Name: Immunoperoksidan ve Immünofluoresesan yöntemlerini kullanarak yetişkin Zebrafisinde Orexin ve Endocannabinoid reseptörlerinin tanımlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Öğrenin, yetişkin Danio rerio'da immunoperoksidaz ve immünofloresan yöntemleriyle oreksin ve endokannabinoid reseptörlerinin lokalizasyonunu. Bu protokoller, obezite gibi patolojik koşullarda moleküler değişiklikleri incelemek için güvenilir bir temel sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada Fondi ricerca di Ateneo (FRA) 2015-2016, Sannio Üniversitesi tarafından desteklenmektedir.

Yazarlar hiç bir ilgi çatışması bildirmiyor.

Numune hazırlama
Örnek hazırlama, ıHC 'deki ilk kritik adımdır. Güvenilir bir protokol hücre morfoloji, doku mimarisi ve antigenicity bakımı için izin verir. Bu adım, doğru doku toplama, sabitleme ve bölüm22,23gerektirir. Sabitleme amacı doku korumak ve doku enzimleri veya mikroorganizmaların eylem azaltmak etmektir. Özellikle, sabitleme adım hücresel bileşenleri ve biomolecules korur, otoliz önler ve hücre bile...

İmmünhistokimya (IHC), antijen-antikor etkileşimi1,2ile hücresel veya doku bileşenlerini (antigens) tanımlamak için kullanılan iyi kurulmuş bir klasik tekniktir. Bir doku içinde hedef biyomoleküllerin lokalizasyonu ve dağılımı tanımlamak için kullanılabilir. IHC doku bölümlerindeki antijenleri algılamak için immünolojik ve kimyasal reaksiyonlar kullanır3. Antijen-antikor etkileşimlerinin görselleştirme için kullanılan ana belirteçleri floresan boyalar (immünofluorescence) ve enzim-substrat renk reaksiyonları (immünoperoksidan), hem antikorlar4konjuate. Mikroskobik gözlem kullanarak etiket doku lokalizasyonu belirlemek mümkündür, hangi yaklaşık doku hedef antijen lokalizasyonu karşılık gelir.
Floresan veya kromojenik reaksiyonlar için protein algılamak için iki yöntem var: belirli birincil antikor doğrudan etiketli olduğu doğrudan algılama yöntemi; ve ikincil antikor etiket5,6,7taşır ederken primer antikor unconjuated olduğu dolaylı algılama yöntemi. Dolaylı Yöntem, çoğunlukla sinyal amplifikasyonu olan bazı avantajlara sahiptir. Dahası, diğer moleküler ve hücresel tekniklerin aksine, immünofluoresesans ile, hücreler ve dokular içinde ayırt edilen iki veya daha fazla proteinin dağılımı, lokalizasyonu ve koifadesini görselleştirmek mümkündür7. Kullanılan algılama yönteminin seçimi deneysel ayrıntılarına bağlıdır.
Bugüne kadar, ıHC yaygın olarak temel araştırmalarda biyomarkerlerin dağıtımını ve lokalizasyonunu ve insan biyolojik dokuda farklı proteinlerin genel profillerini omurgasızlar8' e kadar anlamak için güçlü ve temel bir araç olarak kullanılmaktadır. 9 , 10 ' dan fazla , 11. Teknik, normal ve değiştirilmiş hayvan organlarının ve farklı doku türlerinin çok sayıda protein ifadesinin bir haritasını görüntülemenize yardımcı olur ve fizyolojik ve patolojik değişikliklerle indüklenen ifadenin olası aşağı veya yukarı düzenlemesini gösterir. IHC en iyi sonuçları elde etmek için doğruluk ve doğru Yöntem seçimi gerektiren son derece hassas bir tekniktir12. Her şeyden önce, fiktasyon, çapraz reaktivite, antijen alımı ve antikorların duyarlılığı gibi birçok farklı faktör yanlış pozitif ve yanlış negatif sinyallere yol açabilir13. Antikor seçimi, ıHC 'deki en önemli adımlardan biridir ve antijen özgüllüğü ve soruşturma altında protein ve türe olan benzeşimine bağlıdır7.
Son zamanlarda, Yetişkin zebra balığı dokusunda orexin/ikiyüzretin ve endokannabinoid sistemlerinin üyelerini algılamak için ihc tekniği optimize edilmiştir. Biz temel olarak sabitleme, doku katıştırma iki farklı yaklaşımlar, bölümlenme ve montaj (hangi çözünürlüğü ve ayrıntı mikroskobik analiz sırasında etkileyebilir), ve engelleme (yanlış pozitireleri önlemek ve arka plan azaltmak için)14odaklı. Diğer önemli özellikler, bireysel ıHC protokollerinin antikor özgüllüğü ve seçicilik ve yeniden üretilebilirliği. Antikor özgüllüğü sağlamak için anahtar negatif kontroller (hiçbir primer antikorlar veya hedef proteinleri ifade değil bilinen doku dahil) kullanımı yanı sıra pozitif kontroller (hedef proteinleri ifade bilinen doku dahil)15 . IHC için antikorların seçimi kendi türlerine göre yapılır-özgüllük (onlar faiz antijeni ile reaksiyon olasılığı) ve kullanılan antijen-antikor bağlama algılama sistemleri4,5,6 ,7. İmmünoperoksidaz durumunda, reaksiyon rengi, genellikle diaminobenzidin (kahverengi)16, çökelme Kromojen seçimi ile belirlenir. Öte yandan, benmmunofluorescence, dondurulmuş doku bölümlerinde protein ifadesini görselleştiren ve kromojenik algılama sistemine göre çoklu proteinlerin kolay analizine olanak sağlayan bir fluorophor ile konjuke edilen antikorları kullanır 5 , 7' ye kadar.
İmmünoperoksidaz tekniği, ikincil antikor biotin, bir bağlayıcı molekül bir kromojenik muhabir molekül [avidin-biotin kompleksi (ABC)], boyama sinyalinin amplifikasyon lider işe yeteneğine konjugated olduğunu. ABC Reporter yöntemi ile, enzim peroksidaz, 3, 3 '-diaminobenzidin (DAB) ile tepki verir, enzim ikincil antikor bağlayan bir yoğun kahverengi renkli boyama üreten, daha sonra sıradan bir ışık mikroskobu ile analiz edilebilir. ABC boyama, biotin için avidin yüksek yakınlık nedeniyle, hızlı ve optimum reaksiyon üretir, primer antikor reaktivite siteye bağlı birkaç ikincil antikorlar ile. Bu kromojenik algılama yöntemi, sinyalin densitometrik analizini sağlar ve kahverengi sinyal düzeylerinin protein ifade seviyeleri18ile korelasyon temelinde yarı nicel veriler sunar.
İmmünofluoresesans teknikleri ile, farklı fluorokrotların benzersiz dalga boylarında ışık yayması yeteneği nedeniyle çoklu proteinlerin eşzamanlı olarak algılanması mümkündür, ancak spektral çakışmayı en aza indirmek için florokromlarla 'i dikkatle seçmek önemlidir 5. dahası, farklı ev sahibi türlerin primer antikorların kullanımı çapraz reaktivite ile ilgili zorlukları en aza indirir. Bu durumda, her türe özgü ikincil antikor primer antikor yalnızca bir tür tanır. Floresan gazeteciler, Alexa Fluor boyalar gibi ticari türevleri de dahil olmak üzere küçük organik moleküllerdir.
Birçok hayvan modelleri özellikle fizyolojik ve patolojik koşulları anlamak için kullanılır. Bugüne kadar, evrim boyunca birçok metabolik yol tarafından temin edilir. Bu nedenle, zebra balığı gibi model organizmalarda IHC çalışmaları, patolojik ve patolojik olmayan koşulların Yaratılış ve bakımı hakkında bilgi verebilir17. Bu raporun bir amacı, Yetişkin zebra balığı doku üzerinde gerçekleştirilebilecek IHC protokolleri göstermek ve dağılım ve lokalizasyonu Oxa, Ox-2R ve CB1R ayrıntılı görüntüleri elde etmek için kullanılan periferik ve merkezi düzeylerde. Ayrıca, Yetişkin zebrafish periferik ve merkezi dokularda iki büyük ıHC dolaylı yöntemlerin uygulanması için protokoller olduğunu bildirdi. Açıklanan dolaylı Yöntem, hangi ikincil bir antikor floresan boya (immünofluorescence yöntemi) veya enzim muhabiri (immünoperoksidan yöntemi) konjuli durumlarda sinyal amplifikasyon için izin verir. Hem kromojenik ve floresan algılama yöntemleri avantajları ve dezavantajları sahip. Bu protokolde bildirilen ıHC kullanımı, özellikle immünofluorescence, Yetişkin zebrafish, yaygın olarak farklı fizyolojik ve patolojik koşullar arasında gelişen evrimsel sistemleri incelemek için kullanılan bir hayvan modeli.

<table><tbody><tr><td>Anti CB1</td><td>Abcam</td><td>ab23703</td><td></td></tr><tr><td>Anti OX-2R</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8074</td><td></td></tr><tr><td>Anti-OXA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc8070</td><td></td></tr><tr><td>Aquatex</td><td>Merck</td><td>1,085,620,050</td><td></td></tr><tr><td>Biyotinile tavşan anti-keçi</td><td>Vektör Laboratuvarı</td><td>BA-5000</td><td></td></tr><tr><td>sitrik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse Ti2</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>Leica Biosystem</td><td>CM3050S</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32670</td><td></td></tr><tr><td>Dijital Kamera</td><td>Leica Biosystem</td><td>DFC320</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop için Dijital Fotoğraf Makinesi</td><td>Nikon</td><td>DS-Qi2</td><td></td></tr><tr><td>Eşek anti keçi Alexa fluor 488-konjuge ikincil antikorlar</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>Eşek anti keçi Alexa fluor 594-konjuge ikincil antikorlar</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>Eşek anti tavşan Alexa fluor 488-konjuge ikincil antikorlar</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Eşek anti tavşan Alexa fluor 594-konjuge ikincil antikorlar</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>Etanol mutlak</td><td>VWR</td><td>20,821,330</td><td></td></tr><tr><td>Donmuş kesit bileşiği</td><td>Leica Biosystem</td><td>FSC 22 Donmuş Kesit Ortamı</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31642</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>20,252,290</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB</td><td>Vektör laboratuvarı</td><td>SK4105</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica Biosystem</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica Biyosistem</td><td>RM2125RT</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Normal Eşek Serumu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Normal Tavşan Serumu</td><td>Vektör laboratuvarı</td><td>S-5000</td><td></td></tr><tr><td>parafin mumu</td><td>Carlo Erba</td><td>46793801</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>sodyum sitrat dihidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka Analitik</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>Trizma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>VectaStain Elit ABC</td><td>Kiti Vektör laboratuvarı</td><td>PK6100</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen Saf</td><td>Carlo Erba</td><td>392603</td><td></td></tr></tbody></table>

immunoperoksidan ve immünofluoresesan yöntemlerini kullanarak yetişkin zebrafisinde orexin ve endocannabinoid reseptörlerinin tanımlanması

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

İmmunohistokimya (ıHC), etiketli antikorlar içeren doku bölümlerinde hedef antijenlerin saptanması ile ilgili son derece hassas ve spesifik bir tekniktir. Bu, her adımın optimizasyonunun optimum spesifik sinyali elde etmek için çok önemli olduğu çok adımlı bir süreçtir. IHC aracılığıyla, belirli biyomarkerlerin dağıtımı ve lokalizasyonu, evrimsel koruma hakkında bilgi açığa çıkarılabilir. Dahası, ıHC, obezite gibi patolojik koşullarda biyomarkerlerin ifade ve dağıtım değişikliklerinin anlaşılması için izin verir. IFC, ağırlıklı olarak immünofluorescence tekniği, Yetişkin zebra balığı 'de, fizik olarak kullanılan moleküllerin organizasyonunu ve dağıtımını algılamak için kullanılabilir, ancak standart bir IFC Protokolü estasblished değildir. Orexin ve Endokanabinoid, gıda alımı ve obezite patolojisinin kontrolünde yer alan iki yüksek oranda tüketmeli sistemlerdir. Burada bildirilen protokolleri oreksin peptid (Oxa), oreksin reseptör (Ox-2R) ve kanabinoid reseptör (CB1R) lokalizasyonu ve bağırsak ve beyin normal ve diyet kaynaklı obez (dıo) Yetişkin zebra balığı modellerinin içinde dağıtım hakkında bilgi almak için kullanılır. Ayrıca, immünoperoksidaz ve çift immünofluorescence için yöntemler, reaktifler, fiktasyon, parafin-katıştırma ve zebra balığı dokusunun cryoprotection hazırlanması ve endojen aktivite engelleme adım ve arka plan için hazırlama yöntemleri vardır karşı boyama. Parametrelerin tam kümesi önceki IHC deneylerinden elde edilir, hangi aracılığıyla biz immünofluorescence Oxs, Ox-2R ve CB1R dağılımı, yerelleştirme ve yetişkin zebra balığı ifade korunması anlayışı ile yardımcı olabilir göstermiştir Doku. Yüksek spesifik sinyal yoğunluğu ile ortaya çıkan görüntüler zebra balığı dağıtım, lokalizasyon ve spesifik biyokütörler evrimsel koruma, immünhistokimyasal çalışmalar için uygun hayvan modelleri olduğunu teyit yol açtı fizyolojik ve patolojik koşullar. Burada sunulan protokoller yetişkin zebrafish ıFC deneyler için tavsiye edilir.

İmmünoperoksidaz boyama için temsili veriler Şekil 1 ve Şekil 2' de gösterilir. Yetişkin zebra balığı bağırsaklarında Ox-a ve Ox-2R dağılımı immunohistokimyasal Analizi Ox-a ve Ox-2R farklı yerelleştirme siteleri ve DIO zebra balığı bağırsak hücrelerinde ifade artışlar gösterdi. Medial ve anterior bağırsak hücrelerinde OX-A için yoğun bir kahverengi boyama görüldü (Şekil 1a, A1). OX-A ' d A k i bağışıklık ifadesi, farklı ...

Burada sunulan immunhistokimyasal karakterizasyon ve oreksin peptid lokalizasyonu için protokoller, oreksin reseptörleri, ve bağırsak ve normal ve diyet kaynaklı obezitenin beyni endokannabinoid reseptörleri (IO) Yetişkin zebra balığı modelleri kullanarak immunoperixidaz ve çift immünofluorescence yöntemleri.

Immunoperoksidan ve Immünofluoresesan yöntemlerini kullanarak yetişkin Zebrafisinde Orexin ve Endocannabinoid reseptörlerinin tanımlanması

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Günümüzde immünohistokimya, spesifik moleküler belirteçlerin varlığını ve patoloji durumundaki değişikliklerini belirlemek için artan sıklıkta kullanılmakta ve kantitatif analiz yapma olasılığına kök katmaktadır. İmmünohistokimya, özellikle immünoreskence tekniği, larva ve yetişkin zebra balığı hayvan modelinde kullanılır, ancak zebra balığı için iyi bir standart immünohistokimya protokolü hakkında çok az şey bilinmektedir. Burada, yetişkin zebra balıklarında önemli proteinlerin evrimsel olarak korunmasını incelemek için kullanılabilecek bir protokolü tanımlıyor ve gösteriyoruz.Yetişkin zebra balıklarında immünohistokimya için iyi bir protokol, bu hayvan modelinin morfolojik ekspresyonunu ve yüksek oranda korunmuş biyomoleküllerin dağılımını incelemek için yararlılığının altını ortaya konmaya yardımcı olabilir. Bu yöntem aynı zamanda insan fizyopatolojisi ile ilişkili patolojik koşullar nedeniyle bu biyomoleküllerin olası değişikliklerinin analiz ine yardımcı olabilir. Prosedürü gösteren Dr.Lea Tunisi, benim laboratuvarımdan doktora öğrencisi olacak.Bu işlem başlamak için, eksi 20 santigrat derece bir kriyostat için hazırlanan dondurulmuş doku blokları aktarın. 10 mikrometre koronal veya sagital kesitblok kesin. Daha sonra, immünohistokimya için uygun yapışkan cam slaytlar üzerine alternatif seri bölümlerde dokuları toplamak ve devam etmeye hazır olana kadar eksi 20 santigrat derece saklayın.İlk olarak, slayt üzerindeki doku alanını ayırmak için solvente dayanıklı bir kalem kullanın. 0.1-molar fosfat tamponkullanarak beş dakika boyunca bölümleri üç kez durulayın. Daha sonra, 0.3 mililitre Triton X-100'ü 100 mililitre00 mililitre0 0,1-molar fosfat tamponunda çözün erek Triton X-100 0.3%0.3 normal eşek serumunu fosfat tamponunda %0.3 triton X-100 içeren normal eşek serumunu hazırlayın ve bloke çözeltisini hazırlayın.Hücre zarını permeabilize etmek ve spesifik olmayan bağlama alanlarını engellemek için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca permeabilizasyon tamponu PB-Triton X-100%0.3 çözünmüş normal eşek serumçözeltisi ile bölümleri kuluçkaya yatırın. İlk olarak, 0.1-molar fosfat tampon ile beş dakika boyunca bölümleri üç kez durulayın. PB-T seyreltilmiş birincil antikorların karışımını ekleyin ve oda sıcaklığında nemli bir kutuda bir gecede bölümleri kuluçkaya yatırın.Ertesi gün, 0.1-molar fosfat tampon ile beş dakika boyunca bölümleri üç kez durulayın. PB-T seyreltilmiş ikincil antikorların uygun bir karışımında iki saat oda sıcaklığında kuluçka bölümleri. Başlamak için, 0.1-molar fosfat tampon ile beş dakika boyunca bölümleri üç kez durulayın.Nükleer boya DAPI hazırlamak için fosfat tampon üç mililitre DAPI 1.5 mikrolitre çözünür. Boyadaki bölümleri ters lekesi. Daha sonra, uzun süreli kullanım için doku ve leke stabilize etmek için slaytlar coverslip montaj ortamı kullanın.Floresan numuneler karanlıkta dört santigrat derecede saklanabilir. İmmünofloresan protokolünü tekrarlayın ve primer veya sekonder antikorları atlayın veya negatif kontrolü hazırlamak için primer veya sekonder antiserumu fosfat tamponuyla değiştirin. Daha sonra, immünoresans protokolünü tekrarlayın ve her primer antikora göreli peptid fazlalığı yla önceden emdirin.Pozitif kontrolü hazırlamak için fare beyninin dilimleri üzerinde immünofloresan protokolünü tekrarlayın. X-Y-Z motorize sahne, dijital kamera ve satın alma ve analiz yazılımı ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanarak, gözlemlemek ve immünolekeli bölümleri analiz. 5x, 20x ve 40x hedefleri ile dijital görüntüler edinin.Düşük büyütme montajı oluşturmak için kullanılabilir kanalların her birinde düşük büyütme de her bölümün görüntüleri alın. Floresan görüntülerini maksimum kontrast ve kaplamaya normalleştirin. İlgi alanı boyunca, 1 ila 1,8 mikrometre odak adımları ile altı odak düzlemleri aracılığıyla görüntü seri Z-yığınları toplamak.Her kanal için bu koleksiyonu ayrı ayrı gerçekleştirin. Bundan sonra, 10 yineleme uygulaması yla görüntüleri deconvolve görüntüleme deconvolution yazılımı kullanın ve tek bir maksimum projeksiyon görüntü içine seri Z-düzlem görüntüleri daraltmak. Işık ve kontrast için mikrografları ayarlamak için uygun bir görüntü düzenleme yazılımı kullanın.Erişkin zebra balıklarının bağırsaklarındaki OX-A ve OX-2R dağılımının immünohistokimyasal analizi, OX-A ve OX-2R'nin farklı lokalizasyon bölgelerini ve DIO zebra balığının bağırsak hücrelerinde ifade artışlarını göstermektedir. MEDIAL ve ön bağırsak hücrelerinde OX-A için yoğun bir kahverengi boyama gözlenir. OX-A'nın immünekspresyonu farklı bağırsak bölmelerinde net sinyaller verir ve anteriordan medial bağırsağa doğru azalır.Benzer sonuçlar DIO ve kontrol diyet zebra balığı bağırsakOX-2R immünekspresyon için gözlenmektedir. DIO yetişkin zebra balığında artmış OX-A sinyaline diğer bağırsak kompartmanlarında OX-2R aşırı ekspresyonu eşlik eder. İmmünofloresan görüntülerin doğru analizi, DIO yetişkin zebra balığının bağırsaklarında kontrol diyeti zebra balığına göre OX-2R/CB1R kolokalizasyonunun arttığını göstermektedir.Benzer bir durum dorsal telensefalon, hipotalamus, optik tectum, torus lateralis ve inferior lob diffüz çekirdeği gibi farklı beyin bölgelerinde gözlenmektedir. Oreksin-A ve CB1R kolokalizasyonu ile çift immünostaining ile hipotalamus oreksinerjik nöronlarda kolokalizasyon artışı olduğu, oreksin-A floresan sinyalinin artması ile birlikte gözlenmiştir. Bu sonuçlar, çift immünfloresansın fizyolojik olarak korunmuş protein ekspresyonunu, hedef proteinlerin kolokalizasyonunu ve farklı patolojik koşullarda dağılım ve/veya ekspresyon değişikliklerini belirlemeye nasıl yardımcı olabileceğini göstermektedir.İmmünofloresans kullanarak, biyomoleküllerin birlikte dağılımını ve ortak ekspresyonunu, olası etkileşimlerini daha iyi anlayabiliriz ve farklı patolojiler durumunda onların değişimlerinin görünür bir görüntüsünü de görebiliriz. Ayrıca, metabolik enzim ekspresyonu veya reseptörlerinin nöroanatomik dağılımı dokular içinde protein sinyalizasyon rolünü daha da ortaya çıkarabilir. Mevcut teknik çalışma, yetişkin bir zebra balığı modeli kullanarak, iki yüksek korunmuş sistem, oreksin ve endocannabinoidler çalışma immünororesans yaklaşım tanıttı.Burada ilk kez yetişkin zebra balığının beyninde açıklanan bu protokolü kullanarak oreksin-2 reseptörlerinin anatomik dağılımı ve koekspresyonu ve endofanabinoid-CB1 reseptörleri belirlenmemiştir. Burada immünohistokimya deneyleri için açıklanan protokolleri ve yetişkin zebra balıklarındaki peptidlerde bulunan reseptörlerin mekansal dağılımını ve organizasyonunu tespit etmek ve işlevlerini daha iyi anlamak için öneriyoruz.

identification-orexin-endocannabinoid-receptors-adult-zebrafish-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video, immünofloresan kullanarak normal ve diyete bağlı obezite (DIO) yetişkin zebra balığı beyin dokusunda oreksin ve kanabinoid reseptörlerinin birlikte lokalizasyonunu araştırmak için bir protokolü göstermektedir.

Diyetle Uyarılan Obez Zebra Balıklarında Oreksin ve Kannabinoid Reseptör Kolokalizasyonunun Tespiti

Zebra balığı yetişkin böbrek böbrek yenilenmesi ve hastalık çalışmalar için mükemmel bir sistemdir. Böyle bir araştırmanın önemli bir yönü nefron yapısı ve fonksiyonu değerlendirmesidir. Bu protokol nefron borucuk kompozisyonunun ve böbrek geri emiliminin değerlendirilmesi için uygulanabilecek çeşitli yöntemler anlatılmaktadır.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek Nefron Kompozisyon ve Fonksiyon Analizi

Üreme ve in vivo araştırmalara uygun bir Zebra balığı tesisi kolay ve ekonomik bir şekilde inşa edilmiştir. Bakım minimumdur. Bu tesis, öğrenci katılımı ve bağımsız araştırma için idealdir.

Bir Ekonomik ve Kolay oluşturun Zebra balığı Tesisi İnşaatı

Zebra balığı embriyolarında bulunan düşük bolluktaki endojen reseptörlerin tespiti için yeni bir teknik tanımlanmıştır. Buna AFLIP adını verdik çünkü reseptörün immünopresipitasyona bağlı ligandı tarafından afinite etiketlemesinden oluşuyor.

Zebra balığı Embriyolar Endojen Reseptör Affinity Etiketleme Tespiti

Kirpikler geliştirme için uygun organogenesis hayati önem taşımaktadır. Bu iletişim kuralı etiket ve Zebra balığı siliyer hücreleri görselleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemini açıklar.

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

Burada, zebra balığı embriyoları ve larvalarının tüm preparatlarında floresan antikor aracılı proteinlerin tespiti için bir protokol salıyoruz.

Zebrabalığı Embriyoları ve Larvalarında Tüm Mount Immunohistochemistry

Bu protokol, zebra balığı embriyonik kesitlerinin in situ hibridizasyonu ve immünohistokimyasını birleştirerek görüntülerin nasıl elde edileceğini açıklar. Kriyoseksiyondan önce in situ hibridizasyon yapıldı, bunu takiben antikor boyaması yapıldı. Zebra balığında iki genin ekspresyon kalıplarını, antikorların yetersizliği varsa tespit etmek yararlıdır.

In Situ Kriyokesitli Zebra Balığı Embriyolarında İmmünohistokimya ile Kombine Hibridizasyon

Reaktif elektrofilleri ve oksidanları (Z-REX) hedefleyen zebra balığı, reaktif küçük moleküllü sinyalizasyonun araştırılması için kimyasal biyoloji tabanlı bir yöntemdir. Bu teknik, farklı gelişim aşamalarındaki canlı balıklara uygulanabilir. Burada, zebra balığındaki standart tahlilleri sinyal yolu analizi için Z-REX ile birleştiriyoruz.

Larva Zebra Balıklarında Hedef Sinyalizasyon Yanıtlarının İzlenmesi - Z-REX Elektrofilik İlaçların ve Metabolitlerin Hassas Mekanizmalarının Maskesini Çıkarır

Burada, konfokal mikroskopi kullanarak GCaMP kalsiyum göstergelerini eksprese eden transgenik zebra balıklarının beyin bölgelerindeki nöral aktiviteyi incelemek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

In vivo (İn canlı) Kısmen Kısıtlanmış Larva Zebra Balıklarında Duyusal Stimülasyonla İndüklenen Nöral Aktivitenin Konfokal Floresan Görüntülemesi

RASopatiler, RAS-MAPK yolağı hiperaktivasyonunun neden olduğu multisistemik genetik sendromlardır. Doğrulanmayı bekleyen potansiyel olarak patojenik varyantlar sürekli olarak ortaya çıkarken, zayıf klinik öncesi kanıtlar tedaviyi sınırlar. Burada, genç muhabir zebra balığında canlı FRET görüntüleme ile RASopati ile ilişkili ERK aktivasyon seviyelerini ve embriyogenez sırasındaki farmakolojik modülasyonunu test etmek ve çapraz doğrulamak için in vivo protokolümüzü açıklıyoruz.

Canlı FRET mikroskobu ve immünofloresan ile erken zebra balığı Noonan sendromu modellerinde ERK aktivite modülasyonunu değerlendirmek için etkili bir protokol

Öğrenin, yetişkin Danio rerio'da immunoperoksidaz ve immünofloresan yöntemleriyle oreksin ve endokannabinoid reseptörlerinin lokalizasyonunu. Bu protokoller, obezite gibi patolojik koşullarda moleküler değişiklikleri incelemek için güvenilir bir temel sunar.

Immunoperoksidan ve Immünofluoresesan yöntemlerini kullanarak yetişkin Zebrafisinde Orexin ve Endocannabinoid reseptörlerinin tanımlanması (Video) | JoVE Journal

Immunoperoksidan ve Immünofluoresesan yöntemlerini kullanarak yetişkin Zebrafisinde Orexin ve Endocannabinoid reseptörlerinin tanımlanması

Daha fazla video keşfet