Name: Ekstrasellüler matris Hidrogeller kullanarak normal doku radyasyon etkileri eğitim (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Öğrenin, ekstraselüler matris hidrojelleri kullanarak radyasyonun murine meme yağ pedlerindeki etkilerini nasıl değerlendireceğinizi. Bu yöntem, tümör hücresi davranışları ve kanser nüksü mekanizmaları üzerine önemli bilgiler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Gfp-ve luciferase-4t1 hücreleri sağlamak için Dr. Laura L. Bronsart teşekkür ederiz, Dr. Edward L. lagory 1 üzerinde tavsiye için-([4-(xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol boyama, Dr. Craig L. Duvall Ivis ve kurutucu kullanımı için, ve Dr. Scott A. guelcher Reometre için Kullanın. Bu araştırma NıH Grant #R00CA201304 tarafından mali olarak destekleniyordu.

Hayvan çalışmaları, Vanderbilt Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanan kurumsal yönergeler ve protokollere uygun olarak yapılmıştır.
1. MFP 'lerin hazırlanması ve ex vivo ışınlama
<ol><li>Co2 boğulma kullanarak atymic Nu/nu fareler (8 – 10 hafta) kurban servikal dislocation tarafından takip.</li>
	<li>70% etanol kullanarak cildi temizleyin.</li>
	<li>Tam rpmi medya içeren 15 ml konik tüp önceden sterilize makas ve forseps kullanarak feda fareler meme Yağ pedleri (MFP) toplamak (rpmi 1% penisilin-streptomisin ve% 10 fetal Sığır serum ile tamamlayıcı) ( malzeme tablosuna bakın ).</li>
	<li>Bir sezyum kaynağı kullanarak 20 GY 'ye radyasyon örnekleri.</li>
	<li>Radyasyona neden olan MFP 'leri ve tam RPMı medyasını Biyogüvenlik kabinine getirin. Medya son hidrojel yetişecek hücre hattına bağımlı olacaktır. MFP 'leri alt etmek için yeterli medyaya sahip 6 cm veya 10 cm 'lik yemekleri doldurun. 6 cm 'lik yemekler için 8 mL medya kullanın ve 10 cm 'lik yemekler için 20 mL medya kullanın.</li>
	<li>İki gün boyunca 37 °C/5% CO2 kuluçko içinde inkübe. Kuluçte zaman uzunluğu ayarlanabilir.</li>
	<li>Fosfat-tamponlu tuz (PBS), leke aşırı nem ve yer MFP 'leri 15 ml konik tüplere muhafaza ederek-80 °c ' de deselülarizasyon kadar durulayın. Bu donma adımı deselülarizasyon adımını yardımcı olur ve sonraki adımlar Aksi halde hazır olsa bile örnek dondurulmuş olmalıdır.</li>
</ol>2. deselülarizasyon (referanslara göre uyarlanmış12,16,17)
Not: Bu prosedür, sodyum Dodesil sülfatın yerine sodyum deoksikolatın iyonik deterjan dahil yağ deselülarizasyon üzerinde odaklanan daha önce yayımlanan yöntemlerden adapte edildi DNA 'yı verimli bir şekilde kaldırmak için12,16 , 17 yaşında.
<ol><li>1. gün, dondurulmuş MFP 'leri-80 °c ' den çıkarın ve oda sıcaklığında çözüyor.</li>
	<li>Bir kez çözülür, hassas bir görev silme üzerinde kısaca kuru MFP 'ler. MFP 'leri analitik bir ölçek kullanarak tartın.</li>
	<li>Makas veya neşter ile bir çift forseps kullanarak, bozulmamış ECM ve hidrojel üretimi için kalan doku çalışması için 3 mm x 3 mm x 3 mm örneklere bölme doku. Not: örnek sayısı, test yöntemlerinin sayısına bağlıdır, örneğin iki numune koleksiyonu aşağıda açıklanmıştır: biri parafin katıştırma (adım 2,5) ve bir tane kriyostat gömme ortamında donma için, istenirse ( malzeme tablosuna bakın ve adım 2,6).</li>
	<li>Dokuları tartın. Bölümleme için parafin katıştırmak, adım 2,5 devam edin. Kesme için kriyostat gömme orta donma, adım 2,6 devam edin.</li>
	<li>Kimyasal bir kaput olarak,% 10 nötr tamponlu formalin (NBF) içinde dokuyu ( malzeme tablosunabakın) 4 °c ' de 24 saat içinde taşın. 5 dakika boyunca PBS 'de 3 kez yıkayın. 4 °C ' de 48 h için% 30 sakaroz içinde dokusu taşın.<ol>
<li>Bu parça kaldırıldı şimdi doku tartmak. 2,6 adıma geçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Kimyasal bir kaput içinde, MFP parçalarını kriyostat gömme ortamıyla hazırlanmış etiketli bir kasete yerleştirin. Doku kapsayacak şekilde daha kriyostat gömme orta ekleyin.<ol>
<li>Kaset 2-metilbutan bir kabı içine yerleştirin ( malzeme tablosunabakın) Bu sıvı nitrojen ile önceden soğutulur. Kabı yeterli olmalıdır 2-metilbutan alt kapsayacak şekilde ancak kriyostat gömme Orta 2-methylbutane dokunmamalıdır çünkü kaseti gömmek için yeterli değil. Kriyostat gömme orta donuyor ve opak hale gelene kadar Kaset 2-methylbutane oturmak edelim.</li>
		<li>Kaset (lar) ı folyo, etikete sarın ve kesme için kullanılıncaya kadar-80 °C ' ye bırakın. Not: kriyostat gömme ortamına hemen yerleştirilen dokularda 5 μm ' de kesitli, sakaroz içinde inküklenmiş dokularda adipoksit morfolojisi korumak için 30 μm ' de kesilmiştir.</li>
	</ol></li>
	<li>El kalan doku masaj için forseps kullanın. Not: doku parçaları da% 10 NBF içinde 24 – 48 h, PBS durulanır ve 70% etanol içinde parafin gömme kadar sol yerleştirilir. Gömme işleminden sonra, 5 μm bölüm hematoksinlin ve eozin (H & E) boyama için kullanılabilir (aşağıdaki bölüm 7 ' ye bakın).</li>
	<li>MFPs 'yi 5 mL 0,02% tripsin/% 0.05 EDTA çözeltisi ile 6 cm 'lik yemeklerle yerleştirin. 37 °C ' de 1 saat boyunca kuluçk. inküyörün içine yerleştirmeden önce% 70 etanol ile yemekleri sprey ve silin.</li>
	<li>0,7 mm süzgeci kullanarak MFP 'leri deiyonize (dı) su ile yıkayarak doku üzerinde üç kez su dökerek kullanın. El yıkanıyor arasında doku masaj için forseps kullanın.</li>
	<li>Hassas bir görev üzerinde kısaca kuru doku silin ve tartın. Uygun boyutta bir karıştırın bar içeren bir pre-otoklav kabı içinde doku yerleştirin. 60 mL ile kapak dokular 3% t-octylphenoxypolithoxyethanol (bkz. malzeme tablosu) başına 1 g doku ve karıştırın 1 saat oda sıcaklığında. En az 20 mL kullanın.</li>
	<li>Doku ve içeriği bir süzgece döküyor. DI su ile kabı durulayın ve dokulara dökün. İki kez daha tekrarlayın. El ile durulama arasında doku masaj için forseps kullanın.</li>
	<li>Hassas bir görev üzerinde kısaca kuru doku silin ve tartın. Dokulara yerleştirin ve aynı Beakers geri çubuklar karıştırın, ve 60 ml ile kapak 4% desoksikolik asit 1 g doku başına. Oda sıcaklığında 1 h için karıştırın. En az 20 mL kullanın.</li>
	<li>Doku ve içeriği bir kafes süzgecine döküyor. Ma suyu ile yıkama kabı ve dokulara dökün. İki kez daha tekrarlayın. El ile durulama arasında doku masaj için forseps kullanın.</li>
	<li>Hassas bir görev üzerinde kısaca kuru doku silin ve tartın.</li>
	<li>% 1 penisilin-streptomisin ile tamamlayıcı taze dı su ile aynı kabı içinde doku yerleştirin. Parafin filmi ile sıkıca Kapla. Gece 4 °C ' de bırakın.</li>
	<li>Ertesi gün kullanım için yıkama süzgeçleri ve pancar.</li>
	<li>2. gün, bir süzgeç içine drenaj kabı içeriği. Hassas bir görev üzerinde kısaca kuru doku silin ve tartın.</li>
	<li>Uygun boyutta bir karıştırın Bar ile aynı kabı içinde MFP 'ler yerleştirin. 60 mL 4% etanol/1 g doku başına% 0.1 Perasetik asit çözeltisi ile kapak. En az 20 mL kullanın. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca karıştırın.</li>
	<li>0,7 mm süzgecine doku ve içindekiler dökümü. Manuel doku masaj için forseps kullanın. İçeriği geri beçine yerleştirin. 1 g doku başına 60 mL 1x PBS ile kaplayan dokusu ile yıkayın. En az 20 mL kullanın. Oda sıcaklığında 15 dakika karıştırın. Bir kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>0,7 mm süzgecine doku ve içindekiler dökümü. Manuel doku masaj için forseps kullanın. İçeriği geri Beaker yerleştirin. 1 gr doku başına 60 mL dı su ile kaplayan dokusu yıkayın. En az 20 mL kullanın. Oda sıcaklığında 15 dakika karıştırın. Bir kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Hassas bir görev üzerinde kısaca kuru doku silin ve tartın. Doku ve içeriği bir süzgece döküyor. Manuel doku masaj için forseps kullanın.</li>
	<li>İçeriği geri Beaker yerleştirin. 1 g doku başına 60 mL 100% n-propanol ile kapak dokular. En az 20 mL kullanın. Oda sıcaklığında 1 h için karıştırın.</li>
	<li>Hassas bir görev üzerinde kısaca kuru doku silin ve tartın. 0,7 mm süzgecine doku ve içindekiler dökümü. Manuel doku masaj için forseps kullanın.</li>
	<li>İçeriği geri Beaker yerleştirin. 1 g doku başına 60 mL dı su ile kaplayan dokusu yıkayın. En az 20 mL kullanın. Oda sıcaklığında 15 dakika karıştırın. Üç kez tekrarlayın.</li>
	<li>Doku ve içeriği bir süzgece döküyor. Kriyostat gömme ortamında sukrose inkübasyon ve donma için doku parçalarını toplamak için 2.3 – 2.6 arasındaki adımları tekrarlayın.</li>
	<li>Hassas bir görev üzerinde kısaca kuru doku silin ve tartın. Etiketli 15 mL 'Lik bir tüp yerleştirin. Gece-80 °C ' de dondur.</li>
</ol>3. lyophilization
<ol><li>15 mL tüpü-80 °C ' den çıkarın ve Kuru buzun üzerine yerleştirin. Numuneleri lyophilizer 'a kadar kuru buzda dondurulmuş tutun.</li>
	<li>Kapakları çıkarın. Hassas bir görev açmak için üst silmek eklemek için bir kauçuk bant kullanın. En az 2 gün boyunca kurutucu örnekleri koyun.</li>
	<li>Kurutucu ve yer tüpleri kuru buzdan örnekleri çıkarın. Hassas görev mendilleri, her numuneyi analitik ölçekte tartın. Bir gecede-80 °C ' de kapaklar ve yer takın.</li>
</ol>4. freze
<ol><li>Sığ bir kabı sıvı azot ile doldurun. -80 °C dondurucudan numuneleri çıkarın. Her likofilized MFP 'yi tartın.</li>
	<li>Harç bir örnek yerleştirin. Sıvı nitrojen harç tutmak için bir kriyojenik eldiven kullanın.</li>
	<li>Örnek değirmen için bir el matkap bağlı bir havaneli kullanın. Mill 1 dk aralıklarla ilerleme kontrol etmek ve sıvı nitrojen el eldiven çıkarın. En az 5 dakika değirmen.</li>
	<li>Tüm örnekler için tekrarlayın. Sprey ve her örnek arasında etanol ile harç ve havaneli silin.</li>
	<li>Toz örneklerini 15 mL tüpte-80 °C ' de kullanıma hazır olana kadar saklayın. Not: örnekler hemen kullanılabilir ya da bir gecede depolanabilir.</li>
</ol>5. hidrojel oluşumu
<ol><li>Bir gecede-80 °C ' de depolanırsa, oda sıcaklığında çıkarın ve çözüyor. Çözme sırasında, pepsin gerekli ağırlığı hesaplamak ( malzeme tablosunabakın) ve hidroklorik asit hacmi (HCL) her örnek için gerekli olan bir çözüm sonuçları 1% w/v örnek toz ve 0,1% w/v pepsin Içinde 0,01 M HCL. form için HCL pepsin ekleyin bir pepsin-HCl çözümü.</li>
	<li>15 mL tüpüne örnek toz ve pepsin-HCl çözeltisi ekleyin. Küçük bir karıştırın Bar ekleyin ve 48 h için karıştırın.</li>
	<li>Tüpleri 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. 1x PBS konsantrasyonu ile bir çözüme neden olan her örnek için gerekli 10X PBS 'nin gerekli hacmini hesaplayın. Her tüp için 10X PBS uygun hacmi ekleyin.</li>
	<li>Eklemek 10% v/v 0,1 M NaOH her çözüm pH 7,4 ulaşmak için. Bireysel test etmek için bir pH kağıt kullanın. Not: jel çözeltisi bir hafta boyunca 4 °C ' de depolanabilir.</li>
</ol>6. Hidrojeller hücreleri Kapsüller
<ol><li>GFP-ve luciferase etiketli hücreleri kullanma<ol>
<li>PH 7,4 jel çözeltisi kullanarak, pelletini pelleted Gfp-ve luciferase-4t1 hücreleri 500.000 veya 1.000.000 hücre/ml jel çözeltisi konsantrasyonuna etiketli. 16 kuyu odası kaydırağı her bir kuyu için 16 μL jel hücreli çözelti ekleyin. 37 °C ' de 30 dak.</li>
		<li>Her kuyu için tam RPMı medya 100 μL ekleyin. 37 °C ' de 48 h için inkübasyon devam eder. GFP-ve luciferase etiketli hücreler, floresan mikroskobu ile 0 saat, 24 saat, 48 saat ve jelleşme sonrasında görselleştirilebilir. Not: hücre proliferasyonu GFP-ve luciferase etiketli 4T1 hücreleri için burada (S)-4 ekleyerek kullanılan ölçülebilir 5-dihydro-2-(6-hidroksi-2-benzothiazolyl) 10 dk için kuyulara (bkz ve Bioluminesans görüntüleme sistemi kullanarak biyolüminesans görüntüleme (bkz. malzeme tablosu). Biyolüminesans görüntüleme sonrasında, sitozit görselleştirilebilir (bkz. Bölüm 10).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Etiketli olmayan hücreleri kullanma<ol>
<li>PH 7,4 jel çözeltisi kullanılarak pelletini, 500.000 veya 1.000.000 hücreli/ml jel çözeltisi konsantrasyonuna etiketlenmemiş 4t1 hücrelerini Solunar. 16 kuyu odası kaydırağı ve 96-kuyu plakasının her bir kuyusu için 16 μL jel hücreli çözelti ekleyin. 37 °C ' de 30 dak.</li>
		<li>Her kuyu için 100 μL medya ekleyin. 37 °C ' de 48 h için inkübasyon devam eder. Not: hücre canlılığı ölçülebilir (bkz. Bölüm 11). 16-kuyu odası slayt görüntüleme için kullanılabilir, ve 96-Well plaka Ölçüleme için kullanılabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. H & E boyama
<ol><li>Formalin-sabit, parafin-gömülü doku için, iki kez 100% Ksilin (5 – 10 dk) de-parihfinization için 5 μm bölümleri içeren kayılan slaytlar. % 100,% 95,% 85 ve% 70 etanol ile 5 dakika boyunca her biri, 5 dakika boyunca dı suyu tarafından takip edilmesiyle rehidrat. 7,6 adıma devam edin.</li>
	<li>Dondurulmuş doku bölümleri için, dondurucudan hemen bölümler alın ve 10 dakika boyunca 10% NBF 'de onları yıkın. 1x PBS 'de 5 dakika her biri için üç kez yıkayın. Suda 5 dakika durulayın.</li>
	<li>3 dakika boyunca hematoksilen ile leke çekirdekleri. musluk suyunun çalışmasını durulayın.</li>
	<li>% 0,3 asit alkol (% 0,3 HCl% 70 etanol içinde) 1 – 2 kez daldırma ayırt. 5 dakika boyunca musluk suyunun çalışmasını durulayın.</li>
	<li>30 s için ağartama maddeler Agent ekleyin. 5 dakika boyunca musluk suyunda durulayın. 30 s için 95% etanol içinde alt birleştirme.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 90 s için eozin ile inkübe. 5 dk her biri için% 100 etanol 3 değişiklik içinde dehydrate.</li>
	<li>Her biri için 5 dk% 100 Ksilin iki kez Submerge. Distyrene-plasticiser-Xylene (DPX0 montaj ortamını slayda ekleyin ve bir coverslip ekleyin. Görüntüleme önce bir gecede tedavi edelim.</li>
</ol>8.1-([4-(xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol boyama
<ol><li>Hazırlamak 1-([4-(Xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol çözüm.<ol>
<li>100 ml propilen glikol ile bir kabı için 1-([4-(xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol tozu 0,5 g ekleyin. 95 – 100 °C ' ye kadar ısınarak en az 30 dk. sıcaklığın 100 °C ' yi aşmasını engelleyin.</li>
		<li>Sıcaktan kabı çıkarın ve biraz soğumaya izin verin. Herhangi bir kalıntı parçacıklarını kaldırmak için Grade 4 nitel filtre kağıdı ile eriyik dökün. Not: çözelti oda sıcaklığında depolanabilir ve boya yapmadan hemen önce 0,45 μm şırınga filtresinde filtrelenmelidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Leke dondurulmuş doku bölümleri.<ol>
<li>-80 °C ' den gelen slaytları çıkarın 30 dakika boyunca dondurucu ve hava kuru.% 10 NBF-20 °C ' de bir Coplin kavanozunda 30 dakika boyunca soğutun. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında slaytlar düzeltin. her biri 5 dakika boyunca 3 kez dı suyunda yıkayın.</li>
		<li>Propilen glikol 2 kez 5 dakika boyunca daldırmadan önce hassas bir görev silme kullanarak aşırı su çıkarın. Propilen glikol gelen slaytlar çıkarın. Durulayın.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 3 saat için şırınga filtreli yağlı kırmızı O boyama çözeltisi içine slaytlar yerleştirin.</li>
		<li>% 85 propilen glikol içinde 5 dakika boyunca slaytlar yerleştirerek ayırt. PBS 'deki örnekleri 5 dakika boyunca iki kez durulayın.</li>
		<li>30 s için hematoksilen ile leke örnekleri. 5 dakika boyunca musluk suyu çalışan yıkayın ve sonra dı su slaytlar yerleştirin.</li>
		<li>Sulu bazlı montaj ortamını kullanarak örnekleri monte edin ve medyanın görüntüleme öncesinde bir gecede kurumasına izin verin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Reoloji
<ol><li>Adım 5,4 ön jel çözümlerini buzun üzerindeki Reometre 'a getirin.</li>
	<li>Reometreye 25 mm 'lik bir kol ve plaka takın. Rheometre bağlı bilgisayarda Reoloji yazılımı açın.</li>
	<li>Rotasyonel eşleme gerçekleştirin ve sıfır boşluğu belirleyin. Tamamlandığında kolu kaldırın.</li>
	<li>Pipet 500 plaka üzerinde ön jel μL. Ön jel solüsyonu tamamen plaka ve kol arasındaki boşluğu kaplar kadar aşağı kolu. Bu noktadan geçmiş kolu düşürerek ön jel çözeltisi yan dışarı dökülmesine neden olacaktır çünkü muhafazakar olun.</li>
	<li>37 °C ' de 30 dakika boyunca kaldıktan sonra 0.1 – 100 Hz ön jel çözeltisi üzerinde Frekans taraması gerçekleştirin.</li>
	<li>Tamamlandığında Reometre kolunu yükseltin. Hassas bir görev silme ile sıvı silin. Dı su ile durulayın ve hassas bir görev silme ile silin. 9.4-9.6 arasındaki adımları ek örneklerle yineleyin.</li>
</ol>10. F-actin phalloidin Konjugat boyama
<ol><li>Phalloidin Konjugat çözümünü oda sıcaklığına getirin. Açılmadan önce düşük hızda kısaca santrifüjün. Test için yeterli çözüm aliquot ve dinlenme at-20 °C saklayın.</li>
	<li>1 ml 1x PBS + 1% sığır serum albümin (BSA) 1 μL stok çözüm ekleyerek 1x çalışma çözümü için seyreltmeli 1000x phalloidin Konjugat stok çözüm. Bu 10 kuyu (100 μL/iyi) için yeterli yapar. Not: bir düz 1x PBS kullanabilirsiniz, ancak 1x PBS + BSA tüp yapışmasını phalloidin Konjugat önlemek için tercih edilir. Tahlil işleminden sonra bu çözümü saklamayın. 1 μL mavi floresan boya (bkz. malzeme tablosu) çalışma çözeltisi çekirdekler için leke eklenebilir. 1 μL 20 mM mavi floresan boya ile 11,3 μL 1x PBS karıştırılarak çalışma çözeltisi yapılabilir.</li>
	<li>Kuyudan medya aspirate (adım 6,1). 1x PBS ile durulayın kuyuları.</li>
	<li>% 10 NBF ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 10 NBF ile kuyuları kulyın. Supernatant kaldırın. Her seferinde 5 dakika boyunca PBS ile 3 kez yıkayın.</li>
	<li>PBS 'de 5 dk. Aspirate için 0,1% t-octylphenoxypolithoxyethanol ekleyin ve her seferinde 5 dakika boyunca PBS ile 3 kez yıkayın.</li>
	<li>Ekle 100 μL adım 10,2 her iyi çalışma çözümü. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca inküye yapın. Her seferinde 5 dakika boyunca PBS ile 3 kez aspirate ve yıkayın. 4 °C ' de PBS 'de bırakın.</li>
	<li>Oda kaydırağı üzerindeki conta üzerindeki kuyuları aspirate ve çıkarın. İğne burun cımbız kullanın sürgülü conta kaldırmak için. Sulu bazlı montaj ortamını kullanarak Mount ve lamel magazini örnekleri. Tedavi için izin (5 dk).</li>
	<li>590/618 nm 'nin uyarılması/emisyonunda Floresan Mikroskobu altındaki hücrelere uyun.</li>
</ol>11. viability tahlil
<ol><li>Hücreleri Dulbecco 'nun PBS 'iyle (DPBS) durulayın. Her bir kuyu için 1 μm kalcein ve 2 μm etidyum homodimer içeren dpbs 100 μL ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inküye yapın.</li>
	<li>Floresan Mikroskobu ile 16-kuyu odası slaytı görüntü. Calcein acetoxymetyl (calcein AM) uyarma/emisyon = 494/517 nm görülebilir. Etidium homodimer, uyarma/emisyon = 528/645 nm 'de görülebilir.</li>
	<li>11,2 adımda aynı dalga boylarını kullanarak bir plaka okuyucuda 96-Well plakasını okuyun.</li>
</ol>

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hallmarks+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2018%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li>
<li>Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery%3A+a+systematic+review+by+receptor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).</li>
<li>Miller, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+treatment+and+survivorship+statistics%2C+2016%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer treatment and survivorship statistics, 2016.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).</li>
<li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li>
<li>Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+Following+Radiation+Therapy+in+Immunosuppressed+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).</li>
<li>Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+after+radiation+therapy%3A+Review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">Wound healing after radiation therapy: Review of the literature.</a> Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).</li>
<li>Beachley, V. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+matrix+arrays+for+high+throughput+screening+and+systems+analysis+of+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function.</a> Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).</li>
<li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+metastases+obtained+by+culturing+colorectal+cancer+cells+on+tissue-specific+decellularized+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).</li>
<li>Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+hydrogels+from+decellularized+tissues%3A+Structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function.</a> Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).</li>
<li>Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECM+and+ECM-like+materials+%E2%80%94+Biomaterials+for+applications+in+regenerative+medicine+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">ECM and ECM-like materials — Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).</li>
<li>Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+hydrogel+scaffold+from+decellularized+human+lipoaspirate%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate.</a> Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).</li>
<li>Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+derived+myocardial+matrix+as+an+injectable+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).</li>
<li>Pouliot, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+naturally+derived+lung+extracellular+matrix+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).</li>
<li>Bonvillain, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Nonhuman+Primate+Model+of+Lung+Regeneration%3A+Detergent-Mediated+Decellularization+and+Initial+In+Vitro+Recellularization+with+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).</li>
<li>Brown, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Three+Methods+for+the+Derivation+of+a+Biologic+Scaffold+Composed+of+Adipose+Tissue+Extracellular+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).</li>
<li>Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+Hydrogels+from+Pulmonary+Extracellular+Matrix+for+3D+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).</li>
<li>Massensini, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration-dependent+rheological+properties+of+ECM+hydrogel+for+intracerebral+delivery+to+a+stroke+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity.</a> Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).</li>
<li>Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+5+1+facilitates+cancer+cell+invasion+through+enhanced+contractile+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces.</a> Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).</li>
<li>Ahmadzadeh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+two-way+feedback+between+contractility+and+matrix+realignment+reveals+a+nonlinear+mode+of+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Hidrojel oluşumu bu yöntem büyük ölçüde başlangıç dokusu miktarına bağlıdır. Murine MFP 'ler küçüktür ve deselülarizasyon süreci malzemenin önemli ölçüde azalmasına neden olur (Tablo 1). Son verimi artırmak için daha fazla MFP ile işlem tekrarlanabilir. Frezeleme, malzemenin kaybına yol açabilecek bir başka önemli adımdır. Diğerleri bir kriyojenik değirmen ile başarı göstermiştir, ancak bu protokol bir el harç ve bir havaneli eki ile elektrikli matkap ile frezeleme dayanmaktadır8<...

Kanser apoptozis kaçınmak ve aynı zamanda uzak sitelere metastaz hücrelerin aşırı proliferasyon ile karakterize1. Meme kanseri ABD 'de kadınlar arasında en yaygın formlardan biridir, tahmini 266.000 yeni vaka ve 40.000 ölüm ile 20182. Özellikle agresif ve alt türü tedavi etmek zor üçlü negatif meme kanseri olduğunu (TNBC), hangi östrojen reseptörü yoksun (ER), progesteron reseptör (PR), ve insan epidermal büyüme faktörü (HER2). Radyasyon terapisi, lumpektomi sonrasında kalan tümör hücrelerini ortadan kaldırmak için meme kanserinde yaygın olarak kullanılır, ancak TNBC hastalarının% 13 ' ünden fazlası primer tümör bölgesinde nüks deneyimi yaşıyor3.
Lumpektomi ve radyasyon kombinasyonu mastektomi olarak aynı uzun vadeli hayatta kalma nedeniyle radyasyon tedavisinin metastaz ve nüks azaltıcı etkili olduğu bilinmektedir4. Bununla birlikte, son zamanlarda radyasyon tedavisinin, immünoterapi sağlayan ayarlarda primer tümör sitesine yerel nüks ile ilişkili olduğu gösterildi5,6. Ayrıca, radyasyon fibrozis inducing tarafından normal doku (ECM) ekstrasellüler matris değiştirir bilinmektedir7. Bu nedenle, tümör hücresi davranışlarını dikte ederek radyasyona bağlı ECM değişikliklerinin rolünü anlamak önemlidir.
Deselülarize dokularda hastalık8,9çalışma in vitro modelleri olarak kullanılmıştır. Bu deselülarized dokular ECM bileşimi korumak ve Complex in vivo ECM reapitulate. Bu deselülarize edilen doku ECM 'si, hücre büyümesini ve fonksiyonunu incelemek için kullanılabilecek yeniden oluşturulmuş ECM Hidrojeller oluşturmak için daha fazla işlenmiş ve sindirilebilir10,11. Örneğin, deselülarized insan lipoaspirate ve miyokard dokusundan elde edilen enjekte edilebilir hidrogeller, non-invaziv doku mühendisliği yöntemleri olarak hizmet vermiştir ve bir in vitro test yöntemi olarak domuz akciğer dokusundan elde edilen bir hidrojel kullanılmıştır mezenkimal kök hücre ataşmanı ve canlılığı12,13,14. Ancak, normal doku radyasyon hasarının ECM özelliklerine etkisi araştırılmamıştır.
ECM 'den elde edilen Hidrojeller, in vivo fenomenlerin in vitro çalışması için en büyük potansiyele sahiptir. Kollajen, fibrin ve matrigel de dahil olmak üzere birçok başka malzeme incelenmiştir, ancak ECM13' ün bileşimi için sentetik olarak reapitleştirmek zordur. ECM 'nin türevi hidrojellerin kullanmanın bir avantajı ECM 'nin belirli bir doku için gerekli proteinleri ve büyüme faktörlerini içerdiğinden14,15. Lumpektomi sırasında normal dokuların ışınlanması ECM 'de önemli değişikliklere neden olur ve ECM-türevi Hidrojeller bu etkiyi içinde vitro olarak incelemek için kullanılabilir. Bu yöntem, hastalığın daha karmaşık ve daha doğru in vitro modellerinde yol açabilir.
Bu çalışmada, duvar meme yağ yastıkları (MFP) radyasyon ex vivo maruz. MFP 'ler deselülarize edilmiş ve ön jel çözeltisi halinde yapılmıştır. Hydrogels Embedded 4T1 hücreler, bir murine TNBC hücre hattı ile kuruldu. Hidrojel materyalinin reolojik özellikleri incelenmiştir ve tümör hücre dinamikleri Hidrojeller içinde değerlendirildi. Radyasyon radyal MFPs gelişmiş tümör hücre proliferasyon imal. Gelecekteki çalışmalar, tedavi sonrasında Kanser nüks bağlamında hücre-hücre etkileşimlerini incelemek için diğer hücre türlerini dahil edecektir.

<table><tbody><tr><td>% 10 Nötr Tamponlu Formalin, Tıkaç</td><td>VWR</td><td>16004-128-2-metilbütan</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ile Küp Alfa Aesar</td><td>19387-AR</td><td></td></tr> <tr><td>2000ex Reometre</td><td>TA Aletleri</td><td>10D4335</td><td>reometre</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1933-25G-kalsein</td><td></td></tr> <tr><td>asetoksimetil (kalsein)</td> <td>Moleküler Problar, Inc.</td><td>C1430-D-Luciferin</td><td></td></tr> <tr><td>Ateşböceği, potasyum tuzu</td><td>Biosynth Kimya & Biyoloji</td><td>L-8820</td> <td>(S) -4,5-Dihidro-2- (6-hidroksi-2-benzotiyazolil) -4-tiyazolekarboksilik asit potasyum tuzu</td></tr><tr><td>Histoloji için DPX Mountant</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>06522-500ML-Dulbecco'nun</td><td></td></tr> <tr><td>fosfat tamponlu tuzlu</td><td>su Gibco</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>14040133-Eosin-Y, Floksin</td><td>ile Richard-Allan Scientific</td><td>71304</td><td>eozin</td></tr><tr><td>etidyum homodimer</td><td>Moleküler Problar, Inc.</td><td>E1169</td><td>etidyum homodimer-1 (EthD-1)</td></tr> <tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926-500ML-Fisher</td><td></td></tr> <tr><td>Healthcare Tissue-Plus OCT Bileşik</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td>kriyostat gömme ortamı</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>su bazlı montaj ortamı</td></tr><tr><td>FreeZone 4.5</td><td>Labconco</td><td>7751020</td><td>liyofilizatör</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Çözelti (20 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>mavi floresan boya</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-500ML-IVIS</td><td></td></tr> <tr><td>Lumina III</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td>biyolüminesans görüntüleme sistemi</td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td></td><td>hassas görev mendilleri</td></tr><tr><td>n-Propanol (Peroksit İçermeyen/Dizileme), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1130-500-Yağ</td><td></td></tr> <tr><td>Kırmızısı O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625-25G</td><td>1-([4- (Ksililanoz)ksil]azo)-2-naftol</td></tr><tr><td>OPS Teşhisi CryoGrinder</td><td>OPS Teşhisi, LLC</td><td>CG-08-02-PBS</td><td></td></tr> <tr><td>(10X), pH 7.4</td><td>Kalite Biyolojik, Inc.</td><td>119-069-151</td><td>Fosfat tamponlu salin</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122-Pepsin</td><td>,</td></tr> <tr><td>domuz mide mukozasından</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887-5G</td><td>pepsin</td></tr><tr><td>Perasetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77240-100ML-Phalloidin-iFluor</td><td></td></tr> <tr><td>594 Reaktif (ab176757)</td> <td>abcam</td>, <td>ab176757</td>, <td>phalloidin konjugatı</td></tr><tr><td>Propilen glikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W294004-1KG-K-Richard-Allan</td><td></td></tr> <tr><td>Bilimsel İmza Serisi Mavileştirme Reaktifi</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>7301L</td><td>mavileştirme ajanı</td></tr><tr><td>Richard-Allan Bilimsel İmza Serisi Hematoksilen 7211</td><td>Richard-Allan Bilimsel</td><td>7211-RPMI</td><td></td></tr> <tr><td>Orta 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093-Sodyum</td><td></td></tr> <tr><td>deoksikolat, %98</td><td>Frontier Scientific</td><td>JK559522</td><td>deoksikolik asit</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016-Triton</td><td></td></tr> <tr><td>x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td>t-Oktilfenoksipolietoksietanol</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.25), fenol kırmızısı</td><td>Gibco</td><td>25200-056-Whatman</td><td></td></tr> <tr><td>kalitatif filtre kağıdı, Sınıf 4</td><td>Whatman</td><td>1004-110</td><td>4. sınıf kalitatif filtre kağıdı</td></tr><tr><td>Ksilenler (Sertifikalı ACS), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>X5-4</td><td>-</td></tr></tbody></table>

ekstrasellüler matris hidrogeller kullanarak normal doku radyasyon etkileri eğitim

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Radyasyon Üçlü negatif meme kanseri olan hastalar için bir terapidir. Radyasyon, sağlıklı meme dokusu ve primer tümör bölgesinde lokal nüks rolündeki rol dışı matris (ECM) üzerinde etkisi bilinmiyor. Burada, duvar meme yağlı pedlerden elde edilen ECM hidrojellerin deselülarizasyon, lyophilization ve imalatı için bir yöntem sunuyoruz. Bulgular deselülarizasyon sürecinin etkinliğinde sunulmuştur ve reolojik parametreler değerlendirildi. GFP-ve luciferase-etiketli meme kanseri hücreleri hydrojels içinde kapsüllenmiş hidrojellerin proliferasyon bir artış göstermiştir. Son olarak, phalloidin Konjugat boyama kapsüllenmiş tümör hücrelerinin siterit organizasyonu görselleştirmek için kullanıldı. Hedefimiz, tümör hücresi davranışlarını incelemek için in vivo meme dokusu ortamını ve radyasyona olan tepkisini taklit eden in vitro çalışma için Hidrojeller üretebilmek için bir yöntem sunmadır.

MFP 'ler Şekil 1a'da gösterilen prosedürü kullanarak ışınlama sonrasında deselülarize edildi. MFPs öncesi deselülarizasyon (Şekil 1B) ve sonrası Deselülarizasyon (Şekil 1C) gösterilir. Deselülarizasyon hematoksislin ve eozin (H &amp; E) boyama kullanılarak onaylandı ve 1-([4-(Xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol boyama lipid içeriğini değerlendirmek için kullanıldı (Şekil 2). ECM hidrojellerin reolojik özellikleri de 37 °C '...

Bu protokol, deselülarizasyon ve ex vivo ışınlama sonrasında murine meme Yağ pedleri sonraki hidrojel oluşumu için bir yöntem sunar.

Ekstrasellüler matris Hidrogeller kullanarak normal doku radyasyon etkileri eğitim

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Bu protokol radyasyon murine meme yağ yastığı yağ dokusunun ekstrasellüler matriks özelliklerini etkilediğini göstermektedir. Bir decellularization modelinde radyasyon ilavesi daha önce yapılmamıştir. Bu teknik, her biri hücre dışılaştırma sürecinde benzersiz bir kimyasal amaca hizmet birkaç yıkama adımları kullanır.Bu tekniğin özgüllüğü daha iyi doku özelliklerini korumak için, nazik kimyasal yıkar sağlar. Meme kanseri nüks tedavi sonrasında oluşur, özellikle üçlü negatif olgularda. Irradiated ekstrasellüler matriks tümör hücre davranışını nasıl değiştirir değerlendirilmesi nüks mekanizmaları hakkında önemli keşifler yol açacaktır.Örnekler infüzyon sonra, bir sezyum kaynağı kullanarak, bir biyogüvenlik kabine içine ışınlanmış MFP ve tam RPMI medya aktarın. MFP'leri batıracak kadar ortamla altı santimetre veya 10 santimetrelik tabakları doldurun. 37 derecede kuluçkaya yat, %5 karbondioksitle, iki gün boyunca.İlk olarak, Trypsin-EDTA çözeltisi beş mililitre ile altı santimetre yemekleri MFP yerleştirin. Sprey ve bir saat boyunca 37 santigrat derece% 70 etanol ve kuluçka ile bulaşıkları silin. MFP'leri üç kez dokuüzerine su dökerek deiyonize suyla yıkamak için 0,7 mililitrelik süzgeçler kullanın.Yıkarlar arasında dokuel masaj için forceps kullanın. Daha sonra, kısa bir süre hassas bir görev silin ve tartmak üzerinde doku kuru. Kurutulmuş dokuları, uygun büyüklükte bir stir bar içeren bir ön otoklav kabına yerleştirin ve doku gramı başına %3 t-octylphenoxypolyethoxyetanol 60 mililitre ile dokuları kaplayın.Oda sıcaklığında bir saat karıştırın. Sonra kabın içindekileri bir süzgeçe at. Kabı deiyonize suyla durulayın ve bunu dokuların üzerine dökün.Bu durulama işlemini iki kez daha tekrarlayın, rinses arasında dokuel masaj için forceps kullandığınızdan emin olun. Bundan sonra, kısa bir süre hassas bir görev silin ve tartmak üzerinde doku kuru. Dokuları ve karıştırma çubuklarını aynı beare geri yerleştirin ve bunları doku gramı başına %4 deoksikolik asit 60 mililitre ile kaplayın.Bir saat oda sıcaklığında karıştırın. Daha sonra, bir örgü süzgeç içine kabın içeriğini dökümü, deiyonize su ile beher durulayın ve dokuların üzerine dökün. Bu durulama işlemini iki kez daha tekrarlayın, rinses arasında dokuel masaj için forceps kullandığınızdan emin olun.Kısa bir süre hassas bir görev üzerinde durulanan doku kuru ve tartmak. Aynı beher içine kurutulmuş dokular yerleştirin, taze deiyonize su ile birlikte, 1% penisilin-streptomisin ile desteklenmektedir. Kabı parafin filmle sıkıca kapatın ve bir gecede 4 derece santigrat derecede bırakın.Ertesi gün bir süzgeç içine beher içeriğini drenaj, kısa bir süre hassas bir görev silin ve tartmak üzerinde doku kuru. Daha sonra, MFP uygun büyüklükte bir karıştırma çubuğu ile aynı beher yerleştirin. Dokuyu gram doku başına %4 etanol ve %0,1 perastik asit içeren bir çözeltinin 60 mililitresi ile kapatın.İki saat oda sıcaklığında karıştırın. Kabın içindekileri 0.7 milimetrelik bir süzgeçe boşaltın. Dokuya elle masaj yapmak ve içindekileri kabın içine yerleştirmek için forceps kullanın.Doku gram başına 1X PBS 60 mililitre ile kaplayarak doku yıkayın. 15 dakika oda sıcaklığında karıştırın. Tüm bu yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın.Sonra, kabın içindekileri 0,7 milimetrelik bir süzgeçe boşaltın. Forceps kullanarak, el ile doku masaj ve kabın içine içeriğini geri yerleştirin. Doku gram başına deiyonize su 60 mililitre ile kaplayarak doku yıkayın.15 dakika oda sıcaklığında karıştırın. Tüm bu yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın. Yıkanmış dokuyu hassas bir görev üzerine kısa bir süre kurutun ve tarttı.Bir süzgeç içine doku ve içeriğini dökümü ve el ile doku masaj için forceps kullanın. İçeriği tekrar kabın içine yerleştirin ve dokugramı başına 100%n-propanol 60 mililitre ile dokuları kaplayın. Bir saat oda sıcaklığında karıştırın.Sonra, kısa bir süre hassas bir görev silin ve tartmak üzerinde doku kuru. Doku ve içeriğini 0,7 milimetrelik bir süzgeçe boşaltın ve dokuya elle masaj yapmak için çalgılar kullanın. İçeriği tekrar kabın içine yerleştirin ve dokuyu gram doku başına 60 mililitre deiyonize su ile kaplayarak yıkayın.15 dakika oda sıcaklığında karıştırın. Bu yıkama işlemini üç kez tekrarlayın. Bundan sonra, kısa bir süre hassas bir görev silin ve tartmak üzerinde doku kuru.Dokuyu etiketli 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve bir gecede negatif 80 derecede donun. İlk olarak, sıvı nitrojen ile sığ bir kap doldurun. Numuneleri dondurucudan çıkarın ve her lyophilized MFP tartın.Harç bir örnek yerleştirin, sıvı azot içinde harç tutmak için bir kriyojenik eldiven kullanın. Daha sonra, numuneyi frezelemek için el yapımı bir matkapla bağlı bir pestisit kullanın. İlerlemeyi kontrol etmek ve eldivenli eli sıvı nitrojenden çıkarmak için bir dakika aralıklarla değirmen.Tüm numuneler için bu frezeleme işlemini tekrarlayın, her numune nin arasında harç ve havaneli etanol ile püskürttüğe ve silindiğinden emin olun. Toz numuneleri 15 mililitrelik tüplerde kullanıma hazır olana kadar negatif 80 santigrat derecede saklayın. Başlamak için, dondurucudan örnekleri çıkarın ve oda sıcaklığında çözülün.Numuneler çözülürken, pepsin'i hidroklorik aside karıştırarak Pepsin-HCL çözeltisi oluşturun. Sonra, 15 mililitrelik bir tüp için örnek toz ve Pepsin-HCL çözeltisi ekleyin, küçük bir karıştırma çubuğu ekleyin ve 48 saat karıştırın. Bundan sonra, beş dakika buz üzerinde tüpler yerleştirin.Her numuneye 10X PBS ekleyin, böylece nihai çözelti 1X PBS konsantrasyonuna sahiptir. Daha sonra, her çözeltiyi ayrı ayrı test etmek için pH kağıt kullanarak pH 7.4'e ulaşmak için her çözeltiye %10 hacim/hacim, 0,1 molar sodyum hidroksit ekleyin. Bir pH 7.4 jel çözeltisi kullanarak, peletli GFP ve luciferase etiketli 4T1 hücrelerini mililitre başına 500, 000 veya 1, 000, 000 hücreli bir konsantrasyona geri alın.16 kuyulu bir hazneslayt her kuyuya jel hücre çözeltisi 16 mikrolitre ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 derece santigrat de kuluçka. Bundan sonra, her kuyuya 100 mikrolitre tam RPMI ortamı ekleyin. 48 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat.Daha sonra, hücreleri 519 nanometre ve 618 nanometre emisyon dalga boyunda gözlemlemek için bir floresan mikroskobu kullanın. Bu çalışmada, normal doku radyasyonu etkileri çalışılmıştır, ekstrasellüler matris hidrojeller kullanılarak. Hematoksilin ve eozin boyama decellularization onaylamak için kullanılır, çekirdekleri ve DNA diğer izleri kaybı yoluyla.Yağ Kırmızı O boyama lipid içeriğini değerlendirmek ve bir dipasite morfolojisi tutma onaylamak için kullanılır iken. ECM hidrojellerinin reolojik özellikleri 37 santigrat derecede değerlendirilir. Depolama modülü tüm koşullar için kayıp modülünden daha yüksektir ve hidrojel oluşumunu gösterir.GFP ve luciferase etiketli 4T1 meme karsinom hücreleri daha sonra hidrojellerde kapsüllenir. Hücre proliferasyonu floresan mikroskobu, illuminesans ölçümleri ve canlılık boyama ile, kapsülleme den 48 saat sonra incelenir. Işınlanmış hidrojeller tümör hücre çoğalmasında artan bir eğilim göstermektedir.Phalloidin konjuge kapsüllü hücrelerde F-Actin görselleştirmek için kullanılır. Değirmen içine doku yerleştirmeden önce harç soğutmak için unutmayın, sıcak bir harç eksik frezeleme yol açabilir. N-propanal ve pepsin kullanırken dikkatli olun, sadece bir kimyasal başlık altında n-propanal ve diğer desellüler ajanlar açın.Mümkünse, bir kimyasal başlık altında pepsin tartMak, teneffüs tehlikesi olduğu gibi. Işınlama ve hücreleşme sonrası ECM bileşimi değişiklikleri kütle spektrometresi ve Raman spektroskopisi ile değerlendirilebilir. Ayrıca ECM hidrojellerinin lif yapısı taramalı elektron mikroskobu ile analiz edilebilir.Bu yöntem, radyasyonun sadece tümör hücreleri değil, aynı zamanda bağışıklık hücreleri ve tedavi sonucunda radyasyon hasarı yaşayan dokular üzerindeki etkilerini incelemek için genişletilme potansiyeline sahiptir. Bu decellularization tekniği araştırmacılar radyasyon aşağıdaki dokunun ekstrasellüler matriks özelliklerini değerlendirmek için izin verecektir, hangi çoğu kanserlerde önemli bir tedavi seçeneğidir.

studying-normal-tissue-radiation-effects-using-extracellular-matrix

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Hücresel fonksiyonları katmanlarından sertlik etkisi modellenmiş...

Matrix Rijitlik Akrilamid tabanlı Hidrojeller kullanarak Hücresel Fonksiyon Üzerindeki Etkilerinin incelenmesi

Bu videoda, in vitro çalışmalar için ex vivo ışınlamayı takiben murin meme yağ yastıkçıklarını hücreden arındırarak hücre dışı matris hidrojelleri türetme tekniği açıklanmaktadır. Bu hidrojel, tümör hücresi davranışını incelemek için radyasyon tedavisi sonrası in vivo meme dokusu ortamını taklit etmeye yardımcı olur.

Hücre Dışı Meme Yağ Pedleri: Meme Yağ Pedlerinden Hücre Dışı Matriks Hidrojellerinin Türetilmesi

Bu videoda, hücre dışı matris (ECM) sertliğinin yapışık hücrelerin bakteriyel enfeksiyonu üzerindeki etkisini incelemek için bir test gösterilmektedir. Kollajen ile kaplı, değişen sertlikteki poliakrilamid hidrojeller, fizyolojik ECM'nin sertliğini taklit etmek için çok kuyulu bir plaka içinde katmanlanır. İnsan endotel hücrelerinin hidrojeller üzerine yerleştirilmesi ve hücrelerin hücre içi bir kez floresan proteini eksprese etmek üzere tasarlanmış Listeria monocytogenes bakterileri ile...

Hücre Dışı Matriks Sertliğinin Bakteriyel Enfeksiyon Üzerindeki Etkisini İncelemek İçin Bir Test

Parçacık izleme microrheology olmayan yıkıcı ölçmek ve 3 boyutlu uzamsal tümör modellerinde hücre dışı matris mekanik özelliklerinde değişiklikler eşlemek için kullanılabilir.

Partikül izleme Microrheology kullanarak 3D Tümör Modelleri Ekstrasellüler Matriks Rijitliğinin Boyuna Ölçümü

Kolajen ECM temel bir bileşenidir ve göç farklılaşma ve çoğalması kadar çeşitli hücresel süreçler için gerekli ipuçları sağlar. 3D kolajen hidrojellerin içinde hücreleri gömmek için bir protokol ve PDMS mikrokanallar kullanılarak randomize veya hizalanmış kollajen matrisleri oluşturmak için daha gelişmiş bir teknik burada sağlanmıştır.

3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması<em&gt; İn Vivo</em

Bu akciğer hücre dışı matristen 3 boyutlu hücre kültürü iskele oluşturmak için bir yöntemdir. Bozulmamış akciğer üç boyutlu hücrelerin büyümesini destekleyen hidrojeller olarak işlenir.

3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

Bu iletişim kuralı elastik 3D macroporous microcryogels imalatı microfabrication cryogelation teknolojisi ile entegre ederek açıklar. Hücrelerle yükleme üzerine, 3D microtissues, hangi rejeneratif terapi kolaylaştırmak için kolayca enjekte içinde vivo olabilir veya diziler vitro yüksek üretilen iş uyuşturucu tarama için içine monte oluşturulur.

Enjekte edilebilir rejeneratif terapi ve yüksek-den geçerek uyuşturucu tarama için 3D Microtissues

Bakteriyel enfeksiyon yapisan hücre hücre dışı matriks sertlik etkisi problama için çok iyi biçim polyacrylamide tabanlı tahlil geliştirdik. Bu tahlil akış sitometresi, immunostaining ve çekiş kuvvet mikroskobu, hücreler, hücre dışı matriks ve patojen bakteriler arasında biyomekanik etkileşimlerin nicel ölçümler için izin ile uyumludur.

Hücre dışı matriks sertlik etkisi yapışık hücreleri bakteriyel enfeksiyon türleri çalışmak için çok iyi Format Polyacrylamide tabanlı tahlil

Bu protokol, mekanik ve biyokimyasal ipuçlarının, ayarlanabilir mekanik özelliklere sahip hidrojellerin yüksek verimli fotoçapraz bağlanmasını kolaylaştıran özel yapım bir UV aydınlatma cihazı kullanarak, 3D matris-mimetik kültürlerde hasta kaynaklı glioblastoma hücrelerinin kemoterapötik yanıtları üzerindeki etkilerini değerlendirmek için deneysel bir platform tanımlamaktadır.

Hidrojel dizileri, 3D Tümör Modellerinde Matris Bileşenlerinin ve Terapötiklerin Tarama Etkileri için Artan Verim Sağlar

Burada, tümör sferoidlerinin hızlı, sağlam ve ucuz bir şekilde üretilmesini ve ardından hidrojel kapsüllenmesini sağlayan bir protokol sunuyoruz. Özel ekipman gerektirmediği için yaygın olarak uygulanabilir. Sferoid-matriks etkileşimlerini araştırmak ve in vitro doku fizyolojisi veya patoloji modelleri oluşturmak için özellikle yararlı olacaktır.

Sferoid-Matriks Etkileşimlerini İncelemek için Polietilen Glikol Hidrojellerde Tümör Sferoid Üretimi ve Kapsüllenmesi

Protokol, doğal sığır pulmoner dokularına uygulanan iki farklı hücre dışı bırakma metodolojisini açıklığa kavuşturur ve bunların ilgili karakterizasyonlarının kapsamlı bir açıklamasını sağlar.

Dehücreli Akciğer Ekstraselüler Matriks Hidrojellerinin Geliştirilmesi ve Karakterizasyonu

Öğrenin, ekstraselüler matris hidrojelleri kullanarak radyasyonun murine meme yağ pedlerindeki etkilerini nasıl değerlendireceğinizi. Bu yöntem, tümör hücresi davranışları ve kanser nüksü mekanizmaları üzerine önemli bilgiler sağlar.

Ekstrasellüler matris Hidrogeller kullanarak normal doku radyasyon etkileri eğitim

Daha fazla video keşfet