Name: Nadir-Codon zengin Işaretçileri kullanarak amino asit Overüreticiler tanımlama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Keşfedin, nadir-kodon zengin işaretçiler kullanarak amino asit aşırı üreticilerini yüksek doğruluk ve duyarlılıkla tanımlama yöntemini. Bu teknik, geleneksel toksik analog yöntemine verimli bir alternatif sunar ve çeşitli mikroorganizmalarda uygulanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

İş ortaklaşa Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (Grant No. 21676026), ulusal anahtar R & D programı Çin (Grant No. 2017YFD0201400) ve Çin doktora sonrası Bilim Vakfı (Grant No. 2017M620643) tarafından desteklenmektedir. UCLA Gelişim Enstitüsü 'nde (Suzhou) çalışan Jiangsu Eyaleti ve Suzhou Industrial Park iç hibe tarafından desteklenmektedir.

1. nadir-Codon zengin Marker genler ifade plazmidler inşaatı
<ol><li>Hedeflenen amino asit için ortak codonlar uygun sayıda içeren bir işaret geni seçin. Not: L-lösin için, hangi 27 yaygın codons olan 29 lösin codons içeren kanamyisin direnç gen kanR, seçim sisteminin inşası için kullanılır13. 19 lösin codondan 17 ortak Codon içeren Gfp geni veya 14 lösin ortak codonların bulunduğu mor protein-kodlama geni prancerpurple (PPG), tarama sistemi için kullanılır (Tamamlayıcı Tablo 1 ).</li>
	<li>İşaret genlerinde bulunan ortak kodları, eşanlamlı nadir kodon ile değiştirin. L-leucine için, nadir kodon CTA ile kanr, Gfp, veya PPG kendi kodon değiştirmek, kanr-RCSüreten, Gfp-RC, veya PPG-RC, sırasıyla13 ( Tamamlayıcı Tablo 1). Not: Marker genler nadir kodon sıklığı seçim veya tarama sisteminin katı etkileyecektir. Genel olarak, nadir bulunan kodların sayısını artırmak, seçim veya tarama sisteminin gücünü artıracaktır. Uygun seçim veya tarama gücü elde etmek için, nadir kodon farklı sayıda liman ve etkilerini karşılaştırmak Marker genler bir dizi tasarım.</li>
	<li>Gen sentezi için GeneDesign14 (http://54.235.254.95/GD/) gibi araçları kullanarak nadir kodon açısından zengin Marker genlerinin yapı taşları oluşturun. Alternatif olarak, ticari gen sentezi hizmetlerinden Marker genler sipariş.<ol>
<li>GeneDesign sayfasında, Yapı bloğu tasarımı (sabit uzunlukta çakışma)seçeneğini belirleyin.</li>
		<li>Nadir Codon zengin Marker genler sıraları sıra kutusuna yapıştırın.</li>
		<li>Montaj oligos arasındaki çakışma uzunluğunu tanımlayın; Varsayılan 40 BP çoğu sıraları için iyi çalıştığını aklınızda bulundurun. Not: diğer parametrelerin ayarları hakkında daha fazla yönerge için çevrimiçi el kitabına bakın.</li>
		<li>Tasarım yapı taşları düğmesini tıklatın ve sayfada listelenen oligonükleotides sipariş.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile nadir-Codon-modifiye genler sentezlemek-doğru sentez15.</li>
	<li>Nadir-Codon zengin kanR-RC için vektör pET-28A, Gfp-RC pSB1C3 ve ppg-RC için CPB-37-44116ligate. Not: pET-28A ve pSB1C3 Plasmid haritaları SnapGene online plazmid veritabanında mevcuttur (Tamamlayıcı Tablo 1); CPB-37-441 plazmid Haritası ATUM kromojenik protein Web sitesinde mevcuttur.<ol>
<li>Buzda, vektör ve marker parçaları 1:1 bir molar oranı ekleyin 7,5 μL montaj karışımı (bkz. malzeme tablosu) Toplam hacmine 10 μL. Numuneyi 50 °C ' de 1 saat boyunca inkük.</li>
		<li>Montaj ürününün 5 μL değerini, 42 °C ' de 30 s için 50 μL yetkili hücreye dönüştürün ( malzeme tablosunabakın).</li>
		<li>SOC hücreleri kurtar (katabolit baskı ile süper optimum suyu) orta 37 °C 1 h için, LB (lysogeny suyu) agar Orta üzerinde plaka, ve bir gecede 37 °C ' de onları inkük.</li>
		<li>Koloni LB orta içine inoculate ve 8 h için 37 °C ' de inkübe.</li>
		<li>Tercih edilen ticari kiti kullanarak Plasmid yalıtın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. seçim koşullarını optimize etme
<ol><li>Mutagenez için kullanılan ebeveyn gerginliği yetkili hücrelere17olun.</li>
	<li>Vahşi tip kanrtaşıyan 1 μL Plasmid ile yetkili hücrelerin dönüşüm 50 μL ve nadir tarafından değiştirilen tüm lösin kodon ile kanr-RC29 içeren Plasmid ile yetkili hücrelerin başka bir set dönüşümü kodon CTA.</li>
	<li>950 μL SOC ortamını ekleyin ve numuneyi 37 °C ' de 250 rpm 'de 1 h için bir çalkalayıcı olarak inkük.</li>
	<li>Plaka 100 Cell kültürünün μL 'yi 50 μg · mL-1 kanamycin içeren lb agar ortamına yerleştirin ve koloniler ortaya çıkana kadar yaklaşık 8 saat boyunca 37 °c ' de kulbin.</li>
	<li>Vahşi tip kanr ve lösin nadir-Codon-zengin kanr-RC29 liman kolonileri seçin ve 5 ml beşli seyreltilmiş lb Orta (0.2 x lb) 50 μg · ml-1 kanamycin içeren aşılamak için kullanın. 250 rpm 'de 37 °C ' de bir çalkalayıcı numuneleri inküd. Not: Orta seçim sistemi için çok önemlidir. Nadir-Codon-değiştirilmiş türevleri yerine vahşi tip geni antibiyotik direnci protein ifade izin vermek için yeterli karbon ve azot içermelidir. Bu durumda, 1x LB orta L-leucine konsantrasyonu tamamen nadir-Codon zengin kanRprotein ifadesi inhibe etmek için çok yüksek. Böylece, 5 gibi bir seyreltme faktörü ile seyreltilmiş LB orta vahşi tip ve nadir-Codon zengin genler protein ifadelerde net bir fark oluşturmak için kullanılır.</li>
	<li>Hücre kültürlerinin her biri için 200 μL değerini, tanımlanan zaman noktalarında (örn. 8 saat, 16 saat ve 24 saat) bir 96-kuyu plakasına aktarın. Bir plaka okuyucusu kullanarak OD600 (600 Nm 'de optik yoğunluk) ölçün. Not: hücre od600 bir azalma, vahşi tip Marker genleri taşıyan gerinim od600 ile karşılaştırıldığında nadir-kodon zengin Marker genleri barındıran suşlar için tespit edilemez, nadir kodon miktarını artırmak için deneyin veya daha seyreltilmiş bir ortam kullanın.</li>
	<li>Nadir-Codon zengin Marker genler ifadeleri (örneğin, kanR-RC29) hedeflenen amino asitlerin konsantrasyonu artırarak restore edilebilir eğer test etmek için amino asit besleme assay gerçekleştirin. Not: L-leucine overüreticilerinin seçimi Için, L-leucine beslenme için kullanılır.<ol>
<li>KanR-RC29 Marker geni 5 ml 'ye 0.2 x lb 'ye (50 μg · ml-1 kanamyisin içeren) 1 g tedarik olmadan ya da tedariki içeren suşları inoculate · L-1 l-leucine. Vahşi tip kanR kontrol olarak liman suşları ile 0.2 x lb başka 5 ml inoculate. 250 rpm 'de 37 °C ' de bir çalkalayıcı numuneleri inküd.</li>
		<li>Ölçüm OD600 her kültür için tanımlanan zaman noktalarında (örn., 15 h, 17 h, 19 h ve 22 h).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. tarama koşullarını optimize etme
<ol><li>Vahşi tip Gfp veya vahşi tip PPG'yi taşıyan 1 μL plazmid (~ 50 ng · μL-1) ile mutagenez için kullanılan ana gerinim 50 μL Transform. Ayrıca, üst gerinim Marker genler nadir-Codon zengin türevleri ile dönüştürün.</li>
	<li>950 μL SOC ortamını ekleyin ve numuneyi 37 °C ' de 250 rpm 'de 1 h için bir çalkalayıcı olarak inkük.</li>
	<li>Plaka 100 uygun antibiyotikler içeren lb agar Orta hücre kültürünün μL üzerine (25 μg · ml-1 kloramfenikol bir cmR Marker taşıyan Gfp plazmid, veya 50 μg · ml-1 kanamisin PPG için bir kanR Marker taşıyan Plasmid) ve gece 37 °c ' de inkük.</li>
	<li>Wild-tipi Gfp veya PPG ve ilgili nadir-Codon zengin türevi limanlar bir koloni ve doğru seyreltilmiş lb orta bireysel 5 ml onları aktarmak bir koloni seçin. 250 rpm 'de 37 °C ' de bir çalkalayıcı numuneleri inküd. Not: lösin nadir-Codon zengin Gfp-RC veya PPG-RC, seyreltilmemiş lb Orta (1x lb) kullanılan E. coli suşları için vahşi tip ve nadir-Codon zengin Marker ifadelerinde önemli farklar oluşturmak için kullanılabilir Gen. Ayrıca, indüklenebilir promotörler tarama Marker genler ifadeleri sürücü için kullanılır. Hücreler daha iyi ayrımcılık elde etmek için üstel faz girdiğinizde indüksiyon başlayın.</li>
	<li>Floresan işaretçileri için, hücre kültürlerinin her biri 200 μL değerini, tanımlanan zaman noktalarında (örn. 2 saat, 4 saat ve 6 saat) bir 96-iyi açık dipli siyah plakaya aktarır. OD600 ve floresans ölçmek ve floresan yoğunluğu hesaplamak (floresans oranı od600). Kromojenik belirteçleri için, hücre kültürlerinin renk gelişimini ölçmek. Not: Gfp-RC ' d e k i, vahşi tip Gfp'ye göre kullanılan suşların, veya mor proteini ifade eden hücreler için daha hafif bir renk algılanamazsa, daha düşük floresans yoğunlukları algılanamazsa PPG-RC ' d e k i yaban tipi geni den daha, işaretleme genlerinde nadir bulunan kodon sayısını artırmaya veya daha seyreltilmiş bir ortam kullanmak için çalışın.</li>
	<li>Besleme tahlili gerçekleştirin (Steps 2.7.1 ve 2.7.2 bakın). Floresans yoğunluğunu veya tanımlanan zaman noktalarında renk gelişimini ölçün (örn., 12 saat, 18 saat ve 24 saat).</li>
</ol>4. amino asit overüreticilerinin tanımlaması
<ol><li>Mutantların kültürünün 5 mL 'ye (% 2 v/v) içine inoculate 100 μL ve 250 rpm 'de 37 °C ' de, OD600 Reach 0,4 değerine kadar bir çalkalayıcı içinde kuluçka.</li>
	<li>Mutantları yetkin hücrelere yerleştirin17.</li>
	<li>1 μL Plasmid (~ 50 ng · μL-1) ile mutasyona uğramış hücrelerin dönüştürme 50 μL, seçim Işaretçisi kanR-RC29 veya Gfp-RC veya PPG-RCtarama işaretleyicilerini taşıyor. 950 μL SOC ortamını ekleyin ve numuneyi 1 saat boyunca 37 °C ' lik bir çalkalayıcı olarak döndürün.</li>
	<li>Amino asit overüreticileri seçin.<ol>
<li>4.000 x g 'de hücre kültürünü 5 dakika boyunca santrifüjle çıkarın, süpernatant 'ı atın ve 50 μg · ml-1 kanamycin içeren 5 ml 0.2 x lb orta ekleyin. Örnek bir gece 37 °C shaker içinde inkübe.</li>
		<li>Gece kültürüne plaka (örn. 100 μL, kültürün hücre yoğunluğuna bağlıdır) 50 μg · ml-1 kanamisin içeren 0.2 x lb agar orta üzerine ve 12 h için 37 °c ' de inkük. Not: geliştirilen koloniler, hedeflenen amino asit aşırı üreticilerinin adaylarıdır ve bu durumda L-leucine overüreticileridir.</li>
	</ol></li>
	<li>Amino asit overüreticileri ekran.<ol>
<li>Uygun antibiyotikler içeren lb agar ortamına (4,3 adımda açıklandığı gibi) tarama işaretleyicisini (örn. 100 μL) uygun sayıda hücre plakasını içerir (örneğin, Gfp-RC ve 50 μg · ml ile tarama için 25 μg · ml-1 kloramfenikol) - PPG-RCile tarama için 1 kanamisin) ve 8 h için 37 °c ' de inkük.</li>
		<li>Uygun antibiyotik içeren LB orta inoculate (bkz: adım 4.5.1) plaka her bir koloni ile. 250 rpm 'de 37 °C ' de bir çalkalayıcı numuneleri inküd.</li>
		<li>OD600 ve floresans ölçmek ve Gfp-RC kullanılırsa floresan yoğunluğu hesaplayın. PPG-RC kullanılırsa hücre kültürlerinin renk gelişimini ölçün. Daha yüksek bir floresan yoğunluğu veya ebeveyn gerinim daha derin bir renk sergileme suşları aday amino asit overüreticiler ve bu durumda, L-leucine overüreticiler olduğunu unutmayın. Not: floresan aktif hücre sıralama da tek hücreli yüksek üreticileri tanımlamak için uygundur zaman nadir Codon zengin floresan protein genler tarama için kullanılır.</li>
	</ol></li>
	<li>Aday suşlarının amino asit producti, doğrulayın.<ol>
<li>Her aday suşları ile LB orta 5 mL inoculate ve hücre 37 °C ' de 250 rpm de bir shaker bir gecede büyümeye izin.</li>
		<li>Hücre kültürünün 1 ml 'den hücreleri 2 dakika boyunca 4.000 x g 'de santrifüjleme ile topla. süpernatant atın ve 1 ml steril su ile Pelet pelletini.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunun 200 μL 'si ile% 4 glikoz içeren 20 mL M9 orta ve 250 rpm 'de 37 °C ' de 24 saat boyunca 250 mL 'Lik bir çalkalayıcı ile inoculate.</li>
		<li>Santrifüj 1 ml kültür orta 4.000 x g 5 dk. transfer 200 μL süpernatant için temiz bir 1,5 ml tüp. Hazırlamak L-leucine çözümleri (HPLC (yüksek performanslı sıvı kromatografi) grade) 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, ve 1 g · L-1 standartlar olarak.</li>
		<li>1 mm trietilamin ve 100 μL 1 M fenil isothiocyanate, süpernatant ve standartlara 100 μL ekleyin, yavaşça karıştırın ve 1 saat18için oda sıcaklığında onları inkük. Dikkat: trietilamin ve fenil isothiocyanate şiddetli cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olabilir ve solunduğunda zararlı olur. Eldiven ve maske giyin ve mümkünse bu adımı bir duman kaputu içinde gerçekleştirin.</li>
		<li>400 μL 'i aynı tüpten n-hekzan Ekle ve 10 s için Vortex. amino asit türevleri içeren alt fazı 0,2 μm polytetrafloroetilen membrandan filtreleyin. DIKKAT: n-hekzan cilt tahrişine neden olabilir. Eldiven ve koruyucu giysiler giyin. Cilt ile temas ederse, cilt bol su ile durulayın.</li>
		<li>0,1 M sodyum asetat (pH 6,5) ve Asetonitril bir 99.3:0.7 Volumetrik oranı karıştırma ile mobil faz hazırlayın. Asetonitril hazırlayın (80% v/v) mobil faz olarak B. 0,2 μm polytetrafloroetilen membranlarla tüm mobil aşamaları filtreleyin. DIKKAT: Asetonitril Solunduğunda zararlı ve cilt ve göz tahriş neden olabilir. Eldiven ve koruyucu giysiler giyin ve bu adımı bir duman kaputu içinde gerçekleştirin.</li>
		<li>0,42 mL · min-1 debisi ve 40 °c ' lik bir sütun sıcaklığı olan Tablo 1 ' deki elüsyon programına göre C18 kolon ile donatılmış bir ultra-HPLC üzerinde örnek 1 μL çalıştırın. 254 nm 'de hedeflenen amino asitleri bir diyot dizi dedektörü ile algılayın ve zirve alanlarını standart eğriye eşleştirerek konsantrasyonlarını hesaplayın.</li>
	</ol></li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Zaman (dak)</td>
			<td>Mobil faz A (%)</td>
			<td>Mobil faz B (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>98</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3,5</td>
			<td>70</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>43</td>
			<td>57</td>
		</tr>
<tr>
<td>7,1</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>98</td>
			<td>2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: amino asitlerin ölçülmesi için elüsyon programı.

<ol><li>Tatsumi, N., Inui, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTatsumi%2C+N+%22Corynebacterium+glutamicum%3A+biology+and+biotechnology%22">Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology</a>. , Springer-Verlag. Berlin and Heidelberg. (2012).</li>
<li>Tonouchi, N., Ito, H. Present global situation of amino acids in industry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTonouchi%2C+N+%22Amino+Acid+Fermentation%22">Amino Acid Fermentation</a>. Yokota, A., Ikeda, M. , Springer. 3-14 (2017).</li>
<li>Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , US6403342B1 (2005).</li>
<li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+systems+metabolic+engineering+of+microorganisms+for+amino+acid+production%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).</li>
<li>Norris, R., Lea, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+amino+acid+analogues+in+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Progress%22%5BJournal%5D)">The use of amino acid analogues in biological studies.</a> Science Progress. , 65-85 (1976).</li>
<li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fermentative+production+of+branched+chain+amino+acids%3A+a+focus+on+metabolic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).</li>
<li>Bach, T. M., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties%2C+metabolisms%2C+and+applications+of+L-proline+analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).</li>
<li>Crick, F. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">On the genetic code.</a> Science. 139 (3554), 461-464 (1963).</li>
<li>Plotkin, J. B., Kudla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synonymous+but+not+the+same%3A+the+causes+and+consequences+of+codon+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias.</a> Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).</li>
<li>Dittmar, K. A., Sørensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino%E2%80%90acid+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino‐acid starvation.</a> EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).</li>
<li>Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+explains+patterns+of+codon+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage.</a> Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).</li>
<li>Sørensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel%2B+and+Rel%E2%88%92+strains+during+amino+acid+starvation%3A+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel− strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).</li>
<li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+rare+codon-rich+markers+for+screening+amino+acid+overproducers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers.</a> Nature Communications. 9 (1), 3616(2018).</li>
<li>Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GeneDesign%3A+rapid%2C+automated+design+of+multikilobase+synthetic+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes.</a> Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).</li>
<li>Xiong, A. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-based+accurate+synthesis+of+long+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences.</a> Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PITC+derivatives+in+amino+acid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PITC derivatives in amino acid analysis.</a> Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).</li>
<li>Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Papillomavirus+capsid+protein+expression+level+depends+on+the+match+between+codon+usage+and+tRNA+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability.</a> Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).</li>
<li>Gregg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+optimization+of+tolC+as+a+powerful+dual+selectable+marker+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).</li>
<li>Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Bacillus+subtilis+sacB+gene+confers+sucrose+sensitivity+on+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).</li>
<li>Avcilar-Kucukgoze, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discharging+tRNAs%3A+a+tug+of+war+between+translation+and+detoxification+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).</li>
<li>Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+high+yield+production+of+L-serine+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).</li>
<li>Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectinomycin+resistance+at+site+1192+in+16S+ribosomal+RNA+of+E.+coli%3A+an+analysis+of+three+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants.</a> Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).</li>
<li>Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., Söll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+tRNA+recognition+of+a+tRNA+synthetase+by+a+single+amino+acid+change%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).</li>
<li>Naganuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+selective+tRNA+aminoacylation+mechanism+based+on+a+single+G%E2%80%A2+U+pair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G• U pair.</a> Nature. 510 (7506), 507(2014).</li>
<li>Hoesl, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+evolution+of+a+bacterial+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Chemical evolution of a bacterial proteome.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).</li>
<li>Hershberg, R., Petrov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+on+codon+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Selection on codon bias.</a> Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).</li>
<li>Huo, Y. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+proteins+into+biofuels+by+engineering+nitrogen+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux.</a> Nature Biotechnology. 29, 346(2011).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Marker genler ve seçim veya tarama Orta nadir kodon sayısı nadir-Codon-modifiye Marker genler protein ifadeleri inhibe etmek için önemlidir. Vahşi tip Marker genler ve türevlerinden protein ifadeleri arasında önemli bir fark tespit edilemez, nadir codonlar sayısını artırarak veya bir besin sınırlı orta kullanarak farklılıkları güçlendirebilir. Ancak, inhibisyon etkisi çok güçlü ise, protein ifadeleri bile karşılık gelen amino asitlerin ekstra beslenme tarafından kurtarılabilir olmayabilir. Bu durumda, Marker genler nadir...

Amino asitler mevcut üretim fermantasyon üzerinde ağır dayanır. Ancak, çoğu amino asit üretim suşları için yazılar ve verimler milyarlarca dolar değerinde küresel amino asit piyasasının yükselen taleplerinin altındadır1,2. Yüksek performanslı amino asit aşırı üreticileri elde etmek için amino asit endüstrisinin yükseltilmesi önemlidir.
Amino asit aşırı üreticileri tanımlamak için geleneksel strateji amino asitler ve protein sentezinde onların analogları arasındaki yarışmalar yararlanırlar3,4. Bu analoglar karşılık gelen amino asitler tanımak ve böylece peptid zincirleri uzaması inhibe tRNAs şarj edebiliyoruz, tutuklandı büyüme veya hücre ölümü5yol. Analog streslere karşı bir yol, hücre içi amino asitlerin konsantrasyonlarını artırmaktır. Zenginleştirilmiş amino asitler sonlu tRNAs için analogları aşacak ve fonksiyonel proteinlerin doğru sentezini sağlamaktır. Bu nedenle, analoglar hayatta suşları seçilebilir ve ilgili amino asitlerin overüreticiler muhtemeldir.
L-leucine6gibi amino asitler için overüreticiler seçiminde başarılı olmasına rağmen, analog tabanlı strateji ciddi dezavantajları muzdarip. Bir büyük endişe analog direnç mutagenez işleminden kaynaklanan veya spontan mutasyonlar yoluyla. Direnç ile suşları engelleme, ihracat veya analoglar5aşağılayıcı tarafından seçim kaçabilir. Başka bir endişe diğer hücresel süreçlerde analogların toksik yan etkileri7. Sonuç olarak, analog seçimden hayatta kalan suşlar amino asit overüreticileri olmayabilir, istenilen overüreticileri olumsuz yan etkileri nedeniyle yanlışlıkla imha olabilir iken.
Burada, kodon önyargı yasasına dayalı bir yeni strateji amino asit overüreticilerinin doğru ve hızlı kimliklere ulaşmak için sunulmuştur. Çoğu amino asitler, ev sahibi organizmaların8,9tarafından farklı bir şekilde tercih edilen birden fazla nükl üçlüsü tarafından kodlanmıştır. Bazı kodlar, kodlama dizilerinde nadiren kullanılır ve nadir kodlar olarak adlandırılır. Amino asitler içine çevirileri ilgili amino asitler taşıyan bilat tRNAs güveniyor. Ancak, nadir codonlar tanıyan trnas genellikle10,11ortak kodon trnas daha fazla düşük fazlalıkları vardır. Sonuç olarak, bu nadir tRNAs diğer isoacceptors ile yarışmalarda ücretsiz amino asitler yakalamak için daha az muhtemeldir, ve nadir-Codon zengin dizileri çevirileri yavaşlama başlar veya amino asitler miktarları sınırlı olduğunda bile sonlandırıldı 10. Çeviriler, teorik olarak, aşırı üretimler veya karşılık gelen amino asitlerin ekstra beslemeleri nedeniyle eş anlamlı ortak tRNAs şarj ettikten sonra bir amino asit fazlaları geri yüklenebilir12. Nadir kodon zengin gen bir seçim veya tarama işaretçisi kodlarsa, karşılık gelen fenotürler sergileme suşları daha sonra kolayca tespit edilebilir ve muhtemelen hedeflenen amino asitlerin overüreticiler.
Yukarıdaki strateji, amino asit overüreticilerinin tanımlanması için bir seçim ve bir tarama sistemi kurmak için uygulanır. Seçim sistemi antibiyotik direnci genleri kullanır (örn., kanR) işaretleme sistemi, floresan (örneğin, yeşil floresan protein [Gfp]) veya kromojenik (örneğin, prancerpurple) proteinleri kodlama genler kullanır iken işaretçileri olarak. Her iki sistemde de Marker genler eş anlamlı nadir alternatif ile hedeflenen amino asit için ortak kodon tanımlanmış sayılar değiştirerek değiştirilir. Nadide-Codon zengin Marker geni limandaki mutasyon kütüphanesinde bulunan suşlar, uygun koşullar altında seçilir veya ekranlanır ve hedeflenen amino asitlerin overüreticileri kolayca tespit edilebilir. İş akışı ender-Codon zengin Marker gen sisteminin inşası ile başlar, çalışma koşullarının optimizasyonu ve ardından amino asit overüreticilerinin tanımlanması ve doğrulanması. Bu analog-bağımsız strateji protein çevirisi dogma dayanır ve pratikte amino asit overüreticisinin doğru ve hızlı tanımlamalarını sağlamak için doğrulanmıştır. Teorik olarak, nadir codonlar ve tüm mikroorganizmalar ile amino asitlere doğrudan istihdam edilebilir. Tüm, nadir-Codon tabanlı strateji, belirli amino asitler için uygun analogları kullanılamıyor, ya da yüksek bir yanlış pozitif oran büyük endişe olduğunda geleneksel analog tabanlı yaklaşımı için etkili bir alternatif olarak hizmet verecektir. Aşağıdaki protokol, Escherichia coli L-lösin overüreticileri tanımlamada bu stratejiyi göstermek için lösin nadir kodon kullanır.

<table><tbody><tr><td>Asetonitril</td><td>Termo</td><td>51101</td><td></td></tr><tr><td>EasyPure HiPure Plazmid MiniHazırlık Kiti</td><td>Transgen</td><td>EM111-01</td><td></td></tr><tr><td>EasyPure Hızlı Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Transgen</td><td>EG101-01</td><td></td></tr><tr><td>Gibson montaj ana karışımı</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>İzopropil ve beta;-D-1-tiyogalaktopiranosid</td><td>Solarbio</td><td>I8070</td><td></td></tr><tr><td>L-lösin</td><td>Sigma</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka okuyucu</td><td>Biotek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>n-heksan</td><td>Thermo</td><td>H3061</td><td></td></tr><tr><td>Fenil izotiyosiyanat</td><td>Sigma</td><td>P1034</td><td></td></tr><tr><td>PrancerPurple CPB-37-441</td><td>ATUM</td><td>CPB-37-441</td><td></td></tr><tr><td>TransStar FastPfu Fly DNA polimeraz</td><td>Transgen</td><td>AP231-01</td><td></td></tr><tr><td>Trietilamin</td><td>Sigma</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi</td><td>Agilent</td><td>1290 Infinity II</td><td></td></tr><tr><td>Yabani tip C. glutamicum</td><td>ATCC</td><td>13032</td><td></td></tr><tr><td>XL10-Altın E. coli yetkili hücre</td><td>Agilent</td><td>200314</td><td></td></tr><tr><td>ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 sütunu</td><td>Agilent</td><td>959759-902K</td><td></td></tr></tbody></table>

nadir-codon zengin işaretçileri kullanarak amino asit overüreticiler tanımlama

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Amino asitler için sürekli büyüyen pazar karşılamak için, yüksek performanslı üretim suşları gereklidir. Amino asit overüreticiler geleneksel olarak amino asitler ve onların analogları arasındaki yarışmalar harnessing tarafından tanımlanır. Ancak, bu analog tabanlı yöntem düşük doğruluk ve spesifik amino asitler için uygun analoglar sınırlıdır. Burada, nadir-Codon zengin işaretçileri kullanan amino asit overüreticilerinin doğru, hassas ve yüksek verim taramasına olanak tanıyan alternatif bir strateji sunuyoruz. Bu strateji, protein çevirisi içinde kodon kullanım önyargı fenomen esinlenerek, hangi kodon ortak veya nadir olanlar kodlama DNA oluşumu onların frekansları dayalı kategorilere ayrılır. Nadir bulunan kodların çevirisi, ilgili nadir transfer RNAs 'larına (tRNAs) bağlıdır ve bu da açlık altında bilat amino asitleri tarafından tam olarak şarj edilemez. Teorik olarak, aynı derecede ortak isoacceptors şarj ettikten sonra amino asitler fazlasının varsa nadir tRNAs şarj edilebilir. Bu nedenle, seyrek kodların neden olduğu geri zekalı Çeviriler, karşılık gelen amino asitlerin beslenme veya hücre içi aşırı üretimleri ile restore edilebilir. Bu varsayımı altında, amino asit overüreticileri tanımlamak için bir seçim veya tarama sistemi hedeflenen amino asitlerin ortak kodon antibiyotik direnci genler veya genler kendi eşanlamlı nadir alternatifleri ile değiştirerek kurulur Floresan veya kromojenik proteinleri kodlama. Biz protein ifadeleri büyük ölçüde nadir kodon birleşmesi ile engellenebilir ve proteinlerin düzeyleri amino asit konsantrasyonları ile olumlu ilişkilendirir gösterir. Bu sistemi kullanarak, birden fazla amino asitlerin overüreticiler kolayca mutasyon kütüphaneleri dışarı ekranlaştırılmış olabilir. Bu nadir kodon tabanlı strateji sadece tek bir değiştirilmiş gen gerektirir ve ev sahibi diğer yöntemlerden daha seçim kaçmak için daha az muhtemeldir. Amino asit overüreticileri elde etmek için alternatif bir yaklaşım sunar.

Seçim sistemi için, OD600 nadir-Codon zengin antibiyotik direnci geni barındıran suşları için keskin bir düşüş, uygun bir kültürlü zaman vahşi tip antibiyotik direnci geni barındıran gerinme göre gözlenmelidir (Şekil 1a). Aynı koşullar altında, OD600 hücresindeki azalma, antibiyotik direnci geni içinde nadir bulunan kodların sayısı arttıkça daha belirgin hale gelir (Şekil 1a). Bu protein ifadeleri nadir kodo...

Bu çalışmada, aynı anda doğruluk, hassasiyet ve yüksek verim elde etmek için nadir kodon zengin işaretçileri kullanarak amino asit overüreticilerinin belirlenmesi geleneksel toksik analog tabanlı yöntem için alternatif bir strateji sunar.

Nadir-Codon zengin Işaretçileri kullanarak amino asit Overüreticiler tanımlama

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Bu yöntem, amino asit fazla üreticilerinin elde edilmesinde geleneksel analog temelli yaklaşıma etkili bir alternatif sağlar. Bu teknik, doğruluk, hassasiyet ve yüksek iş elde etme sağlayarak geleneksel analog tabanlı yöntemden daha iyi bir şekilde rekabet eder. Bu yöntem, amino asit aşırı üretim güçlü yönlerini anlama ve nadir kodon çeviri anlama yeni bir ışık tutuyor ve teorik olarak, tüm mikroorganizmalara uygulanabilir.Bu protokol çoğunlukla takip etmesi kolay olan ancak uygun gergin sicim seçimini elde etmek için birden fazla deneme gerektirebilecek temel moleküler deneysel operasyonlara dayanır. Bu tekniğin görsel bir gösteri seçim performansı ve amino asit üreticileri belirlenmesinde bir tarama sistemi doğrudan takdir sunuyor. Bu yordamı başlatmak için, işaretleyici parçaları vektör ekleyin, buz üzerinde, bir ila yedi nokta beş mikrolitre montaj karışımı bir molar oranı on mikrolitre toplam hacmine.Bir saat liğine 50 derecede kuluçkaya yat. Montaj ürününün beş mikrolitresini 42 santigrat derecede 30 saniye boyunca 50 mikrolitre bileşen hücresine dönüştürün. Bir saat boyunca 37 santigrat derece Katabolit baskı ortamı ile Super Optimal suyu hücreleri kurtarmak.Sonra, LB Agar orta ve 37 santigrat derece gecede kuluçka onları plaka. Ertesi gün, plazmid izole etmek için tercih edilen bir ticari kiti kullanın. İlk olarak, yabani tip KanR taşıyan plazmid bir mikrolitre ile yetkili hücrelerin 50 mikrolitre dönüştürün.KanR RC 29 içeren plazmid ile yetkin hücrelerin ikinci bir dizi dönüştürmek tüm lösin kodonları nadir kodon CTA ile değiştirilir. Metin protokolünde belirtildiği gibi hücre kültürünü plakalayın ve kuluçkaya yatırın. Daha sonra, nadir kodon açısından zengin türev yabani tip seçim marker geni barındıran koloniler mililitre başına 50 mikrogram konsantrasyonda kanamisin içeren beş kat seyreltilmiş LB orta beş mililitre içine bireysel olarak aktarın.250 rpm sallayarak 37 santigrat derece bir shaker örnekleri kuluçka. Daha sonra, hücre kültürlerinin her birinin 200 mikrolitresini tanımlanmış zaman noktalarında triplicate olarak 96 kuyu plakasına aktarın. OD600 ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın.KanR RC 29 marker genini barındıran lekeleri, L-lösin kaynağı olan veya olmayan kanamisin içeren 0,2 x LB ortamının beş mililitreiki setinde inoküle. Litre başına bir gram son konsantrasyoniçin medya birine L-lösin ekleyin. 250 rpm sallayarak 37 santigrat derecede bir shaker örnekleri kuluçka ve tanımlanan zaman noktalarında her kültür için OD600 ölçmek.Başlamak için, yabani tip GFP veya yabani tip PPG taşıyan plazmid bir mikrolitre ile mutagenez için kullanılan ebeveyn suşu 50 mikrolitre dönüştürmek. Metin protokolünde belirtildiği gibi hücre kültürlerini plakalayın ve kuluçkaya yatırın. Daha sonra, kolonileri tek tek, düzgün seyreltilmiş LB ortamının beş mililitresine aktarın.Örnekleri 37 santigrat derecede bir çalkalayıcıda 250 rpm'de sallayarak kuluçkaya yatırın. Floresan belirteçleri için, hücre kültürlerinin 200 mikrolitresini tanımlanmış zaman noktalarında triplicate olarak 96 iyi temiz alt arka plakaya aktarın. Floresan OD600'i ölçün ve floresan yoğunluğunu hesaplayın.Kromojenik belirteçler için hücre kültürlerinin renk gelişimini ölçün. Daha önce açıklandığı gibi besleme tayini yapın ve floresan yoğunluğunu veya renk gelişimini tanımlanan zaman noktalarında ölçün. İlk olarak, seçim marker KanR RC 29 taşıyan plazmid bir mikrolitre ile mutant hücrelerin 50 mikrolitre dönüştürmek, veya tarama işaretleri GFP RC veya PPG RC. Sonra, hücre kültürlerini 4000 kez G'de beş dakika santrifüj edin.Seçim için, supernatant atın ve seçim işareti taşıyan hücrelere kanamisin içeren 0,2 x LB orta beş mililitre ekleyin. Numuneyi bir gecede 37 santigrat derecede bir çalkalayıcıya kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, 12 saat boyunca 37 santigrat derecede kanamisin ve kuluçka içeren 0.2 x LB agar orta üzerine gece kültürü plaka.Tarama için, uygun antibiyotik içeren LB agar orta üzerine tarama marker barındıran hücrelerin uygun sayıda plaka. 8 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Bundan sonra, plaka her tek koloni ile uygun antibiyotik içeren LB orta inoculate.250 rpm sallayarak 37 santigrat derece bir shaker örnekleri kuluçka. GFP RC kullanılırsa OD600 ve floresan ölçün ve floresan yoğunluğunu hesaplayın. PPG RC kullanılırsa hücre kültürlerinin renk gelişimini ölçün.Aday suşların amino asit verimliliğini doğrulamak için, her aday suşları ile LB orta beş mililitre aşılayarak tohum kültürü hazırlamak ve hücrelerin bir shaker bir gecede 250 rpm ve 37 santigrat derecede büyümesine izin. Ertesi gün, hücre kültürünün bir mililitresinden hücreleri iki dakika boyunca 4000 kez G'yi santrifüj ederek hasat edin. Supernatant atın ve steril su bir mililitre ile palet ilike askıya.20 000 mikrolitre hücre süspansiyonu ve 250 mililitrelik shaker'da 250 mililitrelik bir çalkalama da 24 saat boyunca 37 derece santigrat ile %4 glikoz içeren 20 mililitre M9 ortamı aşılayın. Ertesi gün, 4000 kez G beş dakika için kültür ortamının bir mililitre santrifüj. 200 mikrolitre süpernatantı temiz bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın.Burada gösterilen konsantrasyonlarda L-lösin standart çözeltileri hazırlayın. Bir duman başlık olarak, bir milimolar trietilamin 100 mikrolitre ve bir molar fenil izotiyosiyanat 100 mikrolitre hem supernatant ve standartlara ekleyin. Çözeltileri hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın.Daha sonra, aynı tüp e 400 mikrolitre n-heksane ekleyin ve on saniye girdap. Alt faz amino asit türevleri içerir ve HPLC analizi için kullanılır. Alt fazı 0,2 mikrolitre politetrafloroetilen membranlar üzerinden süzün.Bundan sonra, dakikada 0,42 mililitre akış hızına sahip c18 sütunu yla donatılmış ultra HPLC'de numunenin bir mikrolitresini ve 40 santigrat derece lik kolon sıcaklığında çalıştırın. Hedeflenen amino asitleri 254 nanometrede tespit etmek ve standart eğrinin altındaki tepe alanlarının haritasını koyarak konsantrasyonlarını hesaplamak için bir diyot dizi dedektörü kullanın. Bu çalışmada, amino asit overproducers aynı anda doğruluk, duyarlılık ve yüksek iş elde etmek için nadir kodon açısından zengin belirteçleri kullanılarak tespit edilmiştir.Seçim sistemi için, nadir kodon açısından zengin antibiyotik direnci geni barındıran suşlar için OD600 keskin bir azalma yabani türü barındıran suş ile karşılaştırıldığında gözlenmelidir. Protein ekspresyonunda nadir kodonun inhibisyonu çoğunlukla aç koşullarda gerçekleşir. Karşılık gelen amino asit ekstra besleme sonra, nadir kodon açısından zengin antibiyotik direnci geni barındıran suşu için OD600 önemli ölçüde artar.Tarama sistemi için floresan hücre sayısındaki floresan yoğunluğu, nadir kodon açısından zengin olan gendeki floresan proteini yabani tip genden daha fazla ifade eden zorlanma için önemli ölçüde daha düşüktür. Karşılık gelen amino asit besleme nadir kodon açısından zengin genlerden protein ifadeleri geri yükleyecek. Mor protein imal edilirken, nadir kodon açısından zengin PPG'den geliştirilen renk, yabani tip genden daha hafiftir.Seyreltilmemiş LB orta ifade mor protein L-lösin besleme olmadan nadir kodon açısından zengin PPG yavaş ifade sağlar hücreler peleted kez görünür hale gelir. Ancak, bu nadir kodon açısından zengin PPG gen ekspresyonunun L-lösin ile beslenerek geliştirilmiş olduğu gerçeğini gizlemez. Nadir kodon bazlı strateji mutasyon kütüphanesinden hedeflenen amino asitlerin aşırı üreticileri tespit edebilir ve bu mutantlar ana suşları daha hedeflenen amino asitlerin daha yüksek miktarlarda üretmek gerekir.Bu yordamı denerken, yabani tip belirteçleri barındıran hücreler ve nadir kodon açısından zengin türevleri barındıran hücreler arasında OD veya renk net bir ayrımcılık elde etmek için nadir kodon frekansı ayarlamak önemlidir. Transkripsiyon analizi ve genom dizilimi, amino asit üretimleri ile ilgili mekanizmayı araştırmak için seçilen suşlara uygulanabilir. Bu tekniği kullanarak, amino asit overproducers verimli bir şekilde tespit edilebilir ve genetik bilgilerin analizi amino asit aşırı üretim arkasındaki mekanizmaları içine yeni anlayışlar sunacak.Amino asit türevi zararlı olabilir. Eldiven ve koruyucu giysiler giymek ve bir duman başlık bu adımları gerçekleştirmek emin olun.

identifying-amino-acid-overproducers-using-rare-codon-rich-markers

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Genetik dernekler genellikle işlevsel bir düzeyde açıklanamayan kalır. Bu yöntem, analiz ederek transkripsiyonu SNP için heterozigot hücrelere gen ekspresyonu fenotipi ile ilişkili genetik belirteçlerin etkisini değerlendirmek amaçlamaktadır. Teknoloji allel spesifik astar uzatma ürünleri ölçmek için MALDI-TOF kütle spektrometresi doğru ölçüm sağlar.

Genetik Dernekleri Fonksiyonel Dayanak Test bir Allel özel Gen İfadesi Testi

Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRMA) ile bir araya PCR zebrafish genotip için hızlı ve etkili bir yöntem olarak gösterilmiştir.

Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi

Biz yüksek verimli sıralama kullanan proteinlerin kapsamlı tek site doyma mutagenezi kütüphanelerinin fonksiyonel değerlendirme için bir protokol mevcut. Daha da önemlisi, bu yaklaşım kütüphane inşaatı ve sıralama multipleks dik primer çiftleri kullanır. ampisilin klinik olarak anlamlı bir doz için seçilen TEM-1 β-laktamaz kullanılarak Örnek sonuçlar verilmiştir.

Yüksek verimlilik sıralaması kullanılması Tüm-Protein Doygunluk Mutagenez Kütüphaneleri Fonksiyonel Değerlendirme Protokolü

Tıbbi, farmasötik, yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için Kanonik olmayan amino asit analoglarının proteinlere kalıntıya özgü dahil edilmesi için kullanımı kolay, hücresiz bir ekspresyon protokolü sunulmuştur.

Bir Kullanarak Modeli Proteinler içine Kuralsız Amino Asit kalıntı özgü Ortaklığın<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hücre içermeyen Transkripsiyon-çeviri Sistemi

Burada, sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi ile, Staphylococcus aureus ve bunların daha sonraki analiz metabolitlerin ekstraksiyonu için bir protokol açıklar.

metabolit analizi için bir Tandem Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi tabanlı yaklaşım<em&gt; Stafilokok aureus</em

Sentetik Biyoloji Mühendisliği proteinlerin kanonik olmayan amino asitlerin co-translational ekleme kullanarak benzersiz özellikleri ile sağlar. Burada, GFP türü fluorophore "altın" floresan protein (GdFP) olarak adlandırdığı roman Floresans spektroskopik özellikleri ile hayalice kırmızı kaymıştır bir türevi E. coli seçici basınç birleşme (SPI) yolu ile nasıl üretilir sundu.

Mühendislik kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından 'Altın' floresan ve kütle spektrometresi ve floresan göre Protein analizi

Amino asit düzeyi parazit sinyal analizi arka plan için verilen bir popülasyonun genetik varyasyon normalleştirilmiş bir belirli amino asit pozisyonda genetik varyasyon yaygınlığı belirler. Bu varyant "sıcak noktalar" frekans nadir versiyonlarının bir nüfus (gürültü) bulundu yukarıda yükselir bir protein sıra (sinyal) içinde tanımlanması için sağlar.

Varyant patojenitesi Amino asit düzeyi parazit sinyal analizi genetik varyasyon kullanarak olasılığını belirleme

Ribozomların çevrilmesi, kodon başına üç nükleotidin peptitlere şifresini çözer. Ribozom profillemesi ile yakalanan mRNA boyunca hareketleri, karakteristik üçlü periyodiklik sergileyen ayak izlerini üretir. Bu protokol, tüm transkriptom düzeyinde aktif olarak çevrilmiş açık okuma çerçevelerini tanımlamak için ribozom profil oluşturma verilerinden bu belirgin özelliği deşifre etmek için RiboCode'un nasıl kullanılacağını açıklar.

De novo Aktif Olarak Çevrilmiş Açık Okuma Çerçevelerinin Ribozom Profil Oluşturma Verileri ile Tanımlanması

Bu protokol, mutant L274G-Metiyonin tRNA sentetazı (MetRS*) ifade eden bir fare çizgisi kullanılarak azidonorlösin (ANL) ile hücre tipine özgü protein etiketlemesinin nasıl gerçekleştirileceğini ve etiketli hücre tipine özgü proteinlerin izolasyonu için gerekli adımları açıklar. Canlı farelerde (1) içme suyu ve (2) intraperitoneal enjeksiyonlarla iki olası ANL uygulama yolunu özetliyoruz.

Mutant Metiyonin tRNA Sentetaz Fare Hattı Kullanılarak Hücre Tipi Özgül Protein Saflaştırma ve Kompleks Dokulardan Tanımlama

Burada açıklanan protokol, kullanıcı dostu UCSC Genom Tarayıcısında PhyloCSF kullanarak mikroprotein kodlama potansiyeli için ilgilenilen genomik bölgelerin nasıl analiz edileceğine dair ayrıntılı talimatlar sağlar. Ek olarak, varsayılan işlevleri hakkında fikir edinmek için tanımlanmış mikroproteinlerin dizi özelliklerini daha fazla araştırmak için çeşitli araçlar ve kaynaklar önerilmektedir.

Mikroprotein Tanımlama ve Dizi Analizi için Entegre Bir Yaklaşım

Bu protokol, ilgilenilen bir antijene bağlanan protein varyantlarını zenginleştirmek için maya yüzeyi teşhir seçimi kampanyalarının yürütülmesi için temel adımları açıklar.

Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği

Keşfedin, nadir-kodon zengin işaretçiler kullanarak amino asit aşırı üreticilerini yüksek doğruluk ve duyarlılıkla tanımlama yöntemini. Bu teknik, geleneksel toksik analog yöntemine verimli bir alternatif sunar ve çeşitli mikroorganizmalarda uygulanabilir.

Nadir-Codon zengin Işaretçileri kullanarak amino asit Overüreticiler tanımlama

Daha fazla video keşfet