulp, onun farklılaşma süreci ve PrPC rolünü Nöronal Farklılaşma sırasında elde etmek için metodoloji vurgulamak oldu.

<table><tbody><tr><td>Amfoterisin B çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td>Hücre kültürü ortamını desteklemek için kullanılır, Streptomyce Anti-B3tubulin Hücre Sinyal Teknolojisi'nden bir polien antifungal antibiyotiktir</td></tr><tr><td></td><td>;</td><td># 4466</td><td>Altı B-tubulin izoformundan biri, fetal ve doğum sonrası gelişim sırasında yüksek oranda eksprese edilir, periferik sinir sisteminde yüksek kalır</td></tr><tr><td>Anti-CD105&nbsp;</td><td></td><td>İnsan vasküler endotelyumunun önemli bir glikoproteini olan BD Biosciences 611314 Endoglin (CD105), geniş bir hücre dışı bölgeye, hidrofobik bir transmembran bölgesine ve kısa bir sitoplazmik kuyruğa sahip bir tip I integral membran proteinidir</td><td></td></tr> <tr><td>Anti-CD44</td><td>Millipore</td><td>CBL154-20ul</td><td>Pozitif hücre belirteçleri mezenkimal kök hücrelere yönelik antikorlar</td></tr><tr><td>Anti-CD73&nbsp;</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi&nbsp;</td><td>13160</td><td>CD73, hücre dışı nükleosit monofosfatların biyoaktif nükleozitlere hidrolizini katalize eden 70 kDa glikosil fosfatidilinositol bağlantılı, zara bağlı bir glikoproteindir</td></tr><tr><td>Anti-CD90</td><td>Millipore</td><td>CBL415-20ul</td><td>Pozitif hücre belirteçleri mezenkimal kök hücrelere yönelik antikorlar</td></tr><tr><td>Anti-GAP43&nbsp;</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi&nbsp;</td><td>#8945</td><td>Büyüme konilerinde ve yüksek plastisiteli alanlarda sinir sistemine özgü, büyüme ile ilişkili bir proteindir</td></tr><tr><td>Anti-fare PE&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab7003</td><td>Akış sitometrisinde veya FACS analizinde kullanılan bir antikordur</td></tr><tr><td>Anti-NFH&nbsp;</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi&nbsp;</td><td>#2836</td><td>Toplam Nörofilament-H proteini</td></tr><tr><td>Anti-PrP mAb EP1802Y&nbsp;</td> endojen seviyelerini tespit eden bir antikordur;<td>Abcam</td><td>ab52604</td><td>Tavşan monoklonal [EP 1802Y] Prion proteini PrP</td></tr><tr><td>Anti-tavşan CY5&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6564</td><td>Akış sitometrisi veya FACS analizinde kullanılan bir antikordur</td></tr><tr><td>Anti-STRO 1</td><td>Millipore</td><td>MAB4315-20ul</td><td>Pozitif hücre belirteçleri mezenkimal kök hücrelere karşı yönlendirilmiş antikorlar</td></tr><tr><td>B27 Supp XF CTS</td><td>Gibco yaşam teknolojileri tarafından</td><td>A14867-01</td><td>B-27&nbsp; pluripotent kök hücrelerden (PSC'ler) insan nöral kök hücrelerinin (hNSC'ler) indüksiyonunu, hNSC'lerin genişlemesini desteklemek için kullanılabilir, hNSC'lerin farklılaşması ve kültürde olgun farklılaşmış nöronların korunması</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 akış sitometresi&nbsp;</td>Mavi <td>lazer (488 nm) ve kırmızı lazer (640 nm) ile donatılmış</td> <td>BD Biosciences</td><td>AC6531180187</td> Flow</tr> <tr><td>sitometresiBD Accuri C6 Software&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>, veri elde etmek, istatistik oluşturmak ve sonuçları analiz etmek için BD Accuri C6 akış sitometre sistemini kontrol eder</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>PeproThec, DBA</td><td>100-18B</td><td>temel Fibroblast Büyüme Faktörü&nbsp;</td></tr><tr><td>Santrifüj CL30R</td><td>Termo fisher Scientific</td><td>11210908</td><td>sıvıların, gazın veya sıvının yoğunluğa göre ayrılması için kullanılan bir cihazdır.</td></tr><tr><td>CO2 İnkübatörü 3541</td><td>Termo fisher Scientific</td><td>317527-185</td><td>hücre kültürleri için optimal ve tekrarlanabilir büyüme koşulları sağlar</td></tr><tr><td>Kollajenaz, tip IV&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17104019</td><td>Kollajenaz, nötr bir amino asit (X) ile glisin arasındaki bağı, kollajende yüksek sıklıkta bulunan Pro-X-Glyc-Pro dizisinde parçalayan bir proteazdır</td></tr><tr><td>. Tek kullanımlık neşter&nbsp;</td><td>Swann-Morton</td><td>501</td><td>Dokuları kesmek için kullanılır</td></tr><tr><td>DMEM-L</td><td>Euroclone</td><td>ECM0060L</td><td>Dulbecco'nun Sodyum Pirüvat ile L-Glutamin ile Modifiye Eagle'ın Orta Düşük Glikozu</td></tr><tr><td></td><td>EGF PeproThec, DBA</td><td>AF-100-15</td><td>Epidermal Büyüme Faktörü & nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco by life technologies</td><td>10270-106</td><td>FBS, hücre kültüründe çok çeşitli işlevler sağladığı için popüler bir medya takviyesidir. FBS, besinleri, büyüme ve bağlanma faktörlerini sağlar ve serumsuz ortam (SFM) sistemlerinde çoğaltılması zor mekanizmalarla hücreleri oksidatif hasar ve apoptozdan korur</td></tr><tr><td>Filtropur BT50 0.2,500 mL Şişe üstü filtre</td><td>Sarstedt</td><td>831,823,101</td><td>çözeltilerinin filtrasyonu için kullanılan bir cihazdır</td></tr><tr>PRNP <td>Qiagen</td><td>GS5621</td> <td>için Flexitube GeneSolution</td><td>Entrez geni 5621 için 4 siRNA. Hedef dizisi N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA&nbsp; N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA&nbsp; N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA&nbsp; N.4&nbsp; CAGTGACTATGAGGACCGTTA</td></tr><tr><td>Hank'in çözümü 1x</td><td>Gibco by life technologies</td><td>240200083</td><td>Hanks&prime'ın temel işlevi; Dengeli Tuz çözeltisi, pH'ın yanı sıra ozmotik dengeyi de korumaktır. Ayrıca hücrelere su ve esansiyel inorganik iyonlar sağlar</td></tr><tr><td>HiPerFect Transfeksiyon Reaktifi&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td>HiPerFect Transfeksiyon Reaktifi, etkili siRNA alımını ve siRNA'nın hücreler içinde verimli bir şekilde salınmasını sağlayan katyonik ve nötr lipidlerin benzersiz bir karışımıdır, bu da düşük siRNA konsantrasyonları kullanıldığında bile yüksek gen yıkımı ile sonuçlanır</td></tr><tr><td>Nörobazal A&nbsp;</td><td>Gibco by life technologies</td><td>10888022</td><td>Neurobazal-A Medium, saf doğum sonrası ve yetişkin beyin nöronlarının uzun süreli bakımı ve olgunlaşması için tasarlanmış bir bazal besiyeridir.</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td>Paraformaldehit, boyama prosedürleri sırasında hücrelerin ve doku bölümlerinin sabitlenmesi için kullanılmıştır</td></tr><tr><td>; penisilin / streptomisin ve nbsp;</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D&nbsp;</td><td>Bakteriyel kontaminasyonu kontrol etmek için hücre kültürü ortamını desteklemek için kullanılır</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su&nbsp; (PBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECB4004LX10&nbsp;</td><td>PBS, memeli hücrelerinin işlenmesi ve kültürlenmesi için kullanılan dengeli bir tuz çözeltisidir. PBS, memeli hücrelerini sulamak, yıkamak ve seyreltmek için kullanılır. Fosfat tamponlama, pH'ı fizyolojik aralıkta</td></tr><tr><td>tutar TC-Platte 6 kuyusu, Hücre +, F</td><td>Sarstedt</td><td>833,920,300</td><td>Yapışık hücreler için bir büyüme yüzeyidir</td></tr><tr><td>Doku kültürü şişesi T-25, Hücre +, Bacalı Kapak</td><td>Sarstedt</td><td>833,910,302</td><td>Doku kültürü şişesi T-25, polistiren, Hassas yapışık hücreler için hücre + büyüme yüzeyi, örneğin birincil hücreler, eğimli boyun, ventilasyon kapağı, sarı, steril, Pirojen içermeyen, sitotoksik olmayan, 10 adet/torba</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>Hafif denatüre olmayan koşullar altında membran bileşenlerinin geri kazanımı için yaygın olarak kullanılan iyonik olmayan yüzey aktif madde</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA&nbsp;</td><td>Euroclone</td><td>ECB3052D&nbsp;</td><td>Tripsin, lizin ve arginin amino asit kalıntılarının C-terminal tarafındaki peptitleri parçalayacaktır. Tripsin, bir kültür yüzeyinden yapışan hücreleri çıkarmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Tüp</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td>Tüp 15 mL, 120 mm x17 mm, PP</td></tr><tr><td>VBH 36 C2 Kompakt</td><td>Steril</td><td>ST-003009000</td><td>Çevre ve çalışan için tam koruma sağlar</td></tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1 &ndash; Ters&nbsp; Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>3849000962</td><td>ZEISS Axio Vert.A1, benzersiz bir giriş seviyesi fiyatı sunar ve parlak alan, faz kontrastı, PlasDIC, VAREL, geliştirilmiş Hoffman Modülasyon Kontrastı (iHMC), DIC ve floresan dahil olmak üzere tüm kontrast tekniklerini sağlayabilir. Floresan etiketli hücreler için hassas görüntüleme için LED aydınlatmayı dahil edin. Axio Vert.A1, rutin işler için ergonomik olarak tasarlanmıştır ve doku kültürü başlıklarının içine oturacak kadar kompakttır.</td></tr></tbody></table>

yalıtım, yayma ve insan diş pulp kök hücrelerin nöronal farklılaşma sırasında prion protein ifade

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

Embriyonik kök hücre manipülasyon ilgili Biyoetik sorunları tıbbi araştırma alanındaki gelişmeler engelliyordu. Bu nedenle, farklı dokuların yağ, göbek kordonu, kemik iliği ve kan gibi yetişkin kök hücre elde etmek çok önemlidir. Biyoetik konuları ile ilgili olarak elde etmek kolaydır çünkü olası kaynaklar arasında diş pulp özellikle ilginçtir. Nitekim, insan diş Pulp kök hücreleri (hDPSCs) erişkin kök hücreleri nöronal benzeri hücrelerde ayırt etmek güçlü bir türüdür ve sağlıklı hastalar (13-19 yaş) üçüncü molar elde edilebilir. Özellikle, diş hamuru bir ekskavatör ile kaldırıldı, küçük dilimler halinde kesip, IV collagenase ile tedavi ve bir şişeye kültürlü. Nöronal Farklılaşma ikna etmek için hDPSCs 2 hafta boyunca EGF/bFGF ile teşvik. Daha önce ayırt etme işlemi sırasında Protein hDPSCs (PrPC) hücresel prion içeriğini artış göstermiştir. Cytofluorimetric analiz artmış Nöronal Farklılaşma süreci sonrasında PrPC erken ifadesi gösterdi. PrPC ablasyon siRNA tarafından PrP Nöronal Farklılaşma EGF/bFGF tarafından indüklenen engelledi. Bu yazıda, biz gibi biz yalıtım, ayrılık ve vitro yetiştirme yöntemleri hDPSCs birkaç kolay yordamlar ile gelişmiş, daha verimli Hücre klonlar Mezenkimal kök hücrelerin (MSCs) elde edilen ve büyük ölçekli genişleme olduğunu göstermek gözlenmiştir. Biz de nasıl iletişim kuralında, ayrıntılı yöntemleri ile elde edilen hDPSCs, MSCs Nöronal Farklılaşma süreci ve sonraki hücresel ve moleküler eğitim için mükemmel bir deneysel model olduğunu göster.

HDPSCs gelen diş pulp, üçüncü molar elde edilen yalıtım ve ayrımı prosedürleri küçük değişiklikler yıkıcı bir sonuç açabilir karmaşık işlemlerdir. Bu yazıda, Arthur ve diğerleri. iletişim kuralı kullanın 12 birkaç yenilik. Yordamlar temsilcisi düzeninin şekil 1' de gösterilen.
hDPSCs hücreleri farklı klonlar ve proliferatif ve farklılaştırıcı kapasitesi<sup class="xr...

Burada insan diş Pulp kök hücre izolasyon ve yayılması için bir protokol Nöronal Farklılaşma süreci sırasında prion protein ifade değerlendirmek için mevcut.

Yalıtım, yayma ve insan diş Pulp kök hücrelerin Nöronal Farklılaşma sırasında Prion Protein ifade

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...

Diş posasından kök hücre elde etmek için standart bir yol kötü verimli, ve bu birkaç değişken bağlıdır. Protokolümüz, olguların %90'ında tedavi edilen dişlerden kök hücrenin başarılı bir şekilde izole edilmesine olanak sağladı. Birkaç hafta içinde çok sayıda hücre elde etmek en büyük avantajdır.Bu bize rejeneratif tıp hücre kullanmak ve bu yararlı aracı ile diğer bilim adamları sağlayan bir biyobanka oluşturmak için izin verir. Diş açma işlemi Dr.Constantino Santacroce tarafından yapılacaktır. Daha sonra, protokol Stefano Martellucci, makalenin ilk yazarı benim laboratuvar, doktora öğrencisi tarafından gösterilecek.Başlamak için, hastadan üçüncü azı zinasını ayıklayın, pbs ile hızlıca durulayın, orta ile 15 mililitrelik bir test tüpü koyun ve iki saatten az bir sürede laboratuvara aktarın. Bir biyolojik tehlike başlık altında, bir koronal kesme geçiş, paralel ve teğet, hamuru odasının çatı yoluyla diş açmak için bir kesici kullanın. Küçük bir ekskavatör ile, yavaşça hamuru çıkarın ve bir test tüpü yerleştirin.Daha sonra PBS ile üç kez yıkayın ve 10 dakika oda sıcaklığında 2, 500 kez g santrifüj. Santrifüjden sonra, supernatant çıkarın. Hank'in çözeltisindeki peleti yeniden askıya alın ve numuneyi petri kabına aktarın.10 dakika oda sıcaklığında 2, 500 kez g santrifüj ile Hank çözeltisi çıkarın. Sonra, tek kullanımlık bir neşter ile, yaklaşık bir milimetre lik dilimler halinde hamuru bölmek ve tip IV kollajenaz bir mililitre ekleyin. Daha sonra, 10 dakika oda sıcaklığında 2, 500 kez g örnek santrifüj.Supernatant çıkarın ve orta pelet resuspend. Kültür bir T25 şişesi kök hücreler için 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit özel. Kuluçka döneminde, kültür ortamını her üç günde bir değiştirin.Yapışık hücreler birleştiğinde, hücrelere bir mililitre tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve hücreleri 37 derecede üç dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, tripsin eylemini durdurmak için bir-beş oranında dört mililitre kültür ortamı ekleyin ve hücre süspansiyonuna altı dakika boyunca 259 kez g'de santrifüj edin. Supernatant çıkarın.Sonra, yaymak için bir T25 şişesine hücreleri yerleştirin. Daha sonra hücreleri bir mililitre tripsin-EDTA ile 37 derecede üç dakika ayırın. Hücre süspansiyonuna 259 kez g'de altı dakika santrifüj edin.Supernatant çıkarın ve sitoflorimetrik analiz için hücreleri test etmeye devam edin. Geçici prion protein susturma adım gerçekleştirmek için, ilk kültür 24 saat boyunca kültür ortamı iki mililitre ile altı iyi plakalar insan diş hamuru kök hücreleri. Daha sonra, her numuneye küçük müdahale eden RNA PrP ortamının 400 mikrolitresini ekleyin ve onları 6 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.siRNA PrP ortamını atmadan, kültür ortamının 1,6 mililitresini bir-beş oranında ekleyin ve hücreleri 37 derecede 72 saat bekletin. Kuluçka döneminden sonra, supernatant çıkarın ve oda sıcaklığında üç kez PBS iki mililitre ile hücreleri yıkayın. Sonra, nöronal kültür ortamının iki mililitre ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derecede bir kuvözde yedi ila 14 gün boyunca saklayın.Kuluçka döneminden sonra hücreleri oda sıcaklığında üç kez iki mililitre PBS ile yıkayın ve nöronal yüzey antijenlerini test etmek için Batı leke analizine geçin. Nöronal indüksiyon işlemini gerçekleştirmek için, kültür 2 milyon insan diş hamuru kök hücreleri altı kuyu plakaları, kadar 28 gün posa ayırma. Her üç günde bir, supernatant atın.Oda sıcaklığında iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın ve nöronal kültür ortamının iki mililitresini değiştirin. Yedi ila 14 gün sonra, hücreleri bir mililitre tripsin-EDTA ile 37 santigrat derecede üç dakika ayırın. Daha sonra, trypsin eylem durdurmak için bir-beş oranında kültür ortamı dört mililitre ekleyin.Akış sitometri sitometri ile insan diş hamuru kök hücreleri karakterize etmek için, kültür kültür ortamının iki mililitre ile altı iyi plakalar hücrelerin mililitre başına 2 milyon. 28 gün post-dental hamuru ayırma veya nöronal kültür ortamı ile ek bir 14 gün sonra, hücreleri ayırmak için üç dakika için 37 derece santigrat tripsin-EDTA bir mililitre ekleyin. Daha sonra, tripsin eylemini durdurmak için bir-beş oranında dört mililitre kültür ortamı ekleyin ve altı dakika boyunca oda sıcaklığında 259 kez g santrifüj edin.PBS'de 300 mikrolitre %4 paraformaldehit ile tedavi edilmeyen veya tedavi edilmeyen hücreleri 10 dakika boyunca dört santigrat derecede düzeltin. Sonra, santrifüj, supernatant atın ve ek bir 10 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS% 1 non-iyonik yüzey aktif madde ile hücreleri permeabilize. Sonra, tekrar santrifüj, supernatant atın ve bir saat boyunca oda sıcaklığında PBS bir mililitre% 5 yağsız kurutulmuş süt ile engelleme gerçekleştirin.Bir mililitre PBS ile üç kez yıkayın ve hücreleri bir saat boyunca oda sıcaklığında anti-CD105, anti-CD44, anti-STRO-1, anti-CD90, anti-CD73, anti-beta-üç-tubulin, anti-NFH ve anti-GAP43 monoklonal antikorlarla kuluçkaya yatırın. Daha sonra, altı dakikalık aralıklarla pbs bir mililitre ile tekrar üç kez hücreleri santrifüj, ve sonra bir ek saat oda sıcaklığında anti-fare PE veya anti-tavşan CY5 monoklonal antikorlar ile kuluçka. Bağışıklık-pozitif hücreleri gating için ikincil antikorlar kullanın ve bir akış sitometre ile tüm örnekleri analiz.Kültür 2 milyon hücre insan diş hamuru kök hücreleri mililitre başına altı iyi plakalar ile kültür ortamı iki mililitre. 21 ve 28 gün post-dental hamuru ayırma veya nöronal kültür ortamı ile ek bir yedi ila 14 gün sonra, hücreleri ayırmak için üç dakika boyunca 37 derece santigrat tripsin-EDTA bir mililitre ekleyin. Sonra, santrifüj, supernatant atın ve sonra 10 dakika boyunca dört derece santigrat pbs% 4 paraformaldehit ile örnekleri düzeltmek.Sonra, santrifüj, supernatant atın ve sonra 10 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS% 1 non-iyonik yüzey aktif madde ile permeabilize. Supernatant çıkarın ve bir saat boyunca oda sıcaklığında tavşan anti-PrP monoklonal antikor ile hücreleri leke. Son olarak, santrifüj, supernatant atın ve daha sonra ek bir saat oda sıcaklığında anti-tavşan CY5 monoklonal antikor ile kuluçka.Akış sitometresi ile tüm örnekleri analiz edin. Posa ayrımından sonra, insan diş hamuru kök hücre kümeleri çevre üzerinde genişletildi. EGF/bFGF tarafından indüklenen nöronal farklılaşma dan önce ve sonra bu hücrelerin büyümesi arasında yapılan karşılaştırmada hücre morfolojisi ve nörit lerin büyümesinde önemli değişiklikler saptandı.Tedavi edilmeyen insan diş hamuru kök hücreleri CD44, CD90, CD105, CD73 ve STRO-1 gibi çok güçlü mezenkimal stromal spesifik yüzey antijenleri ifade. Uygun nöronal indüksiyon uyaranlarından sonra, bu hücreler beta-üç-tubulin, NFH ve GAP43 gibi spesifik nöronal belirteçleri ifade etti. Tedavi edilmeyen veya tedavi edilmeyen hücreler CD14 ve CD19 gibi hematopoetik belirteçleri ifade etmedi.28 gün sonra prion proteini insan diş posası kök hücrelerinde ilgili negatif kontrole göre erken ifade edildi ve EGF/bFGF tarafından indüklenen nöronal farklılaşma sürecinden sonra ekspresyonu arttı. Batı leke analizi, EGF/bFGF uyaranlarından önce sRNA tarafından prion proteininin susturulmasının nöronal belirteçlerin beta-üç-tubulin ve NHF ekspresyonunu engelleyerek insan diş posası kök hücrelerinin nöronal farklılaşma sürecini etkileyebileceğini göstermiştir. En önemli şey, hücreleri posadan ayırmak için enzimseçimidir.Aslında, enzim çok agresif ise, hücreler zarar görebilir ve büyüme ve farklılaşma kapasitesi tehlikeye olabilir. Diş hamuru kök hücreleri rejeneratif tıp alanında in vivo ve in vitro çalışmalarda istihdam edilebilir mükemmel bir deneysel modeldir. PrP diş posakök hücrelerinin nöronal farklılaşma sürecinde önemli bir rol oynadığından, bu belirteç nörodejeneratif hastalıklarda etkili bir hedef olarak mükemmel bir aday olabilir.Tavsiye etmek için en önemli yönü hastaların sağlık durumu, bulaşıcı hastalıkların yokluğu gibi.

isolation-propagation-prion-protein-expression-during-neuronal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Yöntemi kullanarak insan dental pulpa kök hücrelerinin (hDPSCs) izolasyonu ve karakterizasyonu...

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Bu videoda, bir transwell filtresi kullanarak trigeminal nöronların ve birincil diş pulpası hücrelerinin ko-kültürünü oluşturmak için bir teknik gösterilmektedir. Fiziksel olarak ayrılmış bu durumda, diş pulpası dokusundan elde edilen mezenkimal hücreler, gözeneklerden geçen parakrin sinyal molekülleri salgılar ve nöronların mezenkimal hücrelere doğru farklılaşmasını ve göçünü teşvik ederek bir ko-kültür sistemi oluşturur.

Çapraz iletişim için dental pulpa hücreleri ve trigeminal nöronların ortak kültürünün oluşturulması

Bu video, insan pluripotent kök hücrelerinin, tetrasikline duyarlı elementin kontrolü altında nörojenik bir transkripsiyon faktörü geni taşıyan tasarlanmış lentivirüslerle transfekte edilerek nöronlara farklılaşmasını indükleme sürecini ve ardından bir tetrasiklin türevi ve olgunlaşma ortamı ile muameleyi göstermektedir.

Tasarlanmış Lentivirüsler Kullanılarak Nöronlarda İnsan Pluripotent Kök Hücre Farklılaşması

Bu işlem insan gelişimi sırasında gözlenen benzemektedir kontrol noktaları geçerek telencephalic nöronlar verir. Hücreler, kendiliğinden ayırt etmek için izin nöral soy doğru itip faktörlere maruz kalabilir, izole edilir, ve terminal farklılaşma ve olgunlaşma için izin lamelleri üzerine kaplanır.

İnsan Pluripotent Kök Hücreler Telencephalic glutamaterjik Nöron Şartnamesi

Bu iletişim kuralı insan diş kökü çıkarılan diş kök hücrelerin geçici genetik mühendisliği açıklar. Uygulanan non-viral değişiklik strateji tedavi kök hücre ürünlerin geliştirilmesi için bir temel olabilir.

Yalıtım, karakterizasyonu ve insan diş kökü kök hücrelerin genetik değişiklik mikroRNA tabanlı

Biz izolasyon, dağılım ve diş hamuru kaplama (DP) trigeminal ile birincil hücrelerin kaplama (TG) nöronlar üstteki transwell filtreleri üzerinde kültürlü. DP hücrelerinin hücresel yanıtları immünofloresan veya RNA/protein analizi ile analiz edilebilir. Konfokal mikroskopi ile nöronal belirteçlerin immünfloresansi neurite outgrowth yanıtlarının analizine izin verir.

Diş Hamuru Parakrin Sinyalleri yanıt olarak Neurite Outgrowth Çalışma Co-Kültür Yöntemi

Bu makale, eksplant kültür yöntemini kullanarak dental pulpa kök hücrelerinin birincil kültürünü oluşturmak ve bu hücrelerin ICSCRT yönergelerine dayalı olarak karakterizasyonunu yapmak için adım adım bir kılavuz sağlar. Bu protokol ile izole edilen hücreler, daha sonraki uygulamalar için mezenkimal kök hücreler olarak kabul edilebilir.

Dental pulpa kök hücrelerinin birincil kültürü

Bu protokol, multipotent kök hücrelerin enzimatik sindirim yoluyla diş pulpasından ekstraksiyonunu, kültürünü ve korunmasını vurgular. Ek olarak, osteoblastlara, adipositlere ve kondrositlere farklılaşma potansiyellerini göstererek süreçte hassasiyet ve tutarlılığın önemini vurgular.

İnsan Süt ve Daimi Dişlerinden Dental Pulpa Kök Hücrelerinin İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

İnsan kasından türetilen ana yapışık hücre tipleri miyojenik hücreler ve fibroblastlardır. Burada, hücre popülasyonları, CD56 antijenine dayalı olarak manyetik olarak aktive edilen hücre sıralaması kullanılarak zenginleştirilir. Spesifik antikorlarla müteakip immüno-etiketleme ve görüntü analiz tekniklerinin kullanılması, tek tek hücrelerde sitoplazmik ve nükleer özelliklerin miktar tayinine izin verir.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

Bu protokol, domuz adipoz kaynaklı kök hücrelerin (pADSC) deri altı yağ dokularından izolasyonunu ve çoklu potansiyelin incelenmesini tanımlar. Multipotent pADSC, adiposit farklılaşma süreçlerini tanımlamak ve rejeneratif çalışmalar için mezodermal mezenşimin çoklu hücre soylarına veya ektoderm ve endodermin diğer soylarına transdiferansiyonu incelemek için kullanılır.

Domuz Subkutan yağ dokularındaki İzolasyonu ve Yağ-Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşması

Keşfedin insan diş pulpası kök hücrelerinin izolasyonu ve nöronal farklılaşma sırasında prion protein ifadesi. Bu yöntem rejeneratif tıp ve biyobank araştırmaları için yüksek verimli bir kaynak sunar.

Yalıtım, yayma ve insan diş Pulp kök hücrelerin Nöronal Farklılaşma sırasında Prion Protein ifade

Daha fazla video keşfet