Zebrabalığı Embriyoları Kullanılarak Kimyasal Bileşiklerin Toksisitesinin Hızlı Değerlendirilmesi

Toksisite testi prosedürleri Dr.Ashok Aspatwar tarafından gösterilecek. Protokolümüz hedef dışı etkileri tanımlar ve hücre kültürü veya diğer hayvan modellerinde gözden kaçırılabilir keşif erken aşamasında kimyasalların ince toksik etkileri algılar. Tekniğimizin başlıca avantajları şunlardır: hızlı ve verimli, çok az miktarda kimyasal ve laboratuvardaki temel olanaklar gerektirir.

Toksisite taraması tüberküloza neden olan mikobacteriuma karşı etkinliğini incelemek için konsantrasyon belirlemede ve daha fazla klinik öncesi hesaplama için bize yardımcı olacaktır. Bu yöntem kimyasalların hedef dışı etkilerine ilişkin içgörüler kullanır ve bu nedenle bu yöntem kimyasalın toksisitesinin birincil öneme sahip olduğu herhangi bir araştırma alanında kullanılabilir. Bu yöntem çok basittir ve önceden deneyimi olmayan herkes tarafından yapılabilir.

Hiçbir deneyimi olan bireyler dikkatle deney planlamak ve sadece bir bileşik kullanmalısınız. Bu yöntem, gelişmekte olan zebra balığı embriyolarında ve dolayısıyla test edilen bileşiklerin güvenliğinde phenotik değişiklikler şeklinde kimyasalların toksik etkilerini sağlar. Başlamak için, çiftleme tankları içine bir gecede iki ila beş yetişkin erkek zebra balığı ve üç ila beş yetişkin dişi zebra balığı yerleştirin.

Üreme otomatik karanlık ve sonraki ışık döngüsü tarafından indüklenen olarak sabah, ışık açın. Hayvanlara stres le başa çıkmaktan kaçınmak için, hayvanların üreme için aynı bireyleri kullanmadan önce iki hafta dinlenmesine izin verin. Ertesi gün öğlenden önce, ince bir örgü süzgeç kullanarak embriyolar toplamak ve E3 embriyo orta içeren bir petri kabına aktarın.

Petri kabını her bir embriyo partisini incelemek için stereo mikroskop altına yerleştirin. Opak görünümünü belirleyin ve döllenmemiş veya ölü embriyolar olarak kaldırın. Embriyoları bir gece kuvözde 28.5 derecede tutun.

Ertesi sabah, bir stereo mikroskop altında embriyolar incelemek ve herhangi bir sağlıksız veya ölü embriyoları kaldırın. Dikkatle bir 24 kuyu plaka her kuyuya bir embriyo aktarmak için bir pasteur pipet kullanın. Her kuyunun embriyoları kapsayacak kadar E3 ortamı içerdiğinden emin olun.

Bir buzdolabında 4 santigrat derecede depolanan inhibitör bileşikleri içeren şişeleri dışarı atın. Bileşimin uygun miktarda tartmak için analitik bir denge kullanın ve E3 orta veya başka bir uygun çözücü her bileşik için 100 milimolar stok çözeltisi 250 mikrolitre hazırlamak. Daha sonra, 15 mililitrelik santrifüj tüplertiflik düzeylerine dayalı stok çözeltilerinin seri seyreltme yapmak için E3 orta kullanın.

Her biri bir DPF embriyosu içeren kuyulardan, E3 suyunu bir sıra tek er tek sıra çıkarmak için bir pasteur pipeti ve 1 mililitrelik pipet kullanın. Stok çözeltilerinin her bir dilüentinin 1 mililitresini, alttan başlayıp daha yüksek konsantrasyona doğru hareket eden 24 kuyu plakasının kuyularına hemen dağıtın. Kontrol grupları için, E3 su veya başka bir ilgili çözücü ekleyin.

İsmi ve konsantrasyonu ile 24 kuyu plakasını etiketle ve plakaları bir kuvözde 28,5 santigrat derecede tutun. Kuyularda bulunan kimyasalların seyrelticilerinin 24 kuyu plakasının kenarlarını kapatarak kuvözde buharlaşmayana dikkat edin. Kimyasal bileşiklerin maruz kalmasından yirmi dört saat sonra, %3 yüksek molekül ağırlıklı metil selüloz içeren küçük bir petri kabında bileşiğin her konsantrasyonuna maruz kalan larvaları aktarmak için pasteur pipet kullanın.

Metal bir sondayla, yana doğru yatırın. Petri kabını kameraya bağlı bir stereo mikroskobun altına yerleştirin. Görüntüleri alın ve denemenin sonuna kadar her gün görüntüleri ayrı bir klasöre kaydedin.

Tüm gözlemleri her gün bir tabloya çevrimiçi bir tabloya veya basılı bir sayfaya girin. Nörotoksik bileşik maruziyeti için, dört ila beş DPF larvaları anormal yüzme paterni gösterebilir. Bu durumda, larvaların 30 saniye ile bir dakikalık videosunu çekerek bu tür değişikliklerin kaydını yapın.

Kimyasal bileşiklere maruz beş gün sonra, embriyoların yarısı yarım maksimal öldürücü konsantrasyon 50 her kimyasal olarak ölmek konsantrasyonu unutmayın. Uygun bir program kullanarak tüm konsantrasyonları için embriyoların mortalite için bir eğri oluşturmak. Bu protokolde, toksisite değerlendirmesinin kritik kısmı tek bir deneyde bir veya birden fazla kimyasal bileşiğin farklı konsantrasyonlarını test etmektir.

Larvalarda herhangi bir henotipik kusura neden olan bileşikler için, defektler kimyasala maruz kaldıktan sonra bir ila beş günlük bir süre içinde her 24 saatte bir kaydedildi. 250 mikromolar ve 125 mikromolar konsantrasyonlarında beta CA inhibitörleri ile tedavi edilen embriyolar kontrol ile karşılaştırıldığında çeşitli henotypik defektler sergilerler. Örneğin, 3.

Başka bir çalışmada, CA inhibitörleri ile tedavi edilen embriyolar otolit keseleri ve yüzme mesane yokluğu gösterdi. Deneyler, 500 mikromolar embriyonik gelişim sırasında minimal veya hiç fenotipik değişikliklere neden olan temsili bir bileşik karbonik anhidraz 9 tespit etti. Bileşik yüksek LC50 konsantrasyonu gösterdi.

Ancak, bir kontrol ile karşılaştırıldığında, aynı bileşik 300 mikromolar maruz kalma beş gün sonra larvalarda nörotoksik ve indüklenen ataksi bulundu. Embriyoların kalitesi kimyasalların toksisite taraması için önemlidir. Kaliteli embriyolar elde etmek için, üreme için yetişkin zebra balığı genç çifti kullanın.

Güvenli olarak ortaya çıkan bileşikler, ilgili in vitro ve in vivo deneyleri yaparak daha da karakterize edilebilir. Antitüberküloz ilaç geliştirme alanında, bu teknik zebra balığı embriyolarında micobacterium marinum in vivo inhibisyonu için daha fazla deney kurmak için yardımcı oldu. Protokol, insanlar için zehirli olabilecek kimyasalların kullanımını içeriyor.

Deneylerde yer alan kişiler, kimyasalları kullanırken dikkatli olmalıdır.