Mammalin hücrelerinde Micrococcal Nüklenleri kullanarak kromatin Immünopmamitasyon tahlil

Bu protokolde, proteinler ve DNA arasındaki etkileşimleri belirleyebilir ve genin transkripsiyonel düzenlemesini ortaya çıkarabiliriz. Bu hücrelerdeki moleküler mekanizmaları anlamak için yardımcı olur. Önceden varolan protokolleri değiştiriyoruz ve ardından basit ve net bir test protokolleri kuruyoruz.

Sadece ilk adımdan protokolü takip böylece test başarıyla yapılabilir. Çapraz bağlı kromatin hazırlamak için, bir duman kaputunda, altı santimetrelik bir çanağa %1 VCaP hücre kültürü ortamı ve 0,229 mililitre %18,5 PFA dört mililitre ekleyin. PfA'yı eşit olarak dağıtmak için yemeği yavaşça döndürün.

Tam olarak 10 dakika oda sıcaklığında kuluçka. Daha sonra, çanak için 1,25-molar glisin çözeltisi 0,47 mililitre ekleyin ve daha fazla crosslinking durdurmak için beş dakika oda sıcaklığında kuluçka. El yazmasına göre hücreleri yıkadıktan sonra hücreleri kazıyın ve hücre süspansiyonuna 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpü aktarın.

Hücre peletini kurtarmak için hücre yimini oda sıcaklığında beş dakika boyunca 3,000 kez g'de hücre süspansiyonu ile tüpü santrifüj edin. PBS'yi tamamen çıkarmak için pipet kullanın. Tüp başına hücre numarasını kaydedin ve hücre peletini eksi 80 derecede saklayın.

Hücre lisisi gerçekleştirmek için, önce depolanan VCaP hücre peletlerini buz üzerinde eritin. Hazırlanan ChIP hücre lisis tampon 300 mikrolitre her tüp için PIC ile takviye ekleyin ve iyice pelet resuspend. Tüpü 15 saniye girdaplayın ve süspansiyonu 10 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın.

Santrifüj 9, 000 kez g dört santigrat derece üç dakika için. Supernatant tamamen çıkarın ve pelet resuspend mNase sindirim tampon 300 mikrolitre ekleyin. Mikrolitre başına 50 jel birimleri verim 1.5 mililitrelik bir tüp mNase sindirim tampon ile MNase seyreltmek.

Seyreltilmiş MNase'yi süspansiyona ekleyin ve tam 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Karıştırmayı her 2,5 dakikada bir ters çevirmeye ayarlayın. MNase sindirimini sonlandırmak için, pH sekiz de 0.5-molar EDTA 30 mikrolitre ekleyin ve girdap kısaca.

Buzda beş dakika kuluçkadan sonra, santrifüj 9,000 kez g'de dört santigrat derecede beş dakika. Supernatant tamamen çıkarın ve PIC ile desteklenen hazırlanan ChIP seyreltme tampon 300 mikrolitre pelet resuspend. Daha sonra, bir mikrotip sondası ile donatılmış bir sonicator, genlik iki sonication koşulları ayarlayın, işlenmiş zaman 15 saniye, darbe ON beş saniye, ve darbe OFF 30 saniye.

Süspansiyonu buzda sonicate edin. Süspansiyonun bir mikrolitresini çizin ve bir slayt camı üzerine noktalayın. Bir mikroskop altında, hücre yapısı neredeyse kırık olduğundan emin olmak için gözlemlemek.

Tüpü 9,000 kez g'de 10 dakika 4 santigrat dereceye kadar santrifüj edin ve süpernatant'ı 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Daha fazla tedavi için 1,5 mililitrelik vidalı tüp içinde sindirilmiş kromatin 20 mikrolitre kaydedin ve eksi 80 santigrat derece geri kalanı saklayın. İlk olarak, her 1,5 mililitrelik vida tüpünde, 75 mikrolitre su, dört mikrolitre beş molar sodyum klorür ve proteinve DNA arasındaki çapraz lamayı kaldırmak K.To bir mikrolitre protein ekleyin, her bir MNase sindirim durumundan bir vida tüpüne 20 mikrolitre sindirilmiş kromatin ekleyin.

Kapağı sıkıca kapatın, tamamen karıştırın ve tüpü bir gecede 65 derecede kuluçkaya yatırın. Sabah, birkaç saniye için 2-3, 000 kez g tüp santrifüj sonra, PCI 100 mikrolitre ekleyin. Girdap şiddetle bir emülsiyon oluşturmak için.

Oda sıcaklığında 30 saniye boyunca tüpü tekrar maksimum hızda santrifüj edin. Daha sonra, durum başına iki 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın. Bir tüpe 100 mikrolitre PCI ekleyin.

PH 5.2'de 10 mikrolitre üç molar sodyum asetat ve başka bir tüpe iki mikrolitre glikojen ekleyin. Santrifüjden çıkarılan tüpten, DNA içeren üst fazı dikkatlice çizin ve PCI içeren tüpe ekleyin. Girdap şiddetle, ve oda sıcaklığında 30 saniye boyunca maksimum hızda tüp santrifüj.

Daha sonra, daha önce hazırlanmış sodyum asetat ve glikojen içeren tüp üst faz transfer. Etanol 250 mikrolitre ekleyin ve inversion tarafından karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yat.

Tüpü maksimum hızda 30 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin. Tüpün altındaki peletleri doğrulayın. Peletrahatsız değil, böylece dikkatle supernatant çıkarın ve% 70 etanol 500 mikrolitre ekleyin.

Tüpü maksimum hızda beş dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj edin. Supernatant'ı tamamen çıkarın ve peleti oda sıcaklığında yaklaşık beş dakika kurutun. Daha sonra, pelet eritmek için TE 20 mikrolitre ekleyin.

UV spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonu ölçün. Sindirilmiş kromatin hazırlandıktan sonra, buz üzerinde tüm örnekleri eritin. Hazırlanan ChIP seyreltme tampon 1200 mikrolitre 500 mikrolitre başına beş mikrogram konsantrasyonu için sindirilmiş kromatin seyreltmek için PIC ile takviye ekleyin.

Bir giriş örneği olarak 1,5 mililitrelik vidalı tüpe seyreltilmiş sindirilmiş kromatinbeş mikrolitre ekleyin. Numuneyi eksi 80 derecede saklayın. Bir immünenasyon örneği olarak 1.5 mililitrelik vidalı tüpe seyreltilmiş sindirilmiş kromatinher 500 mikrolitre ekleyin.

Her tüpe iki mikrogram antikor ekleyin ve kapağı kapatın. Tüpleri bir gecede dört derece santigrat derecede, sallanan bir platformda hafifçe karıştırarak kuluçkaya yatırın. Sabahları, her tüpe 30 mikrolitre ChIP sınıfı protein G manyetik boncuk ekleyin.

Tüpleri tekrar dört derecede iki saat boyunca hafif karıştırma ile kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, 2-3, 000 kez g kısa bir tüp aşağı spin ve bir dakika için neodimyum mıknatıslar içeren bir polietilen raf tüpü yerleştirin. Sonra, dikkatle aspirasyon tarafından supernatant kaldırın.

Sonra, her tüp için düşük tuz bağışıklık kompleksi yıkama tampon 0,5 mililitre ekleyin. Kısaca boncuk dağıtmak için tüp girdap. Tüpü dört derecede, sallanan bir platformda hafifçe karıştırarak beş dakika kuluçkaya yatırın.

El yazmasına göre yüksek tuz bağışıklık kompleksi ve lityum klorür bağışıklık kompleksi ile yıkama tekrarlayın. Kalan supernatant tamamen çıkardıktan sonra, tüpe elüsyon tampon 150 mikrolitre ekleyin. Girdap tüp tamamen boncuk dağıtmak için.

Kapağı kapatın ve tüpü 65 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Boncukları iyice dağıtmak için, her beş dakikada bir ters çevrilerek karıştırın. Kuluçka sırasında, 1.5 mililitrelik bir vidalı tüp hazırlayın ve beş molar sodyum klorür altı mikrolitre ve proteinase K.Thaw iki mikrolitre ekleyin 1% giriş örneği daha önce buz üzerinde hazırlanan.

Giriş örneğine 150 mikrolitre elüsyon tamponu, altı mikrolitre beş molar sodyum klorür ve iki mikrolitre proteinaz K ekleyin. Boncuk içeren tüpün kuluçkadan sonra, aşağı doğru dön. Tüpü bir dakika lığına manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatant'ı sodyum klorür ve proteinaz K.Temsilcisi mikrit içeren vida tüpüne aktarın.

Sonication olmadan, hücre yapısı bozulmadan kalır, kromatin çekirdekleri mevcut olduğunu gösteren. Kısa bir sonication hücre yapısını bozar. Crosslinked kromatin VCaP hücrelerinden hazırlandı ve çeşitli miktarlarda MNase ile sindirildi.

MNase eklemeden, çok yüksek molekül ağırlığı ile bir yayma deseni ortaya çıktı. MNase eklenmesi bir merdiven desen verdi, Hangi MNase internükleozom sindirir gösterir. Sadece 900 bp'ye kadar kromatin parçaları üreten durum uygun sindirim olarak kabul edilebilirken, uygun olmayan bir sindirim paterni aşırı hazımsızlık gösterir ken esas olarak mononükleozom üretimine neden olur.

VCaP hücrelerinde kromatin sindirim deseni kromatin uygun sindirim gösterir. H3K4methyl3 en yüksek doluluk 0.5 kilobase ve AR-TSS yukarı bir kilobase civarında gözlendi. 19 kilobase ve sekiz kb upstream ve 12 kilobase aşağı AR-TSS bulunan bölgeler, ancak, bu negatif bölgeler olarak kullanılabilir gösteren H3K4methyl3 az doluluk vardı.

MNase sindirim durumunun belirlenmesi en önemlidir. Her deneyde hücre numarasını, tampon hacmini ve enzim miktarını koruyun. Durum her hücre türü için tanımlanmalıdır.

Biz distal genomik lezyonlar arasındaki etkileşimleri belirlemek için faktörler ve kromatin konformasyon yakalar küresel doluluk için ChIP sekans gerçekleştirebilirsiniz. Bu yöntem transkripsiyon işlem mekanizmalarını ortaya çıkarabilir. ChIP tsay transkripsiyonel düzenleme araştırmak için güçlü bir araçtır, ama hantal ve tekrarlanabilir değildir.

Yöntemimiz araştırmacıları rutin ve kolay bir şekilde tetkik yapmaya teşvik eder.