Protein ayrımı ve karakterizasyonu için birden fazla açıyla ışık saçılma (MALS) birleştiğinde iyon Kromatografi (IEX)

Bu protokol, protein kalite kontrolü ve karakterizasyonu için yeni bir yöntem olan iyon değişimi MAL'leri, yaşam bilimi araştırmaları ve farmasötik ürün geliştirmede sonuçların tutarlılığı ve bütünlüğü için gerekli olan kalite kontrol'ü sunmaktadır. Iyon değişimi MALS protein saflığı, oligomerik durum, homojenlik, kimlik, konformasyon, yapı, post-çeviri modifikasyonları ve diğer özellikleri belirler. Ölçümler tahribatsızdır ve yakın fizyolojik tampon koşullarında çözelti halinde yapılır.

Bu yöntem, protein veya peptidlerin molar kütlesini, oligomerik durumu ve örneğin glikoproteinlerin çekim derecesini doğru bir şekilde belirler. Ayrıca membran proteinleri uygulanabilir. IEX makromolekülleri yüzey yüküne göre ayırır.

Anyon değişimi, AIEX ve katyon değişimi, CIEX, matrisler sırasıyla negatif ve pozitif yüklü varyantları bağlar. Nispeten yakın bir kütle yi veya şekli paylaşan protein popülasyonları arasında ince bir ayrım ile, IEX-MALS bir karışım örneğinde her bir protein durumunun molar kütlesini başarıyla belirler. Başlangıç olarak, yıkama ve elüsiyon arabellekleri de dahil olmak üzere tüm reaktifleri filtrelemek için 0,1 mikrometrelik bir filtre kullanın.

Kuru filtrelerdeki partikülleri ortadan kaldırmak için ilk 50 ila 100 mililitre tamponu atık şişeye süzün. Tozların girmesini önlemek için filtrelenmiş suyla iyice yıkanmış ve kapaklı temiz ve steril bir şişede tamponun geri kalanını filtreleyin. pH-sekiz Tris tampon ve 50 milimolar sodyum klorür ile, pH ve iyonik gücü iyon değişimi sütununa bağlanmasını sağlayacak böylece mililitre başına altı miligram bir BSA örnek seyreltmek.

Kaliteli MALS analizini elde etmek için bir mililitrelik kolona en az 0,3 ila 0,5 miligram BSA enjekte etmek için şırınga kullanın. Bir iyon değişimi MALS denemesini başlatmak için, MALS yazılımında Yeni, Yöntemden Deney'i açın ve Light Scattering sistem yöntemleri klasöründen çevrimiçi yöntemi seçin. DLS modülü varsa ve DLS verileri elde edilecekse, QELS alt klasörü ile Işık Saçılımı'ndan çevrimiçi yöntemi seçin.

Parametreleri ayarlamak için, Yapılandırma bölümü altında, ilk olarak Genel Pompa bölümündeki çalıştırmanın akış hızını FPLC'de kullanılan akış hızına dakikada 1,5 mililitre olarak ayarlayın. Solvent bölümünün altında, arabellek parametrelerini girin veya doğrulayın. Enjektör bölümünün altında protein adı BSA, refraktif indeks artışını gram başına 0,185 mililitre ve 280 nanometre dalga boyundaki UV yok olma katsayısı ise gram başına 0,66 litre olarak girin.

Örnek sekmesine, protein numunesinin konsantrasyonuna mililitre başına altı miligram girin ve ardından enjeksiyon için numune hacmini de 170 mikrolitre olarak takın. Yordamlar bölümünde, Temel Koleksiyon sekmesinde, Otomatik Enjekte etme detetikini seçin ve çalışma süresini 70 mililitreye ayarlayın, böylece veri toplama degrade son değerine ulaştıktan sonra en az beş dakika boyunca devam eder. Ardından, FPLC yazılımında Yöntem Düzenleyicisi sekmesinde yeni bir deneme oluşturun.

İlk deneme için, doğrusal tuz veya pH degradesi oluştururken, optimize edilmiş yöntem için el yazmasına göre daha spesifik bir degrade veya adım adım lı bir program oluşturun. MALS yazılımında veri toplamayı tetikleyecek yönteme bir darbe sinyali ekleyin. Daha sonra, pompa vanasını açın ve güçlü bağlı kirleri kaldırmak için 0,5-molar sodyum hidroksit ile yıkayın, nötralizasyon tampon yıkama izledi.

Daha sonra, Tris tampon pH sekiz, yıkama tampon ile A vana ve elüsyon tampon ile B vana ile sütun yıkayın. Proteinin kolon matrisine bağlanmasını sağlamak için, kolondurulamak için son bir yıkama olarak düşük tuz konsantrasyonu ile yıkama tampon kullanın. Numune enjeksiyonundan önce, yıkamadan sonra ve elüsyonun sonunda, düşük gürültü ve tamamen saf seyreltme sağlamak için ışık saçılma taban çizgisi stabilize edilmelidir.

Bir şırınga kullanarak, protein örneğini döngüye yerleştirin. Denemeyi önce MALS yazılımında Çalıştır düğmesine ve ardından FPLC yazılımına tıklayarak başlatın. Veriler, MALS dedektörü aracılığıyla FPLC cihazından darbe sinyali alındıktan sonra toplanır.

Iyon değişimleri MALS tek başına bir yöntem yerine sürekli bir akış modu ile el ile gerçekleştirilirse, daha önce açıklandığı gibi çalıştırma ve yönergelerin aynı parametreleri uygulayın. Son yöntem doğrulandıktan ve çalıştırıldıktan sonra, örnek yerine arabellek yükleyerek boş bir enjeksiyon kullanarak tam olarak aynı yöntemi gerçekleştirin. Otomatik enjekte etme darbesi ile boş çalıştırmanın degradesi arasındaki zamanlamanın örnek çalışmasıyla aynı olması önemlidir.

Analize başlamak için, MALS yazılımındaki Yordamlar bölümü altında, kromatogramları düzeltmek için Despiking sekmesini ve Normal düzeyi kullanın. Eğer çok fazla gürültü sergiliyorlarsa, seviyeyi Heavy'ye ayarlayın. Taban çizgisi görünümünde, LS, UV ve RI dedektörleri de dahil olmak üzere tüm sinyalleriçin taban çizgisini tanımlayın.

Zirveler görünümünde, analiz için zirveleri tanımlayın. Her tepenin altındaki protein için RI artış değeri dn/dc ve UV yok olma katsayısının doğru değerlerini doğrulayın. Işık Saçılma görünümünden Molar Kütlesi ve Yarıçapı altında, Zimm modelini kullanarak molar kütlesini ve yarıçapı analiz edin ve sıfıra uygun derecesine sahip olur.

QELS varsa, QUELS görünümünden Rh altında, Rh değerlerini ve korelasyon fonksiyonunun uygun kalitesini gözlemleyin. RI sinyali, tuz konsantrasyonundaki artış nedeniyle iyon değişimi MALS çalışması sırasında önemli ölçüde değişir. Boş enjeksiyondan temel sinyali çıkarmak için hem proteini hem de boş iyon değişimi MALS deneylerini açın.

Protein deneme adı sağ tıklayın, Yöntem Uygula'yı seçin ve dosya iletişim kutusundan Temel Çıkarma klasörünü seçin. Standart azı kütle analizi için çevrimiçi yöntemi seçin. Temel Çıkarma görünümü altında, boş çalıştırmasinyallerini almak için Boş Alma'yı tıklatın.

Instruments'ın altında, çıkarmak için tüm dedektörleri kontrol edin. İyon değişimi MALS sistemini BSA monomer ile kalibre etmek için, Prosedürler ve Yapılandırma görünümü altında, zirveleri hizalayın. Normalleştirme görünümüaltında, normalleştirme gerçekleştirmek için Rg değeri olarak 3.0 nanometre girin.

Ardından, aynı Yapılandırma sekmesinde Bant Genişletme altında, tepeyi seçin ve UV ve LS sinyallerini RI sinyaliyle eşleştirmek için Sığdır düğmesini kullanın. Sonuçların grafiği, Sonuç Uydurma görünümünde gösterilir. Eksen ölçeklerini ve diğer grafik parametrelerini, grafiğe sağ tıklayarak, Düzenleme'yi seçerek ve gelişmiş düğmeye tıklayarak değiştirin.

Daha fazla ekran seçeneğine sahip olmak için EASI Graph sekmesini seçin ve Ekran açılır menüsündeki pencerenin üst kısmında, molar kütlesi, yarıçap, saflık düzeyi ve diğerleri dahil olmak üzere Molar Mass veya Rh Q.All sonuçlarını seçin ve diğerleri Sonuçlar bölümündeki Rapor görünümünde mevcuttur. Rapora daha fazla sonuç veya parametrenin yanı sıra rakamlar eklemek için Rapor Tasarımcısı düğmesini kullanın. Bu deneyde, BSA iyon değişimi MALS üzerinde bir aniyon değişimi analitik sütun kullanılarak analiz edildi.

Kromatogramlar UV'yi 280 nanometre, ışık 90 derecelik açıyla saçılma, kırılma indisi ve iletkenlik eğrilerini her tepenin azı kütlesi ile birlikte sergiledi. 75 milimolardan 350 milimolar sodyum klorüre kadar 30 sütun hacminden oluşan geniş bir doğrusal degrade BSA monomerlerini dimerlerden ve daha yüksek oligomerlerden ayırdı. Downstream MALS analizi, 66.8 kilodalton hesaplanan monomer molar kütlesi ve 130 kilodalton hesaplanan dimer molar kütlesi ile sonuçlandı.

Eluted zirvelerde tampon iletkenlik dayanarak, gradyan farklı bir program, 175 milimolar sodyum klorür uzun bir adım, 175 milimolar 500 milimolar sodyum klorür doğrusal bir gradyan izledi değiştirildi. Yeni degrade çözünürlüğü büyük ölçüde geliştirdi ve BSA monomer ve daha yüksek oligomerik türler arasında mükemmel bir ayrım üretti. Yüksek oligomerik türlere odaklanmak için 200 milimolar ve 250 milimolar sodyum klorür den oluşan bir adımsal program uygulanmıştır.

BSA monomer, dimer ve trimer arasında mükemmel bir ayrım ile sonuçlandı. Bu prosedürü takiben, her birini tanımlamak ve daha fazla karakterize etmek için iyon değişimi ile ayrılan her varyantta kütle spektrometresi, SDS-PAGE aktivitesi ve stabilite testleri gibi yöntemler gerçekleştirilebilir. İyon değişimi MALS'in MALS analizinin gücünü SEC-MALS tarafından tam olarak analiz edilemeyen numunelere genişlettiklerini bulduk.

Ücrete göre ayırma, SEC'de coelute olan farklı türleri çözer.